Summary
여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.
Abstract
골관절염 (OA)은 통증과 신체적 한계로 고통받는 환자에게 영향을 미치는 가장 널리 퍼진 근골격계 질환 중 하나입니다. 최근 증거는 잠재적으로 OA의 병기와 관련된 T 세포와 단낭세포 / 대식세포와 함께 질병의 잠재적 인 염증 성분을 나타냅니다. 추가 연구는 Th1, Th2, Th17 및 T 조절 림프구, M1, M2 및 synovium 조직-상주 대식세포와 같은 염증성 세포 계보의 하위 집합에 중요한 역할을 가정했습니다. 그러나, 국부적 및 전신 염증성 세포 반응과 관절의 구조적 변화 사이의 상호 작용은 알려지지 않았다. T 세포와 단핵구/대식세포가 OA쪽으로 어떻게 기여하는지 완전히 이해하려면, 이러한 세포와 그들의 하위 세트를 동시 적으로 규명할 수 있어야 하며, 이차 림프관 및 체계적으로(비장 및 골수). 요즘, 상이한 염증세포 서브세트는 다색 유동 세포측정법을 이러한 세포 과정을 조사하는 강력한 기술을 만드는 세포 표면 마커의 조합에 의해 규명될 수 있다. 이 프로토콜에서, 우리는 단일 세포 현탁액의 생성뿐만 아니라, 교반 조직 및 이차 림프기관의 수확에 관한 상세한 단계를 설명합니다. 더욱이, 우리는 단핵구/대식세포 및 그들의 서브세트를 확인하기 위하여 세포외 염색 분석둘 다 및 murine 비장, 골수, 림프절 및 교유 조직 내의 T 세포 및 그들의 하위 세트를 확인하기 위하여 추가 세포 내 염색 분석. 이 프로토콜의 각 단계는 최적화되고 시험되어 다른 외과 및 비 수술 OA 마우스 모델에 사용할 수있는 매우 재현 가능한 분석이 발생했습니다.
Introduction
골관절염(OA)은 관절1과관련된 모든 조직의 다양한 병리를 포함하는 쇠약하고 고통스러운 질환이다. 전 세계인구의약 3.8%에 영향을 미치는 OA는 가장 널리 퍼진 근골격계 질환 중 하나이며 2020년까지 전 세계적으로4번째로 주요 장애 원인이 될것입니다 3. 외상 후 OA는 관절 부상 후 발생하며 모든 OA의 12 % 이상및 무릎4,,5와같은 취약한 관절에서 OA의 최대 25 %를 차지합니다. 더욱이, 관절 상해는 OA의 일생 리스크를 5배 이상6배이상 증가시킵니다. 분명히 유사한 불안정을 가진 모든 부상은 OA를 개발하기 위해 계속됩니다, 따라서 장기 OA 위험을 구동 요인을 정의하는 것은 도전 남아있다. OA1에걸리기 쉬운 부상 별 병리학, 원인 및 메커니즘을 조사하고 더 잘 정의하기 위해 외상 후 OA를 예방 및 / 또는 치료하는 효과적인 치료법을 개발하기 위해 중요합니다.
OA와 그 정의 연골 파괴는 이전에 기계적 스트레스에 전적으로 기인하고, 따라서, OA는 비 염증성 질환 으로 간주되었다2. 그러나, 최근 연구에 따르면 OA 환자의 혈연 조직 내 의 염증성 침투및 염증성 세포의 증가는 건강한 대조군2에비해, OA의 잠재적 원동력으로서 염증 성분에 빛을 흘리는 것으로 나타났다. 추가 연구는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 프로파일뿐만 아니라 타고난 면역 계통의 단핵구/대식세포 모두에서 이상이 OA2,,7의발병에 기여할 수 있음을 나타냈다. 이러한 이상에 대한 상세한 조사는 Th18,Th29,Th178 및 T 규제(Treg) 인구10,11과같은 다양한 T 세포 서브셋2에대한 관련 역할을 밝혀냈습니다., 이 강력한 증거에도 불구하고, T 세포 반응의 변경과 OA의 개발 및 진행 사이의 인과 관계는 여전히 알 수없는2.
OA에서 역할을 갖는 특정 T 세포 이외에, 최근 연구는 분화 / 활성화 된 대식세포가 OA12의병기와 관련 될 수 있음을 시사한다. 특히, 혈액 단세포에서 유래한 대식세포는 혈중 에서 축적되어 OA 개발 중에 고전적으로 활성화된 대식세포(M1) 또는 대안적으로 활성화된 대식세포(M2)로 편광하여 단세포 유래 대식세포와 OA13사이의 상관관계를 암시한다. 대조적으로, 대식세포의 특정 하위 집합은 개발 도중 일찌기 기관을 채우고 단색 세포 독립적인 물질14에서그들의 수를 자립합니다. 최근에는 이러한 연동 조직-상주 대식세포(STRM)14에대해 단단한 접합 장벽에 의해 중재된 관절 보호 기능이 나타났다. 이 사실 인정은 특히 대식세포 서브셋에 있는 이상이 OA의 발달 도중 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 표시합니다. 그러나, 이 선동적인 세포 반응 및 외상 의 후속 합동에 있는 구조적인 변화 사이 상호 작용은 불명합니다.
역사적으로, 용액 조직에서 면역 세포의 분석은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의한 면역조직화학(IHC) 또는 mRNA 발현에 제한되었다15,,16. 그러나, IHC와 RT-PCR 둘 다 다중 다른 세포 모형 및 그들의 서브세트를 동시에 식별하는 기능이 부족하여, 따라서, 이 방법의 적용성을 제한합니다. 더욱이, IHC는 조직의 작은 견본의 분석에 국한되고 초점 선동적인 세포 축적을 놓칠 수 있습니다. 지난 몇 년 동안, 다양한 세포 유형에 대한 표면 마커의 무수한 개발되었습니다, 면역 세포의 하위 세트는 이제 안정적으로 이러한 마커의 고유 조합에 의해 식별 될 수있다. 꾸준한 기술적 진보로 인해, 흐름 세포계는 이제 동시에 대형 다중 색 항체 패널의 분석을 가능하게 하는 다양한 다른 형광을 식별할 수 있게 되었다.
