Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Flow Cytometri Analyse af immuncelledelmængder i Murine Milten, Knoglemarv, Lymfeknuder og synovialvæv i en osteokhritis model

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61008
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

Her beskriver vi en detaljeret og reproducerbar flow cytometri protokol til at identificere monocyt / makrofag og T-celle delmængder ved hjælp af både ekstra- og intracellulære farvning assays inden for murine milten, knoglemarv, lymfeknuder og synovialvæv, ved hjælp af en etableret kirurgisk model af murin slidgigt.

Abstract

Slidgigt (OA) er en af de mest udbredte muskel-og skeletsygdomme, der påvirker patienter, der lider af smerte og fysiske begrænsninger. Nylige beviser tyder på en potentiel inflammatorisk komponent af sygdommen, med både T-celler og monocytter / makrofager potentielt forbundet med patogenesen af OA. Yderligere undersøgelser postulerede en vigtig rolle for delmængder af både inflammatoriske celle slægter, såsom Th1, Th2, Th17, og T-regulerende lymfocytter, og M1, M2, og synovium-væv-hjemmehørende makrofager. Samspillet mellem det lokale synovial og systemisk inflammatorisk cellulære respons og de strukturelle ændringer i leddet er imidlertid ukendt. For fuldt ud at forstå, hvordan T-celler og monocytter/ makrofager bidrager til OA, er det vigtigt at være i stand til at metantal identificere disse celler og deres delmængder samtidig i synovialvæv, sekundære lymfeorganer og systemisk (milten og knoglemarven). I dag kan de forskellige inflammatoriske celleundersæt identificeres ved en kombination af celle-overflade markører gør multi-farve flow cytometri en kraftfuld teknik i at undersøge disse cellulære processer. I denne protokol beskriver vi detaljerede trin vedrørende høst af synovialvæv og sekundære lymfeorganer samt generering af enkeltcellesuspensioner. Desuden præsenterer vi både en ekstracellulær farvningsanalyse for at identificere monocytter/makrofager og deres undersæt samt en ekstra- og intracellulær farvningsanalyse for at identificere T-celler og deres delmængder i murin-milten, knoglemarven, lymfeknuderne og synovialvæv. Hvert trin i denne protokol blev optimeret og testet, hvilket resulterer i en meget reproducerbar analyse, der kan udnyttes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA musemodeller.

Introduction

Slidgigt (OA) er en invaliderende og smertefuld sygdom, der involverer forskellige patologier af alle væv forbundet med ledt1. OA, der berører ca. 3,8 % af verdensbefolkning 2, er en af de mest udbredte muskel - og skeletsygdomme,og det skal blive den 4. Posttraumatisk OA opstår efter en ledskade og tegner sig for mindst 12 % af al OA og op til 25 % af OA i modtagelige led såsomknæet 4,5. Desuden øger fælles skade levetidsrisikoen for OA med mere end fem gange6. Ikke alle skader med tilsyneladende lignende ustabilitet vil fortsætte med at udvikle OA, og derfor definere faktorer, der driver den langsigtede OA-risiko er fortsat udfordrende. Det er afgørende for at udvikle effektive behandlinger til forebyggelse og/eller behandling af posttraumatisk OA, for at undersøge og bedre definere den skadesspecifikke patologi, årsager og mekanismer, der prædisponerer for OA1.

OA og dens definerende brusk ødelæggelse blev tidligere udelukkende tilskrevet mekanisk stress, og dermed OA blev betragtet som en ikke-inflammatorisk sygdom2. Men, nyere undersøgelser har vist en inflammatorisk infiltration af synovial membraner og en stigning i inflammatoriske celler i synovialvæv hos patienter med OA sammenlignet med sunde kontroller2, kaste lys over en inflammatorisk komponent som en potentiel drivkraft i OA. Yderligere undersøgelser viste, at abnormiteter i både CD4+ og CD8+ T-celleprofilen samt monocytter/makrofager i det medfødte immunsystem kan bidrage til patogenesen af OA2,7. Detaljerede undersøgelser af disse abnormiteter afslørede relevante roller for forskellige8T-celledelmængder28 ,såsom91.11 På trods af denne overbevisende dokumentation er årsagssammenhængen mellem ændringen af T-celleresponser og udviklingen og udviklingen af OA stadig ukendt2.

Ud over specifikke T-celler, der har en rolle i OA, tyder nylige undersøgelser på, at differentieret polariserede/aktiverede makrofager kan være forbundet med patogenese af OA12. Makrofager fra blodmoncytter ophobes i synoviummet og polariseres i enten klassisk aktiverede makrofager (M1) eller alternativt aktiverede makrofager (M2) under udviklingen af OA, hvilket indebærer en sammenhæng mellem monocytafledte makrofager og OA13. I modsætning hertil befolker visse undergrupper af makrofager organer tidligt under udvikling og selv opretholde deres antal i en monocyt uafhængig sag14. For nylig, en fælles beskyttende funktion medieret af en stram-junction barriere blev vist for disse synovial-væv-hjemmehørende makrofager (STRMs)14. Disse resultater tyder på, at abnormiteter i særdeleshed makrofag delmængder kan spille en afgørende rolle under udviklingen af OA. Men samspillet mellem denne inflammatoriske cellulære reaktion og de strukturelle ændringer i den fælles efter traumer er ukendt.

