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Analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61008
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

Qui, descriviamo un protocollo di citometria di flusso dettagliato e riproducibile per identificare sottoinsiemi monociti/macrofamiglia e t-cell utilizzando saggi di colorazione extra e intracellulare all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale, utilizzando un modello chirurgico stabilito di osteoartrite murina.

Abstract

L'osteoartrite (OA) è una delle malattie muscolo-scheletriche più diffuse, che colpisce i pazienti affetti da dolore e limitazioni fisiche. Prove recenti indicano una potenziale componente infiammatoria della malattia, sia con cellule T che monociti/macrofagi potenzialmente associati alla patogenesi dell'OA. Ulteriori studi postularono un ruolo importante per sottoinsiemi di entrambi i lignaggi delle cellule infiammatorie, come i linfociti di Th1, Th2, Th17 e T-regulatory, e M1, M2 e macrofagi residenti con tessuto sinovi. Tuttavia, l'interazione tra la risposta cellulare infiammatoria sinoviale locale e sistemica e i cambiamenti strutturali nell'articolazione è sconosciuta. Per comprendere appieno il modo in cui le cellule T e i monociti/macrofagi contribuiscono all'OA, è importante essere in grado di identificare quantitativamente queste cellule e i loro sottoinsiemi contemporaneamente nel tessuto sinoviale, negli organi linfatici secondari e sistemicamente (la milza e il midollo osseo). Al giorno d'oggi, i diversi sottoinsiemi di cellule infiammatorie possono essere identificati da una combinazione di marcatori di superficie cellulare che fanno della citometria del flusso multi colore una potente tecnica nello studiare questi processi cellulari. In questo protocollo, descriviamo passi dettagliati per quanto riguarda il raccolto di tessuto sinoviale e organi linfatici secondari, nonché la generazione di sospensioni a singola cellula. Inoltre, presentiamo sia un saggio di colorazione extracellulare per identificare i monociti/macrofagi e i loro sottoinsiemi, sia un saggio di colorazione extra e intracellulare per identificare le cellule T e i loro sottoinsiemi all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale. Ogni fase di questo protocollo è stata ottimizzata e testata, con conseguente analisi altamente riproducibile che può essere utilizzata per altri modelli di mouse OA chirurgici e non chirurgici.

Introduction

L'osteoartrite (OA) è una malattia debilitante e dolorosa che coinvolge varie patologie di tutti i tessuti associati all'articolazione1. Colpisce circa il 3,8% della popolazione mondiale2, OA è una delle malattie muscolo-scheletriche più diffuse ed è quello di diventare la4a causa leader di disabilità in tutto il mondo entro il 20203. L'OA post-traumatico si verifica dopo un infortunio articolare e rappresenta almeno il 12% di tutto l'OA e fino al 25% di OA in articolazioni suscettibili comeil ginocchio 4,5. Inoltre, lesioni articolari aumenta il rischio di vita di OA di più di cinque volte6. Non tutti gli infortuni con instabilità apparentemente simile andranno a sviluppare OA, e quindi la definizione dei fattori che guidano il rischio di OA a lungo termine rimane difficile. È fondamentale per sviluppare trattamenti efficaci per prevenire e/o trattare l'OA post-traumatico, per indagare e definire meglio la patologia, le cause e i meccanismi specifici della lesione che predispongono all'OA1.

OA e la sua distruzione della cartilagine che definisce è stata precedentemente attribuita interamente allo stress meccanico e, pertanto, OA è stata considerata una malattia non infiammatoria2. Tuttavia, studi più recenti hanno mostrato un'infiltrazione infiammatoria delle membrane sinoviali e un aumento delle cellule infiammatorie nel tessuto sinoviale nei pazienti con OA rispetto ai controllisani 2, facendo luce su un componente infiammatorio come potenziale forza motrice in OA. Ulteriori studi hanno indicato che le anomalie sia nel profilo delle cellule T CD4 che in quello del CD8, nonché nei monociti/macrofagi del sistema immunitario innato possono contribuire alla patogenesi di OA2,7. Indagini dettagliate su queste anomalie hanno rivelato ruoli rilevanti per vari sottoinsiemi di cellule T2, come Th18, Th29, Th178 e T regulatory (Treg)popolazioni 10,11. Nonostante questa prova convincente, la relazione causale tra l'alterazione delle risposte delle cellule T e lo sviluppo e la progressione dell'OA è ancora sconosciuta2.

Oltre a specifiche cellule T che hanno un ruolo nell'OA, studi recenti suggeriscono che macrofagi polarizzati/attivati in modo differenziale possono essere associati alla patogenesi dell'OA12. In particolare, i macrofagi provenienti dai monociti del sangue si accumulano nel sinovio e si polarizzano in macrofagi attivati in modo classico (M1) o in alternativa macrofagi attivati (M2) durante lo sviluppo dell'OA, implicando una correlazione tra macrofagi derivati da monociti e OA13. Al contrario, alcuni sottoinsiemi di macrofagi popolano gli organi precocemente durante lo sviluppo e si autosufficiano il loro numero in una materia indipendentemonocita 14. Recentemente, una funzione di protezione articolare mediata da una barriera a giunzione stretta è stata mostrata per questi macrofagi residenti con tessuto sinoviale (STRMs)14. Questi risultati indicano che le anomalie in particolare i sottoinsiemi di macrofagio possono svolgere un ruolo cruciale durante lo sviluppo dell'OA. Tuttavia, le interazioni tra questa risposta cellulare infiammatoria e i cambiamenti strutturali nell'articolazione successiva al trauma sono sconosciute.

Storicamente, l'analisi delle cellule immunitarie nel tessuto sinoviale era limitata all'immunohistochimica (IHC) o all'espressione dell'mRNA mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR)si avvicina 15,16. Tuttavia, sia IHC che RT-PCR non hanno la capacità di identificare più tipi di cellule diverse e i loro sottoinsiemi contemporaneamente, limitando così l'applicabilità di questi metodi. Inoltre, L'IHC è limitato all'analisi di piccoli campioni di tessuto e può perdere accumuli di cellule infiammatorie focali. Nel corso degli ultimi anni, è stata sviluppata una miriade di marcatori di superficie per vari tipi di cellule, e sottoinsiemi di cellule immunitarie possono ora essere identificati in modo affidabile da combinazioni distinte di questi marcatori. A causa del costante progresso tecnico, i citometri di flusso sono ora in grado di identificare una moltitudine di diversi fluorocromi che consentono contemporaneamente l'analisi di grandi pannelli anticorpali multicolore.

