Summary
在这里,我们提供了一个详细的程序,诱导小鼠结肠镜引导捏活检和跟踪伤口关闭的实时程序。此外,还提供了组织准备方法,用于对伤口床进行组织学、免疫组织化学和分子分析。
Abstract
在研究胃肠道 (GI) 疾病时,了解急性损伤反应中以及伤口愈合过程中发生的组织和细胞变化至关重要。穆林结肠捏活检模型是定义这些过程的有用工具。此外,还可以研究肠道发光成分(例如微生物)和结肠之间的相互作用。然而,伤口感应和以可靠方式跟踪伤口闭合的能力可能具有挑战性。此外,组织准备和定向必须以标准化的方式进行,以最佳地询问组织学和分子变化。在这里,我们提出了一个详细的方法,描述活检引起的伤害和通过重复结肠镜检查伤口封闭的监测。描述的方法,确保伤口大小的一致和可重复的测量,收集伤口床进行分子分析的能力,以及在组织分割时可视化伤口床。成功实施这些技术的能力允许研究结肠内的急性损伤反应、伤口愈合和发光宿主相互作用。
Introduction
胃肠道 (GI) 是一个复杂的器官系统,具有多种功能、宿主细胞类型(如上皮、免疫、频闪等)以及数万亿种微生物。鉴于这种复杂性,胃肠道疾病往往涉及所有这些因素的相互作用。例如,炎症性肠道疾病 (IBD) 与 GI 肠道的炎症和缓解周期有关,涉及炎症细胞的激活、消化不良和上皮修复 1、2、3、4、5、6、7。拥有适当的模型系统来研究IBD和胃肠道的其他炎症状况对于阐明疾病的发病机制至关重要。有几个模型存在研究IBD发病机制,包括基因工程小鼠和使用化学品,如硫酸钠(DSS)在啮齿动物8,9,10。这些模型的局限性包括无法精确控制炎症的诱导以及评估伤口愈合的困难。模仿IBD发病机制的替代方法可能证明对开发疗法有用。
小鼠的结肠镜引导捏活检提供了一个有用的模型系统,用于研究炎症反应的发病机制、伤口愈合以及结肠中的宿主-微生物相互作用。这种方法在2009年首次被用作实验工具,它证明了它对研究肠道11中急性炎症反应和伤口愈合的功用。随后的研究利用这项技术来评估不同的信号通路以及肠道微生物群的作用,在结肠伤口愈合11,12,13,14,15,16,17,18。最近,我们小组利用这个模型来研究辛诺辛-1-磷酸盐信号和细菌在对结肠损伤的急性反应中的重要性。虽然有用,在小鼠身上进行结肠镜引导捏活检和评估随后的组织变化在技术上可能具有挑战性。例如,肠穿孔在诱发损伤时可能发生,通过连续结肠镜检查确保伤口床的一致测量可能很困难。此外,正确定位结肠组织以可视化伤口床进行组织学或免疫组织化学分析可能具有挑战性。虽然确实存在一些有关这些方法的信息18,20,但这些技术的精确步骤描述将视觉辅助承诺提高这种模型的可靠性和更广泛的效用。在这里,我们提出了一个详细的方法,在小鼠进行结肠镜引导捏活检,跟踪伤口闭合随着时间的推移,并准备组织,使组织,使组织和分子分析的伤口床。创建执行这些技术的标准方法可以扩展此模型的使用范围,以研究以前未经调查的调解人,这些调解员对 GI 炎症和伤口修复具有潜在的重要性。
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Protocol
此处描述的所有程序都得到了威尔康奈尔医学院机构动物护理和使用委员会的批准。致:"这里描述的所有程序都得到了威尔康奈尔医学院和石溪大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 结肠镜检查和伤口感应
- 首先将1.9毫米硬孔内窥镜插入护套(图1A-B),预先组装内窥镜的组件。使用提供的管子将空气泵(提供结肠窒息)连接到工作通道(图 1C)旁边的护套左侧的气体阀。
注:虽然此处描述的镜头为 0°,但 30° 透镜也可用于此目的。 - 确保工作通道处于打开位置,并通过工作通道插入 3 Fr 活检钳,并推进到护套结束(同时确保它不会突出出护套)(图 1C)。根据制造商的说明,将组装的内窥镜连接到光源和视频成像设备。
- 在感应室中用5%的异氟化与氧气麻醉小鼠。然后将鼠标移到包含供暖系统(防止体温过低)的内窥镜中继平台,使用含氧量为 2% 异氟的鼻锥在麻醉下保持。在眼睛中加入兽医软膏,以防止麻醉时干燥。通过轻轻捏紧后脚来测试反射,确保鼠标完全麻醉。
注:任何菌株或任何性别的小鼠都可以使用这种技术:然而,更可取的是,小鼠的年龄至少为8周,因此它们足够大,可以进行手术。- 在眼睛中加入兽医软膏,以防止麻醉时干燥。