Historisk set var analysen af immunceller i synovialvævet begrænset til immunhisistokemi (IHC) eller mRNA-ekspression ved omvendt transskription polymerase kædereaktion (RT-PCR)tilgange 15,16. Både IHC og RT-PCR mangler imidlertid evnen til at identificere flere forskellige celletyper og deres delmængder samtidigt, hvilket begrænser anvendeligheden af disse metoder. Desuden er IHC begrænset til analyse af små prøver af væv og kan gå glip af fokale inflammatoriske celleakkumulering. I løbet af de sidste mange år er der udviklet et utal af overflademarkører for forskellige celletyper, og delmængder af immunceller kan nu pålideligt identificeres ved hjælp af forskellige kombinationer af disse markører. På grund af den konstante tekniske udvikling er flowcytometre nu i stand til at identificere et væld af forskellige fluorkromer samtidigt, hvilket muliggør analyse af store flerfarvede antistofpaneler.

Flow cytometri giver efterforskere med en kraftfuld teknik, der tillader samtidig identifikation og kvantificering af et væld af immunceller og deres delmængder på enkelt celleniveau. Vi har udviklet og optimeret både en ekstracellulær farvningsanalyse til at identificere monocytter / makrofager og deres delmængder samt en ekstra / intracellulær farvning analyse til at identificere T-celler og deres delmængder inden murine milt, knoglemarv, lymfeknuder og synovialvæv. Hvert trin i denne protokol blev optimeret og testet resulterer i en meget reproducerbar analyse, der kan udnyttes til andre kirurgiske og ikke-kirurgiske OA mus modeller17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee har godkendt alle procedurer, der er nævnt i denne protokol. Mus er opstuderet og plejes i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr (National Health and Medical Research Council of Australia Revideret 2010). For alle eksperimenter blev 10-12 uger gamle, mandlige C57BL/6 mus udnyttet.

BEMÆRK: At fremkalde post-traumatisk OA, kirurgisk destabilisering af den mediale menisk (DMM) i højre kvæle fælles blev udført. Glasson et al.18har offentliggjort detaljerede oplysninger om denne dyremodel . Kort sagt, generel anæstesi er induceret i et induktion kammer ved hjælp af isofluran og derefter opretholdes ved hjælp af en næse kegle. Det kirurgiske ben er barberet med et barberblad og operationsstedet vaskes og swabbed med ethanol for at minimere forurening. Dyret flyttes derefter til det fungerende mikroskop og placeres på et sterilt håndklæde og benet draperet med sterilt papir drapere for at isolere operationsstedet og minimere forurening. Ved hjælp af mikroskopet, en 0,5 cm mediale para-patella arthrotomy er lavet, patella luxated lateral, og infra-patella fedt pad forhøjet til at afsløre den mediale menisco-tibial ledbånd, som er transected med dissekere pincet. Leddet skylles med sterilt saltvand for at fjerne blod, og såret lukkes i tre lag – ledkapsel, subkutant væv (ved hjælp af suturmateriale) og hud (ved hjælp af kirurgisk vævslim). Metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan dog anvendes på andre modeller og metoder til at fremkalde OA. OA kan induceres i begge sider af dyret, og når høst væv, er det vigtigt at høste ipsilateral (dræning) lymfeknuder.

1. Isolering af milten, kontralateral knoglemarv, ipsilaterale lymfeknuder dræne kvælende og synovial væv

  1. Aflive musen ved cervikal dislokation. Placer musen i en liggende position under en dissekerende mikroskop og tør brystet, maven og benene med 70% ethanol. Åbn forsigtigt huden på midterlinjen for længden af maven ved hjælp af lige saks forlader bughulen intakt.
  2. Træk forsigtigt huden på højre side af dyret væk fra den underliggende muskel forlader subkutane fedtvæv knyttet til huden. Normalt, blid trækkraft alene vil adskille huden og underliggende fedtvæv fra musklen. Sporadiske tilslutninger bør skæres igennem med en saks for at holde spændingen nødvendigt at adskille væv til et minimum og reducere risikoen for at skade lymfeknuder. Identificer en krydsning af tre fartøjer ved forsigtigt at drille det fedtvæv, der er placeret på låret, ved hjælp af to buede fine scener. Den lyskelymfeknude er placeret ved krydset og kan identificeres ved sin ægformede form og lidt mørkere farve.
  3. Fjern lyskelymfeknuden ved hjælp af fine dissekerende kraftaffekt. Pas på ikke at sprænge kapslen. Fjern det resterende fedt på overfladen af lymfeknuden med syr.
  4. Åbn bughulen og identificere milten. Skær milten ud med en fin saks. Træk forsigtigt tarmene til side for at udsætte aorta og dens bifurcation være omhyggelig med ikke at skade dem, for at minimere risikoen for forurening. Den iliaca lymfeknude er placeret på terminalen segment af abdominal aorta og oprindelsen af den fælles iliaca arterie. Højre iliaca lymfeknude og fortsætte som beskrevet i 1,3.
  5. Fjern forsigtigt huden på begge bagben. Dissekere venstre lårben ved at rense det fra muskelvæv ved hjælp af bladet og fine saks. Fjern forsigtigt både kvæle og hofteled forlader hele knoglen intakt og fjern lårbenet.
  6. Identificer patella senen af højre kvæle fælles, derefter fjerne den tilstødende muskelvæv proksimale til dette ved hjælp af fine saks, indtil ca 5mm quadriceps sene proksimale til patella er udsat. Derefter skæres gennem quadriceps senen ca 3-4mm proksimalt til patella at danne et håndtag og ved hjælp af fine pincet forsigtigt trække det væk fra leddet. Dette vil gøre kanterne af den fælles kapsel vedhæftet fil til lårben synlige, og ved hjælp af en skalpel klinge omhyggeligt skåret langs kanterne af ledkapslen på begge sider, der starter ved lårbenet går mod skinnebenet, for at maksimere mængden af synovial membran, der er høstet. Mens skære er det vigtigt at opretholde en blid trækkraft på quadriceps senen og pause, når synovial væv blok er kun knyttet til skinnebenet. På dette stadium intraarticular fedt pad er nu klart synlig distalt for patella og kan forsigtigt løsrevne fra den fælles og forreste aspekt af menisci ved hjælp af bladet. Derefter skæres langs den resterende del af ledkapslen (tibial del) for at fjerne den synoviale vævsblok.
    BEMÆRK: Dette trin skal gøres meget præcist for at give pålidelige resultater. Efter endningen bør "synovial vævsblokken" bestå af patella, patella senen, infrapatellarfedtpude, supra- og infrapatellar-fordybningssynovialfor og tilhørende ledkapsel på grund af de indtrængningsledbånd. Hold alt væv fugtigt under dissektion ved hjælp af 0,9% saltvandsopløsning.
    BEMÆRK: Hver synovial vævsblokprøve anbringes i en separat brønd på en mærket 24-brøndplade, der indeholder 1,5 ml RPMI 1640-medium. Kombiner både iliaca og lyskelymfeknude i en brønd og pool væv fra to mus.

