Summary
هنا، نحن وصف مفصلة واستنساخ تدفق العلاج الخلوي بروتوكول لتحديد أحادية / الضامة والخلايا التائية باستخدام كل من خارج وداخل الخلايا تلطخ المقايسات داخل الطحال مورين، نخاع العظام، والعقد الليمفاوية والأنسجة الزليلي، وذلك باستخدام نموذج جراحية راسخة من هشاشة العظام.
Abstract
هشاشة العظام (OA) هي واحدة من أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا، مما يؤثر على المرضى الذين يعانون من الألم والقيود الجسدية. وتشير الأدلة الحديثة إلى وجود عنصر التهابي محتمل للمرض، مع احتمال ارتباط كل من الخلايا التائية والخلايا أحادية الخلايا/الضامة بتولدات المرض من الزراعة العضوية. وقد افترضت دراسات أخرى دوراً هاماً لكل من مجموعات فرعية من أنساب الخلايا الالتهابية، مثل Th1 وTh2 وTh17 و T-تنظيمية لللمفيات، و M1 و M2 و الضامة السينوفية للأنسجة المقيمة. ومع ذلك، فإن التفاعل بين الاستجابة الخلوية الالتهابية المحلية والنظامية والتغيرات الهيكلية في المفصل غير معروف. لفهم كامل كيف تي الخلايا monocytes / الضامة تسهم في الزراعة العضوية، من المهم أن تكون قادرة على تحديد كمي هذه الخلايا و المجموعات الفرعية الخاصة بهم في وقت واحد في الأنسجة الزليلي، والأعضاء اللمفاوية الثانوية وبشكل نظامي (الطحال ونخاع العظام). في الوقت الحاضر، يمكن تحديد المجموعات الفرعية الخلية الالتهابية المختلفة من خلال مزيج من علامات سطح الخلية مما يجعل عملية استئصال الخلايا متعددة الألوان تقنية قوية في التحقيق في هذه العمليات الخلوية. في هذا البروتوكول، ونحن وصف الخطوات التفصيلية بشأن حصاد الأنسجة الزليلي والأعضاء اللمفاوية الثانوية، فضلا عن توليد تعليق خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، نقدم كل من فحص تلطيخ خارج الخلية لتحديد أحاديات / الضامة و المجموعات الفرعية الخاصة بهم، فضلا عن فحص تلطيخ خارج وداخل الخلوية لتحديد الخلايا التائية وتفرعاتها داخل طحال المورين، نخاع العظام، الغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية. تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول واختبارها ، مما أدى إلى اختبار قابل للاستنساخ للغاية يمكن استخدامه لنماذج أخرى من ماوس الزراعة العضوية الجراحية وغير الجراحية.
Introduction
هشاشة العظام (الزراعة العضوية) هو مرض موهن ومؤلم يشمل مختلف الأمراض من جميع الأنسجة المرتبطة بالمفصل1. تؤثر على ما يقرب من 3.8٪ من سكان العالم2, الزراعة العضوية هي واحدة من أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا وأنه من أن تصبح السببالرئيسي 4 من الإعاقة في جميع أنحاء العالم بحلول عام 20203. بعد الصدمة الزراعة العضوية يحدث بعد إصابة المفاصل وحسابات لا تقل عن 12٪ من جميع الزراعة العضوية وما يصل إلى 25٪ من الزراعة العضوية في المفاصل عرضة مثل الركبة4,5. وعلاوة على ذلك، فإن إصابة المفاصل تزيد من خطر100000000000000000000000000000000000000000000000000000 لن تستمر جميع الإصابات التي يبدو أنها غير مُتشابهة في تطوير الزراعة العضوية، وبالتالي فإن تحديد العوامل التي تدفع خطر الزراعة العضوية على المدى الطويل لا يزال يشكل تحدياً. ومن الأهمية بمكان من أجل تطوير علاجات فعالة لمنع و / أو علاج الزراعة العضوية بعد الصدمة ، للتحقيق وتحديد أفضل الأمراض المتعلقة بالإصابات ، والأسباب ، والآليات التي تهيئ لOA1.
OA والتدمير الغضروف تعريفه كان يعزى سابقا تماما إلى الإجهاد الميكانيكية، وهكذا، كان يعتبر OA مرض غير الالتهابي2. ومع ذلك، أظهرت دراسات أكثر حداثة تسلل التهابي من الأغشية الزليلية وزيادة الخلايا الالتهابية في الأنسجة الزليلية في المرضى الذين يعانون من الزراعة العضوية مقارنة مع الضوابط الصحية2، تسليط الضوء على عنصر التهابي كقوة دافعة محتملة في الزراعة العضوية. وأشارت دراسات أخرى إلى أن شذوذ في كل من CD4 + و CD8 + T-الخلية الشخصية وكذلك monocytes / الضامة من الجهاز المناعي الفطرية قد تسهم في التسبب فيOA 2,7. وكشفت التحقيقات التفصيلية في هذه التشوهات الأدوار ذات الصلة لمختلف المجموعات الفرعية خلية T2، مثل Th18، Th29، Th178 و T التنظيمية (Treg) السكان10،11. على الرغم من هذه الأدلة الدامغة ، فإن العلاقة السببية بين تغيير استجابات الخلايا التى وتطور وتطور الزراعة العضوية لا تزال غير معروفة2.
بالإضافة إلى خلايا تي محددة لها دور في الزراعة العضوية، تشير الدراسات الحديثة إلى أن الضامة المستقطبة /المنشطة قد تكون مرتبطة بتولدية OA12. على وجه الخصوص، الضامة التي تنشأ من أحاديات الدم تتراكم في السينوفيوم والاستقطاب في إما الضامة المنشطة كلاسيكيا (M1) أو بدلا من ذلك تفعيل الضامة (M2) أثناء التنمية الزراعة العضوية، مما يعني وجود علاقة بين الضامة المشتقة monocyte وOA13. في المقابل، مجموعات فرعية معينة من الضامة ملء الأعضاء في وقت مبكر أثناء التنمية والاكتفاء الذاتي أعدادهم في مادة مستقلة monocyte14. في الآونة الأخيرة، تم عرض وظيفة حماية مشتركة بوساطة حاجز ضيق الوصل لهذه الضامة الزليلية الأنسجة المقيم (STRMs)14. وتشير هذه النتائج إلى أن الشذوذ في مجموعات فرعية خاصة من الضامة قد تلعب دوراً حاسماً أثناء تطوير الزراعة العضوية. ومع ذلك، فإن التفاعلات بين هذه الاستجابة الخلوية الالتهابية والتغيرات الهيكلية في المفصل اللاحق للصدمة غير معروفة.