유동 세포측정은 조사자에게 단일 세포 수준에서 수많은 면역 세포와 그들의 하위 집합을 동시 식별 및 정량화할 수 있는 강력한 기술을 제공합니다. 우리는 단핵구/대식세포 및 그들의 하위 세트를 확인하기 위하여 세포외 염색 분석물 및 murine 비장, 골수, 림프절 및 교유 조직 내의 T 세포 및 그들의 부세트를 확인하기 위하여 추가/세포 내 염색 분석 둘 다를 개발하고 최적화했습니다. 이 프로토콜의 각 단계는 최적화및 다른 외과 적 OA 마우스 모델(17)에사용할 수있는 매우 재현 가능한 분석의 결과로 테스트되었다.
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Protocol
노던 시드니 지역 보건 지구 동물 윤리위원회는이 프로토콜에 언급 된 모든 절차를 승인했습니다. 마우스는 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 따라 보관 및 관리 (호주의 국립 건강 및 의학 연구 위원회 개정 2010). 모든 실험에 대해 10-12주 된 남성 C57BL/6 마우스가 활용되었다.
참고: 외상 후 OA를 유도하기 위해, 오른쪽 위관절에서 내측 반월상 연골(DMM)의 외과적 불안정이 수행되었다. 이 동물 모델에 대한 자세한 정보는 Glasson 외18에의해 출판되었다. 요컨대, 전신 마취는 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 유도되고 그 후 코 콘을 사용하여 유지된다. 수술용 다리는 면도칼로 면도하고 수술 부위는 오염을 최소화하기 위해 에탄올로 세척및 스왑됩니다. 동물은 수술 현미경으로 이동하고 멸균 수건에 배치하고 수술 부위를 격리하고 오염을 최소화하기 위해 멸균 종이 드레이프로 드레이프 다리. 현미경을 사용하여 0.5cm 내측 파라 슬개골 관절 절제술이 만들어지고, 슬개골은 측면으로 호화되고, 적외선 슬개골 지방 패드는 내측 반미코-티비알 인대를 노출시키기 위해 상승하여 해부된 집게로 방사됩니다. 관절은 어떤 혈액을 제거하기 위해 멸균 식염수로 플러시되고 상처는 관절 캡슐, 피하 조직 (봉합사 재료 사용) 및 피부 (수술 조직 접착제 사용)의 세 가지 층으로 닫힙니다. 그러나 이 프로토콜에 설명된 메서드는 OA를 유도하는 다른 모델 및 방법에 적용할 수 있습니다. OA는 동물의 양쪽에서 유도될 수 있고, 조직을 수확할 때, 심절자(draining) 림프절을 수확하는 것이 중요하다.
1. 비장, 금단골 골수, 무분별한 림프절의 격리로 막대한 및 용액 조직을 배출합니다.
- 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사. 해부 현미경 의 밑에 supine 위치에 마우스를 놓고 70% 에탄올로 가슴, 복부 및 다리를 닦습니다. 복강을 그대로 두는 직선 가위를 사용하여 복부의 길이에 대해 중진에 피부를 조심스럽게 엽니다.
- 동물의 오른쪽 피부를 기본 근육에서 멀리 부드럽게 당겨 피부에 부착 된 피하 지방 조직을 남깁니다. 일반적으로 부드러운 견인만으로는 피부와 근간을 근육에서 분리합니다. 조직을 최소한으로 분리하고 림프절에 해를 끼칠 가능성을 줄이는 데 필요한 장력을 유지하기 위해 산발적 부착물을 미세 한 가위로 잘라야합니다. 두 개의 곡선 된 미세 포셉을 사용하여 허벅지에있는 지방 조직을 부드럽게 놀리면 3 개의 혈관의 교차를 식별합니다. 잉구인 림프절은 횡단에 위치하고 있으며, 그 노보이드 모양과 약간 어두운 색상으로 식별 할 수 있습니다.
- 미세 해부 포셉을 사용하여 잉구림프절을 제거합니다. 캡슐을 파열하지 않도록 주의하십시오. 집게로 림프절 표면에 남은 지방을 제거합니다.
- 복강을 열고 비장을 식별합니다. 미세 한 가위로 비장을 잘라. 오염위험을 최소화하기 위해 장들을 부드럽게 옆으로 당기면 대자와 그 분화가 해를 끼치지 않도록 주의하십시오. iliac 림프절은 복부 대동맥의 말단 세그먼트와 일반적인 일강 동맥의 기원에 위치한다. 오른쪽 장강 림프절을 제거하고 1.3에 설명된 대로 진행합니다.
- 두 뒷다리의 피부를 부드럽게 제거합니다. 블레이드와 미세 가위를 사용하여 근육 조직에서 청소하여 왼쪽 대퇴골을 해부합니다. 조심스럽게 전체 뼈를 그대로 두고 억지와 엉덩이 관절을 분리하고 대퇴골을 제거합니다.
- 오른쪽 의 슬개골 힘줄을 식별 관절을 억제한 다음, 슬개골에 사두근 근면의 약 5mm가 노출 될 때까지 미세 가위를 사용하여 이에 인접한 근육 조직 근위를 제거합니다. 그 후, 슬개골에 약 3-4mm 근동을 잘라 손잡이를 형성하고 미세 포셉을 사용하여 부드럽게 관절에서 멀리 당겨. 이것은 대퇴골에 대한 조인트 캡슐 부착물의 가장자리를 가시화시키고, 메스 블레이드를 사용하여 양면에 조인트 캡슐의 가장자리를 따라 조심스럽게 절단하여 경골을 향해 가는 대퇴골에서 시작하여 수확되는 용액 막의 양을 최대화합니다. 절단하는 동안 그것은 사두근 힘줄에 부드러운 견인을 유지하고 경골 조직 블록만 경골에 부착 될 때 일시 중지하는 것이 중요하다. 이 단계에서 인과 지방 패드는 이제 슬개골에 명확하게 볼 수 있으며 블레이드를 사용하여 반미시의 관절 및 전방 측면에서 부드럽게 분리 될 수 있습니다. 그 후, 조인트 캡슐(tibial 부분)의 나머지 부분을 따라 잘라 서 조개 조직 블록을 제거한다.
