Summary
هنا، نقدم وصفا مفصلا للإجراءات التي تحث خزعات قرصة متناظرة موجهة في الفئران وتتبع إغلاق الجروح في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير طرق لإعداد الأنسجة للتحليلات النسيجية والمناعة الكيميائية والجزيئية لسرّد الجرح.
Abstract
فهم الأنسجة والتغيرات الخلوية التي تحدث في الاستجابة للاصابة الحادة وكذلك خلال عملية التئام الجروح هو من الأهمية بمكان عند دراسة أمراض الجهاز الهضمي (GI). نموذج خزعة قرصة القولونية مورين هو أداة مفيدة لتحديد هذه العمليات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة التفاعل بين محتوى الأمعاء (على سبيل المثال، الميكروبات) والقولون. ومع ذلك، يمكن أن يكون تحريض الجروح والقدرة على تتبع إغلاق الجروح مع مرور الوقت بطريقة موثوقة تحديا. وعلاوة على ذلك، يجب أن يتم إعداد الأنسجة والتوجه بها بطريقة موحدة لاستجواب الأمثل التغيرات الهستوولوجي والجزيئية. هنا، نقدم طريقة مفصلة تصف الإصابة الناجمة عن الخزعة ورصد إغلاق الجروح من خلال تكرار تنظير القولون. ويرد وصف النهج الذي يضمن قياسات متسقة وقابلة للتكرار من حجم الجرح، والقدرة على جمع السرير الجرح للتحليلات الجزيئية وكذلك تصور سرير الجرح عند تقسيم الأنسجة. القدرة على تنفيذ هذه التقنيات بنجاح يسمح لدراسات الاستجابة للإصابة الحادة، والتئام الجروح والتفاعلات المستضيفة داخل القولون.
Introduction
الجهاز الهضمي (GI) هو نظام الجهاز المعقد نظرا لوظائفه المتعددة، وأنواع الخلايا المضيفة (مثل الظهارية، المناعي، stromal، الخ) فضلا عن تريليونات من الميكروبات. في ضوء هذا التعقيد، وأمراض الجهاز الهضمي غالبا ما تنطوي على التفاعل بين كل هذه العوامل. على سبيل المثال ، ترتبط أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) بدورات الالتهاب والمغفرة في الجهاز الهضمي ، والتي تنطوي على تنشيط الخلايا الالتهابية ، dysbiosis ، والإصلاح الظهاري1،2،3،4،5،6،7. وجود نظم نموذج مناسب لدراسة مرض التهاب الأمعاء والظروف الالتهابية الأخرى في الجهاز الهضمي أمر بالغ الأهمية لتوضيح التسبب في المرض. توجد عدة نماذج لدراسة التسبب في مرض الالتهابات المتعددة الوبائيات بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا واستخدام المواد الكيميائية مثل كبريتات الصوديوم dextran (DSS) في القوارض8،9،10. وتشمل القيود المفروضة على هذه النماذج عدم القدرة على التحكم بدقة في تحريض الالتهاب، فضلا عن الصعوبات في تقييم التئام الجروح. يمكن أن تكون الطرق البديلة لمحاكاة جوانب من مرض الالتهابات الالتهابية IBD مفيدة لتطوير العلاجات.
