Summary
يصف هذا البروتوكول نموذج عدوى أسبيرغيلوس في يرقات حمار وحشي. يتم حقن جراثيم أسبيرغيلوس في الدماغ الخلفي لليرقات ، ويستخدم العلاج الكيميائي للحث على كبت المناعة. يتم رصد تطور العدوى عن طريق إعداد التصوير اليومي لمراقبة النمو الفطري والاستجابات المناعية وكذلك تعداد الجراثيم الحية عن طريق طلاء وحدة تشكيل المستعمرة.
Abstract
داء الرشاشيات الغازي (IA) هو واحد من العدوى الفطرية الأكثر شيوعا بين الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة. على الرغم من توافر الأدوية المضادة للفطريات، يمكن أن يسبب IA >50٪ وفيات في المرضى المصابين بناه نقص المناعة. ومن الأهمية بمكان تحديد العوامل المضيفة ومسببات الأمراض التي تسهم في قابلية العدوى وانخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة لدى المرضى المصابين من أجل تطوير علاجات جديدة. تلعب الاستجابات المناعية الفطرية دورا محوريا في التعرف على جراثيم Aspergillus وإزالتها ، على الرغم من أنه لا يعرف الكثير عن الآليات الخلوية والجزيئية الدقيقة. ويلزم وجود نماذج موثوقة للتحقيق في التفاعلات الميكانيكية التفصيلية بين المضيف ومسببات الأمراض. الوضوح البصري وقابلية المسالك الوراثية ليرقات حمار وحشي جعلها نموذجا مثيرا للاهتمام لدراسة التفاعلات المضيفة الممرضة لعدة التهابات بكتيرية وفطرية بشرية في مضيف حي وسليم. يصف هذا البروتوكول نموذج عدوى حمار وحشي يرقي Aspergillus. أولا، يتم عزل جراثيم أسبيرغيلوس وحقنها في البطين الخلفي لسمك الحمار الوحشي عن طريق الحقن الدقيق. ثم تضاف مثبطات كيميائية مثل الأدوية المثبطة للمناعة مباشرة إلى ماء اليرقات. يتم وصف طريقتين لرصد العدوى في اليرقات المحقونة ، بما في ذلك 1) تجانس اليرقات لتعداد وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) و 2) إعداد تصوير حي يومي متكرر. وعموما، يمكن استخدام هذه التقنيات لتحليل ميكانيكيا تطور عدوى أسبيرغيلوس في الجسم الحي ويمكن تطبيقها على خلفيات المضيف المختلفة وسلالات أسبيرغيلوس لاستجواب التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض.
Introduction
أسبرجريلوس fumigatus هو الفطريات saprophytic في كل مكان، ويمكن العثور على جراثيم المحمولة جوا على حد سواء في الداخل والخارج1. يتم استنشاق هذه الجراثيم من قبل الجميع ولكن تصبح واضحة بشكل فعال من رئتي الأفراد من ذوي القدرة المناعية1،2. ومع ذلك ، يمكن للأشخاص الذين يعانون من أمراض الرئة المتغيرة مثل التليف الكيسي تطوير داء الرشاشيات القصبي الرئوي بسبب الإنبات الفطري في الرئتين3. الشكل الأكثر شدة من هذه العدوى، داء الرشاشيات الغازية (IA)، ويؤثر على الأفراد منقوص المناعة وينطوي على نمو الفطريات في أجهزة أخرى2،3. IA يؤدي إلى وفاة >50٪ من المرضى المصابين على الرغم من توافر العلاجات المضادة للفطريات4. في الأفراد المنافسين للمناعة ، تلعب الاستجابات المناعية الفطرية دورا رئيسيا في إزالة الجراثيم المستنشقة1. ومع ذلك ، فإن الآليات المحددة التي تساهم في هذا التطهير المناعي الفطري ليست مفهومة جيدا. من المهم فهم الآليات الخلوية والجزيئية للخلايا المناعية الفطرية الرئيسية (أي الضامة والنيوتروفيليا) في إزالة أسبيرغيلوس من أجل العثور على استراتيجيات علاجية جديدة لIA.
في حين أن نماذج الثدييات كانت مفيدة في تحديد عوامل الفوعة الفطرية والاستجابات المناعيةالمضيفة 5،6، فإن إمكانية الوصول البصري محدودة للتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض على المستوى الخلوي. لا يمكن لتجارب زراعة الأنسجة أن تلخص بشكل كامل البيئة المعقدة متعددة الخلايا والتفاعلات الموجودة في بأكملها7. لذلك ، اكتسبت حمار وحشي شعبية ككائن حي نموذجي بديل لسد هذه الفجوة وتسهيل دراسة التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض في مضيف حي سليم عبر عدوى متعددة الأيام8،9. يتطور الجهاز المناعي الفطري لسمك الحمار الوحشي في وقت مبكر من 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf)10، ويستغرق النظام التكيفي 4-6 أسابيع لتطوير11، مما يوفر نافذة من الوقت يمكن فيها تقييم الاستجابات المناعية الفطرية بمعزل عن غيرها. يتم الحفاظ على الاستجابات المناعية الفطرية بشكل جيد بين البشر وسمك الحمار الوحشي11. وسمك الحمار الوحشي له العديد من الصفات التي تسهل التحقيق في هذه الاستجابات، بما في ذلك الوضوح البصري (الذي يسمح بالتصوير الحي عالي الدقة للمضيفين السليمين) وقابلية المسالك الوراثية (مما يسهل الدراسات الميكانيكية الجزيئية).