La citometria del flusso fornisce ai ricercatori una potente tecnica che consente l'identificazione simultanea e la quantificazione di una moltitudine di cellule immunitarie e dei loro sottoinsiemi a livello di singola cellula. Abbiamo sviluppato e ottimizzato sia un saggio di colorazione extracellulare per identificare monociti/macrofagi e i loro sottoinsiemi, sia un saggio di colorazione extra/intracellulare per identificare le cellule T e i loro sottoinsiemi all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale. Ogni fase di questo protocollo è stato ottimizzato e testato con conseguente un saggio altamente riproducibile che può essere utilizzato per altri modelli di mouse OA chirurgici e nonchirurgici 17.

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Protocol

Il Comitato Etico Animale del Distretto Sanitario Locale di Sydney Settentrionale ha approvato tutte le procedure menzionate nel presente protocollo. I topi sono alloggiati e curati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali di laboratorio (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/6 maschi di 10-12 settimane.

NOTA: Per indurre oA post-traumatica, è stata eseguita la destabilizzazione chirurgica del menisco mediale (DMM) nell'articolazione di soffocamento destra. Informazioni dettagliate su questo modello animale sono state pubblicate da Glasson etal. In breve, l'anestesia generale è indotta in una camera di induzione utilizzando isoflurane e successivamente mantenuta utilizzando un cono naso. La gamba chirurgica viene rasata con una lama di rasoio e il sito chirurgico viene lavato e tamponato con etanolo per ridurre al minimo la contaminazione. L'animale viene quindi spostato al microscopio operativo e posto su un asciugamano sterile e la gamba drappeggiata con drappeggio di carta sterile per isolare il sito chirurgico e ridurre al minimo la contaminazione. Utilizzando il microscopio, viene realizzata una para-patella artrotomia mediale di 0,5 cm, la rotula luxated lateralmente, e il cuscinetto grasso infra-patella elevato per esporre il legamento menisco-tibiale mediale, che viene transected con forcelle di dissezione. L'articolazione viene lavata con salina sterile per rimuovere il sangue e la ferita viene chiusa in tre strati : capsula articolare, tessuto sottocutaneo (utilizzando materiale di sutura) e pelle (utilizzando colla tissurale chirurgica). I metodi descritti in questo protocollo, tuttavia, possono essere applicati ad altri modelli e metodi per indurre OA. OA può essere indotto in entrambi i lati dell'animale, e quando si raccolgono i tessuti, è importante raccogliere i linfonodi ipsilateri (drenaggio).

1. Isolamento della milza, midollo osseo contralaterale, linfonodi ipsilaterali che drenano il tessuto soffocante e sinoviale

  1. Eutanasia del topo per lussazione cervicale. Posizionare il topo in una posizione supina sotto un microscopio sezionante e pulire il torace, l'addome e le gambe con il 70% di etanolo. Aprire con attenzione la pelle sulla linea mediana per la lunghezza dell'addome utilizzando forbici dritte lasciando intatta la cavità addominale.
  2. Tirare delicatamente la pelle sul lato destro dell'animale lontano dal muscolo sottostante lasciando il tessuto adiposo sottocutaneo attaccato alla pelle. Normalmente, la trazione delicata da sola separerà la pelle e il tessuto adiposo sottostante dal muscolo. Le aderiscezioni sporadiche devono essere tagliate con forbici fini al fine di mantenere la tensione necessaria per separare i tessuti al minimo e ridurre la possibilità di danneggiare i linfonodi. Identificare un incrocio di tre vasi prendendo delicatamente in giro il tessuto adiposo situato sulla coscia utilizzando due forcelle curve sottili. Il linfonodo inguinale si trova all'incrocio e può essere identificato dalla sua forma ovoide e dal colore leggermente più scuro.
  3. Rimuovere il linfonodo inguinale usando le forcepi di sezionazione fine. Fare attenzione a non rompere la capsula. Rimuovere il grasso rimanente sulla superficie del linfonodo con le force e le force.
  4. Aprire la cavità addominale e identificare la milza. Tagliare la milza con forbici fini. Tirare delicatamente l'intestino da parte per esporre l'aorta e la sua biforcazione facendo attenzione a non danneggiarli, al fine di ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Il linfonodo iliacco è situato nel segmento terminale dell'aorta addominale e l'origine dell'arteria iliaca comune. Rimuovere il linfonodo iliac destro e procedere come descritto al 1.3.
  5. Rimuovere delicatamente la pelle di entrambi gli arti posteriori. Dizionare il femore sinistro pulerlo dal tessuto muscolare usando la lama e le forbici fini. Scollegare con attenzione sia l'articolazione soffocare che l'articolazione dell'anca lasciando intatto l'intero osso e rimuovere il femore.
  6. Identificare il tendine rotuleo dell'articolazione soffocante destra, quindi rimuovere il tessuto muscolare adiacente prossimale a questo utilizzando forbici fini fino a quando circa 5mm di tendine quadricipite prossima alla rotula è esposto. Successivamente, tagliare il tendine del quadricipite circa 3-4mm prossimale alla rotula per formare una maniglia e utilizzando le forcelli sottili tirare delicatamente lontano dall'articolazione. Questo renderà visibili i bordi dell'attaccamento della capsula articolare al femore, e utilizzando una lama del bisturi tagliata con cura lungo i bordi della capsula articolare su entrambi i lati, a partire dal femore che va verso la tibia, al fine di massimizzare la quantità di membrana sinoviale che viene raccolta. Durante il taglio è importante mantenere una trazione delicata sul tendine del quadricipite e mettere in pausa quando il blocco di tessuto sinoviale è attaccato solo alla tibia. In questa fase il cuscinetto di grasso intraarticolare è ora chiaramente visibile distale alla rotula e può essere delicatamente staccato dall'articolazione e dall'aspetto anteriore del menisci utilizzando la lama. Successivamente, tagliare lungo la parte rimanente della capsula articolare (porzione tibicale) per rimuovere il blocco di tessuto sinoviale.
    NOTA: Questo passaggio deve essere fatto in modo molto preciso per consentire risultati affidabili. Dopo aver completato la dissezione, il "blocco di tessuto sinoviale" dovrebbe consistere nella rotula, nel tendine della rotula, nel cuscinetto grasso inppoderale, nel rivestimento sinoviale supra e infrapatellar e nella capsula articolare associata anteriore ai legamenti collaterali. Mantenere tutti i tessuti umida durante la dissezione utilizzando la soluzione salina dello 0,9%.
    NOTA: Inserire ogni campione di blocco di tessuto sinoviale in un pozzo separato di una piastra da 24 possidbili etichettata contenente 1,5 ml di RPMI 1640 medio. Unire sia il liaco che il linfonodo inguinale in un pozzo e mettere in comune i tessuti di due topi.