توفر خزعات قرصة المنظار الموجهة في الفئران نظامًا نموذجيًا مفيدًا لدراسة التسبب في الاستجابة الالتهابية ، والتئام الجروح ، بالإضافة إلى تفاعلات الميكروب المضيف في القولون. وقد استخدم هذا النهج لأول مرة كأداة تجريبية في عام 2009، والتي أظهرت فائدتها لدراسة الاستجابة الالتهابية الحادة والتئام الجروح في القناة الهضمية11. واستخدمت الدراسات اللاحقة هذه التقنية لتقييم أدوار مسارات الإشارات المختلفة وكذلك ميكروبيوتا الأمعاء ، في التئام الجروح القولونية11،12،13،14،15،16،17،18. في الآونة الأخيرة، استخدمت مجموعتنا هذا النموذج للتحقيق في أهمية sphingosine-1-الفوسفات الإشارات والبكتيريا في الاستجابة الحادة لإصابة القولون19. على الرغم من أنه مفيد ، يمكن أن يكون إجراء خزعات قرصة موجهة بالمنظار في الفئران وتقييم تغييرات الأنسجة اللاحقة أمرًا صعبًا تقنيًا. على سبيل المثال، يمكن أن يحدث ثقب الأمعاء عند تحريض الإصابة وضمان قياسات متسقة من السرير الجرح من خلال تنظير القولون التسلسلي يمكن أن يكون من الصعب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توجيه الأنسجة القولونية بشكل صحيح لتصور سرير الجرح للتحليلات النسيجية أو المناعية الكيميائية يكون تحديا. على الرغم من وجود بعض المعلومات بشأن هذه الأساليب18,20, وصف دقيق خطوة الحكيمة من هذه التقنيات على طول سوف البصرية المساعدات وعود لتعزيز الموثوقية وفائدة أوسع لهذا النموذج. هنا ، نقدم طريقة مفصلة لتنفيذ خزعات قرصة متناظرة موجهة في الفئران ، وتتبع إغلاق الجروح بمرور الوقت وإعداد الأنسجة لتمكين التحليلات الهستويولوجية والجزيئية للسرير الجرحي. يمكن إنشاء طريقة قياسية لتنفيذ هذه التقنيات توسيع استخدام هذا النموذج لدراسة الوسطاء الذين لم يتم التحقيق في السابق التي يحتمل أن تكون مهمة لالتهاب GI وإصلاح الجرح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على جميع الإجراءات المذكورة هنا من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدام طب وايل كورنيل". إلى: "تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموصوفة هنا من قبل لجان رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في طب وايل كورنيل وجامعة ستوني بروك.
1. تنظير القولون والحث على الجروح
- قبل تجميع مكونات المنظار عن طريق إدراج أول 1.9 ملم جامدة المنظار في العجم (الشكل 1A-B). إرفاق مضخة الهواء (لتوفير insufflation القولون) باستخدام الأنابيب المقدمة، إلى صمام الغاز على الجانب الأيسر من غماد بجانب قناة العمل (الشكل 1C).
ملاحظة: على الرغم من أن العدسة الموصوفة هنا هي 0 درجة، يمكن أيضًا استخدام عدسة 30 درجة لهذا الغرض. - تأكد من أن قناة العمل في وضع مفتوح وإدراج 3 Fr خزعة ملقط من خلال قناة العمل وتقدم حتى نهاية اأجد (مع التأكد من أنها لا تبرز من األفد)( الشكل 1C). قم بتوصيل المنظار المجمع بمصدر الضوء وجهاز تصوير الفيديو لكل تعليمات الشركة المصنعة.
- تخدير الماوس مع isoflurane 5٪ مع الأكسجين في غرفة التعريفي. ثم حرك الماوس إلى منصة التدريج بالمنظار التي تحتوي على نظام التدفئة (لمنع انخفاض حرارة الجسم) على الجانب البطني والحفاظ على تحت التخدير باستخدام مخروط الأنف مع 2٪ isoflurane مع الأكسجين. إضافة مرهم الطبيب البيطري إلى العينين لمنع جفاف أثناء التخدير. تأكد من تخدير الماوس بالكامل عن طريق قرص القدم الخلفية بلطف لاختبار رد الفعل.
ملاحظة: يمكن استخدام أي سلالة أو أي جنس من الفئران مع هذه التقنية; ومع ذلك، فمن الأفضل أن الفئران هي على الأقل 8 أسابيع من العمر حتى تكون كبيرة بما يكفي لهذا الإجراء.- إضافة مرهم الطبيب البيطري إلى العينين لمنع جفاف أثناء التخدير.
- تأكد من تخدير الماوس بالكامل عن طريق قرص القدم الخلفية بلطف لاختبار رد الفعل.
- تعبئة حقنة 3 مل مع إبرة فئران مرفقة مع درجة حرارة الغرفة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). أدخل إبرة حوالي 1 سم في فتحة الشرج في الفأرة وخزّس PBS بلطف لمسح المواد البرازية. يجب أن تخرج العديد من الكريات البراز الماوس جنبا إلى جنب مع برنامج تلفزيوني التي تم غرسها.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي غرس حجم مفرط من PBS إلى تكوين الرغوة في التجويف الذي قد يحجب عرض التجويف. - أدخل المنظار المجمع 0.5 سم في فتحة الشرج للماوس. تقدم ملقط خزعة في تجويف المستقيم حتى كامل 'الفكين' (بما في ذلك المفصل) من ملقط هي أبعد من نهاية العغم (كما لوحظ على شاشة الفيديو) (فيديو تكميلية 1). بدوره ملقط 90 درجة بحيث فتح الفكين في اتجاه الشرق والغرب(فيديو تكميلية 1).