تم تطوير نموذج عدوى حمار وحشي اليرقات Aspergillus الموصوف هنا في الأصل من قبل نوكسوآخرون. وقد تم مؤخرا توسيعه من قبل مجموعتنا وغيرها للتحقيق في الآليات المناعيةالمضيفة 12،13، التفاعلات المضيفةالممرضة 13،14،15، آليات كبت المناعة13،16،17، الفوعة الفطرية18، وفعالية الدواء المضاد للفطريات19،20. يلخص هذا النموذج جوانب متعددة من داء الرشاشيات البشري. في حين أن اليرقات المناعية مقاومة ، يمكن أن تستسلم اليرقات المنافرة للعدوى12و13و16و17.
في هذا النموذج ، يتم إنشاء عدوى موضعية عن طريق حقن الجراثيم في البطين الخلفي لليرقة ، وهي منطقة أقل اكتظاظا بالخلايا الفرجية ، ويمكن تقييم تجنيد الخلايا الفرجية وسلوكها12،13. ويعتقد أن الضامة بمثابة خط الدفاع الأول ضد جراثيم أسبيرغيلوس في البشر1 والثدييات نماذج6،21. وبالمثل ، في نموذج حمار وحشي ، يتم تجنيد الضامة إلى جراثيم Aspergillus المحقونة ، في حين يتم تجنيد العدلات بشكل ثانوي استجابة لنمو الواصلة12و13و22. من هذا النموذج ، تم أيضا معرفة أن Aspergillus يمكن أن يستمر في يرقات الأنواع البرية المناعية بعد أكثر من 7 أيام من العدوى. وعلاوة على ذلك ، يمكن اتباع مسار العدوى بأكمله في نفس الحيوانات الحية عن طريق التصوير البؤري اليومي.
يصف هذا البروتوكول تقنية الحقن المجهري لحقن الجراثيم في البطين الخلفي لمدة يومين بعد الإخصاب (2 dpf) اليرقات. ثم يتم رصد العدوى لمدة تصل إلى 7 أيام ، حيث يمكن أن تعيش يرقات حمار وحشي حتى 10 ديسبف دون تغذية. يمكن أن يسبب العلاج من المخدرات كبت المناعة ، كما يتم وصف تطبيق الأدوية على اليرقات. وأخيرا، يتم وصف طريقتين لمتابعة تطور العدوى، بما في ذلك تحديد كمي ل CFUs من اليرقات الفردية وإعداد التصوير الحي اليومي.
Protocol
يجب على الباحثين الحصول على الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من لجان العناية والاستخدام المناسبة للحيوانات. البيانات التمثيلية المعروضة في هذه المقالة هي من التجارب التي أجريت بموجب بروتوكولات معتمدة من قبل لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كليمسون (AUP2018-070، AUP2019-012).
1. إعداد جراثيم أسبيرجيلوس للحقن
- من تعليق بوغ أسبيرغيلوس، حساب حجم اللازمة للحصول على 1 × 106 الجراثيم. يجب أن يكون حجم 20-100 ميكرولتر; إذا لم يكن كذلك، وإنتاج تخفيف 10x في 0.01٪ (v/v) العقيم توين-20 (توين المياه؛ جدول المواد). على سبيل المثال، إذا كان الحجم المحسوب هو 5 ميكرولتر، قم بإنتاج تخفيف 10x واستخدم 50 ميكرولتر من المحلول المخفف.
ملاحظة: يمكن إعداد صفيحتين/سلالة لجمع المزيد من الجراثيم أو كقطعة غيار في حالة التلوث. - انتشار 1 × 106 جراثيمAspergillus على واحد الجلوكوز الحد الأدنى من وسائل الإعلام (GMM) لوحة(جدول المواد)مع معقمة القابل للتصرف على شكل حرف L في خزانة السلامة البيولوجية. تجنب الانتشار إلى هامش اللوحة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام، مع لوحة تواجه رأسا على عقب.
- في يوم الجمع، أحضر الميراكلوت العقيم وأنابيب مخروطية سعة 50 مل (اثنان لكل سلالة)، وزجاجات طازجة من مياه توين العقيمة (واحدة لكل سلالة)، وموزعات معقمة على شكل حرف L يمكن التخلص منها إلى خزانة السلامة الحيوية.
ملاحظة: يمكن قطع Miracloth إلى ~ 8 في × 6 في قطع، ملفوفة في احباط، وautoclaved لتعقيم. - ضع قطعة واحدة من الميراكلوث في كل أنبوب مخروطي سعة 50 مل وإعادة الغطاء. أخرجي علبة الميراكلوث المتبقية من غطاء محرك السيارة.
- أحضر اللوحات إلى خزانة السلامة الحيوية. افتح طبق واحد، ثم صب توين الماء على الجزء العلوي لتغطية حوالي ثلاثة أرباع لوحة.
- باستخدام موزع على شكل حرف L يمكن التخلص منه ، كشط سطح الثقافة الفطرية بلطف في حركة ذهابا وإيابا ، مع استخدام اليد الأخرى لتدوير اللوحة. كشط حتى يتم تجانس تقريبا كل من الجراثيم في المياه توين.
ملاحظة: بسبب ارتفاع رهاب الماء، يمكن أن تخلق الجراثيم "نفث" عند إضافة مياه توين أو أثناء الكشط. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تلوث الأنابيب أو الصفائح القريبة. ينصح بتغيير القفازات ومسح السطح بالإيثانول بنسبة 70٪ بين استخراج سلالات مختلفة. - خذ أنبوبا مخروطيا واحدا سعة 50 مل وأزل قطعة الميراكلوث. أضعاف في النصف وجعله في مرشح إدراجها في الجزء العلوي من أنبوب مخروطي 50 مل.
- صب المتجانس الفطرية من لوحة على miracloth في الأنبوب.
ملاحظة: إذا تم إعداد طبقين من سلالة واحدة، كشط كل من لوحات وتصب لهم في نفس أنبوب مخروطي. - صب توين المياه ليصل إجمالي حجم في أنبوب مخروطي إلى 50 مل.