تاريخيا، كان يقتصر تحليل الخلايا المناعية في الأنسجة الزليلية على الكيمياء المناعية (IHC) أو التعبير مرنا عن طريق عكس النسخ تفاعل البوليمرات سلسلة (RT-PCR) النهج15،16. ومع ذلك، فإن كلا من IHC وRT-PCR تفتقر إلى القدرة على تحديد أنواع مختلفة متعددة من الخلايا و مجموعاتها الفرعية في وقت واحد، وبالتالي الحد من إمكانية تطبيق هذه الطرق. وعلاوة على ذلك، يقتصر IHC لتحليل عينات صغيرة من الأنسجة، وقد يغيب عن تراكم الخلايا الالتهابية البؤري. على مدى السنوات القليلة الماضية، تم تطوير عدد لا يحصى من علامات السطح لأنواع مختلفة من الخلايا، ويمكن الآن تحديد مجموعات فرعية من الخلايا المناعية بشكل موثوق من خلال مجموعات متميزة من هذه العلامات. بسبب التقدم التقني المطرد، أجهزة قياس التدفق قادرة الآن على تحديد العديد من الفلوروكرومات المختلفة في وقت واحد مما يتيح تحليل لوحات الأجسام المضادة متعددة الألوان الكبيرة.
يوفر قياس التدفق الخلوي للمحققين تقنية قوية تسمح بتحديد وقياس كمية العديد من الخلايا المناعية و المجموعات الفرعية الخاصة بها على مستوى الخلية المفردة. لقد طورنا وحسّنا كل من مقايسة تلطيخ خارج الخلية لتحديد أحاديات / الضامة و المجموعات الفرعية الخاصة بهم وكذلك مقايسة تلطيخ إضافية / داخل الخلايا لتحديد الخلايا التائية و مجموعاتها الفرعية داخل طحال المورين ونخاع العظام والغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلية. تم تحسين كل خطوة من هذا البروتوكول واختبارها مما أدى إلى محك قابل للاستنساخ للغاية يمكن استخدامه لنماذج أخرى ماوس OA الجراحية وغير الجراحية17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان في منطقة الصحة المحلية في شمال سيدني على جميع الإجراءات المذكورة في هذا البروتوكول. يتم إيواء الفئران ورعايتها وفقًا لدليل رعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها (المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا، المنقح لعام 2010). لجميع التجارب 10-12 أسبوعا من العمر، واستخدمت الفئران C57BL/6 الذكور.
ملاحظة: للحث على ما بعد الصدمة OA، تم إجراء زعزعة الاستقرار الجراحي للغضروف المفصلي الوسيط (DMM) في المفصل الخانق الأيمن. وقد نشرت معلومات مفصلة بشأن هذا النموذج الحيواني من قبل Glasson وآخرون18. باختصار، يتم إجراء التخدير العام في غرفة التعريفي باستخدام isoflurane و الحفاظ عليها بعد ذلك باستخدام مخروط الأنف. يتم حلق الساق الجراحية بشفرة حلاقة ويتم غسل الموقع الجراحي وشفاحه بالإيثانول لتقليل التلوث. ثم يتم نقل الحيوان إلى مجهر التشغيل ووضعه على منشفة معقمة والساق تتدلى مع ستائر ورقة معقمة لعزل الموقع الجراحي وتقليل التلوث. باستخدام المجهر، يتم إجراء مفصلية شبه الرضفة 0.5 سم، والرضفة لوكسي بشكل جزئي، ولوحة الدهون تحت الرضفة مرتفعة لفضح الرباط الطمثي- التيبالي المتوسط، الذي يتم تقسيمه مع ملقط تشريح. يتم مسح المفصل مع المالحة المعقمة لإزالة أي الدم ويتم إغلاق الجرح في ثلاث طبقات – كبسولة مشتركة، والأنسجة تحت الجلد (باستخدام مواد خياطة) والجلد (باستخدام الغراء الأنسجة الجراحية). الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول، ومع ذلك، يمكن تطبيقها على نماذج وأساليب أخرى لتحفيز الزراعة العضوية. يمكن أن يكون سبب الزراعة العضوية في جانبي الحيوان، وعند حصاد الأنسجة، من المهم حصاد الغدد الليمفاوية ipsilateral (استنزاف).
1. عزل الطحال، نخاع العظام contralateral، العقد الليمفاوية ipsilateral استنزاف الأنسجة الزليلية خنق
- القتل الرحيم الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. وضع الماوس في وضعية supine تحت المجهر تشريح ومسح الصدر والبطن والساقين مع 70٪ الإيثانول. فتح بعناية الجلد على خط الوسط لطول البطن باستخدام مقص مستقيم ترك تجويف البطن سليمة.
- اسحب الجلد بلطف على الجانب الأيمن من الحيوان بعيدًا عن العضلات الكامنة تاركاً النسيج الدهني تحت الجلد ملتصقاً بالبشرة. عادة، سوف الجر لطيف وحدها فصل الجلد والأنسجة الدهنية الكامنة من العضلات. وينبغي قطع من خلال التمسك متفرقة مع مقص غرامة من أجل الحفاظ على التوتر اللازم لفصل الأنسجة إلى أدنى حد ممكن والحد من فرصة الإضرار العقد الليمفاوية. تحديد عبور ثلاث سفن عن طريق إغاظة بلطف خارج الأنسجة الدهنية الموجودة في الفخذ باستخدام اثنين من ملقط ناعم المنحني. العقدة اللمفية الإربية تقع عند المعبر ويمكن تحديدها من خلال شكلها المبيض ولون أغمق قليلا.
- إزالة العقدة الليمفاوية الإربي باستخدام ملقط تشريح غرامة. يجب الحرص على عدم تمزق الكبسولة. إزالة الدهون المتبقية على سطح العقدة الليمفاوية مع ملقط.
- افتح تجويف البطن وحدد الطحال. قطع الطحال مع مقص غرامة. سحب بلطف الأمعاء جانبا لفضح الشريان الأورطي والتشعب مع الحرص على عدم الإضرار بها, من أجل تقليل خطر التلوث. تقع العقدة اللمفاوية الحرقفية في الجزء الطرفي من الشريان الأورطي البطني وأصل الشريان الحرقفي المشترك. إزالة العقدة الليمفاوية الحرقفية الحق والمضي قدما كما هو موضح في 1.3.
- إزالة بلطف الجلد من كلا الطرفين الخلفيين. تشريح عظم الفخذ الأيسر عن طريق تنظيفه من الأنسجة العضلية باستخدام شفرة ومقص غرامة. قطع بعناية كل من خنق والورك المشتركة ترك كامل العظام سليمة وإزالة عظم الفخذ.