- للخزعة، وفتح ملقط وتقدم ما يقرب من 1 سم، وإغلاق ملقط واحد في حركة ناعمة سحب بسرعة مرة أخرى على ملقط في حين تركها مغلقة(فيديو تكميلية 1).
- تجنب االفقطة تماما عند إجراء الخزعة. لذلك، ترك الجانب الأيمن من صمام الغاز مفتوحة خلال هذه الخطوة; على الرغم من أنه ينبغي ملاحظة أنه عند فتح ملقط هناك خطر من إتلاف الغشاء المخاطي عندما القولون في هذا الموقف.
2. تصور وقياس سرير الجرح
- بدء تسجيل الفيديو مباشرة بعد الخزعة عن طريق الضغط على دواسة القدم المرفقة بجهاز تسجيل منظار القولون. insufflate القولون تماما عن طريق الضغط بحزم على السبابة ضد الجانب الأيمن من صمام الغاز لتغطية تماما فتح من أجل إجبار الهواء في المنظار وبالتالي في القولون.
ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف استخدام مضخة الهواء التي يتم التحكم في تدفق الهواء يدويا، يمكن أيضا أن تستخدم مضخة م peristaltic مع إمدادات الهواء الخاضعة للرقابة. - تقدم ملقط مرة أخرى للخروج من العادما، وإلى التجويف المستقيم بينما في موقف مغلق(فيديو تكميلية 1). ضع ملقط ضد الجدار المستقيم مباشرة فوق الجرح حتى يتم محاذاة قاعدة الفكين مع الحافة العليا لحقل المشاهدة (الشكل 2 والفيديو التكميلي 1). استمر في اِلتفرح القولون بالكامل حتى يمكن ملاحظة رؤية واضحة للجرح.
ملاحظة: يجب توخي الحذر لتمديد ملقط بعيدا بما فيه الكفاية للكشف عن فقط فكي من ملقط حتى قاعدة لكل فأر يجري فحصها من أجل ضمان مسافة متسقة بين عدسة المنظار وآفة(الشكل 2، السهم الأبيض). - إذا كان إجراء الخزعات على الفئران متعددة في نفس اليوم، وإزالة الأنسجة الخزعة من الماوس السابق من ملقط (باستخدام فرشاة التنظيف المقدمة) ومسح أسفل عدسة مع 70٪ الإيثانول لتنظيفه قبل إحداث جرح في الماوس المقبل.
ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف إجراء خزعة واحدة لكل فأرة، يمكن إجراء خزعات متعددة على فأرة واحدة بشرط إزالة الأنسجة المأخوذة من الخزعة السابقة من ملقط لضمان إمكانية أخذ خزعة كاملة على الخزعات اللاحقة. - ضع الفأر في قفص فارغ من الفئران الأخرى وعلى رأس منشفة للحفاظ على مجرى الهواء واضحة حتى يتعافى من التخدير بعد الانتهاء من الإجراء. مراقبة الماوس للتأكد من أنه يتعافى من التخدير كما هو مبين من خلال استعادة النشاط.
ملاحظة: هناك حاجة إلى شخصين للحث على الجرح وتصور سرير الجرح في اليوم 0 (أحدهما يشغل المنظار والآخر يعمل على ملقط الخزعة) ولكن هناك حاجة إلى فرد واحد فقط لتصور الجروح في الأيام اللاحقة (كما هو موضح أدناه). - اتبع نفس الإجراء لإعداد الماوس وتنظير القولون لقياسات الجروح اللاحقة (عادةً أيام 2 و4 و6 بعد الخزعة)، كما هو موضح أعلاه في الأقسام 1.1-1.4، باستثناء تحريض الجرح.
- حدد مكان سرير الجرح على شاشة الفيديو في هذه النقاط الزمنية بعد إدخال المنظار ، وتقدم ملقط الخزعة (في الوضع المغلق) إلى أعلى سرير الجرح مباشرة ، وينقم القولون ويبدأ تسجيل الفيديو ، كما هو موضح في القسمين 2.1 و 2.2 (الشكل 2).