- تدور في 900 × ز لمدة 10 دقيقة. تأكد من استخدام قبعات منع الهباء الجوي في جهاز الطرد المركزي.
- صب قبالة supernatant في محلول التبييض ~ 10٪ لإزالة التلوث. صب 50 مل من برنامج تلفزيوني 1x عقيمة في أنبوب مخروطي، ثم دوامة أو يهز لإعادة إنفاق بيليه.
- تدور مرة أخرى في 900 × ز لمدة 10 دقيقة. صب قبالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1x عقيمة. تصفية من خلال قطعة جديدة من miracloth في أنبوب مخروطي 50 مل جديدة.
- جعل 10 أضعاف المخففات التسلسلية (10x، 100x، 1000x) من المتجانس الفطرية في أنابيب الطرد المركزي 1.7 مل (على سبيل المثال، للمحلول 10x، مزيج 100 ميكروغرام من المتجانس الفطرية مع 900 ميكروغرام من توين المياه).
- اختيار التخفيف الأول الذي الجراثيم غير مرئية عندما يتم تفريغها في توين المياه واستخدام هذا التخفيف لحساب عدد الجراثيم باستخدام مقياس الدم.
- حساب تركيز بوغ في متجانسة الفطرية المعدة (تعليق المياه) باستخدام الصيغة التالية:
التركيز (الجراثيم / مل) = عدد الجراثيم في منتصف 25 صناديق × عامل التخفيف × 104 - إعداد مخزون 1 مل من 1.5 × 108 جراثيم / مل في برنامج تلفزيوني 1x عقيمة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.7 مل. يمكن تخزين هذا الإعداد بوغ في 4 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع تقريبا.
- قبل الاستخدام في الحقن، اخلط 20 ميكرولتر من إعداد البوغ مع 10 ميكرولتر من 1٪ من الفينول الأحمر العقيم في أنبوب طرد مركزي سعة 1.7 مل لتحقيق تركيز بوغ نهائي قدره 1 × 108 جراثيم / مل. دوامة جيدا قبل الحقن.
ملاحظة: يجب أن يكون 1٪ محلول فينول أحمر مرشح تعقيم وتخزينها في aliquots. - لحقن وهمية, مزيج 20 ميكرولتر من 1x PBS مع 10 ميكرولتر من 1٪ فينول أحمر معقم.
2. إعداد لوحات أجار للحقن
- إعداد 2٪ agarose في E3 المتوسطة وتذوب في الميكروويف.
- صب في طبق بيتري 100 ملم × 15 ملم (~ 25 مل لكل لوحة)، دوامة لتغطية لوحة بالتساوي، والسماح لتبرد.
- التفاف لوحة مع فيلم البارافين وتخزين مقلوب في 4 °C.
- قبل الحقن، أحضر الطبق إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
- صب ~ 1 مل من مرشح تعقيمها 2٪ ألبوم مصل البقر (BSA) على لوحة، إمالة لوحة لنشر وتغطية الجزء السفلي بأكمله، وشطف مع E3.
ملاحظة: يمكن تعقيم محلول BSA بنسبة 2٪ وتخزينه ك 1 مل من اليكوت عند -20 درجة مئوية. - صب E3 مع tricaine المخزنة مؤقتا على لوحة والسماح لها الجلوس حتى الحقن.
3. حمار وحشي يرقة الدماغ الخلفي البطين microinjection
- يرقات dechorionate يدويا مع ملقط في 2 dpf في طبق بيتري.
ملاحظة: يمكن إجراء dechorionation في أي وقت من 1.5 ديسف في الو حتى وقت الحقن. - إزالة أكبر قدر ممكن من E3 من طبق بيتري وإضافة تخزين مؤقت 300 ميكروغرام / مل tricaine في E3 لتخدير اليرقات.
ملاحظة: يمكن إعداد وتخزين محلول مخزون من ثلاثية 4 ملغم/مل في E3 عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. يمكن إجراء حل العمل عن طريق تخفيف 4 مل من محلول المخزون حتى 50 مل مع E3. - استخدام الإعداد microinjection الموردة مع حاقن الضغط، وحدة الضغط الخلفي، footswitch، حامل micropipette، micromanipulator، وموقف المغناطيسي ولوحة، وكلها متصلة بمصدر للهواء المضغوط (جدول المواد).
- افتح صمام الهواء المضغوط ثم قم بتشغيل المايكروينجيكتور. تعيين الضغط إلى ~ 25 PSI، ومدة النبض إلى 60 مللي ثانية، ووحدة الضغط الخلفي إلى 1 PSI.
- تحميل إبرة microinjection باستخدام طرف ماصة microloader (جدول المواد) مع حوالي 3-5 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أعدت أو تعليق بوغ مع فينول الأحمر. قم بتركيب الإبرة على المايكرومانيبولاتور.
ملاحظة: يمكن إعداد الإبر microinjection كما هو موضح سابقا23. يجب أن يكون للمجهر الاستريو المستخدم في التكميل الدقيق قعقعة قطعة عين لمعايرة إبرة الحقن المجهري. يجب معايرة الشبكية بميكرومتر مرحلي، ويجب تحديد طول مقياس الشبكية (μm). يتم قياس قطر قطر قطرة التعليق البوغ التي تخرج من الإبرة اعتمادا على عدد التجزئات (من الشبكية) التي تتداخل مع القطرة. - ضع المايكرومابولاتور بحيث تكون نهاية الإبرة في المنظر عند أدنى تكبير تحت المجهر الاستريو. تكبير إلى تكبير 4x، والحفاظ على الإبرة في العرض.