참고: 이 단계는 신뢰할 수 있는 결과를 허용하기 위해 매우 정확하게 수행해야 합니다. 해부를 완료 한 후, "모조 조직 블록"은 슬개골, 슬개골 힘줄, 인프라 슬개골 지방 패드, 수프라 및 인프라 라이닝 리스 synovial 안대기 및 측부 인대에 연결된 관절 캡슐 전방으로 이루어져야합니다. 0.9% 식염수 용액을 사용하여 해부 중에 모든 조직을 촉촉하게 유지하십시오.
참고: 각 용액 조직 블록 샘플을 RPMI 1640 배지 1.5 ml를 함유한 라벨이 부착된 24웰 플레이트의 별도의 우물에 놓습니다. 일강과 잉구림프절을 하나의 우물로 결합하고 두 마리의 마우스에서 조직을 풀수 있습니다.
2. 각 조직에서 단세포 현탁액의 생성
참고: 2마리의 마우스로부터의 유량 분석을 위한 충분한 세포 수를 보장하기 위해서는 양생조직을 풀로 만들어야 한다. 현재 프로토콜에서, 비유를 유지하기 위해 동일한 두 마우스에서 모든 조직을 풀. 더욱이, 일리악과 잉구인 림프절은 각 동물에 대해 결합되어 각 샘플에 대해 총 4개의 림프절을 생성하였다. 일반적으로, 비장, 골수 및 한 동물의 골수 및 림프절의 세포 수는 유동 분석을 수행하기에 충분하며 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 그러나 동물 용해 시간이 하나만 으로 티슈를 사용할 때는 조정해야 할 수도 있습니다.
- 비장
- 풀이 된 두 개의 비장두 개를 70 μm 셀 스트레이너 위에 15mL 튜브 위에 놓습니다. 멸균 3 mL 주사기 플런저를 사용하여 메쉬 필터를 통해 비장을 부드럽게 마퇴화합니다. 10% FBS로 보충된 총 6mL의 RPMI 1640 배지로 스트레이너를 자주 플러시합니다.
- 세포(500 x g,5분, RT)를 회전시키고 적혈구(RBC) 용해 완충제의 5mL에서 펠릿을 재연한다. RT에서 5 분 동안 배양하고 PBS의 10 mL로 용해 버퍼를 희석하여 반응을 중지합니다. 세포(500 x g,5분, RT)를 회전시키고 더 이상 RBC가 펠릿에 없을 때까지 이 단계를 반복합니다.
참고: 30 μm 세포 스트레이너를 사용하여 용액 세포를 제거하기 위해 용액의 두 라운드 사이에 새로운 15mL 튜브로 서스펜션을 다시 필터링합니다. - 용해가 완료된 후 셀(500 x g,5분, RT)을 회전시키고, 슈퍼네티트를 버리고 PBS 1mL에서 펠릿을 다시 중단합니다. Trypan 블루 제외를 사용하여 혈종계의 라이브 셀 수를 계산합니다.
- 림프절
- 풀이 들어있는 4개의 림프절을 70 μm 셀 스트레이너위에 15mL 튜브 위에 놓습니다. 멸균 3 mL 주사기 플런저로 눌러 림프절을 단일 셀 서스펜션으로 부드럽게 애타게합니다. 10%의 FBS로 총 6mL의 RPMI로 스트레이너를 자주 플러시합니다.
- 셀(500 x g,5분, RT)을 회전시키고, 슈퍼네탄을 버리고 PBS의 500 μL에서 펠릿을 재연합니다. 30 μm 세포 스트레이너를 사용하여 현탁액을 새로운 15mL 튜브로 재필터링하여 응고 된 세포를 제거합니다. Trypan 블루 제외를 사용하여 혈종계의 라이브 셀 수를 계산합니다.
- 골수
- 조심스럽게 그것을 골절하지 않고 조직 엄지 손가락 집게를 사용하여 그대로 대퇴골을 잡습니다. 뼈의 홍조를 용이하게하기 위해 날카로운 가위로 근위 대퇴골의 끝을 잘라. 대퇴골을 돌리고 대퇴골의 인터콘딜라 노치 한가운데에 23 G 바늘을 놓습니다. 부드러운 압력을 가하는 동안 뼈 구멍을 입력 하는 인터콘딜러 노치에 구멍을 드릴 엄지와 검지 손가락 사이 바늘을 회전.
참고: 때로는 뼈의 입자가 구멍을 뚫은 후 바늘을 방해할 수 있으며, 플러싱 전에 바늘의 변화를 플러시하는 동안 불필요한 고압을 피할 수 있습니다. - 15mL 튜브에 배치되는 70 μm 세포 스트레이너에 23 G 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 RPMI6mL로 뼈를 플러시합니다( 또는 플러시가 흰색으로 변할 때까지). 3mL 주사기의 플런저로 셀 스트레이너를 통해 골수를 부드럽게 누르고 스트레이너를 RPMI3mL로 헹구십시오.
참고: 모든 골수가 완전히 플러시되면 골격이 흰색으로 표시됩니다. - 세포(500 x g,5분, RT)를 회전시키고 RBC 용해 버퍼의 5mL에서 펠릿을 다시 놓습니다. RT에서 5 분 동안 배양하고 PBS의 10 mL로 용해 버퍼를 희석하여 반응을 중지합니다.
- 세포(500 x g,5분, RT)를 회전시키고, 슈퍼네티트를 버리고 PBS 1mL에서 펠릿을 재연합니다. 30 μm 세포 스트레이너를 사용하여 현탁액을 새로운 15mL 튜브로 재필터링하여 응고 된 세포를 제거합니다. Trypan 블루 제외를 사용하여 혈종계의 라이브 셀 수를 계산합니다.
- 조심스럽게 그것을 골절하지 않고 조직 엄지 손가락 집게를 사용하여 그대로 대퇴골을 잡습니다. 뼈의 홍조를 용이하게하기 위해 날카로운 가위로 근위 대퇴골의 끝을 잘라. 대퇴골을 돌리고 대퇴골의 인터콘딜라 노치 한가운데에 23 G 바늘을 놓습니다. 부드러운 압력을 가하는 동안 뼈 구멍을 입력 하는 인터콘딜러 노치에 구멍을 드릴 엄지와 검지 손가락 사이 바늘을 회전.