ملاحظة: قد يكون من الصعب تحديد مكان سرير الجرح بعد أكثر من 6 أيام بعد الخزعة. - تقدم ملقط في تجويف في هذه الأيام اللاحقة إلى نفس المسافة كما في اليوم 0 لضمان مسافة ثابتة بين عدسة المنظار وآفة عبر أيام. ومن ثم فإن ضمان وجود مسافة ثابتة بين العدسة والأذى يعزز دقة القياسات بمرور الوقت.
ملاحظة: يمكن للفرد إجراء القياسات في هذه الأيام (يتم تشغيل المنظار باليد اليمنى ويتم تقدم ملقط الخزعة باليد اليسرى). - بمجرد الانتهاء من جميع القياسات ، وفتح تسجيلات الفيديو من تنظير القولون التسلسلي في برامج تحرير الفيديو التي تمكن من إنشاء لقطات ثابتة من الفيديو.
- تقدم الفيديو إلى إطار يظهر نقطة في الوقت المناسب عندما يمكن تصور سرير الجرح بسهولة ، والملقط المغلقة فوق سرير الجرح وضد الجدار المستقيم والجدار مشدود. خذ لقطة من هذا الإطار ورمز اسم الملف لضمان أن يتم إجراء قياسات أسرّة الجرح بطريقة عمياء.
- افتح الصور بأسماء ملفات مشفرة في NIH ImageJ لتحديد حجم سرير الجرح. ضمن علامة التبويب تحليل، حدد تعيين القياسات وحدد المربع المنطقة.
- حدد أداة التحديدات الحر من شريط القوائم الرئيسي ورسم محيط حول الجرح (انظر الشكل 2). ضمن علامة التبويب تحليل حدد قياس وقيمة هذا القياس سيتم تلقائياً ملء في إطار النتائج.
- قم بتصدير النتائج إلى جدول بيانات بعد إكمال القياسات لكافة الصور، وذلك بتحديد حفظ باسم ضمن علامة التبويب ملف ضمن نافذة النتائج وتغيير الملحق ليصبح ملف جدول بيانات.
- حساب حجم الجرح في الأيام التالية لتحريض الجرح (أي أيام 2 و 4 و 6) بالنسبة إلى الحجم في اليوم 0 (مباشرة بعد الجرح) في جدول بيانات. تحقيق ذلك عن طريق تقسيم حجم الجرح في كل يوم على حجم الجرح في اليوم 0 وتحويل تلك القيمة إلى نسبة مئوية.
ملاحظة: في ظل الظروف العادية باستخدام هذه الطريقة من عرض القولون، ويلاحظ أكبر إغلاق للجرح بعد أول 2 أيام (~ 75٪ تخفيض في الحجم) مع إغلاق أكثر تدرجا في أيام 4 و 6 (~ 80٪ و ~ 95٪ في حجم التخفيض، على التوالي).
3. جمع السرير الجرح للتحليل الجزيئي
- القتل الرحيم الماوس باستخدام CO2 الاختناق تليها خلع عنق الرحم (أو ما يعادلها من تقنية) في اليوم المحدد التالي للخزعة.
- حصاد منطقة القاصي من القولون عن طريق فتح الجلد وعضلة البطن لفضح تجويف الجسم. وضع مقص مغلق تحت القولون ورفع بلطف لتحريره من الميentery الكامنة ثم قطع القولون في نقطة الوسط وعند فتحة الشرج لإزالته من الماوس.
- تدفق محتوى البراز باستخدام إبرة الجرذان gavage تعلق على حقنة 20 مل مليئة الجليد الباردة 1X PBS ثم وضع أسفل القولون على ورقة التصفية.
- قطع فتح طولي القولون على ورقة التصفية ضمان أن الجانب mesenteric هو الوجه إلى أسفل ضد ورقة التصفية. تطبيق 0.2٪ الميثيلين الأزرق إلى الغشاء المخاطي باستخدام أنبوب الضغط بينما الأنسجة لا يزال على ورقة التصفية ثم استنزاف قبالة الأزرق الميثيلين الزائدة. عرض القولون تحت المجهر تشريح وتحديد موقع السرير الجرح (الشكل 3A).
- باستخدام مقص القزحية الصغيرة 4 بوصة، وقطع حول حافة سرير الجرح (الشكل 3A، دائرة متقطعة) مع الحرص على عدم قطع في طبقة العضلات (ما لم يتم طلب العضلات) ونقل الجرح تشريح السرير إلى أنبوب باستخدام ملاقط نقطة غرامة لsa-تجميد أو طريقة التخزين المطلوب.