- 通过轻轻捏紧后脚来测试反射,确保鼠标完全麻醉。
- 用室温磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 将 3 mL 注射器与附着的鼠嘴针填充。将针头插入鼠标肛门约 1 厘米,轻轻注入 PBS 以清除粪便材料。几个粪便颗粒应与注入的 PBS 一起退出鼠标。
注:PBS体积过大的灌输会导致流明的泡沫形成,从而模糊对流明的观察。 - 将组装的内窥镜插入鼠标肛门 0.5 厘米。将活检钳推进直肠的流明,直到钳子的全"爪子"(包括铰链)超出护套的末端(如视频监视器上观察到的)(补充视频 1)。将钳子转动 90°,使下颚以东西方向打开(补充视频 1)。
- 要活检,打开钳子,向前推进约1厘米,关闭钳子,并在一个平稳的动作迅速拉回钳子,同时让他们关闭(补充视频1)。
- 进行活检时,避免完全窒息结肠。因此,在此步骤中保持气阀右侧打开:虽然应该指出,打开钳子时,当结肠处于此位置时,有损坏粘膜的风险。
2. 可视化和测量伤口床
- 活检后立即启动视频录制,按下连接到结肠镜记录装置的脚踏板。通过将食指牢牢地压在气体阀门的右侧以完全覆盖开口,从而迫使空气进入内窥镜,从而进入结肠,从而完全窒息结肠。
注:虽然此协议描述了手动控制气流的气泵的使用,但也可以使用带可控空气供应的腹股油泵。 - 推进钳子从护套,并进入直肠流明,而在封闭的位置(补充视频1)。将钳子放在伤口正上方的直肠壁上,直到下颚底部与视场的上边缘对齐(图 2 + 补充视频 1)。继续完全窒息结肠,直到可以清楚地看到伤口。
注意:应注意将钳子伸展到足够远的地方,以便只显示每个被检查的小鼠的钳子的下颚,以确保内窥镜透镜与病变(图 2,白色箭头)之间的一致距离。 - 如果在同一天对多只小鼠进行活检,请从钳子上取出前一只小鼠的活检组织(使用提供的清洁刷),并用 70% 的乙醇擦拭镜头护套以清洁,然后诱导下一只小鼠的伤口。
注:虽然此协议描述每只小鼠进行一次活检,但只要从钳子上取出先前活检的组织,就可以对单只小鼠进行多次活检,以确保在随后的活检中可以进行全面的活检。 - 将鼠标放入其他小鼠的笼子中,并在毛巾上保持气道畅通,直到完成手术后从麻醉中恢复过来。监测鼠标,以确保它从麻醉中恢复,如恢复活动所示。
注:第0天需要两个人诱导伤口并可视化伤口床(一人操作内窥镜,另一人操作活检钳),但在随后的几天内,只有一个人需要可视化伤口(如下所述)。 - 遵循相同的程序准备小鼠和结肠镜检查,以进行后续的伤口测量(通常活检后为2天、4天和6天),如上文所述,但伤口诱导除外。
- 在插入内窥镜后,在这些时间点定位伤口床,并将活检钳(处于封闭位置)推进到伤口床正上方,将结肠充气并启动录像,如第 2.1 和 2.2 节(图 2)所述。
注:活检后6天以上很难找到伤口床。 - 在随后的几天里,将钳子推进到流明中,达到与第 0 天相同的距离,以确保内窥镜透镜的透镜与数天的病变之间保持一致的距离。确保透镜和病变之间的一致距离将随着时间的推移提高测量的准确性。
注:一个人可以在这些天进行测量(内窥镜用右手操作,活检钳用左手推进)。 - 完成所有测量后,在视频编辑软件中打开串行结肠镜检查的录像,以便从视频中创建静止镜头。
- 将视频推进到显示伤口床可轻松可视化的时间点的帧,封闭的钳子在伤口床上方,靠在直肠壁上,墙壁被拉紧。拍摄此框架的快照并编码文件名称,以确保以盲目的方式进行伤口床位的测量。
- 在 NIH ImageJ 中使用编码文件名称打开图像,以量化伤口床的大小。在 "分析 "选项卡下,选择 "设置测量" 并选中 "区域 "框。
- 从主菜单栏中选择 徒手选择 工具,并在伤口周围画一个周长(见 图2)。在 "分析 "选项卡下选择 "测量", 该测量值将自动填充在 结果 窗口中。
- 在完成所有图像的测量后,通过在结果窗口内选择"文件"选项卡下的"保存"选项卡并将扩展更改为电子表格文件,将结果导出到电子表格中。
- 与电子表格中第 0 天(受伤后立即)的大小相比,计算伤口在伤口诱导后的几天(即第 2 天、第 4 天和第 6 天)的大小。通过将每天的伤口大小除以第 0 天的伤口大小,并将该值转换为百分比来实现此目的。