- 끈적 끈적한 조직
- 두 개의 용액 조직 블록은 미세한 수술 가위와 작은 조각으로 블록을 주사위. 배지가 있는 샘플을 15mL 튜브로 옮킨다. 기존 우물을 RPMI의 추가 0.5 mL로 헹구어 남은 세포와 용액 조직을 얻고, 팔콘 튜브 (최종 부피 2 mL)로 옮직합니다.
팁: 이 단계에서 직경이 넓어지는 팁의 전달 파이펫과 절단을 사용합니다. - 제조 업체 지침에 따라 효소와 알리 쿼트 재구성 (예를 들어, Liberase). 1 단위/mL의 최종 농도를 초래하기에 충분한 효소를 추가하십시오 (샘플 당 총 2 단위). MACS 회전기사용으로 2시간 동안 37°C에서 소화합니다.
- 새로운 15mL 튜브에 70 μm 세포 여과기를 통해 10% FBS와 필터 셀 서스펜션으로 RPMI 8mL을 추가하여 소화를 중지하십시오. 기존 15mL 튜브를 RPMI의 또 다른 5mL로 헹구고 10% FCS 배지와 동일한 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 튜브(15mL 최종 부피)로 헹구는다.
- 셀(500 x g,10분, RT)을 회전시키고, 슈퍼네탄을 버리고 PBS의 500 μL로 펠릿을 재연합니다. Trypan 블루 제외를 사용하여 혈종계의 라이브 셀 수를 계산합니다.
- 두 개의 용액 조직 블록은 미세한 수술 가위와 작은 조각으로 블록을 주사위. 배지가 있는 샘플을 15mL 튜브로 옮킨다. 기존 우물을 RPMI의 추가 0.5 mL로 헹구어 남은 세포와 용액 조직을 얻고, 팔콘 튜브 (최종 부피 2 mL)로 옮직합니다.
3. 셀 할당
- 조직 유형, 동물 ID 및 지정된 항체 패널로 2개의 96웰 플레이트(U-bottom shape)를 라벨로 지정합니다. 이 프로토콜에는 총 2개의 항체 패널이 사용됩니다: Monocyte 서브셋 패널(세포 외 염색) 및 T 세포 하위 집합 패널(엑스트라 및 세포 내 염색).
- 각각의 단일 셀 현탁액을 사용하여 잘 당 5 x 105 세포를 제공합니다.
참고: 실험을 설정할 때, 그룹 및 조직 유형당 예상되는 세포의 절대 수를 평가합니다(치료된 동물은 대조동물보다 조직에서 세포 수가 더 높습니다). 단일 세포 현탁액을 생성하는 마지막 단계에서 세포 펠릿을 다시 일시 중지할 때, 200 μL 당 5 x 105의 농도로 끝나기 위해 적절한 양의 PBS를 선택하십시오. 여기서 사용되는 96웰 플레이트는 최대 300 μL을 보유할 수 있으며 일반적으로 200 μL은 유출로 인한 교차 오염 위험을 최소화하는 데 이상적입니다. - 각 패널 및 조직 유형에 대해, 명확하게 표시된 우물에서 얼룩없는 컨트롤로 적어도 5 x 105 세포를 배포합니다.
4. 모노사이클 서브셋 패널
- 생존성 염색 수행: 플레이트 스피너를 사용하여 스핀 셀(500 x g,5분, 4°C)을 회전하고 1x PBS의 200 μL로 한 번 세척합니다. 1x PBS에서 1:50희석된 세포불구형 아민 반응성 염료(생존성 얼룩)의 스톡 용액을 준비한다. 그 후, 이 스톡 용액의 100 μL로 셀 펠릿을 다시 일시 중단하여 우물당 2 μL의 생존성 얼룩을 절대로 부피가 생성합니다. 빛으로부터 보호된 4°C에서 15분 동안 배양하십시오.
참고: 필요한 생존성 얼룩의 최적 양은 용량 적정 곡선을 수행하여 결정되어야 합니다. 또한, 희석된 생존성 스테인 스톡 용액은 하루 만에 사용되어야 하며 저장하지 않아야 합니다. 생존 가능성 얼룩을 재구성, 희석 및 저장하는 방법에 대한 자세한 내용은 제조업체의 지침을 참조하십시오. - 인큐베이션 동안, 적절한 양의 FACS 버퍼(Ca2+ 및 Mg+ 무료 PBS)로 항체의 칵테일을 준비하여 0.1%BSA 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유한다. FACS 버퍼, 원심분리기(500xg, 5분, 4°C)의 200 μL로 세포를 두 번 세척하고 항체 혼합물의 100 μL 또는 적절한 대조 혼합물로 각 펠릿을 재연한다. 빛으로부터 보호된 4°C에서 30분 동안 배양하십시오.
참고: 아지드 나트륨은 세포에 독성이 있다는 점에 유의하십시오. 현재 프로토콜에서 유동 완충액에서 아지드 나트륨의 농도는 매우 낮습니다(0.02%) 따라서 염색 한 직후에 샘플이 실행되므로 문제가 발생하지 않습니다. 정렬 된 세포의 다운스트림 기능적 해석이 계획되어 있는 경우 매일 새로운 FACS 버퍼를 구성하고 나트륨 아지드를 사용하지 않는 것이 유용 할 수 있습니다. 항체의 무리를 사용하는 경우, 결과를 향상시키기 위해 항체의 칵테일에 적절한 양의 "브릴리언트 스테인 버퍼"를 추가하는 것이 좋습니다. - FACS 버퍼200 μL로 셀을 두 번 세척하고 FACS + EDTA 버퍼의 250 μL에서 세포를 다시 일시 중단합니다(1mMM EDTA를 포함하는 FACS 버퍼). 라벨이 부착된 FACS 튜브로 샘플을 전송합니다. 샘플을 4°C로 유지하고 빛으로부터 획득까지 보호합니다.
참고: 면역 세포는 끈적거리는 경향이 있습니다. 막힘의 위험과 더블릿 수를 모두 최소화하기 위해 최종 흐름 버퍼에 1mM EDTA를 추가하는 것이 좋습니다.