ملاحظة: كمية الأنسجة التي تم جمعها بهذه الطريقة كافية لاستخراج الحمض النووي الريبي لتحليل RNA-seq أو ما يعادلها من التحليل.
4. إعداد الأنسجة للتحليل النسيجي
- القتل الرحيم الماوس وحصاد القولون كما هو موضح في الخطوة 3.1-3.2.
- قطع فتح طولي القولون على ورقة التصفية ضمان أن الجانب mesenteric هو الوجه إلى أسفل ضد ورقة التصفية. تطبيق بلطف 4٪ شبهformaldehyde (أو المثبت من اختيار) باستخدام أنبوب الضغط وتغطية الأنسجة مع parafilm. اتركي الشقة في حاوية مغلقة لمدة 4-6 ساعات.
- نقل الأنسجة إلى 70٪ الإيثانول للتخزين. عندما تكون على استعداد لمعالجة الأنسجة، وإزالة parafilm وتطبيق 0.2٪ الميثيلين الأزرق إلى الغشاء المخاطي باستخدام أنبوب ضغط بينما الأنسجة لا يزال على ورقة التصفية. ثم استنزاف قبالة الأزرق الميثيلين الزائدة.
- عرض القولون تحت المجهر تشريح وتحديد موقع السرير الجرح (الشكل 3A). باستخدام مشرط مع شفرة #10 ، وقطع مباشرة من خلال مركز السرير الجرح ومواصلة قطع من خلال ما تبقى من القولون في خط مستقيم ، بحيث القولون قد قطعت في النصف ، طول الحكمة (الشكل 3A، الخط الأسود).
- معالجة القولون ثم التضمين البارافين (إما واحد أو كلا الجانبين التي تبقى بعد قطع) بحيث الجانب الذي تم قطعه من قبل مشرط (الجانب الذي كان مركز سرير الجرح قبل bisection) هو الوجه إلى أسفل في البارافين. انتقل إلى قطع المقاطع وتلطيخ البقع المطلوبة أو صانع (ق).
- إذا كانت مطلوبة cryosections لتلوين معين، حصاد القولون كما هو موضح في الخطوة 3.1 وفتح طوليا على ورقة التصفية، وضمان أن الجانب mesenteric هو الوجه إلى أسفل ضد ورقة التصفية.
- اقطع سرير الجرح داخل القولون الطازج كما هو موضح في الخطوة 4.5 وتضمين القولون (إما أحد الجانبين أو كلا الجانبين التي تبقى بعد القطع) بحيث يتم توجيه الجانب الذي تم قطعه بواسطة المشرط لأسفل في قالب قاعدة نصف مملوءة بتجميد الأنسجة المتوسطة.
- تأمين الأنسجة في مكان مع ملاقط غرامة ووضع القالب قاعدة على لوحة معدنية على رأس الجليد الجاف لتصلب المتوسطة تجميد. مرة واحدة يتم تجميد الجزء السفلي من المتوسطة (ويتم عقد الأنسجة في مكان)، والافراج عن الأنسجة وملء حجم المتبقي من القالب قاعدة مع تجميد المتوسطة ووضع مرة أخرى على الجليد الجاف.
- بعد تجميد كامل حجم تجميد المتوسطة، ونقل إلى -80 درجة مئوية الفريزر حتى قسم.
- بالنسبة للبارافين أو المقاطع المجمدة، قطع وتلطيخ أقسام إضافية من قبل H & E لضمان أن تم التقاط سرير الجرح على القسم قبل الشروع في تلطيخ الدراسة الخاصة. ويبين الشكل 3B مثالاً على مقطع يمكن فيه ملاحظة سرير الجرح بوضوح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر العناصر الصغيرة (العدسة، الوحد الخزعة) اللازمة لتنفيذ الخزعات في الشكل 1 مع مؤشرات التجميع السليم لهذه المكونات. ويبين الشكل 2 الصور التمثيلية للمناظر المقبولة لسرّد الجرح من أجل تحديد حجم سرير الجرح ومعدل إغلاق الجرح بدقة. مثال على عرض v vivo من سرير الجرح في الشكل 3A بما في ذلك مؤشرات محيط سرير الجرح (مشيرا إلى المنطقة للمكوس للتحليل الجزيئي) وحيث لقطع الأنسجة من أجل تمكين التصور من السرير الجرح عند القطاعات. ويبين الشكل 3B صورة تمثيلية لقسم H & E الملطخة فيه يمكن ملاحظة سرير الجرح بوضوح. فيديو إضافي 1 يوفر طريقة عرض لإجراء الخزعة من داخل القولون الماوس.