- تحديد وتر الرضفة من الحق خنق مشتركة، ثم إزالة الأنسجة العضلية المجاورة القريبة إلى هذا باستخدام مقص غرامة حتى ما يقرب من 5mm من وتر رباعية القريبة من الرضفة يتعرض. بعد ذلك، وقطع من خلال وتر رباعية تقريبا 3-4mm قريبة إلى الرضفة لتشكيل مقبض واستخدام ملقط غرامة سحب بلطف بعيدا عن المفصل. وهذا سيجعل حواف مرفق كبسولة مشتركة لعظم الفخذ مرئية، واستخدام شفرة مشرط قطع بعناية على طول حواف كبسولة مشتركة على كلا الجانبين، بدءا من عظم الفخذ تسير نحو الساق، من أجل تعظيم كمية الغشاء الزليلي الذي يتم حصاده. في حين قطع من المهم للحفاظ على الجر لطيف على وتر رباعية ووقفة عندما يتم إرفاق كتلة الأنسجة الزليلي فقط إلى الساق. في هذه المرحلة لوحة الدهون داخل العين هو الآن واضحة واضحة لرضفة الرضفة ويمكن فصل بلطف من الجانب المشترك والمرئي من الثني باستخدام شفرة. بعد ذلك، قطع على طول الجزء المتبقي من الكبسولة المشتركة (جزء الريبة) لإزالة كتلة الأنسجة الزليلي.
ملاحظة: هذه الخطوة يجب أن يتم بدقة للسماح نتائج موثوق بها. بعد الانتهاء من تشريح, "كتلة الأنسجة الزليلي" ينبغي أن تتكون من الرضفة, وتر الرضفة, وسادة الدهون infrapatellar, فوق- وfrafrapatellar استراحة بطانة الزليلية وكبسولة مشتركة المرتبطة بها الأمامي إلى الأربطة الجانبية. الحفاظ على جميع الأنسجة رطبة أثناء تشريح باستخدام محلول ملحي 0.9٪.
ملاحظة: ضع كل عينة كتلة الأنسجة الزليلي في بئر منفصل من لوحة 24-well الموسومة التي تحتوي على 1.5 مل من 1640 1640 1640 11. الجمع بين كل من الحرقفي والعقدة الليمفاوية الإربية في بئر واحد وبركة الأنسجة من اثنين من الفئران.
2. توليد تعليق خلية واحدة من كل نسيج
ملاحظة: من أجل ضمان أرقام الخلايا الكافية لتحليل تدفق الأنسجة الزليلي من اثنين من الفئران تحتاج إلى أن تكون مجمعة. في البروتوكول الحالي، تجمع جميع الأنسجة من نفس الفئران اثنين من أجل الحفاظ على القياس. وعلاوة على ذلك، تم الجمع بين الغدد الليمفاوية الإربية والأربية لكل مما أدى إلى ما مجموعه 4 العقد الليمفاوية لكل عينة. بشكل عام، أرقام الخلايا في الطحال، نخاع العظام والغدد الليمفاوية من واحد كافية لإجراء تحليل التدفق ويمكن تطبيق البروتوكول. ومع ذلك، عند استخدام الأنسجة من وقت واحد فقط الحيوانات lysing قد تحتاج إلى تعديل.
- الطحال
- ضع الطحالين المتجمعين على مصفاة 70 ميكرومتر على قمة أنبوب 15 مل. برفق اشعل الطحال من خلال مرشح شبكة باستخدام مغمس حقنة معقم 3 مل. تدفق المصفاة في كثير من الأحيان مع ما مجموعه 6 مل من 1640 1640 متوسطة 1640 تكملة مع FBS 10٪.
- تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT) و resuspend بيليه في 5 مل من خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ووقف رد الفعل عن طريق تخفيف العازلة تحلل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT) وتكرار هذه الخطوة مرة واحدة أو حتى لا يكون أكثر RBC في بيليه.
ملاحظة: إعادة تصفية التعليق باستخدام مصفاة خلية 30 ميكرومتر في أنبوب جديد 15 مل بين الجولتين من الخلع لإزالة الخلايا المتخثرة. - بعد اكتمال lysing، تدور الخلايا (500 س ز،5 دقيقة، RT)، تجاهل عظمى و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني. عد عدد الخلايا الحية على مقياس الهيموسيت باستخدام استبعاد Trypan الأزرق.
- العقد اللمفاوية
- ضع العقد اللمفية الأربعة المجمعة على مصفاة خلايا 70 ميكرومتر فوق أنبوب 15 مل. ندف بلطف العقد الليمفاوية وبصرف النظر في تعليق خلية واحدة عن طريق الضغط مع مغطس حقنة 3 مل معقمة. تدفق المصفاة في كثير من الأحيان مع ما مجموعه 6 مل من RPMI مع 10٪ FBS.
- تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT)، والتخلص من افرا و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إعادة تصفية التعليق باستخدام مصفاة 30 ميكرومتر الخلايا في أنبوب جديد 15 مل لإزالة الخلايا المتخثرة. عد عدد الخلايا الحية على مقياس الهيموسيت باستخدام استبعاد Trypan الأزرق.
- نخاع العظم
- فهم بعناية عظم الفخذ سليمة باستخدام ملقط الإبهام الأنسجة دون كسر ذلك. قطع نهاية عظم الفخذ القريب مع مقص حاد من أجل تسهيل مسح العظام. بدوره حول عظم الفخذ ووضع إبرة 23 G في منتصف الشق intercondylar من عظم الفخذ. في حين تطبيق ضغط لطيف تدوير الإبرة بين الإبهام وسببة من أجل حفر ثقب في الشق بينات الدم لدخول تجويف العظام.
ملاحظة: في بعض الأحيان يمكن أن جزيئات العظام عرقلة الإبرة بعد حفر الحفرة، لتجنب الضغط العالي غير الضرورية أثناء التنظيف تغيير إبرة قبل أن ينصح التنظيف. - قم بتدفق العظم مع 6 مل من RPMI مع 10٪ FBS (أو حتى يتحول تدفق أبيض) باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 23 G على مصفاة خلايا 70 ميكرومتر التي يتم وضعها على أنبوب 15 مل. اضغط بلطف على نخاع العظم من خلال مصفاة الخلية مع المكبس من حقنة 3 مل وشطف المصفاة مع آخر 3 مل من RPMI.
ملاحظة: يجب أن تظهر العظام بيضاء مرة واحدة وقد تم مسح كل النخاع تماما. - تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT) و resuspend بيليه في 5 مل من العازلة تحلل RBC. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ووقف رد الفعل عن طريق تخفيف العازلة تحلل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
- تدور الخلايا (500 س ز،5 دقائق، RT)، والتخلص من افرا و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني. إعادة تصفية التعليق باستخدام مصفاة 30 ميكرومتر الخلايا في أنبوب جديد 15 مل لإزالة الخلايا المتخثرة. عد عدد الخلايا الحية على مقياس الهيموسيت باستخدام استبعاد Trypan الأزرق.
- فهم بعناية عظم الفخذ سليمة باستخدام ملقط الإبهام الأنسجة دون كسر ذلك. قطع نهاية عظم الفخذ القريب مع مقص حاد من أجل تسهيل مسح العظام. بدوره حول عظم الفخذ ووضع إبرة 23 G في منتصف الشق intercondylar من عظم الفخذ. في حين تطبيق ضغط لطيف تدوير الإبرة بين الإبهام وسببة من أجل حفر ثقب في الشق بينات الدم لدخول تجويف العظام.