注:在正常情况下,使用这种结肠镜观察方法,在前2天(大小减少约75%)后观察到伤口的最大闭合,在第4天和第6天(分别减少约80%和95%的大小)。
3. 收集伤口床进行分子分析
- 使用 CO2 窒息对小鼠实施安乐死,然后在活检后选定的一天对小鼠进行宫颈脱位(或等效技术)。
- 通过打开皮肤和腹部肌肉来暴露体腔,收获结肠的分离区域。将封闭式剪刀放在结肠下,轻轻抬起,将其从底层的中间部释放,然后在其中点和肛门处切开结肠,将其从鼠标中去除。
- 使用附着在装满冰冷 1x PBS 的 20 mL 注射器上的鼠嘴针冲洗粪便含量,然后将结肠放在滤纸上。
- 在滤纸上纵向切开结肠,确保中性面朝下与滤纸对峙。当组织仍在滤纸上时,使用挤压管道将0.2%的甲基蓝色涂抹在粘膜上,然后排出多余的甲基蓝色。在解剖显微镜下查看结肠,并找到伤口床(图3A)。
- 使用 4 英寸微虹膜剪刀,在伤口床的边缘切开(图 3A,破折号圆),小心不要切入肌肉层(除非需要肌肉),并使用细点钳子将解剖的伤口床转移到管子上,以进行捕捉冻结或所需的存储方法。
注:以这种方式收集的组织数量足以提取RNA,用于RNA-seq或等效分析。
4. 组织准备组织组织学分析
- 安乐死小鼠并收获第3.1-3.2步描述的结肠。
- 在滤纸上纵向切开结肠,确保中性面朝下与滤纸对峙。使用挤压移液器轻轻涂抹 4% 甲醛(或首选固定剂),并用准胶片覆盖组织。将平放在密封的容器中4-6小时。
- 将组织转移到 70% 乙醇中储存。当准备处理组织时,取出对羟基苯甲基苯,在组织仍在滤纸上时,使用挤压管将0.2%的甲基蓝色涂抹在粘膜上。然后排干多余的甲基蓝色。
- 在解剖显微镜下查看结肠,并找到伤口床(图3A)。使用带#10刀片的手术刀,直接穿过伤口床的中心,继续直线切割结肠的其余部分,使结肠被切成两半,长度为图3A,黑线)。
- 处理结肠,然后石蜡嵌入(一方或两侧切割后仍然存在),使被手术刀切割的一侧(在两节前是伤口床的中心)面朝下在石蜡中。继续切割部分和染色所需的污渍或制造商。
- 如果给定染色需要低温,则按照步骤 3.1 描述的收获结肠,并在滤纸上纵向打开,确保中性侧面朝下与滤纸对峙。
- 将伤口床分隔在刚收获的结肠内,如第 4.5 步所述,并嵌入结肠(切割后仍保留的一侧或两侧),以便被手术刀切割的侧面朝下放在一个半充满组织冻结介质的基础模具中。
- 用细钳将组织固定到位,并将底模固定在干冰顶部的金属板上,以硬化冷冻介质。一旦介质的底部被冻结(组织保持到位),释放组织,用冷冻介质填充基础模具的剩余体积,并放回干冰上。
- 冷冻介质的整个体积冻结后,转移到-80°C冰柜,直到分片。
- 对于石蜡或冷冻部分,H&E 切割和弄脏其他部分,以确保伤口床在进行特定研究染色之前已捕获。 图 3B 显示了一个可以清楚地观察伤口床的部分示例。
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Representative Results
进行活检所需的小项目(透镜、护套、活检钳)显示在 图 1 中,以及这些组件正确组装的指示器。 图2 显示伤口床可接受视图的代表性图像,以便准确量化伤口床的大小和伤口的闭合率。 图 3A 中显示了伤口床的前活体视图示例,其中包含伤口床周长的指示指标(指示用于分子分析的区域),以及切割组织的位置,以便在剖腹产时实现伤口床的可视化。 图 3B 显示了 H&E 染色部分的代表性图像,其中可以清楚地观察到伤口床。 补充视频 1 从鼠标结肠内提供活检过程的视图。
图1:进行活检所需的项目。(A) 镜头图像 (a)、护套 (b) 和活检钳 (c)。(B) 将镜头插入护套。(C) 通过护套(实心箭头)的工作通道插入钳子。破折号箭头表示空气泵附件的正确位置。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2:活检后伤口床的结肠镜图像。静止图像是在活检(第0天)和2天、4天和6天后立即从结肠镜检查的录像中创建的。蓝线指示每个时间点的伤口床的边缘。箭头指示钳子向流明的延伸的正确长度,以确保从镜头到直肠壁的适当距离,以确保随着时间的推移对伤口床的一致测量。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3:伤口床的外活体和剖面图像。(A) 活检后2天从小鼠身上采集结肠,染上0.2%的甲基蓝色,并在解剖显微镜下成像。破折号圆表示伤口床的边缘。黑线表示在嵌入进行剖腹产之前将伤口床/结肠两分的适当位置。(B) 伤口床的H&E染色部分的代表形象。星号表示伤口床,箭头表示伤口床旁的完整墓穴,指示受伤区域的边界。 请点击这里查看此数字的较大版本。