5. T 셀 서브셋 패널
- 생존성 염색 수행: 플레이트 스피너를 사용하여 스핀 셀(500 x g,5분, 4°C)을 회전하고 1x PBS의 200 μL로 한 번 세척합니다. 1x PBS에서 1:50희석된 세포불구형 아민 반응성 염료(생존성 얼룩)의 스톡 용액을 준비한다. 그 후, 이 스톡 용액의 100 μL로 셀 펠릿을 다시 일시 중단하여 우물당 2 μL의 생존성 얼룩을 절대로 부피가 생성합니다. 빛으로부터 보호된 4°C에서 15분 동안 배양하십시오.
- 시료를 배양하는 동안, 1배 FACS 버퍼의 적절한 부피로 세포외 염색 항체 칵테일을 준비한다. 1x FACS 버퍼의 200 μL로 세포를 두 번 세척하고, 아래로 회전 (500 x g,5 분, 4 °C) 항체 혼합물또는 적절한 제어 혼합물의 100 μL각 펠릿을 다시 놓습니다. 빛으로부터 보호된 4°C에서 30분 동안 배양하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 고정 및 투과화 키트로 세포 내 염색을 수행합니다. 1x FACS 버퍼의 200 μL로 셀을 두 번 세척하고 고정 버퍼 200 μL에서 재연하십시오. 빛으로부터 보호된 4°C에서 40분 동안 배양합니다.
- 인큐베이션 동안, 1배 의 적절한 부피로 항체(세포내 염색)의 칵테일을 준비하고 완충제를 세척한다. 회전(750 x g,5분, 4°C)으로 세포를 수집하고 1배 파마/세척 버퍼의 200 μL로 셀을 두 번 세척합니다.
참고: 고정 및 투과성으로 인해 제대로 펠릿이 약간 더 어려워지는 세포가 발생합니다. 후속 세척 단계 동안 세포 손실을 최소화하기 위해 원심력을 750 x g로늘립니다. 또는 더 긴 회전 주기를 적용할 수도 있습니다. 그러나, 이것은 세포를 준비하는 데 필요한 상당히 긴 시간이 발생할 것이다. - 스핀 셀(750 x g,5분, 4°C)을 회전시키고 항체 혼합물 또는 적절한 대조 혼합물의 100 μL로 각 펠릿을 재연한다. 빛으로부터 보호된 4°C에서 40분 동안 배양합니다.
- 1배 파마/세척 버퍼의 200 μL로 셀을 두 번 세척하고 FACS + EDTA 버퍼의 250 μL에서 세포를 다시 중단합니다. 라벨이 부착된 FACS 튜브로 샘플을 전송합니다. 샘플을 4°C로 유지하고 빛으로부터 획득까지 보호합니다.
참고: 각 항체에 대해 최적의 농도는 투여량 적정 곡선을 수행함으로써 결정되어야 합니다. 항체 간의 농도는 크게 다를 수 있습니다: CD3와 CD80은 1:1의 희석계수와 함께 사용되었고, CD11b와 CD4는 1:6400의 희석계수와 함께 사용되었다. 항체 농도를 적중시킬 때 실험 중에 사용될 동일한 수의 세포를 사용한다.
6. 보상, 적절한 제어 및 게이팅
- 실험 설정
- 최적의 항체 농도가 결정되면 스펙트럼 중첩을 조정하기 위한 보상을 위해 스테인드 및 단일 스테인드 컨트롤을 실행합니다.
참고: 셀과 보상 구슬을 모두 갖춘 모든 보상 컨트롤을 실행합니다. 보상을 위해 가장 밝은 결과(긍정적인 이벤트의 가장 높은 MFI)를 생성하는 모든 것을 사용하십시오. MFI는 평균 형광 강도를 의미하며 종종 생성된 신호의 평균 강도를 설명하고 정의하기 위해 사용되며, 따라서 항체 발현의 수준을 정의합니다. - 새로운 다색 실험을 시작할 때 형광을 뺀 하나(FMO) 컨트롤 및 동종형 컨트롤을 실행합니다. FMO에 관한 자세한 내용은 이전에19에게시되었습니다.
- 각 조직 유형의 스테인드 컨트롤에서 백혈구 집단을 검출하기 위해 최적의 전방 분산 영역(FSC-A) 전압 및 측면 산란 영역(SSC-A) 전압을 결정합니다.
참고: 고정 및 투과화 프로세스는 셀의 치수를 변경합니다. 따라서, 단핵서브세트 패널 및 T 셀 서브셋 패널에 대한 FSC-A 및 SSC-A 전압은 상당히 다릅니다. T 셀 서브셋 패널에 대한 최적의 전압을 찾으려면 FSC-A 및 SSC-A 값을 조정하는 동안 CD3 및 백 게이트로 염색된 셀을 백게이트로 백게이트로 백게이트로 염색하여 백구체 개체 집단을 향하게 됩니다.
- 최적의 항체 농도가 결정되면 스펙트럼 중첩을 조정하기 위한 보상을 위해 스테인드 및 단일 스테인드 컨트롤을 실행합니다.
- 게이팅 전략
- 최적의 FSC-A 및 SSC-A 전압이 결정되면 백혈구 모집단에 기본 게이트를 설정합니다.
참고: 각 실험에 앞서 제조업체의 지침에 따라 교정 구슬을 사용하여 사이토미터를 보정하고 얼룩이 없는 구슬을 실행합니다. 다른 시간 포인트의 백혈구 인구는 유사한 FSC 및 SSC 속성이 있어야합니다 (조직 유형 사이의 약간의 차이가 예상되고 정상). FSC와 SSC가 상당한 문제가 발생하면 세포계와 샘플 생성을 촬영합니다. - 이중 값 제외: FSC-A(y축) 및 FSC-H(x축)를 플롯합니다. 싱글은 이 플롯의 대각선으로 나타납니다. 싱글에 게이트.
- 데드 셀 제외: 플롯 FVS510(생존 가능성 얼룩) (x 축) 및 FSC-A(y축). 죽은 세포는 긍정적 인 사건으로 나타나므로 살아있는 세포에 게이트가 나타납니다.
참고: 실제 음수 셀은 스테인드 컨트롤에서 볼 수 있습니다. 따라서 스테인드 샘플 전에 스테인드되지 않은 컨트롤을 실행할 때 각 샘플 집합에 대해 이 게이트를 조정합니다. 추가 게이팅은 조사되는 항체 패널 및 세포 유형에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에 사용되는 각 패널에 대한 게이팅 전략은 각각 그림 1 및 그림 4에서찾을 수 있습니다.