- باستخدام ملقط حاد، مقطع نهاية الإبرة. اضغط على دواسة الحقن لتصور حجم القطيرات التي تخرج. الحفاظ على لقطة مرة أخرى حتى ~ 3 يتم حقن nL من تعليق بوغ (هنا، وهذا هو خمسة تجزئة).
- نقل micromanipulator وإبرة للخروج من الطريق لتجنب ضرب بطريق الخطأ الإبرة في حين يتم ترتيب اليرقات على لوحة الحقن.
- صب E3-Tricaine قبالة لوحة الحقن، ثم نقل ~ 24 يرقات مخدر إلى لوحة الحقن مع أقل قدر ممكن E3 باستخدام ماصة نقل.
- باستخدام أداة صغيرة للتلاعب يرقات حمار وحشي (أي أداة حلقة الشعر أو أداة رمش) ، وترتيب اليرقات وفقا للاتجاه الذي يواجهونه. على وجه التحديد، ضع كل ما يواجه إلى اليمين في صف واحد، وكلها تواجه إلى اليسار في صف واحد أدناه.
ملاحظة: هذا الترتيب صعب إذا كان هناك الكثير من السائل على اللوحة ، حيث أن اليرقات "تطفو" في مكانها. ومع ذلك ، فإن القليل جدا من السائل يمثل مشكلة أيضا إذا استغرقت الحقن وقتا طويلا ، حيث يمكن أن تجف اليرقات أو يزول التخدير. وبالتالي ، ينبغي إيلاء اهتمام دقيق لكمية السائل على لوحة طوال عملية microinjection بأكملها. - ضبط التكبير المجهر إلى أدنى التكبير. أحضر الميكرومانيبولاتور مرة أخرى ورتب بحيث تكون الإبرة قريبة من اليرقات ، بزاوية ~ 30°-60 ° ، في منتصف مجال الرؤية.
- تكبير إلى أعلى التكبير واستخدام مقابض التكيف الدقيقة لمزيد من ضبط موقف الإبرة. تحقق من أن جراثيم ~30-70 تخرج من الإبرة عن طريق حقن تعليق البوغ في السائل على اللوحة المجاورة لليرقات. ضبط الوقت والضغط على إعداد الحقن، إذا لزم الأمر.
ملاحظة: يجب تكرار هذا الاختبار بعد كل خمس إلى ست يرقات ، حيث يمكن أن يزيد عدد الجراثيم التي تخرج من الإبرة أو ينخفض بمرور الوقت. - بدءا من الصف الذي تواجه فيه اليرقات نحو الإبرة ، قم بتحريك اللوحة بحيث تكون الإبرة فوقها مباشرة ووضعها بالقرب من اليرقات الأولى.
- تحريك الإبرة مع micromanipulator، إدراج الإبرة من خلال الأنسجة حول الحويذة otic لاختراق من خلال في البطين الخلفي. حرك اللوحة باليد الأخرى حسب الضرورة للحصول على الاتجاه الصحيح لليرقة بزاوية الإبرة.
- تحقق بصريا من أن نهاية الإبرة في وسط البطين الخلفي، اضغط على دواسة القدم لحقن الجراثيم وسحب الإبرة بلطف.
ملاحظة: يجب أن تبقى الصبغة الحمراء الفينول في المقام الأول داخل البطين الخلفي. قد تذهب كمية صغيرة إلى الدماغ المتوسط ، ولكن لا ينبغي أن تصل إلى الدماغ الأمامي أو خارج الدماغ. إذا حدث ذلك ، فإن الحجم الذي يتم حقنه كبير جدا ، ويجب تقليل الضغط والوقت وفقا لذلك ، أو يجب معايرة إبرة جديدة. - تتحرك أسفل الصحن، وحقن جميع اليرقات في هذا الصف. ثم، بدوره لوحة حولها وحقن جميع اليرقات في الصف الآخر.
ملاحظة: يمكن وضع علامة على اليرقات التي تم حقنها أو تلفها عن طريق الخطأ دون جدوى من قبل 1) حقن في صفار بضع مرات لإنشاء علامة حمراء أو 2) سحب اليرقة من الصف مع الإبرة. - تحرك إبرة صعودا وابتعادا عن الطريق مرة أخرى. تصغير إلى تكبير أقل على المجهر. يجب أن تكون الصبغة الحمراء الفينول لا تزال مرئية في الدماغ الخلفي لكل يرقة.
- أولا ، اسحب بعيدا باستخدام أداة حلقة الشعر وماصة للتخلص من أي يرقات بالحقن غير الناجحة. نقل اليرقات المتبقية إلى طبق بيتري جديد عن طريق غسلها من لوحة مع E3 معقمة طازجة وماصة نقل.
- كرر حسب الضرورة لعدد العينة التجريبية النهائية المطلوبة.
- شطف اليرقات على الأقل 2x مع E3 وضمان الشفاء من التخدير.
- لقياس البقاء على قيد الحياة دون أي علاج آخر ، باستخدام ماصة نقل ، قم بنقل اليرقات إلى لوحة بئر 96 (يرقة واحدة لكل بئر) في E3.
4. إنشاء حقن وأعداد بوغ قابلة للحياة
- بعد الحقن مباشرة ، باستخدام ماصة نقل ، اختر عشوائيا حوالي ثمانية من اليرقات المحقونة ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي 1.7 مل (يرقة واحدة لكل أنبوب).
- قتل اليرقات مع tricaine أو عن طريق وضعها في 4 درجة مئوية لمدة 0.5-2.0 ساعة.
- إعداد 1 مل من 1 ملغم / مل أمبيسلين و 0.5 ملغم / مل حلول المضادات الحيوية كاناميسين في برنامج تلفزيوني 1x معقمة. يمكن تخزين المحلول المتبقي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدامه لاحقا.