الشكل 1: البنود اللازمة لإجراء خزعات. (أ) صورة للعدسة (أ) ، غماد (ب) ، وخزعة ملقط (ج). (ب) إدخال العدسة في الغماد. (C) إدخال من ملقط من خلال قناة العمل من الغمد (السهم الصلبة). السهم متقطعة يشير إلى الموقع الصحيح لمرفق من مضخة الهواء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور القولون من سرير الجرح بعد الخزعة. تم إنشاء الصور الثابتة من تسجيلات الفيديو من تنظير القولون مباشرة بعد خزعة (يوم 0) و 2، 4، و 6 أيام في وقت لاحق. الخطوط الزرقاء تشير إلى حواف أسرة الجرح في كل نقطة زمنية. يشير السهم إلى طول التمديد الصحيح للملطوبين في التجويف لضمان المسافة الصحيحة من العدسة إلى جدار المستقيم ، من أجل ضمان قياسات متسقة من سرير الجرح مع مرور الوقت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: السابقين فيفو وصور مقطعة من سرير الجرح. (أ)تم حصاد القولون من فأرة بعد يومين من الخزعة، ملطخة 0.2٪ الميثيلين الأزرق وصور تحت مجهر تشريح. تشير الدائرة المتقطعة إلى حواف سرير الجرح. يشير الخط الأسود إلى الموقع الصحيح لتقسم سرير/القولون قبل تضمينه للقطع. (B) صورة تمثيلية لقسم H&E الملطخة من سرير الجرح. وتشير العلامات النجمية إلى أن سرير الجرح والسهام تشير إلى cry سليمة متاخمة لسرّد الجرح تشير إلى حدود المنطقة المصابة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو تكميلي 1: إجراء الخزعة وتصوير سرير الجرح. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ضمان خزعات متسقة ودقيقة وكذلك قياسات حجم الجرح هي ذات أهمية قصوى عند محاولة تقييم فعال لمعدل إغلاق الجرح في هذا النموذج. ولذلك، ينبغي اتخاذ عدة تدابير للتأكد من أن الإجراءات يجري تنفيذها على النحو الصحيح. أولاً، يجب ألا يكون عمق الخزعة ضحلاً أو عميقاً جداً. إذا كانت ضحلة جدا، لن يكون هناك نافذة كافية لتقييم إغلاق الجرح. يوضح الشكل 2 عمق خزعة وحجم مثالي في اليوم 0. لاحظ التمييز الواضح بين الغشاء المخاطي حول سرير الجرح والأنسجة التي تبقى تحت سرير الجرح (الشكل 2). إذا كانت الخزعة عميقة جدا، يمكن أن يحدث ثقب مما يؤدي إلى الماوس لا تقدر بثمن. على insufflation بعد خزعة في اليوم 0، إذا بطن الماوس يصبح مُزدّد بشدة، وقد حدث ثقب ولا يمكن استخدام الماوس للتقييم وينبغي القتل الرحيم. ومن المفيد أن يقوم نفس الشخص بإجراء الخزعات لإجراء دراسة معينة لضمان الاتساق. ثانياً، من المهم إجراء الخزعة في المستقيم وليس في منطقة أقرب. وبالنظر إلى أن المستقيم هو أكثر سمكا من المناطق القريبة أكثر من القولون، وهناك فرصة انخفاض ملحوظ من ثقب. يجب أن تكون علامة على السطح الخارجي للغمد 0.5 سم من النهاية وينبغي إدخال المنظار فقط حتى تلك النقطة للتأكد من أن ملقط خزعة لن تمتد إلى ما وراء المستقيم. ثالثاً، من الضروري أن يكون هناك الكمية المناسبة من الرضاعة أثناء الخزعة وتصوّر سرير الجرح. خلال الخزعة، إذا كان القولون مُتَزَدَّدًا جدًا، فسيكون جدار القولون مشدودًا جدًا ولن يكون هناك مقدار كافٍ من الغشاء المخاطي للخزعة. لذلك، يقترح أن الفرد تشغيل المنظار لا تضغط على السبابة ضد الطرف المفتوح لصمام الغاز، من أجل السماح لأدنى تدفق الهواء في القولون. ومع ذلك، ينبغي استخدام النهج المعاكس عند تصور أسرة الجرح لأغراض قياس حجم الجرح. مرة واحدة يتم تحديد موقع الجرح، insufflate القولون تماما عن طريق الضغط على السبابة بحزم ضد الطرف المفتوح لصمام الغاز وعقد هناك حتى يتم الحصول على وجهة النظر المطلوب. يجب أن يكون جدار القولون مشدود قدر الإمكان لهذا الغرض. ملاحظة، كامل insufflation من القولون مهم أيضا لضمان وجهات النظر الجانبي متسقة من السرير الجرح. وأخيراً، من المهم ضمان الحفاظ على مسافة ثابتة بين العدسة والجرح لتمكين إجراء قياسات دقيقة عبر تنظير القولون المتعدد في نفس الفئران. وهناك مسافة أقرب بشكل مصطنع جعل السرير الجرح تظهر أكبر مما هي عليه، ومسافة أبعد سيجعلها تبدو أصغر. ولذلك، فإن استخدام ملقط الخزعة كدليل للحفاظ على المسافة مفيد جدا.