2. Generering af enkeltcellesuspensioner fra hvert væv

BEMÆRK: For at sikre tilstrækkelige celletal til flowanalyse skal synovialvæv fra to mus grupperes. I den nuværende protokol, pool alle væv fra de samme to mus for at opretholde analogi. Endvidere blev iliaca og lyskelymfeknuder kombineret for hvert dyr, hvilket resulterede i i alt 4 lymfeknuder for hver prøve. Generelt er celletal i milt, knoglemarv og lymfeknuder fra et dyr tilstrækkeligt til at foretage flowanalyse, og protokollen kan anvendes. Men, når du bruger væv fra kun ét dyr lysing gange kan være nødvendigt at justere.

  1. Milten
    1. Placer de to poolede milt på en 70 μm celle si på toppen af en 15 ml rør. Simr forsigtigt milt gennem netfilteret med en steril 3 ml sprøjtestempel. Skyl sien ofte med i alt 6 ml RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS.
    2. Drej cellerne (500 x g,5 min, RT) og opslæm pellet i 5 ml røde blodlegemer (RBC) lysis buffer. Inkuber i 5 minutter ved RT og stop reaktionen ved at fortynde lysisbufferen med 10 ml PBS. Drej cellerne (500 x g,5 min, RT) og gentag dette trin én gang, eller indtil der ikke er mere RBC i pellet.
      BEMÆRK: Suspensionen genfiltres med en 30 μm cellesien i et nyt 15 ml rør mellem de to lyslyseunder for at fjerne koagulerede celler.
    3. Når lysing er færdig, dreje cellerne (500 x g,5 min, RT), kassere supernatant og resuspend pellet i 1 ml PBS. Tæl antallet af levende celler på et hæmocytometer ved hjælp af Trypan blå udelukkelse.
  2. Lymfeknerne
    1. Placer de fire poolede lymfeknuder på en 70 μm celle si på toppen af en 15 ml rør. Forsigtigt drille lymfeknuder fra hinanden i en enkelt celle suspension ved at trykke med en steril 3 ml sprøjte stemplet. Skyl sien ofte med i alt 6 ml RPMI med 10% FBS.
    2. Drej cellerne (500 x g,5 min, RT), kassér supernatanten og opslæmp pelletet igen i 500 μL PBS. Suspensionen genfiltres med en 30 μm cellesien i et nyt 15 ml rør for at fjerne koagulerede celler. Tæl antallet af levende celler på et hæmocytometer ved hjælp af Trypan blå udelukkelse.
  3. Knoglemarven
    1. Tag forsigtigt fat i det intakte lårben ved hjælp af en vævstjraftæt uden at frakturering det. Skær slutningen af det proksimale lårben af med en skarp saks for at lette rødmen af knoglen. Drej lårbenet rundt og placer en 23 G nål i midten af det intercondylar hak af lårbenet. Mens der anvendes blidt tryk rotere nålen mellem tommel-og pegefinger for at bore et hul i intercondylar hak at komme ind i knoglehulen.
      BEMÆRK: Nogle gange kan knoglepartikler blokere nålen efter boring af hullet for at undgå unødvendigt højt tryk under skylning af en ændring af nålen, før skylning anbefales.
    2. Skyl knoglen med 6 ml RPMI med 10% FBS (eller indtil skylen bliver hvid) med en 10 ml sprøjte med en 23 G nål på en 70 μm cellestien, der er placeret på et 15 ml rør. Tryk forsigtigt knoglemarven gennem cellesien med et stempel på en 3 ml sprøjte og skyl sien med yderligere 3 ml RPMI.
      BEMÆRK: Knoglerne skal fremstå hvide, når al marven er skyllet helt ud.
    3. Drej cellerne (500 x g,5 min, RT) og opslæm pellet i 5 ml RBC lysis buffer. Inkuber i 5 minutter ved RT og stop reaktionen ved at fortynde lysisbufferen med 10 ml PBS.
    4. Drej cellerne (500 x g,5 min, RT), kassér supernatant og opslæmp pellet i 1 ml PBS. Suspensionen genfiltres med en 30 μm cellesien i et nyt 15 ml rør for at fjerne koagulerede celler. Tæl antallet af levende celler på et hæmocytometer ved hjælp af Trypan blå udelukkelse.
  4. Det synoviale væv
    1. Ter de to synovialvæv blokke i bittesmå stykker med en fin kirurgisk saks. Prøverne overføres med medium til et 15 ml rør. Skyl den gamle brønd med yderligere 0,5 ml RPMI for at få de resterende celler og synovialvæv, overførsel til falkerør (endeligt volumen 2 ml).
      TIP: Brug en overførselspipette, og skær spidsen over, hvor diameteren udvides i dette trin.
    2. Rekonstituere enzym og aliquot i henhold til producentens anvisninger (f.eks. Der tilsættes tilstrækkeligt enzym til at resultere i en endelig koncentration på 1 enhed/ml (i alt 2 enheder pr. prøve). Fordøje ved 37 °C i 2 timer ved hjælp af en MACS rotator.
    3. Stop fordøjelsen ved at tilsætte 8 ml RPMI med 10% FBS og filtercellesuspension gennem en 70 μm cellestien i et nyt 15 ml rør. Skyl det gamle 15 ml rør med yderligere 5 ml RPMI med 10% FCS-medium og filtercellesuspension gennem samme cellesien ind i det nye rør (15 ml endeligt volumen).
    4. Drej cellerne (500 x g,10 min, RT), kassér supernatanten og opslæmp pelletet igen i 500 μL PBS. Tæl antallet af levende celler på et hæmocytometer ved hjælp af Trypan blå udelukkelse.