ملاحظة: يمكن أن تكون حلول المخزون من أمبيسلين في 100 ملغم / مل وكاناميسين 50 ملغ / مل مسبقة الصنع، مرشح تعقيمها، وتخزينها في aliquots في -20 درجة مئوية. تمييع هذه 100x في برنامج تلفزيوني 1x للحصول على حل العمل. - باستخدام ماصة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا اليرقة وراءه وإضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x بالمضادات الحيوية.
ملاحظة: تستخدم المضادات الحيوية لمنع نمو البكتيريا في لوحات GMM التي قد تتداخل مع عد مستعمرات أسبيرجيلوس. - تجانس اليرقات في منديل في 1800 ذبذبة / دقيقة (30 هرتز) لمدة 6 دقائق. تدور أسفل في 17،000 × ز لمدة 30 s.
- تسمية لوحات GMM (لوحة واحدة لكل يرقات متجانسة). باستخدام الموقد بونسن لخلق بيئة معقمة، ماصة تعليق متجانسة من أنبوب واحد إلى منتصف لوحة GMM، ثم تنتشر باستخدام موزع على شكل حرف L المتاح. تجنب نشر المتجانسة ضد الحافة.
- احتضان لوحات رأسا على عقب في 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام وعدد المستعمرات التي شكلت (CFU).
- لقياس عدد الجراثيم الحية خلال فترة العدوى، اختر اليرقات من صفيحة البئر ال 96 في 1-7 أيام بعد الحقن (نقطة في البوصة) ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي. قتل اليرقات وتجانسها للانتشار على لوحات GMM كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.5.
5. العلاج الدوائي لليرقات المحقونة
- بعد القسم 4 ، قسم اليرقات المحقونة المتبقية إلى طبقين عيار 3.5 ملم: واحد للعلاج من المخدرات وواحد للسيطرة. استخدم حوالي 24 يرقة مصابة لكل حالة.
ملاحظة: يمكن علاج الأطباق مقاس 3.5 مم بالحليب الجاف غير الدهني بنسبة 2٪ في الماء، وشطفه، وتجفيفه بالهواء، وتخزينه في RT مسبقا. الطلاء بالحليب سيمنع اليرقات من الالتصاق بالبلاستيك. - إعداد محلول الدواء المطلوب والسيارة في E3 دون الميثيلين الأزرق في أنابيب مخروطية وفقا للتركيز النهائي المطلوب، ثم مزيج جيدا. على سبيل المثال ، لرصد بقاء اليرقات المعرضة للديكساميثازون ، استخدم 24 يرقة (تكرار) للديكساميثازون و 24 للتحكم في السيارة ، مثل DMSO. إعداد 5 مل من محلول الدواء بتركيز المطلوب. هنا ، تم استخدام 5 مل من 0.1٪ DMSO و 10 ميكرومتر ديكساميثازون ، وتم نقل 24 يرقة / حالة إلى ~ 200 ميكرولتر من محلول السيارة / الدواء / اليرقات.
- إزالة أكبر قدر ممكن من السائل من طبق واحد مع ماصة نقل وإضافة E3 مختلطة مسبقا تحتوي على التحكم في السيارة. كرر مع E3 مختلطة مسبقا تحتوي على علاج الفائدة للطبق الآخر.
- باستخدام ماصة ، نقل اليرقات إلى 96 لوحة بئر (يرقة واحدة لكل بئر). مراقبة بقاء اليرقات المحقونة المعرضة للسيارة أو الدواء لمدة 7 أيام.
ملاحظة: يمكن تطبيق الدواء فقط في يوم العدوى وبقائه على اليرقات للتجربة بأكملها أو يمكن تحديثه يوميا.
6. التصوير اليومي لليرقات المصابة باستخدام جهاز جرح ووقوع سمك الحمار الوحشي للنمو والتصوير (zWEDGI)
- تأكد من معالجة اليرقات ب 100 ميكرومتر N-phenylthiourea (PTU) عند 24 حصان لمنع التصبغ وأن يتم الاحتفاظ بوحدة الإرسال الكبرى على اليرقات للتجربة بأكملها.
ملاحظة: تمنع وحدة الإرسال والوحدة في 75-100 ميكرومتر تصبغ اليرقات دون أي عيوب تنموية إجمالية24. ومع ذلك ، يمكن أن تتداخل وحدة الإرسال والتسلية مع بعض العمليات البيولوجية25، ويجب على الباحثين تحديد ما إذا كان الدواء قد يؤثر على أي عمليات قيد التحقيق. - تصيب اليرقات المعدلة وراثيا بمجموعات الخلايا المسماة ذات الأهمية عند 2 ديسبف مع جراثيم أسبيرغيلوس المهندسة للتعبير عن بروتين فلوري ، كما هو موضح في القسم 3. ثم، نقل اليرقات المصابة إلى آبار من لوحة بئر 48 في حوالي 500 ميكرولتر / بئر من E3 دون الأزرق الميثيلين.
ملاحظة: يتم استخدام لوحة بئر 48 هنا ، لأنه من الأسهل نقل اليرقات من وإلى أثناء التصوير اليومي المتكرر. - في يوم التصوير، قم بإعداد طبقين من بيتري مقاس 3.5 مم: أحدهما مع وحدة حرارية بريطانية 100 ميكرومتر وواحد مع E3-tricaine.
- إضافة E3-tricaine في غرف جهاز zWEDGI26،27. تحت المجهر ستيريو، وإزالة فقاعات الهواء من الغرف والقناة تقييد باستخدام ميكروباينيت P100. إزالة جميع فائض E3-tricaine، بحيث يكون فقط في الغرف.