- 최적의 FSC-A 및 SSC-A 전압이 결정되면 백혈구 모집단에 기본 게이트를 설정합니다.
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Representative Results
모노사이클 서브셋 패널과 T셀 서브셋 패널의 대표적인 결과는 아래에 설명되어 있다.
도 1은 DMM 처리동물의 골수로부터 수집된 면역 세포상핵세포 에 대한 단핵제 서브셋 패널을 위한 계층적 게이팅 전략을 도시한다. 동일한 전략이 사용되었고 다른 모든 조직 유형에서 확인되었습니다. 실험을 설정할 때, 전방 분산 영역(FSC-A) 및 측면 분산 영역(SSC-A) 전압은 각 조직 유형에 대해 단핵구/대식세포를 식별하고 T 세포 및 이물질을 제외하도록 결정하였다. 각 실험 동안 각 조직 유형의 미염색 된 컨트롤을 분석하고 필요한 경우 FSC-A 및 SSC-A 전압을 조정했습니다. 매개 변수가 사이토미터의 막힘가능성이 크게 변경되면 전압은 시간이 지남에 따라 유사하게 유지될 것으로 예상됩니다. 더욱이, 미염색된 컨트롤은 실험이 그에 따라 수행될 때마다 죽은/살아있는 얼룩 및 게이트에 대한 진정한 네거티브를 결정하는 데사용되었다(그림 2A). 실험을 설계할 때, 플루오로크롬은 신중하게 선택해야 하며, 일반적으로 발현이 낮은 표면 마커는 밝은 플루오로크롬과 결합됩니다(예: 여기에서 Alexa Fluor 647은 CD206에 사용됨). 다양한 죽은 /살아있는 얼룩은 다른 파장에 의해 검출 될 수있다 존재; 여기서 FVS510이 사용되었습니다.
도 3는 동물이 DMM 또는 샴 대조 수술을 받은 후 6 주 동안 세포 외 표면 마커로 염색된 용액 조직으로부터 분리된 면역 세포로부터의 샘플 데이터를 보여줍니다. 모든 하위 집합은 스터디 및 제어 동물 모두에서 프로토콜을 사용하여 쉽게 식별할 수 있습니다. 특히, 대식세포 하위 집합(DMM 그룹에서 의 라이-6C+/MHC-II-대식세포(G7)의 높은 비율과 M1 및 M2 대식세포의 발현(DMM 그룹에서 M2 대식세포의 높은 비율)에 대해 그룹 간의 차이를 볼 수 있다.
도 4는 DMM 처리동물의 비장으로부터 분리된 면역 세포에 대한 세포 내 T 세포 패널에 대한 계층적 게이팅 전략을 시각화한다. 원칙은 단세포 패널에 사용되는 원리와 동일합니다. 그러나 고정 및 투과화 프로세스는 세포의 크기와 밀도를 변경합니다. 따라서, 일반적인 FSC 및 SSC 파라미터는 각 세포 유형에 대한 실험을 처음 설정할 때 CD3+ 셀으로부터의 백 게이팅 공정을 사용하여 결정되어야 한다. 일부 플루오로크롬은 시간이 지남에 따라 집계하는 경향이 있습니다 (예 : FoxP3와 함께 사용 된 PE). 응집체는 스펙트럼 중첩 및 보정에 영향을 주는 높은 밝기로 인해 결과를 수정할 수 있습니다. 따라서, 모든 항체는 골재를 감소시키기 위해 사용하기 전에 매번 소용돌이와 분사되었다. 또한 게이팅 전략을 사용하여 골재(G2)의 영향을 더욱 줄였습니다. 실험을 설정하는 동안 형광마이너스 하나의 대조군 (FmOs)은 각 항체에 대해 수행되었다. 샘플 데이터는 도 2B,2C에표시됩니다.
도 5 및 도 6은 림프절(도5)과용액 조직(도6)으로부터분리된 면역 세포를 나타내고, 동물이 DMM 또는 샴대조 수술을 받은 후 4주 후에 T세포 패널 프로토콜을 사용하여 염색하였다. 데이터는 두 조직에서 DMM 동물 (G9)에서 Th1 세포의 더 높은 비율을 보여줍니다. 더욱이, T-조절 세포(G11) 및 Th17 세포(G12)를 위한 세포내 염색은 프로토콜을 사용하여 성공적이고 그룹 간에 차이가 검출될 수 있다.