3. Fordeling af celler

  1. Mærk to 96-brøndsplader (U-bundform) med vævstype, dyre-id og det udpegede antistofpanel. Der anvendes i alt to antistofpaneler i denne protokol: Monocyt-delsætpanel (ekstracellulær farvning) og T-celledelsætpanel (ekstra- og intracellulær farvning).
  2. Giv 5 x 105 celler pr brønd ved hjælp af de respektive enkeltcellesuspensioner.
    BEMÆRK: Ved opsætning af forsøget skal det absolutte antal celler, der forventes pr. gruppe og vævstype (behandlede dyr har et højere celletal i væv end kontroldyr). Når cellepelletet skal resuspeneres under det sidste trin i generering af enkeltcellesuspensioner, skal du vælge en passende mængde PBS for at ende med en koncentration på 5 x 105 pr. 200 μL. Den 96-brøndplade, der anvendes her, kan rumme maksimalt 300 μL, og typisk er 200 μL ideel til at minimere risikoen for krydskontaminering på grund af spild.
  3. For hvert panel og vævstype fordeles mindst 5 x 105 celler som uhæmmede kontroller i brønde, der er tydeligt markeret.

4. Monocyt-undersætpanel

  1. Udfør levedygtighed farvning: Spin celler (500 x g,5 min, 4 °C) ved hjælp af en plade spinner og vask cellerne én gang med 200 μL af 1x PBS. Der forberedes en stamopløsning af celle-impermeant amin-reaktivt farvestof (levedygtighedplet) fortyndet 1:50 i 1x PBS. Derefter opspjævnning af cellepiller med 100 μL af denne stamopløsning, hvilket resulterede i et absolut volumen på 2 μL levedygtighedplet pr. brønd. Inkuberes i 15 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
    BEMÆRK: Den optimale mængde levedygtighedplet, der er behov for, skal bestemmes ved at udføre en dosistitreringskurve. Desuden bør opløsning af fortyndet levedygtighed pletlager anvendes på en enkelt dag og må ikke opbevares. Se producentens vejledning for at få flere oplysninger om, hvordan du rekonstitueres, fortyndes og opbevares på levedygtighedspletten.
  2. Under inkubationen klargøres cocktailen af antistoffer i et passende volumen af FACS-buffer (Ca2+ og Mg+ fri PBS, der indeholder 0,1 % BSA og 0,02 % natriumazid). Cellerne vaskes to gange med 200 μL FACS-buffer, centrifuge (500 x g, 5 min, 4 °C) og opsaltes hver pellet med 100 μL af antistofblandingen eller den relevante kontrolblanding. Inkuberes i 30 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
    BEMÆRK: Vær opmærksom på, at natriumazid er giftigt for celler. I den nuværende protokol er koncentrationen af natriumazid i flowbufferen meget lav (0,02 %) og prøver køres umiddelbart efter farvning således, ikke forårsager noget problem. Hvis der planlægges funktionelle analyser af sorterede celler i senere omsætningsled, kan det være gavnligt at opføde frisk FACS-buffer hver dag med forsøg og ikke bruge natriumazid. Når du bruger et væld af antistoffer, anbefales det at tilføje en passende mængde "Brilliant Plet buffer" til cocktail af antistoffer til at forbedre resultaterne.
  3. Cellerne vaskes to gange med 200 μL FACS-buffer, og cellerne skal opslæls i 250 μL FACS + EDTA-buffer (FACS-buffer indeholdende 1 mM EDTA). Overfør prøverne til mærkede FACS-rør. Prøverne opbevares ved 4 °C og beskyttes mod lys indtil erhvervelsen.
    BEMÆRK: Immunceller har tendens til at være klistrede. For at minimere både risikoen for blokering og antallet af doublets anbefales det at tilføje 1 mM EDTA til den endelige flowbuffer.