- ماصة تصل يرقة واحدة من لوحة باستخدام ماصة نقل. إذا تم استخدام الكثير من السائل لإزالته، ماصة في طبق 3.5 ملم تحتوي على E3-PTU. ثم، ماصة مرة أخرى، وذلك باستخدام أقل قدر ممكن من السائل، ونقلها إلى E3-tricaine.
- انتظر ~ 30 ق لالتخدير، ثم نقل إلى غرفة التحميل من الجهاز الجرح والفخ (على سبيل المثال، zWEDGI).
- تحت المجهر ستيريو، وضع اليرقة. استخدم P100 micropipette لإزالة E3-tricaine من غرفة الجرح وإطلاقها في غرفة التحميل لنقل ذيل اليرقة إلى قناة التقييد. تأكد من وضع اليرقة على جانبها الجانبي أو الظهري أو الجانبي الظهري ، بحيث يمكن تصوير اليرقة الخلفية بعدسة موضوعية مقلوبة.
- صورة يرقة مع المجهر confocal.
- بعد التصوير ، مع ماصة P100 ، أطلق E3-tricaine في غرفة الجرح لدفع اليرقة من القناة المقيدة إلى غرفة التحميل.
- باستخدام ماصة نقل ، التقط اليرقة ونقلها مرة أخرى إلى طبق بيتري مع E3-Tricaine. باستخدام أقل قدر ممكن من السائل، ونقله إلى طبق بيتري مع E3-PTU. شطف في وحدة الإرسال الكبرى ونقل مرة أخرى إلى لوحة بئر 48.
Representative Results
بعد الاقتصاص الدقيق لجراثيم Aspergillus في الدماغ الخلفي ليرقات حمار وحشي ، يمكن متابعة نتائج العدوى من خلال فحوصات متعددة ، بما في ذلك البقاء على قيد الحياة ، و CFUs ، والتصوير الحي. في فحص البقاء على قيد الحياة ، تم رصد عدد اليرقات المصابة التي تعيش على قيد الحياة 1-7 نقطة في البوصة. عندما تركت يرقات النوع البري دون علاج ، لوحظت وفيات قليلة جدا ، مع بقاء ~ 80٪ -100٪ من اليرقات على قيد الحياة طوال التجربة (الشكل 1). إذا كانت اليرقات مثبطة للمناعة ، مثل التعرض لعقار الكورتيكوستيرويد ديكساميثازون (10 ميكرومتر) ، لوحظ انخفاض كبير في البقاء على قيد الحياة(الشكل 1).
عندما تم قياس CFUs طوال التجربة التي استمرت 7 أيام من يرقات النمط البري المصابة بجراثيم A. fumigatus ، لوحظ استمرار الجراثيم ، مع إزالة بطيئة بمرور الوقت(الشكل 2A). تم تطبيع عدد الجراثيم الباقية على قيد الحياة في 1 و 2 و 3 و 5 و 7 نقطة في البوصة إلى عدد الجراثيم التي تم حقنها في 0 نقطة في البوصة لمقارنة المثابرة والتخليص عبر التكرارات(الشكل 2B).
خطوط الأسماك المعدلة وراثيا التعبير عن البروتينات الفلورية في الكريات البيض جنبا إلى جنب مع الفلورسنت البروتين التعبير عن جراثيم Aspergillus يمكن استخدامها لتصور كل من تجنيد الكريات البيض والسلوك، فضلا عن الإنبات الفطري والنمو13. عندما وصفت الضامة (على سبيل المثال، Tg(mpeg1:H2B-GFP))،لوحظ تكتل الضامة في ~ 50٪ من اليرقات عادة، بدءا من 2-3 نقطة في البوصة(الشكل 3A). العدلات (TG(lyz:BFP)) تأخر عادة التوظيف, يحدث في المقام الأول بعد حدوث الإنبات الفطرية(الشكل 3A). في حين استمر العبء الفطري للتجربة بأكملها في غالبية اليرقات (الشكل 3A) ، لوحظ إزالة(الشكل 3B). في بعض اليرقات ، لوحظ أيضا عبء فطري خارج الدماغ الخلفي في وقت لاحق في العدوى ، بسبب نشر الفطريات ، على الأرجح في الضامة.
المنطقة المحيطة الحويذة otic هو أحد المواقع الممكنة حيث يمكن العثور على هذا النشر(الشكل 3C). تم قياس هذه الملاحظات كميا في يرقات فردية متعددة على مدار التجربة بأكملها(الشكل 4). عادة ، شوهد الإنبات في ~ 60 ٪ من اليرقات بنسبة 5 نقطة في البوصة(الشكل 4A). منطقة الكتلة الخلايا الفرجية، تجنيد الضامة، وتجنيد العدلات تختلف على حد سواء مع مرور الوقت وعبر اليرقات، مع بعض تتجه حتى طوال التجربة وبعض حل مع مرور الوقت (الشكل 4B، C، D).