2. Generazione di sospensioni a singola cellula da ciascun tessuto

NOTA: Per garantire un numero sufficiente di cellule per l'analisi del flusso, è necessario mettere in comune i tessuti sinoviali di due topi. Nell'attuale protocollo, mettere in comune tutti i tessuti degli stessi due topi per mantenere l'analogia. Inoltre, i linfonodi iliac e inguinali sono stati combinati per ogni animale con un totale di 4 linfonodi per ogni campione. In generale, i numeri cellulari nella milza, nel midollo osseo e nei linfonodi di un animale sono sufficienti per condurre l'analisi del flusso e il protocollo può essere applicato. Tuttavia, quando si utilizzano tessuti da un solo animale, potrebbe essere necessario regolare i tempi di llysing.

  1. La milza
    1. Posizionare le due milza in pool su un colino a cellule da 70 m sopra un tubo da 15 mL. Macerare delicatamente le milza attraverso il filtro mesh utilizzando uno stantuffo sterile di siringa da 3 mL. Lavare frequentemente il colino con un totale di 6 mL di RPMI 1640 medio integrato con 10% FBS.
    2. Far girare le cellule (500 x g, 5 min, RT) e risspendere il pellet in 5 mL di globuli rossi (RBC) lysis buffer. Incubare per 5 min a RT e fermare la reazione diluendo il tampone di lisi con 10 mL di PBS. Ruotare le celle (500 x g, 5 min, RT) e ripetere questo passaggio una volta o fino a quando non ci sono più RBC nel pellet.
      NOTA: Rifilo la sospensione utilizzando un colino per cellule da 30 m in un nuovo tubo da 15 mL tra i due cicli di laliggio per rimuovere le cellule coagulate.
    3. Una volta completata la lissidazione, far girare le celle (500 x g, 5 min, RT), scartare il supernatant e risalire il pellet in 1 mL di PBS. Contare il numero di celle vive su un emocitometro utilizzando l'esclusione blu Trypan.
  2. I linfonodi
    1. Posizionare i quattro linfonodi in pool su un colino a cellule di 70 m sopra un tubo da 15 mL. Prendere delicatamente in giro i linfonodi a parte in una sospensione a singola cellula premendo con uno stantuffo sterile di siringa da 3 mL. Lavare frequentemente il colino con un totale di 6 mL di RPMI con 10% FBS.
    2. Far girare le cellule (500 x g, 5 min, RT), scartare il supernante e risuspendere il pellet in 500 L di PBS. Rifilo la sospensione utilizzando un colino per cellule da 30 m in un nuovo tubo da 15 mL per rimuovere le cellule coagulate. Contare il numero di celle vive su un emocitometro utilizzando l'esclusione blu Trypan.
  3. Il midollo osseo
    1. Afferrare con cura il femore intatto usando un pollice tissutale senza fratturarlo. Tagliare l'estremità del femore prossimale con una forbice affilata al fine di facilitare lo sciacquone dell'osso. Girare il femore e posizionare un ago di 23 G al centro della tacca interconditare del femore. Durante l'applicazione di una leggera pressione ruotare l'ago tra il pollice e l'indice per praticare un foro nella tacca interconditare per entrare nella cavità ossea.
      NOTA: A volte le particelle dell'osso possono ostruire l'ago dopo aver forato il foro, per evitare un'alta pressione non necessaria durante lo sciacquone di un cambio di ago prima di sciacquare.
    2. Sciacquare l'osso con 6 mL di RPMI con 10% FBS (o fino a quando lo sciacquone diventa bianco) utilizzando una siringa da 10 mL con un ago da 23 G su un colino a cellule da 70 m che viene posto su un tubo da 15 mL. Premere delicatamente il midollo osseo attraverso il colino cellulare con uno stantuffo di siringa da 3 mL e sciacquare il colino con altri 3 mL di RPMI.
      NOTA: Le ossa dovrebbero apparire bianche una volta che tutto il midollo è stato lavato completamente.
    3. Ruotare le celle (500 x g, 5 min, RT) e rissuspendere il pellet in 5 mL di buffer di lysi RBC. Incubare per 5 min a RT e fermare la reazione diluendo il tampone di lisi con 10 mL di PBS.
    4. Far girare le celle (500 x g, 5 min, RT), scartare il supernante e risundere il pellet in 1 mL di PBS. Rifilo la sospensione utilizzando un colino per cellule da 30 m in un nuovo tubo da 15 mL per rimuovere le cellule coagulate. Contare il numero di celle vive su un emocitometro utilizzando l'esclusione blu Trypan.
  4. Il tessuto sinoviale
    1. Tagliare a dadini i due blocchi di tessuto sinoviale in piccoli pezzi con una forbice chirurgica fine. Trasferire i campioni con mezzo in un tubo da 15 mL. Risciacquare il vecchio pozzo con ulteriori 0,5 mL di RPMI per ottenere le cellule rimanenti e tessuti sinoviali, trasferire al tubo di falco (volume finale 2 mL).
      SUGGERIMENTO: Utilizzare una pipetta di trasferimento e tagliare la punta in cui il diametro si allarga in questo passaggio.
    2. Ricostituire l'enzima e l'aliquot secondo le istruzioni del produttore (ad esempio, Liberase). Aggiungere un enzima sufficiente per ottenere una concentrazione finale di 1 unità/mL (un totale di 2 unità per campione). Digerire a 37 gradi centigradi per 2 h utilizzando un rotore MACS.
    3. Fermare la digestione aggiungendo 8 mL di RPMI con 10% FBS e filtrare le sospensioni delle cellule attraverso un colino a cellule da 70 m in un nuovo tubo da 15 mL. Risciacquare il vecchio tubo da 15 mL con altri 5 mL di RPMI con 10% di supporto FCS e filtrare le sospensioni delle cellule attraverso lo stesso colino cellulare nel nuovo tubo (15 mL volume finale).
    4. Far girare le cellule (500 x g, 10 min, RT), scartare supernante e risuspendere il pellet in 500 L di PBS. Contare il numero di celle vive su un emocitometro utilizzando l'esclusione blu Trypan.