5. T Celle delsæt panel

  1. Udfør levedygtighed farvning: Spin celler (500 x g,5 min, 4 °C) ved hjælp af en plade spinner og vask cellerne én gang med 200 μL af 1x PBS. Der forberedes en stamopløsning af celle-impermeant amin-reaktivt farvestof (levedygtighedplet) fortyndet 1:50 i 1x PBS. Derefter opspjævnning af cellepiller med 100 μL af denne stamopløsning, hvilket resulterede i et absolut volumen på 2 μL levedygtighedplet pr. brønd. Inkuberes i 15 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
  2. Mens du inkuberer prøverne, forberedes den ekstracellulære farvningsantistofcocktail i et passende volumen på 1x FACS-buffer. Cellerne vaskes to gange med 200 μL 1x FACS-buffer, drejes ned (500 x g,5 min, 4 °C) og opslæmmes hver pellet med 100 μL af antistofblandingen eller den relevante kontrolblanding. Inkuberes i 30 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
  3. Udfør den intracellulære farvning med et fikserings- og permeabiliseringssæt, der følger producentens anvisninger. Cellerne vaskes to gange med 200 μL 1x FACS-buffer og resuspendret i 200 μL fikseringsbuffer. Inkuberes i 40 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
  4. Under inkubationen forberedes cocktailen af antistoffer (intracellulær farvning) i et passende volumen på 1x permeabilisering og vaskebuffer. Cellerne opsamls ved at spinne (750 x g,5 min, 4 °C) og vaske celler to gange med 200 μL 1x perm/vaskebuffer.
    BEMÆRK: Fiksering og permeabilisering resulterer i celler, der har tendens til at være en smule sværere at korrekt pellet. For at minimere celletab under de efterfølgende vasketrin skal centrifugalkraften øges til 750 x g. Alternativt kan en længere spinning cyklus også anvendes. Dette ville dog resultere i en betydeligt længere tid, der er nødvendig for at forberede cellerne.
  5. Spinceller (750 x g,5 min, 4 °C) og opslæmt hver pellet med 100 μL af antistofblandingen eller passende kontrolblanding. Inkuberes i 40 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
  6. Cellerne vaskes to gange med 200 μL 1x perm/vaskebuffer, og cellerne opslæmmes igen i 250 μL FACS + EDTA-buffer. Overfør prøverne til mærkede FACS-rør. Prøverne opbevares ved 4 °C og beskyttes mod lys indtil erhvervelsen.
    BEMÆRK: For hvert antistof skal den optimale koncentration bestemmes ved at udføre en dosistitreringskurve. Koncentrationen mellem antistoffer kan variere drastisk: CD3 og CD80 blev anvendt med en fortyndingsfaktor på 1:1, mens CD11b og CD4 blev brugt med en fortyndingsfaktor på 1:6400. Ved titrering af antistofkoncentrationen anvendes det samme antal celler, som vil blive anvendt under forsøgene.

6. Kompensation, passende kontrol og gating

  1. Opsætning af eksperimentet
    1. Når den optimale antistofkoncentration er blevet bestemt, skal du køre uindgroede og enkeltfarvede kontroller for kompensation for at justere for spektral overlapning.
      BEMÆRK: Kør alle kompensationskontroller med både celler og kompensationsperler. Brug det, der genererer de lyseste resultater (højeste MFI af positive hændelser) for kompensation. MFI står for middelfluorescensintensitet og bruges ofte til at beskrive og definere gennemsnitsintensiteten af det genererede signal og dermed niveauet af antistofudtryk.
    2. Kør fluorescens minus en (FMO) kontrol og isotype kontrol, når du starter en ny flerfarvet eksperiment. Yderligere oplysninger om FMO er tidligere blevet offentliggjort19.
    3. Den optimale FSC-A-spænding (Forward Scatter Area) og SSC-A-spænding (Side Scatter Area) bestemmes for at detektere leukocytpopulationen i uhæmmede kontroller af hver vævstype.
      BEMÆRK: Fikserings- og permeabiliseringsprocessen ændrer cellens dimensioner. FSC-A- og SSC-A-spændingerne for Monocyt-undersætpanelet og T-celledelsættet er således meget forskellige. For at finde de optimale spændinger til T Cell Subset Panel, bruge celler, der er blevet enkelt farves med CD3 og bagporten mod leukocyt populationer, mens justere FSC-A og SSC-A værdier.
  2. Gating strategi
    1. Når den optimale FSC-A- og SSC-A spænding er fastlagt, skal der oprettes en primær port på leukocytpopulationen.
      BEMÆRK: Før hvert eksperiment kalibreres cytometeret ved hjælp af kalibreringsperler i henhold til producentens anvisninger og kør uindgroede perler. Leukocytpopulationer med forskellige tidspunkter bør have sammenlignelige FSC- og SSC-egenskaber (der forventes og normaliseres små forskelle mellem vævstyper). Hvis FSC og SSC varierer betydelige problemer skyde cytometer og prøve generation.
    2. Udeluk doublets: Plot FSC-A (y-akse) og FSC-H (x-akse). Singlets vises som en diagonal af dette plot. Port på singlets.
    3. Udelad døde celler: Plot FVS510 (levedygtighed plet) (x-akse) og FSC-A (y-akse). Døde celler vises som positive begivenheder, således gate på levende celler.
      BEMÆRK: Sande negative celler vil være synlige i uhæmmede kontrolelementer. Juster således denne port for hvert sæt prøver, når du kører de uindgroede kontroller før farvede prøver. Yderligere gating afhænger af antistof panel og celletype, der er undersøgt. Gating strategier for hvert panel, der anvendes i denne protokol kan findes i figur 1 og figur 4, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative resultater fra både det monocytdelsætpanel og T-celle-delsætpanelet er beskrevet nedenfor.

Figur 1 illustrerer den hierarkiske gatingstrategi for det monocyt-delsætpanel på immunceller, der er indsamlet fra knoglemarven hos DMM-behandlede dyr. Den samme strategi blev anvendt og verificeret i alle andre vævstyper. Ved opsætning af eksperimentet blev FSC-A-spændingen (Forward Scatter Area) og Side Scatter Area (SSC-A) bestemt for hver vævstype for at identificere monocytter/makrofager og udelade T-celler og snavs (G1). Under hvert eksperiment blev uhæmmede kontroller af hver vævstype analyseret, og FSC-A- og SSC-A-spænding justeres, når det var nødvendigt. Spændinger forventes at forblive ens over tid, hvis parametre ændrer sig drastisk en blokering af cytometeret er sandsynligt. Desuden blev der anvendt uindgrote kontroller til at bestemme de sande negativer for den døde/levende plet, og portene blev justeret, hver gang forsøget blev udført i overensstemmelse hermed (figur 2A). Ved udformningen af eksperimentet skal fluorokromerne vælges omhyggeligt, og normalt parres overflademarkører med lavt udtryk med lyse fluorokrom (f.eks. blev Alexa Fluor 647 brugt til CD206. Forskellige døde / levende pletter findes, der kan påvises ved forskellige bølgelængder; her blev FVS510 brugt.