بالإضافة إلى الاعتبارات الرئيسية التي يجب مراعاتها عند استخدام هذا النموذج، هناك نقاط ثانوية أكثر يجب أن تكون على علم بها ويمكن أن تؤثر أيضًا على القدرة على تنفيذ هذا الإجراء بشكل فعال. على سبيل المثال، ينبغي التأكد من أن تجويف القولون واضح عند إجراء تنظير القولون. على الرغم من أن يتم مسح المواد البرازية عن طريق التنظيف مع برنامج تلفزيوني، يمكن أن تنحدر مواد إضافية في المستقيم بعد إدراج المنظار. وعلاوة على ذلك، عند تصور سرير الجرح مباشرة بعد الخزعة، يمكن أن يحجب الدم الحقل. لذلك ، من الضروري في بعض الأحيان إزالة المنظار من المستقيم ، وطرد القولون مع PBS لمسح الدم اللمعان وإعادة إدخال المنظار لتصور سرير الجرح. في بعض الحالات، يمكن أن يتم الالتزام بالدم والمحتوى الآخر من اللمعان بالعدسة، مما يحجب الحقل. في هذه الحالات، يجب إزالة المنظار من الماوس وينبغي مسح العدسة باستخدام الفرشاة قبل مواصلة التصوير.
قبل ظهور نموذج خزعة قرصة مُوجّه بالمنظار، كان لدى الباحثين أنظمة نموذج محدودة للتحقيق في التئام الجروح القولونية. وكان أحد النهج لتقييم التعافي من التعرض للحث الكيميائية من إصابة القولون مثل DSS8. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يسمح بالتحكم الدقيق في مدى الإصابة التي يتم الحث عليها ولا مكان الإصابة في جميع أنحاء القولون. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون القياسات الدقيقة للشفاء المخاطي في الوقت الحقيقي تحديا مع هذه النماذج الكيميائية. على الرغم من أن مفيدة, نموذج خزعة أيضا قيود. على سبيل المثال، تقتصر المشغلين على تنفيذ الجرح في القولون القاصي. يمنع هذا القيد دراسات تقرح الأمعاء الصغيرة ، وهي قضية سريرية مهمة. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن هذه التقنية تتلخص في بعض جوانب مرض الإمراض IBD، إلا أنه لا يمكن اعتباره نموذجًا حقيقيًا لهذا المرض. من الاعتبار التقني ، يمكن أن يكون من الصعب الحث على أحجام الجروح متسقة عبر الفئران ، وتوليد الجروح لا تقدر بثمن ، أو تحديد مكان أسرة الجرح في المراحل اللاحقة من عملية التئام الجروح. عند أخذ هذه النقاط في الاعتبار ، من المستحسن أن تبدأ الدراسات مع الفئران إضافية لحساب فقدان العينات التي لا تقدر بثمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من مؤسسة كرون والتهاب القولون (D.C.M) ومؤسسة نيويورك كرون (D.C.M و A.J.D.). يشكر المؤلفون السيدة كارمن فيرارا على مساعدتها في إنشاء مرافقة الفيديو لهذه المقالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