그림 1: 세포외 염색을 사용하여 단핵구/대식세포 및 하위 집합을 식별하는 흐름 세포형 계층 적 게이팅 전략. 골로이드 세포는 주로 전방/측면 분산(FSC-A 및 SSC-A) 도트 플롯(G1)을 사용하여 식별된다. 그 후, 단일T는 FSC-A 및 FSC-H(G2)를 사용하여 검출되고 그 후 라이브 셀이 선택된다(G3). G3로부터의 세포는 Ly-6G를 사용하여 호중구(G4) 및 CD11b를 단세포/대식세포(G5a)에 식별하기 위해 더 분류된다. MHC-II는 CD11b 양성 세포 와 F4/80 사이에서 수지상 세포(G5b)를 식별하는 데 사용되며 대식세포(G6) 및 단핵구(G12) 사이에서 선택하는 데 사용된다. 대식세포는 Ly-6C 및 MHC-II(Ly-6C+/MHC-II-대식세포(G7)를 사용하여 하위 집합으로 추가로 분류됩니다. Ly-6C-/MHC-II- 조직 상주 대식세포 (G8); Ly-6C-/MHC-II+ 혈액 유래 대식세포 (G9). CD206 및 CD80(M1: CD80+/CD206- G10)을 사용하여 대식세포 전체와 각 하위 집합에서 더 많은 하위 집합을 선택할 수 있습니다. M2: CD80/CD206+(G11). 단세포는 MHC-II 및 CD11c(MHC-II-/CD11c-단핵구(G13)를 사용하여 추가로 분류됩니다. MHC-II+/CD11c-단핵구(G14). 활성화 수준은 Ly-6C의 발현을 사용하여 분류되고 낮은(G15), 매체(G16) 및 높은(G17)으로 나뉩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단핵구와 T셀 패널 모두에서 적절한 제어를 보여주는 샘플 데이터입니다. (A)Synovial 조직은 DMM 수술(DMM) 또는 샴 대조수술(sham) 및 단일 세포 현탁액이 세포외 표면 마커를 사용하여 염색된 후 6주 후에 수확되었다. 각 실험 동안 스테인드 된 세포는 죽은 /살아있는 얼룩에 대한 진정한 네거티브를 결정하고 게이트 (Control)를 설정하는 데 사용되었다. 스테인드 드 된 세포를 이용한 게이트의 설정은 패널 A.(B+C)비장 세포가 처리되지 않은 대조군 동물로부터 수확되었으며, 단하나 세포 현탁액은 엑스트라 및 세포 내 마커를 사용하여 생성되고 염색되었다. 형광-마이너스-1(FMO) 대조군은 하나의 항체만 누락된 전체 항체 패널로 세포를 염색함으로써 생성되었다. 샘플 데이터는 세포 내 항체 모두에 대해 도시된다. (B)FMO -RORgt 및(C)FMO -폭스-P3. FmOs는 패널 모두에 대해 수행되었으며 각 게이트를 설정하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 생쥐의 혈중에서 분리된 단핵구/대식세포의 세포외 염색. 샘플 조직은 마우스가 DMM 수술 (DMM) 또는 샴 대조 수술 (sham)을받은 후 6 주 수집되었다. 활용게이트에 관한 추가 정보는 도 1에서찾을 수 있다. 샘플 데이터는 모든 하위 집합을 안정적으로 식별할 수 있으며 그룹 간에 차이점을 볼 수 있음을 보여 주습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: T 세포및 그들의 하위 집합을 확인하기 위하여 추가 세포 내 염색을 둘 다 사용하여 유석 순환측정 계층 적 게이팅 전략. T 세포는 주로 전방/측면 분산(FSC-A 및 SSC-A) 도트 플롯(G1)을 사용하여 식별된다. 활용된 항체 골재의 특성상 CD3 및 CD4(G2)를 사용하여 배제되어야 한다. 그 후, 싱글트는 FSC-A 및 FSC-H(G3)를 사용하여 검출되고 그 후 라이브 셀이 선택된다(G4). G4로부터의 세포는 Nk1.1을 사용하여 T 세포를 식별하기 위해 천연 킬러 세포(G5) 및 CD3를 사용하여 더 분류된다(G6). 활성화 수준은 CD69(G6b)를 사용하여 결정됩니다. 그 후, CD4 및 CD8은 T 킬러 세포(CD4-/CD8+(G7) 및 T-도우미 세포(CD4+/CD8-(G8)를 식별하는 데 사용됩니다. T-도우미 세포는 C-X-CR3(CD183) 및 CCR4(CD194)를 사용하여 Th-1(C-X-CR3+/CCR4-(G9) 및 Th-2 셀(C-X-CR3-/CCR4+(G10)으로 분류됩니다. 또한, Th-17 세포(CD25+/RORgt+(G11)와 T 조절 셀(CD25+/Fox-P3+(G12)은 세포내 마커를 사용하여 식별된다. 또한, 메모리 셀 서브셋은 CD44 및 CD62L(CD44/CD62L+ 순진한 T 메모리 셀(G13)을 사용하여 T-도우미 세포에서 식별됩니다. CD44+/CD62L+ 중앙 T 메모리 셀(G14); CD44+/CD62L- 이펙터 T 메모리 셀(G15). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 마우스의 림프절을 배수에서 분리 된 T 세포의 세포 외 및 세포 내 염색. 샘플 조직은 마우스가 DMM 수술 (DMM) 또는 샴 대조 수술 (sham)을받은 후 4 주 수집되었다. 활용게이트에 관한 추가 정보는 도 4에서찾을 수 있다. 샘플 데이터는 모든 하위 집합을 안정적으로 식별할 수 있으며 그룹 간에 차이점을 볼 수 있음을 보여 주습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 마우스의 모조 조직으로부터 분리된 T 세포의 세포외 및 세포 내 염색. 샘플 조직은 마우스가 DMM 수술 (DMM) 또는 샴 대조 수술 (sham)을받은 후 4 주 수집되었다. 활용게이트에 관한 추가 정보는 도 4에서찾을 수 있다. 샘플 데이터는 모든 하위 집합을 안정적으로 식별할 수 있으며 그룹 간에 차이점을 볼 수 있음을 보여 주습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에 기술된 방법은 골관절염(OA)의 뮤린 모델에서 모낭/대식세포 및 T세포 모두에서 다양한 하위 집합을 안정적으로 식별하도록 설계 및 테스트되었습니다. 현재 프로토콜은 항체를 교환하여 상이한 조직 모형, 또는 그밖 세포 모형을 조사하기 위하여 쉽게 변형될 수 있고, OA의 대체 뮤린 모형을 위해 이용될 수 있다. 다른 조직 유형을 테스트할 때, 면역 세포의 표면 마커의 발현이 각조직(20)에서변화함에 따라 각 항체의 특이성을 테스트하는 것이 중요하다. 또한, 항체를 교환할 때, 항체의 최적 농도를 확립하고 스펙트럼 중첩의 변화를 해결하기 위해 보상 과정을 반복하기 위해 투여량 적정 곡선을 수행해야 한다.