补充视频1:活检程序和伤口床成像。请点击这里下载此视频。
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Discussion
在尝试有效评估此模型中的伤口闭合率时,确保一致和准确的活检以及伤口大小的测量至关重要。因此,应采取若干措施,确保程序得到正确执行。首先,活检的深度不能太浅或太深。如果太浅,将没有足够的窗口来评估伤口关闭。 图 2 显示第 0 天的最佳活检深度和大小。注意伤口床周围的粘膜和伤口床下残留的组织之间的明显区别(图2)。如果活检太深,穿孔可能会发生,从而导致一个不可估量的老鼠。在第0天活检后窒息后,如果小鼠的腹部严重松开,已经穿孔,小鼠不能用于评估,应安乐死。如果同一个人进行给定研究的活检,以进一步确保一致性,这是有帮助的。其次,在直肠进行活检至关重要,而不是在更近的区域进行活检。鉴于直肠比结肠的近部区域厚,穿孔几率明显降低。应在距离末端 0.5 厘米的护套外部进行标记,内窥镜应只插入到该点,以确保活检钳不会延伸到直肠之外。第三,在活检期间和伤口床的可视化过程中,有适量的窒息是必不可少的。在活检期间,如果结肠太分散,结肠壁将过于紧绷,没有足够的粘膜进行活检。因此,建议操作内窥镜的个体不要将食指压在气阀的开放端,以便以最小的气流进入结肠。但是,在可视化伤口床位以测量伤口大小时,应采用相反的方法。一旦找到伤口,通过将食指牢牢地压在气体阀门的开放端,使其完全窒息结肠,并将其保持在那里,直到获得所需的视图。为了这个目的,殖民墙应该尽可能紧绷。值得注意的是,结肠的充分充斥对于确保伤口床的一致横向视图也很重要。最后,确保镜头和伤口之间保持一致的距离至关重要,以便对同一小鼠的多个结肠镜检查进行精确测量。更近的距离会人为地使伤口床显得比现在大,而更远的距离会使伤口显得更小。因此,使用活检钳作为保持距离的指南是非常有帮助的。
除了在使用此模型时要考虑的主要考虑因素外,还有更多需要注意的小点也会影响有效执行此程序的能力。例如,在进行结肠镜检查时,应确定结肠流明是明确的。虽然粪便材料通过与PBS冲洗清除,但插入内窥镜后,其他材料可以进入直肠。此外,当活检后立即可视化伤口床时,血液会遮盖整个领域。因此,有时有必要从直肠中取出内窥镜,用PBS冲洗结肠以清除亮血,并重新插入内窥镜,以可视化伤口床。在某些情况下,血液和其他发光成分可以粘附在镜头上,遮盖整个领域。在这些情况下,内窥镜应从鼠标中取出,在继续成像之前,应使用刷子擦拭镜头。
在结肠镜引导捏活检模型出现之前,研究人员的研究结肠伤口愈合的模型系统有限。一种方法是评估从接触结肠损伤的化学诱因,如DSS8的恢复。但是,这种方法不允许精确控制诱发的伤害程度,也不允许精确控制整个结肠的伤害位置。此外,这些化学模型对粘膜愈合的精确测量可能具有挑战性。活检模型虽然有用,但也有局限性。例如,操作员仅限于在分离结肠中进行伤害。这种限制可以防止小肠溃疡的研究,这是一个重要的临床问题。此外,虽然这项技术回顾了IBD发病机制的某些方面,但它不能被视为这种疾病的真正模型。在技术考虑方面,在小鼠身上诱导一致的伤口大小、产生可估价的伤口或在伤口愈合过程的后期找到伤口床位可能具有挑战性。在考虑这些点时,建议开始研究额外的小鼠,以考虑不估价样品的丢失。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了克罗恩和结肠炎基金会(D.C.M)和纽约克罗恩基金会(D.C.M和A.J.D.)的资助。作者感谢卡门·费拉拉女士为本文制作视频伴奏的帮助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
isofluorane | Covetrus | 2905 | |
methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
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