3. Allocazione delle cellule

  1. Etichettare due piastre da 96 alimenti (forma U-bottom) con tipo di tessuto, ID animale e pannello anticorpale designato. In questo protocollo vengono utilizzati in totale due pannelli anticorpo: pannello sottoinsieme Monocite (colorazione extracellulare) e pannello sottoinsieme di cellule T (colorazione extra e intracellulare).
  2. Fornire 5 x 105 celle per pozzo utilizzando le rispettive sospensioni a singola cellula.
    NOTA: durante l'impostazione dell'esperimento, valutare il numero assoluto di cellule previsto per gruppo e tipo di tessuto (gli animali trattati hanno un numero di cellule più elevato nei tessuti rispetto agli animali di controllo). Quando si riempì il pellet cellulare durante l'ultima fase di generazione di sospensioni a singola cella, scegliere una quantità appropriata di PBS per ottenere una concentrazione di 5 x10 5 per 200 L. La piastra di 96 po 'ben utilizzata qui può contenere un massimo di 300 L e, in genere, 200 L è ideale per ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata a causa di fuoriuscite.
  3. Per ogni pannello e tipo di tessuto, distribuire almeno 5 x 105 cellule come controlli non contenuti in pozzi che sono stati chiaramente contrassegnati.

4. Pannello Sottoinsieme Monocite

  1. Eseguire la colorazione della fattibilità: Girare le celle (500 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) utilizzando un filatore piatto e lavare le cellule una volta con 200 L di 1x PBS. Preparare una soluzione stock di colorante amine-reattivo cellulare (macchia di vitalità) diluito 1:50 in 1x PBS. Successivamente, risundere i pellet cellulari con 100 L di questa soluzione di stock con conseguente un volume assoluto di 2 L di macchia di vitalità per pozzo. Incubare per 15 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
    NOTA: La quantità ottimale di macchia di vitalità necessaria deve essere determinata eseguendo una curva di titolazione della dose. Inoltre, la soluzione di stoccaggio della macchia di vitalità diluita deve essere utilizzata in un solo giorno e non deve essere immagazzinata. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per ulteriori informazioni su come ricostituire, diluire e conservare la macchia di vitalità.
  2. Durante l'incubazione, preparare il cocktail di anticorpi in un volume appropriato di tampone FACS (CA2 e MgTM PBS libero contenente 0,1% BSA e 0,02% azide di sodio). Lavare le cellule due volte con 200 L di tampone FACS, centrifuga (500 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) e risuspendere ogni pellet con 100 L della miscela di anticorpi o una miscela di controllo appropriata. Incubare per 30 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
    NOTA: Si prega di essere consapevoli del fatto che l'azide di sodio è tossico per le cellule. Nell'attuale protocollo la concentrazione di azide di sodio nel buffer di flusso è molto bassa (0,02%) e i campioni vengono eseguiti immediatamente dopo la colorazione, senza causare alcun problema. Se sono pianificati saggi funzionali a valle delle cellule ordinate, potrebbe essere utile creare un buffer FACS fresco ogni giorno di esperimenti e non utilizzare alcun azide di sodio. Quando si utilizza una moltitudine di anticorpi, si consiglia di aggiungere una quantità appropriata di "Brilliant Stain Buffer" al cocktail di anticorpi per migliorare i risultati.
  3. Lavare le celle due volte con 200 L di buffer FACS e rispendere le cellule in 250 l di FACS - buffer EDTA (buffer FACS contenente 1 mM EDTA). Trasferire i campioni in tubi FACS etichettati. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi e protetti dalla luce fino all'acquisizione.
    NOTA: Le cellule immunitarie hanno la tendenza ad essere appiccicose. Per ridurre al minimo sia il rischio di blocco che il numero di doppiette si consiglia di aggiungere 1 mM EDTA al buffer di flusso finale.