Figur 3 illustrerer prøvedata fra immunceller, der er isoleret fra synovialvæv og plettet med ekstracellulære overflademarkører 6 uger efter, at dyrene har modtaget enten DMM- eller sham-control-kirurgi. Alle delmængder kan nemt identificeres ved hjælp af protokollen både i forsøg og kontrol dyr. Især kan der ses forskelle mellem grupper for makrofagsubsubsubser (højere procentdel af Ly-6C+/MHC-II- makrofager (G7) i DMM-gruppen) og udtrykket af makrofager M1 og M2 (højere procentdel af M2-makrofager i DMM-gruppen).

Figur 4 visualiserer den hierarkiske gatingstrategi for det ekstra- og intracellulære T-cellepanel på immunceller, der er isoleret fra milten af DMM-behandlede dyr. Principperne er identiske med dem, der anvendes til monocytpanelet. Men fastsættelse og permeabilization proces ændrer størrelse og tæthed af celler. Typiske FSC- og SSC-parametre skal derfor bestemmes ved hjælp af en back-gating-proces fra CD3+-celler, første gang eksperimentet oprettes for hver celletype. Nogle fluorokrom har tendens til at samle over tid (f.eks PE, der blev brugt med FoxP3 her). Aggregater kan potentielt ændre resultaterne på grund af den høje lysstyrke, der påvirker den spektrale-overlapning og kompensation. Således, alle antistoffer blev vortexed og spundet ned hver gang før deres anvendelse for at mindske aggregater. Derudover blev der anvendt en gating-strategi til yderligere at reducere aggregaternes indflydelse (G2). Under opsætning af forsøgene fluorescens minus en kontrol (FMOs) blev udført for hvert antistof. Eksempeldata er vist i figur 2B,2C.

Figur 5 og Figur 6 viser immunceller, der blev isoleret fra lymfeknuder (figur 5) og synovialvæv (figur 6) og farves ved hjælp af T-cellepanelets protokol 4 uger efter, at dyrene fik enten DMM- eller sham-control-kirurgi. Dataene viser en højere procentdel af Th1 celler i DMM dyr (G9) i begge væv. Desuden er intracellulær farvning for T-regulatoriske celler (G11) og Th17 celler (G12) vellykket ved hjælp af protokollen og forskelle kan påvises mellem grupper.