الشكل 1: تحليل البقاء التمثيلي لليرقات المصابة. تعرضت اليرقات المصابة ب Aspergillusلمراقبة المركبات (DMSO) أو ديكساميثازون (ديكس) ، وتم رصد البقاء على قيد الحياة. تمثل البيانات ثلاث نسخ متماثلة مجمعة. متوسط حقن CFUs: DMSO = 30، ديكس = 29 (تم حساب قيمة p ونسبة الخطر من قبل تحليل كوكس الانحدار الخطر النسبي، **** ف < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تعداد CFU التمثيلي من اليرقات المصابة الفردية مباشرة بعد الحقن (0 نقطة في البوصة) وأثناء دورة العدوى (2 و 3 و 5 و 7 نقطة في البوصة). تم تجانس ثماني يرقات مصابة ومطلية لحساب CFU لكل نقطة زمنية وتكرارها. (أ) مثال على البيانات من نسخة متماثلة واحدة. كل نقطة تمثل يرقة واحدة ، تمثل القضبان وسائل لكل نقطة زمنية. (ب)تم تطبيع تعدادات CFU لحساب CFU عند 0 نقطة في البوصة لكل نسخة متماثلة، وتم تجميع ثلاث نسخ متماثلة. وقورنت البيانات بين الشروط التجريبية باستخدام تحليل التباين وتلخص من حيث الوسائل الهامشية المقدرة والأخطاء المعيارية. تمثل أستريكس أهمية إحصائية مقارنة ب CFU عند 0 نقطة في البوصة (*p < 0.05، **p < 0.01، ****p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية من تجارب العدوى. تم حقن اليرقات المعالجة ب PTU مع الضامة الفلورية (mpeg1:H2B-GFP) والنيوتروفيليا (lyz:BFP) مع الترددات اللاسلكية التي تعبر عن A. fumigatus. تم تصوير اليرقات الحية المصابة بشكل متكرر في 2 و 3 و 5 نقطة في البوصة على مجهر كونفوجكال. يتم عرض أقصى كثافة Z صور الإسقاط. تشير مخططات اليرقات إلى موقع التصوير لكل لوحة. تمثل جميع أشرطة المقياس 100 ميكرومتر ، باستثناء أشرطة مقياس inset ، والتي تبلغ 25 ميكرومترا (A)الصور المعروضة هي من يرقة واحدة تؤخذ عند 2 و 3 و 5 نقطة في البوصة ، مما يمثل تطور العدوى النموذجي. تظهر الإنبات الفطري في اليومين 3 و 5. (ب) صورة تمثيلية لمجموعة فرعية من اليرقات التي يمكن أن تزيل العدوى ، مع انخفاض العبء الفطري وليس الكثير من الالتهاب عند 5 نقطة في البوصة. (ج) صورة تمثيلية لمجموعة فرعية من اليرقات التي تنشر العدوى من الدماغ الخلفي في وقت لاحق. في هذه الصورة ، يمكن العثور على الفطريات وال الضامة والعدلات حول وأسفل الحويكل الصوتي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحديد الكمي التمثيلي لتجارب التصوير. تم تحليل الصور من الإعداد التجريبي في الشكل 3 للإنبات الفطري وتجنيد الكريات البيض. (أ)تم تسجيل اليرقات لوجود جراثيم منبتة في كل يوم ، وتم حساب النسبة المئوية لليرقات مع الإنبات. (B, C, D) يتم تمثيل كل يرقة فردية كخط ألوان مختلف. تمت متابعة مظهر الكتلة الفرجية وحجمها (B) وتجنيد الضامة (C) وتجنيد العدلات (D) على مدار تجربة 5 أيام لكل يرقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
نموذج العدوى الموصوف هنا مفيد لتحليل الاستجابات المناعية المضيفة ، والتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض ، ومسببات الأمراض الفطرية12،13،14،15. يمكن استخلاص هذه المعلومات من التصوير عالي الدقة لمسببات الأمراض ذات العلامات الفلورية والخلايا المضيفة13، وبقاء اليرقات ، واستمرار CFU بمرور الوقت.
تقنية التجميل الدقيق أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول، وقد تحتاج إلى تعديل عند استخدام معدات وأجهزة مختلفة للتحريج الدقيق. على وجه الخصوص، والضغط والوقت من الحقن هما المتغيرات الرئيسية ويمكن تعديلها لضمان أن حجم قذف بواسطة الإبرة هو ~ 3 nL. حجم الإبرة كما يحددها قص مع ملقط ينظم أيضا عدد الجراثيم التي يتم حقنها. على الرغم من أن فتحة أكبر يمكن أن تسبب تلف الأنسجة لليرقة. من ناحية أخرى، فإن صغيرة جدا من فتحة لا تسمح الجراثيم كبيرة نسبيا (>2 ميكرومتر) من ويمكن أن يؤدي إلى انسداد إبرة. إذا حدث هذا، يمكن أن تكون إبرة reclipped أن يكون لها فتحة أكبر قليلا.
بروتوكولات أخرى للميكروجينجيكون البكتيريا الاستفادة PVP-40 للمساعدة في الحفاظ على خليط حقن متجانسة، ولكن لم نجد أي ميزة في استخدام هذا الناقل مع جراثيم أسبيرغيلوس. انسداد الإبرة يمكن التخفيف من دوامة إعداد الفطرية تماما لكسر أي كتل قبل تحميل الإبرة. في بعض الأحيان ، يمكن أيضا خلع تسد في الإبرة عن طريق زيادة الضغط أو وقت الحقن مؤقتا وحفز الحقن الدقيق أثناء وجود الإبرة في السائل المحيط باليرقات. ثم ينبغي أن ينخفض الضغط وحقن مرة أخرى إلى المستويات السابقة. في حالات أخرى، لا يمكن إزالة تسد، وإبرة جديدة تحتاج إلى تحميل وإعادة معايرة.
تم تصميم هذا البروتوكول لحقن ~ 30-70 جراثيم لكل يرقة. ومن المعروف أنه استنادا إلى تركيز إعداد بوغ وحجم حقن، وهذا العدد منخفض جدا. ومع ذلك ، فقد وجد تجريبيا أن هذا هو عدد الجراثيم التي تم حقنها في ظل هذه الظروف. لماذا يحدث هذا الاختلاف غير معروف، ولكن قد يكون بسبب تكتل بوغ في الإبرة. محاولاتنا الخاصة لحقن أعداد أكبر من الجراثيم كانت فاشلة إلى حد كبير.