5. T Pannello Sottoinsieme di celle

  1. Eseguire la colorazione della fattibilità: Girare le celle (500 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) utilizzando un filatore piatto e lavare le cellule una volta con 200 L di 1x PBS. Preparare una soluzione stock di colorante amine-reattivo cellulare (macchia di vitalità) diluito 1:50 in 1x PBS. Successivamente, risundere i pellet cellulari con 100 L di questa soluzione di stock con conseguente un volume assoluto di 2 L di macchia di vitalità per pozzo. Incubare per 15 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
  2. Durante l'incubazione dei campioni, preparare il cocktail di anticorpi di colorazione extracellulare in un volume appropriato di 1x tampone FACS. Lavare le cellule due volte con 200 L di 1x tampone FACS, girarle verso il basso (500 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) e risvegliare ogni pellet con 100 L della miscela di anticorpi o di un'adeguata miscela di controllo. Incubare per 30 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
  3. Eseguire la colorazione intracellulare con un kit di fissazione e permeabilizzazione seguendo le istruzioni del produttore. Lavare due volte le celle con 200 L di 1x buffer FACS e rispendere in 200 L di buffer di fissaggio. Incubare per 40 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
  4. Durante l'incubazione, preparare il cocktail di anticorpi (colorazione intracellulare) in un volume appropriato di 1x permeabilizzazione e tampone di lavaggio. Raccogliere le cellule ruotando (750 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) e lavando le cellule due volte con 200 L di 1x perm/buffer di lavaggio.
    NOTA: La fissazione e la permeabilizzazione si trassolvono in cellule che tendono ad essere un po' più difficili da pellet correttamente. Al fine di ridurre al minimo la perdita di cellule durante le successive fasi di lavaggio, aumentare la forza centrifuga a 750 x g. In alternativa potrebbe essere applicato anche un ciclo di filatura più lungo. Tuttavia, ciò si tradurrebbe in un tempo notevolmente più lungo necessario per preparare le cellule.
  5. Celle di rotazione (750 x g, 5 min, 4 gradi centigradi) e risuspendo ogni pellet con 100 L della miscela anticorpo o miscela di controllo appropriata. Incubare per 40 minuti a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
  6. Lavare le cellule due volte con 200 L di 1x perm/buffer di lavaggio e rispendere le cellule in 250 L di FACS - buffer EDTA. Trasferire i campioni in tubi FACS etichettati. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi e protetti dalla luce fino all'acquisizione.
    NOTA: Per ogni anticorpo è necessario determinare la concentrazione ottimale eseguendo una curva di titolazione della dose. La concentrazione tra anticorpi può differire drasticamente: CD3 e CD80 sono stati utilizzati con un fattore di diluizione di 1:1, mentre CD11b e CD4 sono stati utilizzati con un fattore di diluizione di 1:6400. Quando si titrating la concentrazione di anticorpi utilizzare lo stesso numero di cellule che verranno utilizzati durante gli esperimenti.

6. Compensazione, controlli appropriati e gating

  1. Impostazione dell'esperimento
    1. Una volta che la concentrazione ottimale di anticorpi è stata determinata eseguire controlli non macchiati e singoli controlli macchiati per la compensazione per regolare la sovrapposizione spettrale.
      NOTA: eseguire tutti i controlli di compensazione con entrambe le celle e perline di compensazione. Utilizzare tutto ciò che genera i risultati più brillanti (MFI più alto di eventi positivi) per la compensazione. MFI è l'acronimo di intensità media di fluorescenza ed è spesso usato per descrivere e definire l'intensità media del segnale generato e, quindi, il livello di espressione anticorpo.
    2. Eseguire la fluorescenza meno uno (FMO) controlli e controlli isotipi quando si avvia un nuovo esperimento multicolore. Ulteriori dettagli riguardanti FMO sono stati precedentemente pubblicati19.
    3. Determinare la tensione ottimale dell'area di dispersione in avanti (FSC-A) e la tensione SSC-A (Side Scatter Area) al fine di rilevare la popolazione di leucocitoli in controlli non macchiati di ogni tipo di tessuto.
      NOTA: il processo di fissazione e permeabilizzazione altera le dimensioni della cella. Pertanto, le tensioni FSC-A e SSC-A per il pannello Monocyte Subset e T Cell Subset Panel differiscono notevolmente. Per trovare le tensioni ottimali per il T Cell Subset Panel, utilizzare celle che sono state macchiate singole con CD3 e back gate verso le popolazioni di leucocati mentre si regolano i valori FSC-A e SSC-A.
  2. Strategia di Gating
    1. Una volta determinata la tensione ottimale FSC-A e SSC-A, impostare un cancello primario sulla popolazione di leucocid.
      NOTA: Prima di ogni esperimento calibrare il citometro utilizzando perline di calibrazione secondo le istruzioni del produttore ed eseguire perline non contenute. Le popolazioni di leucocenza di diversi punti di tempo dovrebbero avere proprietà FSC e SSC comparabili (sono previste lievi differenze tra i tipi di tessuto e normali). Se FSC e SSC variano notevoli difficoltà sparare il citometro e la generazione del campione.
    2. Escludi doppi: stampa FSC-A (asse y) e FSC-H (asse x). Le singole vengono visualizzate come una diagonale di questo grafico. Cancello su singlet.
    3. Escludi cella morta: traccia FVS510 (macchia di vitalità) (asse x) e FSC-A (asse y). Le cellule morte appariranno come eventi positivi, quindi cancello su cellule vive.
      NOTA: le celle negative vere saranno visibili nei controlli non macchiati. Pertanto, regolare questo cancello per ogni set di campioni quando si eseguono i controlli non macchiati prima di campioni macchiati. L'ulteriore gating dipende dal pannello anticorpo e dal tipo di cellula che viene studiato. Le strategie di Gating per ogni pannello utilizzato in questo protocollo sono disponibili rispettivamente nella Figura 1 e nella Figura 4.

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Representative Results

Di seguito sono descritti i risultati rappresentativi del pannello Sottoinsieme monocito e del pannello Sottoinsieme di celle t.

La figura 1 illustra la strategia gerarchica di gating per il pannello del sottoinsieme di monociti sulle cellule immunitarie raccolte dal midollo osseo degli animali trattati con DMM. La stessa strategia è stata utilizzata e verificata in tutti gli altri tipi di tessuto. Durante l'impostazione dell'esperimento, è stata determinata la tensione dell'area di dispersione in avanti (FSC-A) e dell'area di dispersione laterale (SSC-A) per ciascun tipo di tessuto per identificare monociti/macrofagi ed escludere cellule T e detriti (G1). Durante ogni esperimento, sono stati analizzati i controlli non macchiati di ogni tipo di tessuto e la tensione FSC-A e SSC-A regolata quando necessario. Le tensioni dovrebbero rimanere simili nel tempo, se i parametri cambiano drasticamente è probabile un blocco del citometro. Inoltre, i controlli non macchiati sono stati utilizzati per determinare i veri negativi per la macchia morta/viva e i cancelli sono stati regolati ogni volta che l'esperimento è stato condotto di conseguenza (Figura 2A). Durante la progettazione dell'esperimento, i fluorocromi dovrebbero essere scelti con attenzione, e normalmente i marcatori superficiali con bassa espressione sono abbinati a fluorocromi luminosi (ad esempio, qui Alexa Fluor 647 è stato utilizzato per CD206). Esistono varie macchie morte/vive che possono essere rilevate da diverse lunghezze d'onda; qui, È stato utilizzato FVS510.