Figure 1
Figur 1: Flowcytometrihierarisk gatingstrategi ved hjælp af ekstracellulær farvning til at identificere monocytter/makrofager og deres undersæt. Myeloid celler er primært identificeret ved hjælp af en frem / side scatter (FSC-A og SSC-A) prik plot (G1). Derefter registreres singlets ved hjælp af FSC-A og FSC-H (G2), og efterfølgende vælges levende celler (G3). Celler fra G3 klassificeres yderligere ved hjælp af Ly-6G for at identificere neutrofiler (G4) og CD11b for monocyt/makrofager (G5a). MHC-II bruges til at identificere dendritiske celler (G5b) blandt CD11b positive celler, og F4/80 bruges til at vælge mellem makrofager (G6) og monocytter (G12). Makrofager klassificeres yderligere i deres delmængder ved hjælp af Ly-6C og MHC-II (Ly-6C+/MHC-II- makrofager (G7); Ly-6C-/MHC-II- vævsreklassering makrofager (G8); Ly-6C-/MHC-II+ blod stammer fra makrofager (G9)). Der kan vælges flere undersæt fra alle makrofager og de respektive delmængder ved hjælp af CD206 og CD80 (M1: CD80+/CD206- (G10); M2: CD80-/CD206+ (G11)). Monocytter klassificeres yderligere ved hjælp af MHC-II og CD11c (MHC-II-/CD11c- monocytter (G13); MHC-II+/CD11c- monocytter (G14)). Aktiveringsniveauet klassificeres derefter ved hjælp af Ly-6C-udtrykket og opdeles i lav (G15), medium (G16) og høj (G17). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Eksempeldata, der illustrerer passende kontrolelementer i både monocyt- og T-cellepanelet. (A)Synovialvæv blev høstet 6 uger efter enten DMM-kirurgi (DMM) eller sham-control-kirurgi (fingeret) og en enkelt celle suspension blev plettet ved hjælp af ekstracellulære overflade markører. Under hvert eksperiment blev uindgroede celler brugt til at bestemme sande negativer for den døde/levende plet og til at sætte porte (Kontrol). Indstilling af porte ved hjælp af uindgroede celler er vist i panel A. (B +C)Miltceller blev høstet fra ubehandlede kontroldyr, en enkelt celle suspension genereret og farves ved hjælp af både ekstra- og intracellulære markører. Fluorescerende-minus-en (FMO) kontrol blev genereret af farvning celler med hele antistof panel mangler kun ét antistof. Der vises prøvedata for begge intracellulære antistoffer. bB) FMO -RORgt ogc) FMO-Fox-P3. FMOs blev udført for begge paneler og bruges til at indstille hver port. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Ekstracellulær farvning af monocytter/makrofager isoleret fra mus synovium. Prøvevæv blev indsamlet 6 uger efter mus fik enten DMM-kirurgi (DMM) eller fingeret-kontrol-kirurgi (fingeret). Yderligere oplysninger om de udnyttede porte findes i figur 1. Eksempeldata viser, at alle delmængder kan identificeres pålideligt, og forskelle kan ses mellem grupper. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Flowcytometrihierarisk gatingstrategi ved hjælp af både ekstra- og intracellulær farvning til identifikation af T-celler og deres delmængder. T-celler identificeres primært ved hjælp af et punktplot for fremad/side (FSC-A og SSC-A) (G1). På grund af arten af de anvendte antistof aggregater bør udelukkes ved hjælp af CD3 og CD4 (G2). Derefter registreres singlets ved hjælp af FSC-A og FSC-H (G3), og efterfølgende vælges levende celler (G4). Celler fra G4 klassificeres yderligere ved hjælp af NK1.1 for at identificere naturlige dræberceller (G5) og CD3 for at identificere T-celler (G6). Aktiveringsniveauet bestemmes ved hjælp af CD69 (G6b). Derefter anvendes CD4 og CD8 til at identificere T-killer celler (CD4-/CD8+ (G7)) og T-helper-celler (CD4+/CD8- (G8)). T-hjælperceller klassificeres i Th-1 (C-X-CR3+/CCR4- (G9)) og Th-2 celler (C-X-CR3-/CCR4+ (G10)) ved hjælp af C-X-CR3 (CD183) og CCR4 (CD194). Desuden identificeres Th-17-celler (CD25+/RORgt+ (G11)) og T-regulatoriske celler (CD25+/Fox-P3+ (G12)) ved hjælp af intracellulære markører. Desuden identificeres undersæt af hukommelsesceller fra T-hjælperceller ved hjælp af CD44 og CD62L (CD44-/CD62L+ naive T-hukommelsesceller (G13). CD44+/CD62L+ centrale T-hukommelsesceller (G14); CD44+/CD62L- effektor T-hukommelsesceller (G15)). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Ekstracellulær og intracellulær farvning af T-celler, der er isoleret fra drænende lymfeknuder for mus. Prøvevæv blev indsamlet 4 uger efter mus modtaget enten DMM-kirurgi (DMM) eller fingeret-kontrol-kirurgi (fingeret). Yderligere oplysninger om de udnyttede porte findes i figur 4. Eksempeldata viser, at alle delmængder kan identificeres pålideligt, og forskelle kan ses mellem grupper. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Ekstracellulær og intracellulær farvning af T-celler isoleret fra synovialvæv af mus. Prøvevæv blev indsamlet 4 uger efter mus modtaget enten DMM-kirurgi (DMM) eller fingeret-kontrol-kirurgi (fingeret). Yderligere oplysninger om de udnyttede porte findes i figur 4. Eksempeldata viser, at alle delmængder kan identificeres pålideligt, og forskelle kan ses mellem grupper. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder, der er beskrevet i denne protokol er designet og testet til pålideligt at identificere forskellige delmængder fra både monocytter / makrofager og T-celler i murine milten, knoglemarv, lymfeknuder, og synovialvæv i en murine model af slidgigt (OA). Den nuværende protokol kan nemt ændres til at undersøge forskellige vævstyper, eller andre celletyper ved at udveksle antistoffer, og kan bruges til alternative murine modeller af OA. Ved test af andre vævstyper er det afgørende at teste hvert antistofs specificitet, da udtryk for overflademarkører for immunceller varierer i hvert væv20. Ved udveksling af antistoffer er det desuden nødvendigt at udføre en dosistitreringskurve for at fastslå den optimale koncentration af antistof samt gentage kompensationsprocessen for at afhjælpe ændringer i spektral overlapning.

I den aktuelle protokol blev OA induceret ved hjælp af DMM-musemodellen18. De mest almindeligt anvendte og etablerede dyremodeller er i musen, fordi denne art giver mangefoldige fordele i at undersøge patofysiologi af post-traumatisk OA17. Især i musen er kirurgiske og ikke-kirurgiske OA-modeller blevet beskrevet17: den mest almindelige er destabilisering af den mediale menisk (DMM), kirurgisk transsektion af det forreste korsbånd (ACLT) og ikke-kirurgisk ACL-brud (ACLR), henholdsvis21. Alle disse dyremodeller er velegnede til undersøgelse af den rolle, cellulær inflammation i patologien af post-traumatisk OA og den nuværende protokol er blevet testet med succes for alle tidligere nævnte dyremodeller i laboratoriet. Selv om alle de ovennævnte dyremodeller er etableret og er blevet beskrevet i litteraturen, har hver sine egne styrker og begrænsninger, der er blevet diskuteret i detaljer andresteder 17 og derfor kun diskuteres kort nedenfor. Alle kirurgiske modeller er underlagt den kirurgiske tilgang, sårheling proces og dens tilknyttede inflammatoriske respons. Ved vurderingen af inflammatoriske cellers bidrag til udviklingen af posttraumatisk OA kan denne inflammatoriske sårhelingsrespons tjene som en confounder, især i de tidlige tidspunkter efter interventionen. Desuden skal DMM- og ACLT-procedurer udføres på en meget standardiseret måde for at minimere variabiliteten mellem dyrene. ACLT-operationen er meget vanskeligere at lære end DMM-operationen og kræver en større kirurgisk eksponering end DMM for definitivt at identificere og sikre skade kun til ACL og undgå iatrogene skader på andre ledvæv18. Ikke-kirurgisk ACL brud er en standardiseret og meget effektiv måde at fremkalde post-traumatisk OA. Men en specialiseret enhed, der anvender en kontrolleret enkelt trykbelastning på skinnebenet af det bøjede knæ er nødvendig. Denne enhed skal kalibreres og testes for at opnå sammenlignelige og pålidelige resultater. Derudover fremkalder ACLR-modellen meget alvorlige og progressive ledskader hos mus med markant erosion af det bageste mediale tibial plateau22, der ikke ses med ACL-skade hos andre arter, herunder mennesker.