- النسيج الزليلي
- الزهر كتل النسيج الزليلي اثنين في قطع صغيرة مع مقص الجراحية غرامة. نقل العينات مع المتوسطة في أنبوب 15 مل. شطف البئر القديم مع 0.5 مل إضافية من RPMI للحصول على الخلايا المتبقية والأنسجة الزليلي، ونقل إلى أنبوب الصقر (الحجم النهائي 2 مل).
TIP: استخدام ماصة نقل وقطع من طرف حيث يتسع قطر في هذه الخطوة. - إعادة تشكيل انزيم و aliquot وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (على سبيل المثال، Liberase). إضافة إنزيم كافٍ لنتيجة تركيز نهائي من وحدة/مل (ما مجموعه وحدتين لكل عينة). جسّد عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة باستخدام جهاز ماكينة ماكينة ماكينة ماك.
- وقف الهضم عن طريق إضافة 8 مل من RPMI مع 10٪ FBS وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر خلية في أنبوب جديد 15 مل. شطف أنبوب 15 مل القديمة مع آخر 5 مل من RPMI مع 10٪ FCS المتوسطة ومرشح تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية نفسها في أنبوب جديد (15 مل الحجم النهائي).
- تدور الخلايا (500 س ز،10 دقيقة، RT)، والتخلص من افرا و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. عد عدد الخلايا الحية على مقياس الهيموسيت باستخدام استبعاد Trypan الأزرق.
- الزهر كتل النسيج الزليلي اثنين في قطع صغيرة مع مقص الجراحية غرامة. نقل العينات مع المتوسطة في أنبوب 15 مل. شطف البئر القديم مع 0.5 مل إضافية من RPMI للحصول على الخلايا المتبقية والأنسجة الزليلي، ونقل إلى أنبوب الصقر (الحجم النهائي 2 مل).
3- تخصيص الخلايا
- تسمية اثنين من 96-جيدا لوحات (U-أسفل الشكل) مع نوع من الأنسجة، معرف الحيوان، ولوحة الأجسام المضادة المعينة. يتم استخدام مجموع اثنين من لوحات الأجسام المضادة في هذا البروتوكول: لوحة فرعية أحادية (تلطيخ خارج الخلية) ولوحة مجموعة فرعية T-خلية (تلطيخ خارج الخلية وداخل الخلايا).
- توفير 5 × 105 خلايا في البئر باستخدام تعليق خلية واحدة.
ملاحظة: عند إعداد التجربة، قم بتقييم العدد المطلق للخلايا المتوقعة لكل مجموعة ونوع الأنسجة (الحيوانات المعالجة لديها عدد خلايا أعلى في الأنسجة من الحيوانات المسيطرة). عند إعادة بناء بيليه الخلية خلال الخطوة الأخيرة من توليد تعليق خلية واحدة، واختيار كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني في نهاية المطاف مع تركيز 5 × 105 لكل 200 ميكرولتر. يمكن أن تحمل اللوحة 96-جيدا المستخدمة هنا ما لا يزيد عن 300 ميكرولتر وعادة ما تكون 200 ميكرولتر مثالية لتقليل خطر التلوث المتبادل بسبب الانسكاب. - لكل لوحة ونوع الأنسجة، وتوزيع ما لا يقل عن 5 × 105 الخلايا والضوابط غير الملطخة في الآبار التي تم وضع علامة واضحة.
4. لوحة المجموعة الفرعية أحادية الكيس
- أداء تلطيخ القدرة على البقاء: خلايا الدوران (500 س ز،5 دقائق، 4 درجة مئوية) باستخدام لوحة الدوار وغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من 1X PBS. إعداد حل الأسهم من خلية impermeant أمين التفاعلي صبغة (وصمة عار قابلية البقاء) المخفف 1:50 في 1X PBS. بعد ذلك، resuspend الكريات الخلية مع 100 ميكرولتر من هذا الحل المخزون مما أدى إلى حجم مطلق من 2 ميكرولتر من وصمة عار قابلة للحياة في بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
ملاحظة: ينبغي تحديد الكمية المثلى من وصمة عار القدرة على البقاء اللازمة من خلال إجراء منحنى المعايرة الجرعة. وبالإضافة إلى ذلك، وينبغي أن تستخدم المخففات محلول الأسهم وصمة عار قابلة للحياة في يوم واحد، ولا يتم تخزينها. راجع تعليمات الشركة المصنعة للحصول على مزيد من المعلومات حول كيفية إعادة تشكيل وصمة عار قابلية البقاء وتمييعها وتخزينها. - أثناء الحضانة، وإعداد كوكتيل من الأجسام المضادة في حجم مناسب من FACS العازلة (Ca2 + و Mg + برنامج تلفزيوني مجاني يحتوي على 0.1٪ BSA و 0.02٪ أزيد الصوديوم). غسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر من FACS العازلة، الطرد المركزي (500 × ز، 5 دقيقة، 4 درجة مئوية) وإعادة بناء كل بيليه مع 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة أو خليط التحكم المناسب. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
ملاحظة: يرجى أن تكون على علم بأن أزيد الصوديوم هو سام للخلايا. في البروتوكول الحالي تركيز أزيد الصوديوم في المخزن المؤقت للتدفق منخفض جداً (0.02٪ ) ويتم تشغيل عينات مباشرة بعد تلطيخ وبالتالي، لا تسبب أي مشكلة. إذا تم التخطيط للفرز الوظيفية المصب من الخلايا المفوّجة ، فقد يكون من المفيد تعويض عازلة FACS جديدة كل يوم من التجارب وعدم استخدام أي أزيد الصوديوم. عند استخدام العديد من الأجسام المضادة، ينصح بإضافة كمية مناسبة من "الرائعة وصمة عار العازلة" إلى كوكتيل من الأجسام المضادة لتعزيز النتائج. - اغسل الخلايا مرتين بـ 200 ميكرولتر من مخزن FACS العازلة و resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر من FACS + EDTA العازلة (FACS العازلة التي تحتوي على 1 mM EDTA). نقل العينات إلى أنابيب FACS المسماة. الاحتفاظ بالعينات عند 4 درجة مئوية وحمايتها من الضوء حتى الحصول عليها.
ملاحظة: الخلايا المناعية لديها ميل إلى أن تكون لزجة. من أجل تقليل كل من خطر انسداد وعدد من doublets فمن المستحسن إضافة 1 mM EDTA إلى المخزن المؤقت تدفق النهائي.