La figura 3 illustra i dati di esempio provenienti da cellule immunitarie isolate dai tessuti sinoviali e macchiate con marcatori di superficie extracellulari 6 settimane dopo che gli animali hanno ricevuto un intervento chirurgico di DMM o di controllo fittizio. Tutti i sottoinsiemi possono essere facilmente identificati utilizzando il protocollo sia negli animali di studio che in quello di controllo. In particolare, si possono vedere differenze tra i gruppi per i sottoinsiemi di macrofagi (percentuale più elevata di macrofagi Ly-6C/MHC-II- (G7) nel gruppo DMM) e l'espressione dei macrofagi M1 e M2 (percentuale più alta di macrofagi M2 nel gruppo DMM).

La figura 4 visualizza la strategia gerarchica di gating per il pannello di cellule T extra e intracellulare sulle cellule immunitarie isolate dalla milza degli animali trattati con DMM. I principi sono identici a quelli utilizzati per il pannello monocito. Tuttavia, il processo di fissaggio e permeabilizzazione modifica le dimensioni e la densità delle cellule. Pertanto, i parametri FSC e SSC tipici devono essere determinati utilizzando un processo di back-gating dalle celle CD3 quando si imposta l'esperimento per ogni tipo di cella. Alcuni fluorocromi tendono ad aggregarsi nel tempo (ad esempio, PE che è stato utilizzato con FoxP3 qui). Le aggregazioni possono potenzialmente modificare i risultati a causa dell'elevata luminosità che influenza la sovrapposizione spettrale e la compensazione. Così, tutti gli anticorpi sono stati vorticosi e filati ogni volta prima del loro uso al fine di diminuire gli aggregati. Inoltre, è stata utilizzata una strategia di gating per ridurre ulteriormente l'influenza degli aggregati (G2). Durante l'impostazione degli esperimenti, la fluorescenza meno uno (FMO) è stata eseguita per ogni anticorpo. I dati di esempio sono illustrati nella Figura 2B,2C.

Figura 5 e Figura 6 mostrano le cellule immunitarie che sono state isolate dai linfonodi (Figura 5) e tessuto sinoviale (Figura 6) e macchiato utilizzando il protocollo del pannello T-cell 4 settimane dopo che gli animali hanno ricevuto un intervento chirurgico DMM o sham-control. I dati mostrano una percentuale più alta di cellule Th1 negli animali DMM (G9) in entrambi i tessuti. Inoltre, la colorazione intracellulare per le cellule T-regolatorie (G11) e Th17 (G12) ha successo utilizzando il protocollo e le differenze possono essere rilevate tra i gruppi.