현재 프로토콜에서, OA는 DMM 마우스모델(18)을사용하여 유도되었다. 가장 일반적으로 사용 되고 확립 된 동물 모델은 마우스에, 이 종은 외상 후 OA의 병리 생리학을 조사에 다가지 이점을 제공하기 때문에17. 특히 마우스에서, 외과 및 비수술OA 모델은17에기술되었다 : 내측 반월 상 연골 (DMM), 전방 십자 인대 (ACLT)의 외과 적 편부 및 비 수술 ACL 파열 (ACLR)의 가장 일반적인 되는 것은 각각21. 이러한 모든 동물 모델은 외상 후 OA의 병리학에서 세포 염증의 역할에 대한 조사에 적합하며 현재 프로토콜은 실험실에서 이전에 언급 한 모든 동물 모델에 대해 성공적으로 테스트되었습니다. 위의 모든 동물 모델이 설립되고 문학에 설명되어 있지만, 각각은다른 곳에서 자세히 논의 된 자신의 강점과 한계를 가지고 있으므로 아래에 간단히 논의됩니다. 모든 수술 모델은 외과 적 접근 법, 상처 치유 과정 및 관련 염증 반응의 영향을 받습니다. 외상 후 OA의 발달에 염증 세포의 기여를 평가할 때, 이 선동적인 상처 치유 반응은 특히 내정간섭 후에 초기 시간 점 도중, confounder로 봉사할 수 있습니다. 또한 DMM 및 ACLT 절차는 동물 간의 가변성을 최소화하기 위해 매우 표준화된 방식으로 수행되어야 합니다. ACLT 수술은 DMM 수술보다 배우기가 훨씬 더 어렵고 ACL에만 부상을 확인하고 보장하고 다른 관절 조직에 대한 이트로겐성 손상을 피하기 위해 DMM보다 더 큰 수술 노출이필요합니다(18). 비 수술 ACL 파열은 외상 후 OA를 유도하는 표준화되고 매우 효율적인 방법입니다. 그러나, 구부러진 무릎의 경골에 제어된 단일 압축 부하를 적용하는 특수 장치가 필요하다. 이 장치는 비교되고 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 교정하고 테스트해야 합니다. 추가적으로, ACLR 모델은 인간을 포함한 다른 종에서 ACL 부상으로 볼 수 없는 후방22 내측 티비알 고원의 현저한 침식을 가진 마우스에서 매우 심각하고 진보적인 관절 손상을 유도한다.
OA의 발달 도중 염증 과정 및 그 세포 성분을 포괄적으로 특성화하기 위하여는, 비장 및 골수와 같은 이차 림프성 기관 뿐 아니라 지방 림프절 뿐 아니라 또한 지방 림프절을 조사하는 것이 바람직하다. 무릎 관절의 림프 배수 패턴은 다양한분산23에서일리악과 잉게인 림프절을 통해 무릎 관절 배수에서 마우스와 림프액을 특징으로한다23,24. 동물 간의 비교를 용이하게하기 위해, 우리는 이 프로토콜에서 잉구이날 림프절을 풀링하기로 결정했습니다. 대조적으로, 무릎에 가까운 동안, 포라이트 림프절은 뒷발을 배출하고 무릎의 염증 과정 동안 역할을하지 않습니다.
마우스는 소량의 관절 내 용액조직(25)을 가지며, 본원에 면역 세포의 분리는 여전히 도전적이다. 현재 프로토콜에서, 모조 조직을 위한 수확 기술은 면역 세포의 최대 수의 격리를 허용하기 위하여 적응되었습니다. 따라서, 수확 기술은 면역 세포의 높은수(26)로인해 수프라 및 인프라 스락라 오목뿐만 아니라 적외선 유행 패드를 포함한다. 소화 과정과 효소선택은 힘줄을 남기면서, 끈적끈적한 막과 지방 조직을 완전히 소화하도록 최적화되었고, 슬개골과 연골은 손상되지 않았다. 따라서, 현재 의정서는 용액 조직으로부터 면역 세포를 수확하는 재현 가능한 방법을 소개한다.
흐름 세포 분석은 OA의 발달 도중 세포 면역 프로세스를 조사할 때 다중 이점이 있습니다; 그럼에도 불구하고,이 기술은 한계가 있습니다. 용액 조직에서 면역 세포의 작은 수로 인해, 하나의 샘플을 얻기 위해 적어도 두 동물에서 조직 샘플을 풀 링 할 필요가있다. 이 프로토콜에 사용되는 많은 수의 형광과 색상으로 인해 각 조직 유형에 대한 가능한 스펙트럼 중첩의 세심한 보상에 특별한주의를 기울여야하며 보상은이 기술을 사용하여 일관되게 재평가되어야합니다. 사용 가능한 마커의 큰 수와 특정 인구를 식별 하기 위해 연구 중 상당한 변화, 또 다른 가능한 제한은 세포를 식별 하는 데 사용 되는 마커의선택(19). 유동 세포측정은 반드시 총 세포와 조정하지 않는 "이벤트"의 정량화를 허용합니다. 진정으로 정량적 분석을 얻으려면, 유동 분석을 실행할 때 동시에 구슬을 획득하거나 단일 셀 현탁액에서 셀을 계산하여 절대 숫자를 얻어야 합니다(여기에서 와 같이). 일반적으로 이 프로토콜의 원리(예: 단일 셀 서스펜션을 준비하는 데 사용되는 유량 패널 또는 기술을 설계하고 설정하는 방법)은 잠재적으로 인간의 샘플에 맞게 조정될 수 있습니다. 그러나, 인간 적인 면역 세포의 표면 마커는 뮤린 세포와 다르므로, 적당한 항체를 선택하고 시험할 필요가 있습니다. 또한 RBC 용해 의 지속 시간 및 적절한 버퍼 볼륨은 대부분 다를 가능성이 있으므로 결정되어야 합니다. 이 프로토콜에서 다른 종 또는 조직에 대한 방법을 적응하기 전에 각 단계의 세심한 테스트가 필요하여 메서드가 의도한 대로 작동하는지 확인합니다.
그것의 한계에도 불구하고, 면역 세포의 유동 세포 분석은 단하나 세포 수준에서 단핵 세포 및 T 세포 서브세트를 둘 다 확인할 수 있는 강력한 기술 남아 있습니다. 특히, 현재 의정서는 활액 조직 및 이차 림프관에서 OA의 발달 중에 세포 면역 반응을 식별하고 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 기술을 소개한다. 미래에, 이 기술은 동물 모형을 유도하는 각종 골관절염에 있는 면역 반응을 특성화하고 이 쇠약하게 하는 질병에 면역 변조 약의 효험을 평가하는 것을 도울 수 있습니다.
결론적으로, 이 유동 세포측정 프로토콜은 명두부 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석법을 사용하여 단핵구/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하는 상세하고 재현 가능한 방법을 설명합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 앤드류 림, 박사 와 자일스 베스트, 유동 세포계를 설정하는 데 도움을 주셔서 감사드립니다. 이 프로젝트는 PH에 수여 도이치 포충스게마인샤프트 (DFG) (DFG-HA 8481/1-1)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
References
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