5. T الخلية لوحة فرعية
- أداء تلطيخ القدرة على البقاء: خلايا الدوران (500 س ز،5 دقائق، 4 درجة مئوية) باستخدام لوحة الدوار وغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من 1X PBS. إعداد حل الأسهم من خلية impermeant أمين التفاعلي صبغة (وصمة عار قابلية البقاء) المخفف 1:50 في 1X PBS. بعد ذلك، resuspend الكريات الخلية مع 100 ميكرولتر من هذا الحل المخزون مما أدى إلى حجم مطلق من 2 ميكرولتر من وصمة عار قابلة للحياة في بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
- أثناء احتضان العينات، إعداد كوكتيل الأجسام المضادة تلطيخ خارج الخلية في حجم مناسب من 1x FACS العازلة. غسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر من 1x FACS العازلة، تدور عليهم (500 × ز،5 دقيقة، 4 درجة مئوية) و resuspend كل بيليه مع 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة أو خليط التحكم المناسب. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
- تنفيذ تلطيخ داخل الخلايا مع تثبيت وطقم permeabilization اتباع تعليمات الشركة المصنعة. اغسل الخلايا مرتين بـ 200 ميكرولتر من 1x FACS buffer و resuspend في 200 ميكرولتر من حاجز التثبيت. احتضان لمدة 40 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
- أثناء الحضانة ، قم بإعداد مزيج من الأجسام المضادة (التلطيخ داخل الخلايا) في حجم مناسب من 1x permeabilization وغسيل العازلة. جمع الخلايا عن طريق الغزل (750 × ز،5 دقيقة، 4 درجة مئوية) وغسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر من 1x بيرم / غسل العازلة.
ملاحظة: التثبيت والنتائج permeabilization في الخلايا التي تميل إلى أن تكون أصعب قليلاً بيليه بشكل صحيح. من أجل تقليل فقدان الخلايا خلال خطوات الغسيل اللاحقة، وزيادة قوة الطرد المركزي إلى 750 x ز. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضاً تطبيق دورة غزل أطول. ومع ذلك، فإن هذا يؤدي إلى وقت أطول بكثير التي هي مطلوبة لإعداد الخلايا. - تدور الخلايا (750 س ز،5 دقيقة، 4 درجة مئوية) و resuspend كل بيليه مع 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة أو خليط التحكم المناسب. احتضان لمدة 40 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
- غسل الخلايا مرتين مع 200 ميكرولتر من 1x بيرم / غسل العازلة وإعادة تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من FACS + EDTA العازلة. نقل العينات إلى أنابيب FACS المسماة. الاحتفاظ بالعينات عند 4 درجة مئوية وحمايتها من الضوء حتى الحصول عليها.
ملاحظة: بالنسبة لكل جسم مضاد، يجب تحديد التركيز الأمثل من خلال إجراء منحنى المعايرة بالجرعة. يمكن أن يختلف التركيز بين الأجسام المضادة بشكل كبير: تم استخدام CD3 و CD80 مع عامل تخفيف 1:1 ، في حين تم استخدام CD11b و CD4 مع عامل تخفيف 1:6400. عند المعايرة تركيز الأجسام المضادة استخدام نفس العدد من الخلايا التي سيتم استخدامها خلال التجارب.
6- التعويض، والضوابط المناسبة، والبوابات
- إعداد التجربة
- مرة واحدة تم تحديد تركيز الأجسام المضادة الأمثل تشغيل الضوابط الملطخة والملطخة واحدة للتعويض لضبط التداخل الطيفي.
ملاحظة: تشغيل كافة عناصر التحكم التعويض مع كل من الخلايا والخرز التعويض. استخدام كل ما يولد النتائج ألمع (أعلى MFI من الأحداث الإيجابية) للتعويض. MFI تعني متوسط شدة الفلورس، وغالباً ما تستخدم لوصف وتحديد متوسط شدة الإشارة المتولدة، وبالتالي، مستوى التعبير عن الأجسام المضادة. - تشغيل الفلوريسنس ناقص واحد (FMO) عناصر التحكم و isotype عناصر تحكم عند بدء تجربة متعددة الألوان جديدة. مزيد من التفاصيل بشأن FMO وقد نشرت سابقا19.
- تحديد الأمثل لمنطقة التشتت إلى الأمام (FSC-A) الجهد والجهد منطقة تشتت الجانب (SSC-A) من أجل الكشف عن السكان الكريات البيض في الضوابط غير الملطخة من كل نوع الأنسجة.
ملاحظة: عملية التثبيت و permeabilization يغير أبعاد الخلية. وهكذا، فإن الفولتية FSC-A وSSC-A للوحة المجموعة الفرعية أحادية الخلية و T مجموعة فرعية تختلف اختلافا كبيرا. من أجل العثور على الفولتية المثلى لتي الخلية مجموعة فرعية الفريق، استخدام الخلايا التي كانت واحدة ملطخة CD3 والبوابة الخلفية نحو السكان الكريات البيض مع ضبط القيم FSC-A وSSC-A.
- مرة واحدة تم تحديد تركيز الأجسام المضادة الأمثل تشغيل الضوابط الملطخة والملطخة واحدة للتعويض لضبط التداخل الطيفي.
- استراتيجية الغاتينغ
- مرة واحدة تم تحديد الأمثل FSC-A و SSC-A الجهد، اقامة بوابة رئيسية على السكان الكريات البيض.
ملاحظة: قبل كل تجربة معايرة مقياس المقاييس باستخدام حبات المعايرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتشغيل الخرز غير المطّط. وينبغي أن يكون للسكان الكريات البيض من نقاط زمنية مختلفة خصائص FSC وSSC قابلة للمقارنة (الاختلافات الطفيفة بين أنواع الأنسجة ومن المتوقع أن تكون طبيعية). إذا FSC وSSC يختلف مشكلة كبيرة اطلاق النار على مقياس الدراجات الكهربائية وتوليد العينة. - استبعاد المضاعفة: مؤامرة FSC-A (محور ص) و FSC-H (محور س). يظهر Singlets كقطر من هذه المؤامرة. البوابة على العزاب.
- استبعاد الخلية الميتة: مؤامرة FVS510 (وصمة البقاء) (س المحور) و FSC-A (محور ص). الخلايا الميتة سوف تظهر كالأحداث الإيجابية، وبالتالي بوابة على الخلايا الحية.
ملاحظة: الخلايا السالبة true ستكون مرئية في عناصر التحكم غير المُطَمَّى. وهكذا، ضبط هذه البوابة لكل مجموعة من العينات عند تشغيل عناصر التحكم غير الملطخة قبل عينات ملطخة. مزيد من الغوط يعتمد على لوحة الأجسام المضادة ونوع الخلية التي يتم التحقيق. ويمكن الاطلاع على استراتيجيات الغات لكل لوحة تستخدم في هذا البروتوكول في الشكل 1 والشكل 4، على التوالي.
- مرة واحدة تم تحديد الأمثل FSC-A و SSC-A الجهد، اقامة بوابة رئيسية على السكان الكريات البيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم أدناه وصف النتائج التمثيلية من كل من لوحة المجموعة الفرعية أحادية الخلية و T-cell.