Figure 1
Figura 1: Strategia gerarchica di gating della citometria del flusso che utilizza la colorazione extracellulare per identificare monociti/macrofagi e i relativi sottoinsiemi. Le cellule mieloidi sono identificate principalmente utilizzando un grafico a dispersione in avanti/lato (FSC-A e SSC-A) (G1). Successivamente, le singlet vengono rilevate utilizzando FSC-A e FSC-H (G2) e successivamente vengono selezionate le cellule vive (G3). Le cellule di G3 sono ulteriormente classificate utilizzando Ly-6G per identificare i neutrofili (G4) e CD11b per monociti/macrofagi (G5a). MHC-II viene utilizzato per identificare le cellule dendritiche (G5b) tra le cellule positive CD11b e F4/80 viene utilizzato per selezionare tra macrofagi (G6) e monociti (G12). I macrofagi sono ulteriormente classificati nei loro sottoinsiemi utilizzando macrofagi Ly-6C e MHC-II (Ly-6C/MHC-II- macrofagi (G7); macrofagi residenti di tessuto Ly-6C-/MHC-II (G8); Il sangue di Ly-6C-/MHC-II ha originato i macrofagi (G9)). È possibile selezionare più sottoinsiemi dall'intera macrofagi e dai rispettivi sottoinsiemi utilizzando CD206 e CD80 (M1: CD80/CD206- (G10); M2: CD80-/CD206 (G11)). I monociti sono ulteriormente classificati utilizzando MHC-II e CD11c (MHC-II-/CD11c- monociti (G13); monociti MHC-II/CD11c (G14)). Il livello di attivazione viene quindi classificato utilizzando l'espressione di Ly-6C e diviso in basso (G15), medio (G16) e alto (G17). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dati di esempio che illustrano i controlli appropriati sia nel pannello monocito che in quello a celle T. (A) Il tessuto sinoviale è stato raccolto 6 settimane dopo la chirurgia DMM (DMM) o la sham-control-chirurgia (sham) e una sospensione a singola cellula è stata macchiata utilizzando marcatori di superficie extracellulari. Durante ogni esperimento le cellule non macchiate sono state utilizzate per determinare i veri negativi per la macchia morta/viva e per impostare le porte (Control). L'impostazione di cancelli che utilizzano celle non macchiate è mostrata nel pannello A. ( B -C) Le cellule di Spleen sono state raccolte da animali di controllo non trattati, una sospensione a singola cellula generata e macchiata utilizzando marcatori extra e intracellulari. I controlli fluorescenti-meno uno (FMO) sono stati generati da cellule colorazione con l'intero pannello anticorpo che manca un solo anticorpo. I dati di esempio sono mostrati per entrambi gli anticorpi intracellulari. (B) FMO -RORgt e (C) FMO -Fox-P3. Le FMO sono state eseguite per entrambi i pannelli e utilizzate per impostare ogni cancello. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Colorazione extracellulare di monociti/macrofagi isolati dal sinovio dei topi. I tessuti campione sono stati raccolti 6 settimane dopo che i topi hanno ricevuto un intervento chirurgico DMM (DMM) o un finto controllo-chirurgia (sham). Ulteriori informazioni relative ai cancelli utilizzati sono disponibili nella Figura 1. I dati di esempio mostrano che tutti i sottoinsiemi possono essere identificati in modo affidabile e che è possibile visualizzare le differenze tra i gruppi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Strategia di gating gerarchica della citometria di flusso che utilizza sia la colorazione extra che intracellulare per identificare le cellule T e i relativi sottoinsiemi. Le celle T vengono identificate principalmente utilizzando un grafico a dispersione in avanti/lato (FSC-A e SSC-A) (G1). A causa della natura degli aggregati di anticorpi utilizzati dovrebbero essere esclusi utilizzando CD3 e CD4 (G2). Successivamente, le singlet vengono rilevate utilizzando FSC-A e FSC-H (G3) e successivamente vengono selezionate le cellule vive (G4). Le cellule di G4 sono ulteriormente classificate utilizzando NK1.1 per identificare le cellule killer naturali (G5) e CD3 per identificare le cellule T (G6). Il livello di attivazione viene determinato utilizzando CD69 (G6b). Successivamente, CD4 e CD8 vengono utilizzati per identificare le cellule T-killer (CD4-/CD8 (G7) e le celle T-helper (CD4/CD8- (G8)). Le celle T-helper sono classificate in celle Th-1 (C-X-CR3-/CCR4- (G9)) e Th-2 (C-X-CR3-/CCR4) utilizzando C-X-CR3 (CD183) e CCR4 (CD194). Inoltre, le celle Th-17 (CD25/RORgt) e le cellule T-regolatorie (CD25/Fox-P3( G12) vengono identificate utilizzando marcatori intracellulari. Inoltre, i sottoinsiemi di cellule di memoria sono identificati da cellule T-helper utilizzando CD44 e CD62L (CD44-/CD62L, cellule di memoria T ingenua (G13); Cellule di memoria T centrale CD44/CD62L (G14); Cellule di memoria T (G15)) cd44-/CD62L- effector). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Colorazione extracellulare e intracellulare delle cellule T isolate dal drenaggio dei linfonodi dei topi. I tessuti campione sono stati raccolti 4 settimane dopo che i topi hanno ricevuto la chirurgia DMM (DMM) o la sham-control-chirurgia (sham). Ulteriori informazioni relative ai cancelli utilizzati sono disponibili nella Figura 4. I dati di esempio mostrano che tutti i sottoinsiemi possono essere identificati in modo affidabile e che è possibile visualizzare le differenze tra i gruppi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Colorazione extracellulare e intracellulare delle cellule T isolate dal tessuto sinoviale dei topi. I tessuti campione sono stati raccolti 4 settimane dopo che i topi hanno ricevuto la chirurgia DMM (DMM) o la sham-control-chirurgia (sham). Ulteriori informazioni relative ai cancelli utilizzati sono disponibili nella Figura 4. I dati di esempio mostrano che tutti i sottoinsiemi possono essere identificati in modo affidabile e che è possibile visualizzare le differenze tra i gruppi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I metodi descritti in questo protocollo sono stati progettati e testati per identificare in modo affidabile vari sottoinsiemi sia da monociti/macrofagi che da cellule T all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale in un modello murino di osteoartrite (OA). L'attuale protocollo può essere facilmente modificato per studiare diversi tipi di tessuto, o altri tipi di cellule scambiando anticorpi, e può essere utilizzato per modelli murini alternativi di OA. Quando si testano altri tipi di tessuto, è fondamentale testare la specificità di ogni anticorpo come espressione di marcatori superficiali delle cellule immunitarie variano in ogni tessuto20. Inoltre, quando si scambiano anticorpi, è necessario eseguire una curva di titolazione della dose per stabilire la concentrazione ottimale di anticorpi e ripetere il processo di compensazione per affrontare i cambiamenti nella sovrapposizione spettrale.

Nel protocollo attuale, OA è stato indotto utilizzando il modello di mouse DMM18. I modelli animali più comunemente utilizzati e consolidati sono nel topo, perché questa specie offre molteplici vantaggi nello studiare la fisiofisiologia dell'OA17post-traumatico . Nel topo, in particolare, sono stati descritti i modelli chirurgici e non chirurgici OA17: la più comune è la destabilizzazione del menisco mediale (DMM), la trassezione chirurgica del legamento crociato anteriore (ACLT) e la rottura acltica non chirurgica (ACLR),rispettivamente 21. Tutti questi modelli animali sono adatti per l'indagine sul ruolo dell'infiammazione cellulare nella patologia dell'OA post-traumatico e l'attuale protocollo è stato testato con successo per tutti i modelli animali menzionati in precedenza in laboratorio. Anche se tutti i modelli animali di cui sopra sono stabiliti e sono stati descritti nella letteratura, ognuno ha i propri punti di forza e limitazioni che sono stati discussi in dettaglioaltrove 17 e così sono discussi solo brevemente sotto. Tutti i modelli chirurgici sono soggetti all'approccio chirurgico, al processo di guarigione delle ferite e alla sua risposta infiammatoria associata. Quando si valuta il contributo delle cellule infiammatorie allo sviluppo di OA post-traumatico, questa risposta di guarigione della ferita infiammatoria potrebbe servire come un confusore, soprattutto durante i primi punti di tempo dopo l'intervento. Inoltre, le procedure DMM e ACLT devono essere condotte in modo molto standardizzato per ridurre al minimo la variabilità tra gli animali. La chirurgia ACLT è molto più difficile da imparare rispetto alla chirurgia DMM e richiede una maggiore esposizione chirurgica rispetto al DMM per identificare definitivamente e garantire lesioni solo all'ACL ed evitare danni iatrogeni ad altri tessutiarticolari 18. La rottura non chirurgica dell'ACL è un modo standardizzato e molto efficiente per indurre oA post-traumatica. Tuttavia, è necessario un dispositivo specializzato che applichi un singolo carico di compressione controllato alla tibia del ginocchio flesso. Questo dispositivo deve essere calibrato e testato al fine di ottenere risultati comparabili e affidabili. Inoltre, il modello ACLR induce danni articolari molto gravi e progressivi nei topi con marcata erosione dell'altopiano tibiale medialeposteriore 22 che non si vede con lesioni ACL in altre specie, tra cui gli esseri umani.