لضمان حقن حوالي 30-70 جراثيم والحفاظ على اتساق الحقن في جميع اليرقات ، تحقق من عدد الجراثيم عن طريق الحقن على E3 المحيطة باليرقات. كرر هذا كل خمس إلى ست يرقات في جميع الحقن. إذا كان عدد بوغ يبدو أن التغيير، يمكن تعديل الضغط و / أو حقن الوقت لحقن عدد ثابت من الجراثيم عبر يرقات متعددة. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر من أن جرعة الحقن لا تزال في المقام الأول في الدماغ الخلفي ولا تملأ الدماغ المتوسط والماء.
لضمان العدوى الموضعية، يجب احتواء تعليق البوغ داخل البطين الخلفي. ويمكن تصور هذا من قبل تلطيخ الأحمر الفينول فقط بعد الحقن، على الرغم من أن اللون الأحمر ينتشر مع مرور الوقت. بالنسبة للحقن، يتم استخدام المنطقة المحيطة بالحويصلة الصوتية لاختراق البطين والوصول إليه بزاوية 45 درجة إلى 65 درجة. هذه المنطقة ليس لديها الأوعية الدموية الرئيسية، ويسبب أقل تلف الأنسجة، ويشفي على الفور. إذا تم ثقب الجلد فوق البطين، يمكن تسريب تعليق بوغ، لأن الإبرة التي يجب أن تستخدم لحقن بوغ أسبيرغيلوس أكبر من ذلك يستخدم للتعليق البكتيري. يمكن وضع علامة على اليرقات التي تم حقنها أو تلفها عن طريق الخطأ عن طريق الحقن في الصفار عدة مرات لإنشاء علامة حمراء أو عن طريق سحب اليرقة من الصف باستخدام الإبرة. بعد اكتمال مجموعة من الحقن ، يجب إزالة هذه اليرقات والتخلص منها قبل غسل الباقي من الطبق. يستخدم E3 بدون أزرق الميثيلين لتخدير اليرقات قبل الحقن وأيضا الحفاظ على اليرقات بعد الحقن ، لأن أزرق الميثيلين مضاد للفطريات.
في وقت الحقن ، تمثل أعداد CFU عدد الجراثيم القابلة للحياة داخل المضيف المصاب. ومع ذلك ، إذا انبتت الجراثيم إلى هيفاي ، يمكن تقسيمها إلى "وحدات فطرية" منفصلة قابلة للحياة أثناء التجانس ويمكن أن تؤدي إلى مستعمرات متعددة. أو، يمكن أن يؤدي الغشاء البهيج المتعدد الخلايا غير المنقطع إلى ظهور مستعمرة واحدة، مما يؤدي إلى تمثيل متوسط، ولكن غير دقيق، للعبء الفطري. ويمكن التخفيف من ذلك من خلال الجمع بين تعداد CFU مع المجهر الطولي لليرقات الفردية ، والذي يوفر بيانات بصرية عن مصير الجراثيم المحقونة.
بالمقارنة مع نظام الثدييات ، فإن نموذج عدوى يرقات الحمار الوحشي مهم بشكل خاص بسبب إمكانية الوصول البصري إليه. يمكن تصور تجنيد واستجابة الخلايا المناعية الفطرية داخل مضيف حي سليم. ويمكن دمج ذلك مع تثبيط الوراثية أو الكيميائية من الأهداف الجزيئية لتحليل كيف يؤثر كل هدف على الماكروفيج أو رد فعل العدلات ضد جراثيم أسبيرغيلوس في حي.
في حين أن نموذج عدوى يرقات الحمار الوحشي Aspergillus لا يزال مفيدا في وصف جوانب مختلفة من IA12و13و14و15و16و17و18و19و20و22، فهناك مجالات أخرى للتوسع. من الجانب المضيف ، يتم استخدامه لوصف الاستجابات المناعية على المستوى الخلوي ، ولكن يمكن توسيع هذا لتحليل آليات المناعة على المستوى الجزيئي من خلال الجمع بينه وبين مورفولينو المستهدف ، CRISPR ، خطوط متحولة مستقرة ، أو التعرض الكيميائي. تحذير واحد هو أن المتجانسات لجميع مكونات المسار المناعي الفطرية الثدييات المعروفة لم يتم تحديدها في حمار وحشي.
من جانب مسببات الأمراض ، تم وصف ضراوة الأنواع والسلالات المختلفة. وهناك سبيل واعد للبحوث في المستقبل هو استخدام سلالات أسبيرغيلوس المتحولة لاختبار كيفية مساهمة جينات أو بروتينات محددة كعوامل فحولة. وبالتالي ، يمكن تطوير أدوية جديدة مضادة للفطريات لاستهداف هذه البروتينات. الأدوية المضادة للفطريات الحالية لها فعالية منخفضة في المرضى البشر وهناك مقاومة متزايدة لهذه الأدوية في الفطريات28. يمكن استخدام هذا النموذج في الجسم الحي للتحقيق في سبب فشل هذه الأدوية وكنموذج وسيط لاختبار فعالية الأدوية المضادة للفطريات الجديدة. وعموما، يمكن للنتائج المكتشفة باستخدام هذا النموذج تسهيل التطوير المستقبلي للعلاجات الفعالة للمرضى المصابين ب Aspergillus.
Disclosures
لا تضارب أو مصالح مالية للكشف عنها.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم K22AI134677. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
References
- Latge, J. P.
- Denning, D. W.
- Dagenais, T. R., Keller, N. P. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).
- Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections. Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).
- Behnsen, J., et al. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Rosowski, E. E., et al. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 4 (4), (2018).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).
- Knox, B. P., et al. Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae. Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).
- Rosowski, E. E., et al. Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing. PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).
- Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination. Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).
- Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment. PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).
- Herbst, S., et al. Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).
- Shah, A., et al. Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).
- Jain, S., et al. Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).
- Jones, C. N., et al. Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).
- Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).
- Herbst, S., et al. A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis. Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).
- Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae. Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Huemer, K., et al. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. Update on Antifungal Drug Resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).