يوضح الشكل 1 استراتيجية البوابات الهرمية للوحة الفرعية أحادية الخلايا على الخلايا المناعية التي تم جمعها من نخاع العظم للحيوانات المعالجة DMM. واستخدمت نفس الاستراتيجية وتحققت في جميع أنواع الأنسجة الأخرى. عند إعداد التجربة، تم تحديد الجهد في منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبية (SSC-A) لكل نوع من الأنسجة لتحديد أحاديات الخلايا/الضامة واستبعاد الخلايا T-cells والحطام (G1). خلال كل تجربة، تم تحليل عناصر التحكم غير المطّوعة لكل نوع من الأنسجة، وتم تعديل الجهد FSC-A و SSC-A عند الضرورة. ومن المتوقع أن تظل الفولتية متشابهة مع مرور الوقت ، إذا تغيرت المعلمات بشكل كبير انسداد مقياس cytometer المحتمل. وعلاوة على ذلك، استخدمت الضوابط غير المطّهية لتحديد السلبيات الحقيقية للثّابة الميتة/الحيّة وتم تعديل البوابات في كل مرة أجريت فيها التجربة وفقًا لذلك (الشكل 2A). عند تصميم التجربة، ينبغي اختيار الفلوروكررومات بعناية، وعادة ما يتم إقران علامات السطح ذات التعبير المنخفض مع الفلوروكرومات الساطعة (على سبيل المثال، هنا تم استخدام أليكسا فلور 647 لـ CD206). توجد بقع مختلفة ميتة / حية يمكن اكتشافها بواسطة أطوال موجية مختلفة؛ هنا، تم استخدام FVS510.
يوضح الشكل 3 بيانات العينة من الخلايا المناعية المعزولة من الأنسجة الزليلية والملطخة بعلامات سطحية خارج الخلية بعد 6 أسابيع من تلقي الحيوانات إما جراحة DMM أو صورية للتحكم. يمكن التعرف بسهولة على جميع المجموعات الفرعية باستخدام البروتوكول في كل من دراسة والسيطرة على الحيوانات. وبوجه خاص، يمكن رؤية الاختلافات بين المجموعات للمجموعات الفرعية الضامة (نسبة أعلى من Ly-6C+/MHC-II-الضامة (G7) في مجموعة DMM) والتعبير عن الضامة M1 و M2 (نسبة أعلى من الضامة M2 في مجموعة DMM).
الشكل 4 يتصور استراتيجية التراتبية الهرمية للوحة الخلايا التائية خارج الخلية وداخل الخلايا على الخلايا المناعية المعزولة عن طحال الحيوانات المعالجة DMM. المبادئ هي مطابقة لتلك المستخدمة للوحة أحادية. ومع ذلك، عملية التثبيت و Permeabilization تغيير حجم وكثافة الخلايا. وبالتالي، يجب تحديد معلمات FSC وSSC النموذجية باستخدام عملية النسخ من خلايا CD3+ عند إعداد التجربة لأول مرة لكل نوع خلية. بعض الفلوروكرومات تميل إلى تجميع مع مرور الوقت (على سبيل المثال، PE التي تم استخدامها مع FoxP3 هنا). يمكن أن مجاميع يحتمل تعديل النتائج بسبب السطوع العالية التي تؤثر على التداخل الطيفي والتعويض. وهكذا، كانت جميع الأجسام المضادة الدوامة ونسج في كل مرة قبل استخدامها من أجل تقليل المجاميع. وبالإضافة إلى ذلك، استُخدمت استراتيجية البوابات لزيادة الحد من تأثير المجاميع (G2). أثناء إعداد التجارب fluorescence ناقص واحد ضوابط (FMOs) تم تنفيذها لكل الأجسام المضادة. يتم عرض بيانات العينة في الشكل 2B, 2C.
الشكل 5 والشكل 6 تظهر الخلايا المناعية التي كانت معزولة عن الغدد الليمفاوية(الشكل 5)والأنسجة الزليلي(الشكل 6)وملطخة باستخدام بروتوكول لوحة الخلايا T 4 أسابيع بعد تلقي الحيوانات إما DMM أو صورية السيطرة على الجراحة. وتظهر البيانات نسبة أعلى من خلايا Th1 في الحيوانات DMM (G9) في كلا النسيج. وعلاوة على ذلك، فإن التلطيخ داخل الخلايا للخلايا التنظيمية T (G11) وخلايا Th17 (G12) ناجح باستخدام البروتوكول ويمكن الكشف عن الاختلافات بين المجموعات.
الشكل 1: استراتيجية البوابات الهرمية للغداد الخلوي التدفقي باستخدام التلطيخ خارج الخلية لتحديد أحاديات الخلايا/الضامة و المجموعات الفرعية الخاصة بها. يتم تحديد الخلايا النخاعية في المقام الأول باستخدام مبعثر إلى الأمام / الجانب (FSC-A وSSC-A) مؤامرة نقطة (G1). بعد ذلك، يتم الكشف عن العزب باستخدام FSC-A و FSC-H (G2) وبعد ذلك يتم تحديد الخلايا الحية (G3). وتصنف الخلايا من G3 باستخدام Ly-6G لتحديد العدلات (G4) و CD11b ل monocyte /الضامة (G5a). يستخدم MHC-II لتحديد الخلايا التشجر (G5b) بين الخلايا الإيجابية CD11b ويستخدم F4/80 لتحديد بين الضامة (G6) والموحدات (G12). وتصنف الضامة كذلك في مجموعات فرعية باستخدام Ly-6C و MHC-II (Ly-6C+/MHC-II-الضامة (G7)؛ Ly-6C-/MHC-II- الأنسجة الضامة المقيمين (G8); Ly-6C-/MHC-II+ الدم نشأت الضامة (G9)). ويمكن اختيار المزيد من المجموعات الفرعية من مجموع الضامة و المجموعات الفرعية المعنية بها باستخدام CD206 و CD80 (M1: CD80+/CD206 - (G10)؛ M2: CD80-/CD206+ (G11)). وتصنف أكثر monocytes باستخدام MHC-II وDD11c (MHC-II-/CD11c-monocytes (G13); MHC-II +/CD11c- أحادية (G14)). ثم يتم تصنيف مستوى التنشيط باستخدام تعبير Ly-6C وينقسم إلى منخفض (G15) ومتوسط (G16) وعالي (G17). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بيانات عينة توضح عناصر التحكم المناسبة في كل من لوحة أحادية الخلايا و T. (أ)تم حصاد الأنسجة الزليلية بعد 6 أسابيع من عملية جراحية من نوع DMM (DMM) أو جراحة تحكم صورية (صورية) وكان تعليق خلية واحدة ملطخًا باستخدام علامات سطح الخلايا الخارجية. خلال كل تجربة استخدمت الخلايا غير الملطخة لتحديد السلبيات الحقيقية لل stain/alive الميتة ولضبط البوابات (Control). يتم عرض وضع البوابات باستخدام الخلايا غير المطّعّة في اللوحة A.(B+C)تم حصاد خلايا الطحال من التحكم غير المعالجة، وتعليق خلية واحدة تم إنشاؤها وملطخة باستخدام علامات إضافية وداخل الخلايا. تم إنشاء ضوابط الفلورسنتات-ناقص واحد (FMO) عن طريق تلطيخ الخلايا مع لوحة الأجسام المضادة بأكملها في عداد واحد فقط في عداد المفقودين. يتم عرض بيانات العينة لكل من الأجسام المضادة داخل الخلايا. (ب) FMO -RORgt و (C) FMO -Fox-P3. وقد تم تنفيذ هذه اللوحات والأجسام الخارجية المستخدمة لتعيين كل بوابة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تلطيخ خارج الخلية من أحاديات / الضامة معزولة عن سينوجم الفئران. تم جمع عينات الأنسجة بعد 6 أسابيع من الفئران تلقى إما DMM- جراحة (DMM) أو صورية السيطرة على الجراحة (صور). ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات بشأن البوابات المستخدمة في الشكل 1. وتبين بيانات العينة أن جميع المجموعات الفرعية يمكن أن تحدد بشكل موثوق ويمكن رؤية الاختلافات بين المجموعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: استراتيجية البوابات الهرمية للخلايا التدفقية باستخدام تلوين خارج الخلية وداخل الخلايا لتحديد الخلايا التائية و مجموعاتها الفرعية. يتم تحديد الخلايا التائية في المقام الأول باستخدام مبعثر إلى الأمام / الجانب (FSC-A وSSC-A) مؤامرة نقطة (G1). ونظرا لطبيعة المجاميع المستخدمة الأجسام المضادة ينبغي استبعاد باستخدام CD3 و CD4 (G2). بعد ذلك، يتم الكشف عن العزب باستخدام FSC-A و FSC-H (G3) وبعد ذلك يتم تحديد الخلايا الحية (G4). وتصنف الخلايا من G4 باستخدام NK1.1 لتحديد الخلايا القاتلة الطبيعية (G5) وCD3 لتحديد الخلايا T-الخلايا (G6). يتم تحديد مستوى التنشيط باستخدام CD69 (G6b). وبعد ذلك، يتم استخدام CD4 و CD8 لتحديد خلايا T-القاتل (CD4-/CD8+ (G7)) وخلايا T-مساعد (CD4+/CD8- (G8)). وتصنف الخلايا T-المساعد إلى Th-1 (C-X-CR3+/CCR4- (G9)) وخلايا Th-2 (C-X-CR3-/CCR4+ (G10)) باستخدام C-X-CR3 (CD183) وCR4 (CD194). وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد الخلايا TH-17 (CD25+/RORgt+ (G11)) والخلايا التنظيمية T (CD25+/Fox-P3+ (G12)) باستخدام علامات داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد مجموعات فرعية من خلايا الذاكرة من خلايا T-مساعد باستخدام CD44 و CD62L (CD44-/CD62L+ خلايا الذاكرة التائية الساذجة (G13); CD44+/CD62L+ خلايا الذاكرة T المركزية (G14); CD44+/CD62L-تأثير خلايا الذاكرة T (G15)). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تلطيخ الخلايا الخارجية وداخل الخلايا للخلايا التائية المعزولة عن استنزاف الغدد الليمفاوية للفئران. تم جمع عينات الأنسجة بعد 4 أسابيع من الفئران تلقى إما DMM- جراحة (DMM) أو صورية السيطرة على الجراحة (صوري). ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات بشأن البوابات المستخدمة في الشكل 4. وتبين بيانات العينة أن جميع المجموعات الفرعية يمكن أن تحدد بشكل موثوق ويمكن رؤية الاختلافات بين المجموعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تلطيخ الخلايا خارج الخلية وداخل الخلايا من الخلايا التائية المعزولة من الأنسجة الزليلية للفئران. تم جمع عينات الأنسجة بعد 4 أسابيع من الفئران تلقى إما DMM- جراحة (DMM) أو صورية السيطرة على الجراحة (صوري). ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات بشأن البوابات المستخدمة في الشكل 4. وتبين بيانات العينة أن جميع المجموعات الفرعية يمكن أن تحدد بشكل موثوق ويمكن رؤية الاختلافات بين المجموعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تصميم واختبار الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول لتحديد موثوق مجموعات فرعية مختلفة من كل من أحادية الخلايا / الضامة والخلايا التائية داخل الطحال مورين، نخاع العظام، والغدد الليمفاوية، والأنسجة الزليلي في نموذج مورين من هشاشة العظام (الزراعة العضوية). يمكن تعديل البروتوكول الحالي بسهولة للتحقيق في أنواع الأنسجة المختلفة ، أو أنواع الخلايا الأخرى عن طريق تبادل الأجسام المضادة ، ويمكن استخدامه لنماذج مورين بديلة من الزراعة العضوية. عند اختبار أنواع الأنسجة الأخرى، من المهم اختبار خصوصية كل جسم مضاد كتعبير عن علامات سطح الخلايا المناعية تختلف في كل نسيج20. وبالإضافة إلى ذلك، عند تبادل الأجسام المضادة، فمن الضروري إجراء منحنى المعايرة جرعة لتحديد التركيز الأمثل للأجسام المضادة، فضلا عن تكرار عملية التعويض لمعالجة التغيرات في التداخل الطيفي.
في البروتوكول الحالي، OA تم حث باستخدام نموذج الماوس DMM18. النماذج الحيوانية الأكثر شيوعاً والمتعارف عليها هي في الماوس، لأن هذا النوع يوفر مزايا متعددة الأوجه في التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية من OA ما بعد الصدمة17. في الماوس على وجه الخصوص، وقد وصفت النماذج الجراحية وغير الجراحية OA17: الأكثر شيوعا هي زعزعة الغضروف المفصلي (DMM)، والtransection الجراحية من الرباط الصليبي الأمامي (ACLT) و تمزق دوري أبطال آسيا غير الجراحية (ACLR)، على التوالي21. كل هذه النماذج الحيوانية مناسبة تماما للتحقيق في دور الالتهاب الخلوي في أمراض الزراعة العضوية بعد الصدمة وقد تم اختبار البروتوكول الحالي بنجاح لجميع النماذج الحيوانية المذكورة سابقا في المختبر. على الرغم من أن جميع النماذج الحيوانية المذكورة أعلاه أنشئت وقد وصفت في الأدبيات، كل لديه نقاط القوة الخاصة به والقيود التي نوقشت بالتفصيل في مكان آخر17 وهكذا يتم مناقشتها لفترة وجيزة فقط أدناه. تخضع جميع النماذج الجراحية للنهج الجراحي وعملية التئام الجروح والاستجابة الالتهابية المرتبطة بها. عند تقييم مساهمة الخلايا الالتهابية في تطوير الزراعة العضوية اللاحقة للصدمة ، قد تكون استجابة التئام الجروح الالتهابية هذه بمثابة مُربكة ، خاصة خلال النقاط الزمنية المبكرة بعد التدخل. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي إجراء إجراءات DMM و ACLT بطريقة موحدة للغاية لتقليل التباين بين الحيوانات. جراحة ACLT هو أكثر صعوبة بكثير لتعلم من جراحة DMM ويتطلب التعرض الجراحي أكبر من DMM لتحديد بشكل نهائي وضمان الإصابة فقط إلى دوري أبطال آسيا وتجنب الضرر iatrogenic للأنسجة المشتركة الأخرى18. غير الجراحية تمزق ACL هو وسيلة موحدة وفعالة جدا من الحث على الزراعة العضوية ما بعد الصدمة. ومع ذلك، جهاز متخصص الذي ينطبق على حمولة واحدة اجهاد تسيطر على الساق من الركبة المرنة أمر ضروري. هذا الجهاز يجب معايرة واختبار من أجل الحصول على نتائج قابلة للمقارنة وموثوق بها. بالإضافة إلى ذلك، فإن نموذج ACLR يؤدي إلى ضرر شديد جداً وتدريجية مشتركة في الفئران مع تآكل ملحوظ من الهضبة التيبية الوسيطة الخلفية22 التي لا ينظر إليها مع إصابة ACL في الأنواع الأخرى بما في ذلك البشر.
من أجل توصيف شامل لعملية الالتهابات ومكونها الخلوي أثناء تطوير الزراعة العضوية ، من المستحسن ليس فقط التحقيق في الأنسجة الزليلي ولكن أيضًا الغدد الليمفاوية المحلية وكذلك الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، مثل الطحال ونخاع العظام. وقد تميزت أنماط التصريف اللمفاوي من مفصل الركبة في الفئران والسوائل الليمفاوية من المصارف مفصل الركبة من خلال كل من العقدة الليمفاوية الحرقفية والأربية في تشتتمتفاوتة 23,24. من أجل تسهيل المقارنة بين الحيوانات، قررنا في هذا البروتوكول لتجميع العقدة الليمفاوية الإربية والربيعة. في المقابل ، بينما على مقربة من الركبة ، فإن العقدة اللمفاوية الزهية تستنزف القدم الخلفية ولا تلعب دورًا أثناء العمليات الالتهابية للركبة.
الفئران لديها حجم صغير من الأنسجة الزليلية داخل المفصل25 وعزل الخلايا المناعية هنا لا تزال صعبة. في البروتوكول الحالي، تم تكييف تقنيات الحصاد للأنسجة الزليلية للسماح بعزل أكبر عدد من الخلايا المناعية. ولذلك، فإن تقنية الحصاد تشمل الراحات فوق وfrapatellar فضلا عن وسادة بدعة infrapatellar، نظرا لارتفاع عدد الخلايا المناعية26. تم تحسين عملية الهضم واختيار الإنزيم لهضم الغشاء الزليلي والأنسجة الدهنية بشكل كامل ، مع ترك الوتر ، والركتيلا والغضاريف غير منقّح. وهكذا، فإن البروتوكول الحالي يقدم طريقة قابلة للتكاثر من حصاد الخلايا المناعية من الأنسجة الزليلية.
تحليل تدفق cytometry له مزايا متعددة عند التحقيق في عمليات المناعة الخلوية أثناء تطوير الزراعة العضوية; ومع ذلك، هذه التقنية لها قيود. نظراً لصغر عدد الخلايا المناعية في النسيج الزليلي، فمن الضروري تجميع عينات الأنسجة من حيوانين على الأقل للحصول على عينة واحدة. ونظرا للعدد الكبير من الفلوروكررومات والألوان المستخدمة في هذا البروتوكول، يجب إيلاء اهتمام خاص للتعويض الدقيق عن التداخل الطيفي المحتمل لكل نوع من أنواع الأنسجة، كما يجب إعادة تقييم التعويض بشكل متسق طوال استخدام هذه التقنية. ونظرا للعدد الكبير من العلامات المتاحة والتباين الكبير بين الدراسات لتحديد عدد معين من السكان، فإن هناك قيدا آخر محتمل هو اختيار العلامات المستخدمة لتحديد الخلايا19. يسمح قياس التدفق للخلايا بالكمية لـ "الأحداث"، التي لا تنسق بالضرورة إلى الخلايا الكلية. من أجل الحصول على تحليل كمي حقا ، يحتاج المرء إما الحصول على الخرز العد في وقت واحد عند تشغيل تحليل التدفق أو عد الخلايا في تعليق خلية واحدة مسبقا للحصول على الأرقام المطلقة (كما هو الحال هنا). وعموماً، يمكن تكييف مبادئ هذا البروتوكول (على سبيل المثال كيفية تصميم وإعداد لوحة تدفق أو تقنيات تستخدم في إعداد عمليات تعليق أحادية الخلية) مع العينات البشرية. ومع ذلك، تختلف العلامات السطحية للخلايا المناعية البشرية عن خلايا الزين، وبالتالي، يجب اختيار الأجسام المضادة المناسبة واختبارها. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تحديد مدة تحلل RBC وحجم مناسب من المخزن المؤقت لأنها مختلفة على الأرجح. قبل تكييف الأساليب من هذا البروتوكول إلى الأنواع الأخرى أو الأنسجة اختبار دقيق من كل خطوة ضروري لضمان أن أساليب تعمل على النحو المنشود.
على الرغم من القيود، لا يزال تحليل تدفق الخلايا الخلوية للخلايا المناعية تقنية قوية تسمح بتحديد كل من الخلايا الأحادية الخلايا الفرعية على مستوى الخلية المفردة. على وجه الخصوص، يقدم البروتوكول الحالي تقنية موثوقة وقابلة للتكرار يمكنها تحديد وقياس الاستجابة المناعية الخلوية أثناء تطوير الزراعة العضوية في الأنسجة الزليلية والأعضاء اللمفاوية الثانوية. في المستقبل، قد تساعد هذه التقنية على تحديد خصائص الاستجابة المناعية في مختلف النماذج الحيوانية التي تحفز هشاشة العظام، وتقيّم فيما بعد فعالية أدوية التضمين المناعي على هذا المرض الموهن.
في الختام، هذا البروتوكول تدفق قياس الخلايا يصف طريقة مفصلة وقابلة للتكرار لتحديد monocytes / الضامة والخلايا التائية باستخدام كل من خارج وداخل الخلايا تلطخ المقايسات داخل الطحال، ونخاع العظام، والعقد الليمفاوية والأنسجة الزليلي باستخدام نموذج الماوس هشاشة العظام الجراحية المنشأة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر أندرو ليم، دكتوراه وجايلز بيست، دكتوراه لمساعدتهم في إعداد تدفق مقياس المقاييس. وقد دعم هذا المشروع دويتشه هـيـزنغـسجيمينشافت (DFG-HA 8481/1-1) الذي مُنح لـ PH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
References
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
- Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
- Woolf, A. D., Pfleger, B.
- Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
- Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
- Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
- Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
- Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
- Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
- Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
- Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
- Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
- Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
- Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
- Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
- Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Lorenz, J., Grassel, S.
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A.
- Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
- Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).