Al fine di caratterizzare in modo completo il processo infiammatorio e la sua componente cellulare durante lo sviluppo di OA, è auspicabile non solo indagare il tessuto sinoviale, ma anche i linfonodi locali così come gli organi linfoidi secondari, come la milza e il midollo osseo. I modelli di drenaggio linfatico dell'articolazione del ginocchio sono stati caratterizzati nei topi e nel liquido linfatico dagli scarichi articolari attraverso il linfonodo iliaco e il linfonodo inguinale a una diversadispersione 23,24. Al fine di facilitare la comparabilità tra gli animali, abbiamo deciso in questo protocollo di mettere in comune il linfonodo inguinale e iliaco. Al contrario, mentre in prossimità del ginocchio, il linfonodo popliteale drena il piede posteriore e non gioca un ruolo durante i processi infiammatori del ginocchio.

I topi hanno un piccolo volume di tessuti sinoviali intra-articolari25 e l'isolamento delle cellule immunitarie qui in questo caso rimane impegnativo. Nell'attuale protocollo, le tecniche di raccolta per i tessuti sinoviali sono state adattate per consentire l'isolamento del numero massimo di cellule immunitarie. Pertanto, la tecnica di raccolta include i recessi sopra- e inppostillari così come il pad moda infrapatellar, a causa del suo elevato numero di cellule immunitarie26. Il processo di digestione e la scelta dell'enzima è stato ottimizzato per digerire completamente la membrana sinoviale e il tessuto adiposo, lasciando il tendine, e la rotula e la sua cartilagine non ancorata. Così, l'attuale protocollo introduce un metodo riproducibile di raccolta delle cellule immunitarie dal tessuto sinoviale.

L'analisi della citometria del flusso presenta molteplici vantaggi nello studiare i processi immunitari cellulari durante lo sviluppo di OA; tuttavia, questa tecnica ha dei limiti. A causa del piccolo numero di cellule immunitarie nel tessuto sinoviale, è necessario mettere in comune campioni di tessuto di almeno due animali per ottenere un campione. A causa del gran numero di fluorocromi e colori utilizzati in questo protocollo, particolare attenzione deve essere prestata a una compensazione meticolosa di una possibile sovrapposizione spettrale per ogni tipo di tessuto e la compensazione deve essere rivalutata in modo coerente durante l'uso di questa tecnica. A causa del gran numero di marcatori disponibili e di notevoli variazioni tra gli studi per identificare una certa popolazione, un'altra possibile limitazione è la scelta dei marcatori utilizzati per identificare le celle19. La citometria del flusso consente la quantificazione degli "eventi", che non si coordina necessariamente con le cellule totali. Per ottenere un'analisi veramente quantitativa, è necessario acquisire il conteggio delle perline contemporaneamente quando si esegue l'analisi del flusso o contare le celle in sospensioni a singola cella in anticipo per ottenere numeri assoluti (come fatto qui). In generale, i principi del presente protocollo (ad esempio, come progettare e impostare un pannello di flusso o tecniche utilizzate per preparare sospensioni a singola cella) potrebbero essere potenzialmente adattati per i campioni umani. Tuttavia, i marcatori superficiali delle cellule immunitarie umane differiscono dalle cellule murine e, pertanto, è necessario selezionare e testare anticorpi appropriati. Inoltre, è necessario determinare la durata della lysi RBC e il volume appropriato del buffer in quanto è molto probabile che sia diverso. Prima di adattare i metodi di questo protocollo ad altre specie o tessuti è necessario testare meticolosa di ogni fase per garantire che i metodi funzionino come previsto.

Nonostante i suoi limiti, l'analisi della citometria di flusso delle cellule immunitarie rimane una potente tecnica che permette di identificare sia le cellule monocitiche che i sottoinsiemi di cellule T a livello di singola cellula. In particolare, l'attuale protocollo introduce una tecnica affidabile e riproducibile in grado di identificare e quantificare la risposta immunitaria cellulare durante lo sviluppo dell'OA nel tessuto sinoviale e negli organi linfatici secondari. In futuro, questa tecnica può aiutare a caratterizzare la risposta immunitaria in vari modelli animali che inducono l'osteoartrite e successivamente valutare l'efficacia dei farmaci immuno modulanti su questa malattia debilitante.

In conclusione, questo protocollo di citometria di flusso descrive un metodo dettagliato e riproducibile per identificare monociti/macrofagi e sottoinsiemi di cellule T utilizzando saggi di colorazione extra e intracellulare all'interno di milza murina, midollo osseo, linfonodi e tessuto sinoviale utilizzando un modello di topo osteoartrite chirurgico stabilito.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Andrew Lim, Ph.D. e Giles Best, Ph.D. per il loro aiuto nella creazione del citometro di flusso. Questo progetto è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) assegnata alla PH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4) BioLegend 131212 T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst BD 566385 Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 Monocyte Panel
Liberase, Research Grade Roche 5401127001 Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg BD 564985 Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg BD 562454 Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg BD 742274 T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg BD 565250 Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg BD 563061 T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg BD 557596 T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg BD 552775 T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg BD 565480 T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg BD 565261 T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg BD 740664 T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg BD 563687 Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg BD 563332 T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg BD 565411 Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg BD 560408 T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg BD 563414 Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg BD 560593 Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg BD 560600 Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg BD 564143 T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg BD 562894 T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer N/A N/A Buffers
Transcription Factor Buffer Set 100Tst BD 562574 Buffers

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References

  1. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
  2. Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
  3. Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
  4. Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
  5. Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
  6. Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
  7. Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
  8. Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
  9. Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
  10. Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
  11. Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
  12. Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
  13. Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
  14. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
  15. Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
  16. Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
  17. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  20. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  21. Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  22. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  23. Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
  24. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  25. Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
  26. Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).

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Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu, Y., Stoner, S., Shu, C., Little, C. B. Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model. J. Vis. Exp. (158), e61008, doi:10.3791/61008 (2020).

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