For at omfattende karakterisere den inflammatoriske proces og dens cellulære komponent under udviklingen af OA, er det ønskeligt at ikke kun undersøge synovialvæv, men også de lokale lymfeknuder samt sekundære lymfoide organer, såsom milten og knoglemarven. Lymfedrænage mønstre i knæleddet er blevet karakteriseret i mus og lymfevæske fra knæleddet afløb gennem både iliaca og inguinal lymfeknude ved en varierende dispersion23,24. For at lette sammenligneligheden mellem dyr, besluttede vi i denne protokol at samle lyskelymfeknude og iliaca lymfeknude. I modsætning hertil, mens i nærheden af knæet, popliteal lymfeknude dræner bagfoden og ikke spiller en rolle under inflammatoriske processer i knæet.

Mus har en lille mængde af intra-artikulære synovial væv25 og isolering af immuncellerne heri er fortsat udfordrende. I den nuværende protokol blev høstteknikker for synovialvæv tilpasset for at muliggøre isolering af det maksimale antal immunceller. Derfor omfatter høstteknikken supra- og infrapatellarfordybningerne samt infrapatellar-fadpuden på grund af dens høje antal immunceller26. Fordøjelsesprocessen og valget af enzym blev optimeret til fuldt ud at fordøje synovialmembranen og fedtvævet, mens senen blev forladt, og patellaen og brusken var uden at blive oprøjet. Således introducerer den nuværende protokol en reproducerbar metode til at høste immunceller fra synovialvæv.

Flow cytometri analyse har flere fordele ved undersøgelse af cellulære immun processer under udviklingen af OA; ikke desto mindre har denne teknik begrænsninger. På grund af det lille antal immunceller i synovialvævet er det nødvendigt at samle vævsprøver fra mindst to dyr for at få én prøve. På grund af det store antal fluorromer og farver, der anvendes i denne protokol, skal der lægges særlig vægt på en omhyggelig kompensation for en mulig spektral overlapning for hver vævstype, og kompensationen skal revurderes konsekvent under hele brugen af denne teknik. På grund af det store antal tilgængelige markører og betydelige forskelle mellem undersøgelser for at identificere en bestemt population, en anden mulig begrænsning er valget af markører, der anvendes til at identificere celler19. Flowcytometri giver mulighed for kvantificering af "hændelser", som ikke nødvendigvis koordinerer med totalceller. For at opnå en virkelig kvantitativ analyse, er man nødt til enten at erhverve tælle perler samtidig, når du kører flow analyse eller tælle celler i enkelt celle suspensioner på forhånd for at opnå absolutte tal (som gjort her). Generelt kan principperne i denne protokol (f.eks. hvordan man udformer og opretter et flowpanel eller teknikker, der anvendes til fremstilling af enkeltcellesuspensioner), potentielt tilpasses til humane prøver. Overflademarkører for humane immunceller adskiller sig imidlertid fra murinceller, og derfor skal passende antistoffer udvælges og testes. Desuden skal varigheden af RBC lysis og passende buffermængde bestemmes, da den højst sandsynligt er forskellig. Før tilpasning af metoder fra denne protokol til andre arter eller væv er det nødvendigt at foretage omhyggelig afprøvning af hvert trin for at sikre, at metoderne fungerer efter hensigten.

På trods af sine begrænsninger, flow cytometri analyse af immunceller forbliver en kraftfuld teknik, der gør det muligt at identificere både monocytiske celle og T-celle delmængder på enkelt celleniveau. Den nuværende protokol indfører navnlig en pålidelig og reproducerbar teknik, der kan identificere og kvantificere det cellulære immunrespons under udviklingen af OA i synovialvævet og sekundære lymfeorganer. I fremtiden, denne teknik kan bidrage til at karakterisere immunrespons i forskellige slidgigt inducerende dyremodeller og herefter vurdere effekten af immun modulerende lægemidler på denne invaliderende sygdom.

Afslutningsvis beskriver denne flowcytometriprotokol en detaljeret og reproducerbar metode til at identificere monocytter/makrofager og T-celledelmængder ved hjælp af både ekstra- og intracellulære farvningsanalyser i murinskige, knoglemarv, lymfeknuder og synovialvæv ved hjælp af en etableret kirurgisk slidgigt musemodel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Andrew Lim, Ph.D. og Giles Best, Ph.D. for deres hjælp til at oprette flow cytometer. Dette projekt blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1), der blev tildelt PH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4) BioLegend 131212 T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst BD 566385 Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 Monocyte Panel
Liberase, Research Grade Roche 5401127001 Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg BD 564985 Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg BD 562454 Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg BD 742274 T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg BD 565250 Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg BD 563061 T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg BD 557596 T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg BD 552775 T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg BD 565480 T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg BD 565261 T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg BD 740664 T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg BD 563687 Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg BD 563332 T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg BD 565411 Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg BD 560408 T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg BD 563414 Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg BD 560593 Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg BD 560600 Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg BD 564143 T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg BD 562894 T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer N/A N/A Buffers
Transcription Factor Buffer Set 100Tst BD 562574 Buffers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
  2. Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
  3. Woolf, A. D., Pfleger, B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).
  4. Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
  5. Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
  6. Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
  7. Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
  8. Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
  9. Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
  10. Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
  11. Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
  12. Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
  13. Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
  14. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
  15. Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
  16. Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
  17. Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  20. Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  21. Lorenz, J., Grassel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  22. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  23. Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
  24. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  25. Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
  26. Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).

Tags

Medicin Slidgigt immunologi flow cytometri lymfocyt delmængder T-celler monocytter makrofager ortopædi posttraumatisk slidgigt
Flow Cytometri Analyse af immuncelledelmængder i Murine Milten, Knoglemarv, Lymfeknuder og synovialvæv i en osteokhritis model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu,… More

Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu, Y., Stoner, S., Shu, C., Little, C. B. Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model. J. Vis. Exp. (158), e61008, doi:10.3791/61008 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter