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Immunology and Infection

मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए एस्परगिलस बीजाणुओं के साथ जेब्राफिश लार्वा का संक्रमण

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/61165
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Clemson University

Summary

यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश लार्वा में एस्परगिलस संक्रमण मॉडल का वर्णन करता है। एस्परगिलस बीजाणु लार्वा के हिंडब्रेन में माइक्रोइंजेक्टेड होते हैं, और इम्यूनोसप्रेसेशन को प्रेरित करने के लिए रासायनिक उपचार का उपयोग किया जाता है। संक्रमण प्रगति की निगरानी एक दैनिक इमेजिंग सेटअप के माध्यम से की जाती है ताकि फंगल विकास और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ-साथ कॉलोनी बनाने इकाई चढ़ाना द्वारा लाइव बीजाणुओं की गणना की निगरानी की जा सके।

Abstract

इनवेसिव एस्परगिलोसिस (आईए) इम्यूनोसमझौता व्यक्तियों के बीच सबसे आम फंगल संक्रमणों में से एक है। एंटीफंगल दवाओं की उपलब्धता के बावजूद, आईए संक्रमित इम्यूनोसमझौता रोगियों में >५०% मृत्यु का कारण बन सकता है । यह दोनों मेजबान और रोगजनक कारकों है कि संक्रमण संवेदनशीलता और संक्रमित रोगियों में कम जीवित रहने की दर में योगदान के लिए उपंयास चिकित्सा विकसित करने के लिए निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं एस्परगिलस बीजाणुओं की मान्यता और निकासी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, हालांकि सटीक सेलुलर और आणविक तंत्र के बारे में बहुत कम जानकारी है। मेजबान और रोगजनक के बीच विस्तृत मशीनी बातचीत की जांच करने के लिए विश्वसनीय मॉडल की आवश्यकता होती है। जेब्राफिश लार्वा की ऑप्टिकल स्पष्टता और आनुवंशिक अनुरेखा उन्हें एक जीवित और बरकरार मेजबान में कई मानव जीवाणु और फंगल संक्रमणों के मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक पेचीदा मॉडल बनाती है। यह प्रोटोकॉल एक लार्वा जेब्राफिश एस्परगिलस संक्रमण मॉडल का वर्णन करता है। सबसे पहले, एस्परगिलस बीजाणुओं को अलग-थलग कर दिया जाता है और माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से जेब्राफिश हिंडब्रेन वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया जाता है। फिर, इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं जैसे रासायनिक अवरोधकों को सीधे लार्वा पानी में जोड़ा जाता है। इंजेक्शन लार्वा में संक्रमण की निगरानी के लिए दो तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसमें कॉलोनी बनाने इकाई (सीएलयू) गणना के लिए लार्वा का 1) समरूपीकरण और 2) एक दोहराया, दैनिक लाइव इमेजिंग सेटअप शामिल है। कुल मिलाकर, इन तकनीकों का उपयोग वीवो में एस्परगिलस संक्रमण की प्रगति का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है और मेजबान-रोगजनक बातचीत से पूछताछ करने के लिए विभिन्न मेजबान पृष्ठभूमि और एस्परगिलस उपभेदों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

एस्परगिलस फ्यूमिगटस एक सर्वव्यापी सैप्रोफाइटिक कवक है, और इसके हवाई बीजाणु घर के अंदर और बाहरदोनों 1पाए जा सकते हैं। ये बीजाणु हर किसी के साँस लेते हैं लेकिन इम्यूनोसंटिव व्यक्तियों के फेफड़ों से प्रभावी रूप से साफ हो जाते हैं1,2. हालांकि, सिस्टिक फाइब्रोसिस जैसे परिवर्तित फेफड़ों की स्थिति वाले लोग फेफड़ों में फंगल अंकुरण के कारण ब्रोन्कोपल्मोनरी एस्परगिलोसिस विकसित कर सकते हैं3। इस संक्रमण का सबसे गंभीर रूप, आक्रामक एस्परगिलोसिस (आईए), इम्यूनोसमझौता व्यक्तियों को प्रभावित करता है और इसमें कवक का अन्य अंगों में विकास शामिल है2,3। आईए एंटी-फंगल उपचार 4 की उपलब्धता के बावजूद संक्रमित रोगियों की>५०%मौत की ओर जाता है । इम्यूनोसंटिव व्यक्तियों में, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं साँस वाले बीजाणुओं को साफ करने में एक प्रमुख भूमिका निभाती हैं1। हालांकि, विशिष्ट तंत्र है कि इस सहज प्रतिरक्षा निकासी में योगदान अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । आईए के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों को खोजने के लिए एस्परगिलस की मंजूरी में प्रमुख जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं (यानी, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल) के सेलुलर और आणविक तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है।

जबकि स्तनधारी मॉडल फंगल उग्रता कारकों की पहचान करने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं5,6की मेजबानी करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, दृश्य पहुंच सेलुलर स्तर पर मेजबान रोगजनक बातचीत के लिए सीमित है। ऊतक संस्कृति प्रयोग जटिल बहु-सेलुलर वातावरण और पूरे जानवरों में मौजूद बातचीत को पूरीतरहसे पुनः रीजिट नहीं कर सकते हैं। इसलिए, ज़ेब्राफ़िश ने इस अंतर को भरने के लिए एक वैकल्पिक मॉडल जीव के रूप में लोकप्रियता प्राप्त की है और एक बहु-दिवसीय संक्रमण8,9में एक जीवित, अक्षुण्ण मेजबान में मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन के अध्ययन को सुविधाजनक बना दिया है। जेब्राफिश जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली 24 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ)10के रूप में विकसित होती है, और अनुकूली प्रणाली को11विकसित करने में 4-6 सप्ताह लगते हैं, जो समय की एक खिड़की प्रदान करते हैं जिसमें सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को अलगाव में मूल्यांकन किया जा सकता है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं मनुष्यों और जेब्राफिश11के बीच अच्छी तरह से संरक्षित हैं। ज़ेब्राफ़िश में कई गुण होते हैं जो इन प्रतिक्रियाओं की जांच को सुविधाजनक बनाते हैं, जिनमें ऑप्टिकल स्पष्टता (जो अक्षुण्ण मेजबानों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव इमेजिंग के लिए अनुमति देता है) और आनुवंशिक अनुरेखण (जो आणविक मशीनवादी अध्ययनों की सुविधा प्रदान करता है)।

यहां वर्णित लार्वा जेब्राफिश एस्परगिलस संक्रमण मॉडल मूल रूप से नॉक्स एट अलद्वाराविकसित किया गया था। हाल ही में हमारे समूह और अन्य लोगों द्वारा12 , 13, मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन13,14, 15,इम्यूनोसप्रेसेशन के तंत्र 13,16,17,फंगल उग्रता18और एंटी-फंगल ड्रग प्रभावकारिता19,20की जांच करने के लिए इसका विस्तार किया गया है । यह मॉडल मानव एस्परगिलोसिस के कई पहलुओं को पुनः रीकैपिटल करता है। जबकि इम्यूनोसंपेस्टेंट लार्वा प्रतिरोधी होते हैं, इम्यूनोसमझौता लार्वासंक्रमण 12, 13,16,17का शिकार हो सकता है।

इस मॉडल में, लार्वा के हिंडब्रेन वेंट्रिकल में बीजाणुओं को इंजेक्ट करके एक स्थानीय संक्रमण स्थापित किया जाता है, जो फागोसाइट्स के साथ कम आबादी वाला क्षेत्र है, और फागोसिटर भर्ती और व्यवहार का मूल्यांकन12,13किया जा सकता है। ऐसा माना जाता है कि मैक्रोफेज मनुष्यों में एस्परगिलस बीजाणुओं के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करते हैं1 और स्तनधारी मॉडल6,21। इसी तरह, जेब्राफिश मॉडल में, मैक्रोफेज को इंजेक्शन एस्परगिलस बीजाणुओं में भर्ती किया जाता है, जबकि डेंगूफिल को हाइफाल विकास12, 13, 22के जवाब में माध्यमिक रूप से भर्ती कियाजाताहै। इस मॉडल से, यह भी सीखा गया है कि एस्परगिलस संक्रमण के 7 दिनों से अधिक समय के बाद वाइल्डटाइप इम्यूनोसप्यूटेंट लार्वा में बने रह सकते हैं। इसके अलावा, संक्रमण के पूरे पाठ्यक्रम को दैनिक कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा एक ही जीवित जानवरों में पालन किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल निषेचन (2 डीपीएफ) लार्वा के 2 दिनों के हिंडब्रेन वेंट्रिकल में बीजाणुओं को इंजेक्ट करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन की तकनीक का वर्णन करता है। इसके बाद संक्रमण की निगरानी 7 दिनों तक की जाती है, क्योंकि जेब्राफिश लार्वा बिना खिलाए 10 डीपीएफ तक रह सकता है। इम्यूनोसप्रेसेशन को दवा उपचार द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, और लार्वा के लिए दवाओं के आवेदन का भी वर्णन किया गया है। अंत में, संक्रमण प्रगति का पालन करने के लिए दो तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसमें व्यक्तिगत लार्वा से सीएफयू का मात्राकरण और दैनिक लाइव इमेजिंग सेटअप शामिल है।

Protocol

शोधकर्ताओं को उपयुक्त पशु देखभाल और उपयोग समितियों से सभी पशु प्रयोगों के लिए अनुमोदन प्राप्त करना चाहिए । इस लेख में दिखाए गए प्रतिनिधि डेटा क्लेमसन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (AUP2018-070, AUP2019-012) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत किए गए प्रयोगों से हैं ।

1. इंजेक्शन के लिए एस्परगिलस बीजाणुओं की तैयारी

  1. एस्परगिलस पोर निलंबन से, 1 x 106 बीजाणुओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें। मात्रा 20-100 माइक्रोल होनी चाहिए; यदि नहीं, तो 0.01% (v/v) बाँझ ट्वीन-20 (ट्वीन-वॉटर) में 10x कमजोर पड़ने का उत्पादन करें; सामग्री की तालिका)। उदाहरण के लिए, यदि गणना की गई मात्रा 5 माइक्रोन है, तो 10x कमजोर पड़ने का उत्पादन करें और पतला समाधान के 50 माइक्रोन का उपयोग करें।
    नोट: संदूषण के मामले में अधिक बीजाणुओं को इकट्ठा करने या स्पेयर के रूप में दो प्लेटें/तनाव तैयार किया जा सकता है ।
  2. एक ग्लूकोज न्यूनतम मीडिया (जीएमएम) प्लेट(सामग्रीकी तालिका) पर 1 x10 6एस्परगिलस बीजाणुओं को बायोसेफेटी कैबिनेट में बाँझ डिस्पोजेबल एल-आकार के स्प्रेडर के साथ फैलाएं। थाली के मार्जिन में फैलने से बचें। 3-4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, प्लेट के साथ उल्टा सामना करना पड़ रहा है।
  3. संग्रह के दिन, बाँझ मिराक्लोथ और 50 एमएल शंकु नलियों (दो प्रति तनाव), बाँझ ट्वीन-पानी (एक प्रति तनाव) की ताजा बोतलें, और बाँझ डिस्पोजेबल एल के आकार के स्प्रेडर जैवसेफ्टी कैबिनेट में लाएं।
    नोट: मिराक्लोथ को टुकड़ों में x 6 में ~ 8 में काटा जा सकता है, पन्नी में लपेटा जा सकता है, और निष्फल करने के लिए ऑटोक्लेव किया जा सकता है।
  4. प्रत्येक लेबल 50 एमएल शंकु नली और फिर से टोपी में मीराक्लोथ का एक टुकड़ा रखें। शेष मिराक्लोथ पैकेट को हुड से बाहर निकालें।
  5. बायोसेफ्टी कैबिनेट में प्लेटें लाएं। एक प्लेट खोलें, फिर प्लेट के लगभग तीन-चौथाई को कवर करने के लिए शीर्ष पर ट्वीन-पानी डालें।
  6. एक डिस्पोजेबल एल के आकार का स्प्रेडर का उपयोग करके, प्लेट को घुमाने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करते हुए, फंगल संस्कृति की सतह को धीरे-पीछे की गति में परिमार्जन करें। जब तक लगभग सभी बीजाणुओं को ट्वीन-पानी में समरूप नहीं किया जाता है तब तक परिमार्जन करें।
    नोट: उच्च हाइड्रोफोबसिटी के कारण, जब ट्वीन पानी जोड़ा जाता है या स्क्रैपिंग के दौरान बीजाणु "पफ" बना सकते हैं। आसपास की ट्यूबों या प्लेटों के प्रदूषण से बचने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए। विभिन्न उपभेदों के निष्कर्षण के बीच 70% इथेनॉल के साथ दस्ताने बदलने और सतह को मिटाने की सलाह दी जाती है।
  7. एक 50 एमएल शंकु नली लें और मिराक्लोथ के टुकड़े को हटा दें। इसे आधे हिस्से में मोड़कर 50 एमएल शंकु नली के शीर्ष में डाले गए फिल्टर में बना लें।
  8. ट्यूब में मीराक्लोथ के ऊपर प्लेट से फंगल समरूप डालो।
    नोट: यदि एक तनाव की दो प्लेटें तैयार की जाती हैं, तो दोनों प्लेटों को कुरेदें और उन्हें एक ही शंकु नली में डालें।
  9. 50 एमएल करने के लिए शंकु ट्यूब में कुल मात्रा लाने के लिए ट्वीन-पानी डालो।
  10. 10 मिनट के लिए 900 x ग्राम पर स्पिन करें। अपकेंद्रित्र में एयरोसोलाइजेशन-रोकथाम टोपियां का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  11. दूषित करने के लिए ~ 10% ब्लीच समाधान में सुपरनिटेंट बंद डालो। शंख ट्यूब में बाँझ 1x PBS के 50 एमएल डालो, तो भंवर या गोली resuspend करने के लिए हिला।
  12. 10 मिनट के लिए 900 x ग्राम पर फिर से स्पिन करें। सुपरनैंट को बंद करें और बाँझ 1x पीबीएस के 5 एमएल में गोली को फिर से रखें। एक ताजा 50 एमएल शंकु नली में मीराक्लोथ के एक ताजा टुकड़े के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  13. 1.7 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब्स (उदाहरण के लिए, 10x समाधान के लिए, 100 माइक्रोन-μgenate के साथ फंगल समरूप के 10 गुना सीरियल डिमोशन (10x, 100x, 100x) बनाएं।
  14. पहला कमजोर पड़ने का चयन करें जिसमें बीजाणु तब दिखाई नहीं देते जब इसे ट्वीन-पानी में छोड़ दिया जाता है और इस कमजोर पड़ने का उपयोग हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके बीजाणुओं की संख्या गिनने के लिए करते हैं।
  15. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके तैयार फंगल समरूप (जल निलंबन) में बीजाणु एकाग्रता की गणना करें:

    एकाग्रता (बीजाणु/एमएल) = मध्य 25 बक्से एक्स कमजोर पड़ने कारक x 104 में बीजाणुओं की संख्या
  16. 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में बाँझ 1x पीबीएस में 1.5 x 108 बीजाणु/एमएल का 1 एमएल स्टॉक तैयार करें। इस बीजाणु तैयारी ~ 4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  17. इंजेक्शन में उपयोग करने से पहले, 1.7 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में 1%बाँझ फिनोल लाल के 10 माइक्रोन के साथ बीजाणु तैयारी के 20 माइक्रोन को मिलाएं ताकि 1 x 108 बीजाणुओं/एमएल की अंतिम बीजाणु एकाग्रता प्राप्त की जा सके। इंजेक्शन से पहले भंवर अच्छी तरह से।
    नोट: 1% फिनॉल लाल समाधान को फ़िल्टर-स्टरलाइज्ड किया जाना चाहिए और अलीकोट में संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  18. एक नकली इंजेक्शन के लिए, 1x पीबीएस के 20 माइक्रोन को 1% बाँझ फिनॉल लाल के 10 माइक्रोल के साथ मिलाएं।

2. इंजेक्शन के लिए आगर प्लेटों की तैयारी

  1. E3 माध्यम में 2% agarose तैयार करें और माइक्रोवेव में पिघलें।
  2. एक 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश (~ 25 एमएल प्रति प्लेट) में डालें, प्लेट को समान रूप से कवर करने के लिए भंवर करें, और ठंडा होने दें।
  3. प्लेट को पैराफिन फिल्म से लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर उलटा स्टोर करें।
  4. इंजेक्शन से पहले, प्लेट को कमरे के तापमान (आरटी) में लाएं।
  5. प्लेट पर 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को बंद कर दिया गया फ़िल्टर का ~ 1 एमएल डालें, प्लेट को फैलने और पूरे नीचे कवर करने के लिए झुकाएं, और ई 3 के साथ कुल्ला करें।
    नोट: 2% बीएसए समाधान को फिल्टर-स्टरलाइज्ड किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट्स के रूप में संग्रहीत किया जा सकता है। 2% बीएसए प्री-ट्रीटमेंट लार्वा को एगरेज की सतह से चिपकने से रोकता है।
  6. थाली पर बफर ट्राइकेन के साथ E3 डालो और यह इंजेक्शन तक बैठते हैं ।

3. जेब्राफिश लार्वा हिंडब्रेन वेंट्रिकल माइक्रोइंजेक्शन

  1. पेट्री डिश में 2 डीपीएफ पर संदंश के साथ मैन्युअल रूप से लार्वा को डिकोरोनेट करें।
    नोट: इंजेक्शन के समय तक 1.5 डीपीएफ से कभी भी डिकोरियोनेशन किया जा सकता है।
  2. पेट्री डिश से जितना संभव हो उतना E3 निकालें और लार्वा को एनेस्थेटाइज करने के लिए ई 3 में बफर 300 माइक्रोग्राम/एमएल ट्राइकेन जोड़ें।
    नोट: E3 में बफर 4 मिलीग्राम/एमएल ट्राइकेन का स्टॉक समाधान तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। ई3 के साथ 50 एमएल तक स्टॉक सॉल्यूशन के 4 एमएल को कमजोर करके वर्किंग सॉल्यूशन बनाया जा सकता है।
  3. प्रेशर इंजेक्टर, बैक प्रेशर यूनिट, फुटस्विच, माइक्रोपिपेट होल्डर, माइक्रोमैनिपेंटर और मैग्नेटिक स्टैंड और प्लेट के साथ आपूर्ति किए गए माइक्रोइंजेक्शन सेटअप का उपयोग करें, जो सभी संकुचित हवा(सामग्री की तालिका) केस्रोत से जुड़े हैं।
  4. कंप्रेस्ड एयर वाल्व खोलें और माइक्रोइंजेक्टर चालू करें। दबाव को ~ 25 पीएसआई, पल्स अवधि 60 एमएस और बैकप्रेशर यूनिट से 1 पीएसआई तक दबाव निर्धारित करें।
  5. माइक्रोलोडर पिपेट टिप(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके एक माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करें जिसमें लगभग 3-5 माइक्रोन तैयार पीबीएस या फेनोल लाल के साथ बीजाणु निलंबन होता है। माइक्रोमैनीपुलेटर पर सुई माउंट।
    नोट: माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को पहले23वर्णित के रूप में तैयार किया जा सकता है । माइक्रोइंजेक्शन के लिए इस्तेमाल होने वाले स्टीरियो माइक्रोस्कोप में माइक्रोइंजेक्शन सुई को कैलिब्रेट करने के लिए आंखों का टुकड़ा रेटिकल होना चाहिए। रेटल को एक चरण माइक्रोमीटर के साथ कैलिब्रेट किया जाना चाहिए, और रेटिकल स्केल (माइक्रोन) की लंबाई निर्धारित की जानी चाहिए। बीजाणु निलंबन ड्रॉप का व्यास जो सुई से बाहर निकलता है, उसे बूंद के साथ ओवरलैप करने वाले हैश (रेटिकल की) की संख्या के आधार पर मापा जाता है।
  6. माइक्रोमैनीपुलेटर को स्थिति दें ताकि सुई का अंत स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत सबसे कम आवर्धन को ध्यान में रखें। सुई को ध्यान में रखते हुए 4x आवर्धन के लिए ज़ूम करें।
  7. तेज संदंश का उपयोग करना, सुई के अंत क्लिप। बाहर आने वाली बूंद के आकार की कल्पना करने के लिए इंजेक्शन पेडल दबाएं। जब तक बीजाणु निलंबन के ~ 3 nL इंजेक्शन है वापस कतरन रखें (यहां, यह पांच हैश है) ।
  8. इंजेक्शन प्लेट पर लार्वा की व्यवस्था करते समय गलती से सुई से टकराने से बचने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर और सुई को रास्ते से बाहर ले जाएं।
  9. इंजेक्शन प्लेट से E3-Tricaine डालो, तो एक हस्तांतरण pipet का उपयोग कर के रूप में थोड़ा E3 संभव के साथ इंजेक्शन प्लेट के लिए ~ 24 एनेस्थेटाइज्ड लार्वा हस्तांतरण ।
  10. जेब्राफिश लार्वा (यानी, हेयर लूप टूल या बरौनी उपकरण) में हेरफेर करने के लिए एक छोटे से उपकरण का उपयोग करना, लार्वा को उस दिशा के अनुसार व्यवस्थित करें जिसमें वे सामना कर रहे हैं। विशेष रूप से, सभी को एक पंक्ति में दाईं ओर सामना करना पड़ रहा है, और सभी नीचे एक पंक्ति में बाईं ओर का सामना करना पड़ रहा है ।
    नोट: यह व्यवस्था मुश्किल है यदि प्लेट पर बहुत अधिक तरल है, क्योंकि लार्वा जगह से "तैरना" होगा। हालांकि, बहुत कम तरल भी समस्याग्रस्त है यदि इंजेक्शन लंबे समय तक लेते हैं, क्योंकि लार्वा सूख सकता है या संज्ञाहरण टूट सकता है। इस प्रकार, पूरी माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया में प्लेट पर तरल की मात्रा पर सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए।
  11. माइक्रोस्कोप ज़ूम को सबसे कम आवर्धन के लिए समायोजित करें। माइक्रोमैनीपुलेटर को वापस लाएं और व्यवस्था करें ताकि सुई लार्वा के करीब हो, दृश्य के क्षेत्र के बीच में ~ 30 डिग्री-60 डिग्री कोण पर।
  12. उच्चतम आवर्धन में ज़ूम इन करें और सुई की स्थिति को और अधिक समायोजित करने के लिए ठीक समायोजन घुंडी का उपयोग करें। सत्यापित करें कि लार्वा के बगल में प्लेट पर तरल में बीजाणु निलंबन इंजेक्शन द्वारा सुई से ~ 30-70 बीजाणु बाहर आ रहे हैं। यदि आवश्यक हो तो इंजेक्शन सेटअप पर समय और दबाव को समायोजित करें।
    नोट: यह परीक्षण हर पांच से छह लार्वा के बाद दोहराया जाना चाहिए, क्योंकि सुई से बाहर आने वाले बीजाणुओं की संख्या समय के साथ बढ़ सकती है या कम हो सकती है।
  13. उस पंक्ति से शुरू होता है जिसमें लार्वा सुई की ओर सामना कर रहे हैं, प्लेट को स्थानांतरित करें ताकि सुई सीधे ऊपर हो और पहले लार्वा के पास तैनात हो।
  14. माइक्रोमैनिपलेटर के साथ सुई को हिलाते हुए, हिब्राइन वेंट्रिकल में छेदने के लिए एटोटिक वेसिकल के चारों ओर ऊतक के माध्यम से सुई डालें। सुई के कोण के साथ लार्वा का सही अभिविन्यास प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में दूसरे हाथ से प्लेट को स्थानांतरित करें।
  15. नेत्रहीन सत्यापित करें कि सुई का अंत हिंडब्रेन वेंट्रिकल के केंद्र में है, बीजाणुओं को इंजेक्ट करने के लिए पैर के पेडल को दबाएं और धीरे-धीरे सुई को वापस लें।
    नोट: फिनोल लाल डाई मुख्य रूप से हिंडब्रेन वेंट्रिकल के भीतर रहना चाहिए। थोड़ी मात्रा में मिडब्रेन में जा सकते हैं, लेकिन यह पूर्वाभास या मस्तिष्क के बाहर नहीं पहुंचना चाहिए। यदि ऐसा होता है, तो इंजेक्शन की मात्रा बहुत बड़ी है, और दबाव और समय को तदनुसार कम किया जाना चाहिए, या एक नई सुई को कैलिब्रेट किया जाना चाहिए।
  16. प्लेट को नीचे ले जाते हुए, उस पंक्ति में सभी लार्वा इंजेक्ट करें। फिर, प्लेट को चारों ओर घुमाएं और दूसरी पंक्ति में सभी लार्वा इंजेक्ट करें।
    नोट: असफल इंजेक्शन या गलती से क्षतिग्रस्त लार्वा को 1 द्वारा चिह्नित किया जा सकता है) एक लाल निशान या 2 बनाने के लिए जर्दी में इंजेक्शन लगाना) लार्वा को सुई के साथ पंक्ति से बाहर खींचना।
  17. सुई को फिर से ऊपर और रास्ते से बाहर ले जाएं। माइक्रोस्कोप पर कम आवर्धन के लिए ज़ूम आउट करें। फिनॉल लाल रंग अभी भी प्रत्येक लार्वा के हिंडब्रेन में दिखाई देना चाहिए।
  18. सबसे पहले, असफल इंजेक्शन के साथ किसी भी लार्वा को निपटाने के लिए हेयर लूप टूल और पिपेट के साथ दूर खींचें। शेष लार्वा को ताजा बाँझ E3 और एक स्थानांतरण पिपेट के साथ प्लेट से धोकर एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  19. वांछित अंतिम प्रयोगात्मक नमूना संख्या के लिए आवश्यक के रूप में दोहराएं।
  20. ई 3 के साथ कम से कम 2x लार्वा कुल्लाएं और संज्ञाहरण से वसूली सुनिश्चित करते हैं।
  21. किसी भी आगे के उपचार के बिना अस्तित्व की मात्रा निर्धारित करने के लिए, स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, लार्वा को ई 3 में 96 अच्छी तरह से प्लेट (1 लार्वा प्रति अच्छी तरह) में स्थानांतरित करें।

4. इंजेक्शन और व्यवहार्य बीजाणु संख्या की स्थापना

  1. इंजेक्शन के तुरंत बाद, स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, बेतरतीब ढंग से इंजेक्शन वाले लार्वा में से आठ को चुनें और उन्हें 1.7 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब (प्रति ट्यूब एक लार्वा) में स्थानांतरित करें।
  2. ट्राइकेन के साथ या उन्हें 0.5-2.0 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखकर लार्वा को इच्छामृत्यु दें।
  3. बाँझ 1x पीबीएस में 1 मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलिन के 1 एमएल और 0.5 मिलीग्राम/एमएल कानमाइसिन एंटीबायोटिक समाधान तैयार करें। बचे हुए घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है और बाद में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: 100 मिलीग्राम/एमएल और कानमाइसिन 50 मिलीग्राम/एमएल पर एम्पिसिलिन के स्टॉक समाधान को प्रीमेड, फिल्टर-स्टरलाइज्ड किया जा सकता है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर अलीकोट में संग्रहीत किया जा सकता है। काम समाधान प्राप्त करने के लिए 1x पीबीएस में इन 100x को पतला करें।
  4. एक पिपेट का उपयोग करके, सेंट्रलाइज ट्यूब से जितना संभव हो उतना तरल निकालें, लार्वा को पीछे छोड़ दें और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 1x पीबीएस के 90 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग जीएमएम प्लेटों में बैक्टीरियल वृद्धि को रोकने के लिए किया जाता है जो एस्परगिलस उपनिवेशों की गिनती में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  5. 6 मिनट के लिए 1,800 दोलन/मिनट (30 हर्ट्ज) पर एक ऊतक lyser में लार्वा समरूप। 30 एस के लिए 17,000 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें।
  6. लेबल जीएमएम प्लेटें (एक प्लेट प्रति समरूप लार्वा)। एक बाँझ वातावरण बनाने के लिए एक Bunsen बर्नर का उपयोग करना, एक ट्यूब से होमोजेनाइज्ड निलंबन को जीएमएम प्लेट के बीच में पिपेट करें, फिर डिस्पोजेबल एल-आकार के स्प्रेडर का उपयोग करके फैल जाएं। रिम के खिलाफ समरूपता फैलाने से बचें।
  7. प्लेटों को 2-3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा करें और गठित कॉलोनियों (सीएलयू) की संख्या गिनें।
  8. संक्रमण अवधि के दौरान जीवित बीजाणुओं की संख्या को मापने के लिए, 1-7 दिनों के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) पर 96 अच्छी प्लेट से लार्वा चुनें और उन्हें अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 4.1-4.5 चरणों में वर्णित जीएमएम प्लेटों पर फैलने के लिए इच्छामृत्यु और समरूप लार्वा।

5. इंजेक्शन लार्वा की दवा उपचार

  1. धारा 4 के बाद, शेष इंजेक्शन लार्वा को दो 3.5 मिमी व्यंजनों में विभाजित करें: एक दवा उपचार के लिए और एक नियंत्रण के लिए। प्रति स्थिति लगभग 24 संक्रमित लार्वा का उपयोग करें।
    नोट: 3.5 मिमी व्यंजन पानी में 2% नॉनफैट सूखे दूध के साथ इलाज किया जा सकता है, कुल्ला, हवा में सूखा, और पहले से आरटी में संग्रहीत। दूध के साथ कोटिंग प्लास्टिक से चिपके लार्वा को रोक देगा।
  2. वांछित दवा समाधान और ई3 में वाहन को अंतिम एकाग्रता के अनुसार शंकु नलियों में मेथिलीन नीले रंग के बिना तैयार करें, फिर अच्छी तरह से मिलाएं। उदाहरण के लिए, डेक्सामेथासोन के संपर्क में आने वाले लार्वा के अस्तित्व की निगरानी करने के लिए, डेक्सामेथासोन के लिए 24 लार्वा (प्रतिकृति) और वाहन नियंत्रण के लिए 24 का उपयोग करें, जैसे कि डीएमएसओ। आवश्यक एकाग्रता पर दवा समाधान के 5 एमएल तैयार करें। यहां 01 प्रतिशत डीएमएसओ के 5 एमएल और 10 माइक्रोन डेम डेक्सामेथासोन का उपयोग किया गया और 24 लार्वा/शर्त को वाहन/दवा समाधान/लार्वा के ~ 200 माइक्रोन में स्थानांतरित कर दिया गया।
  3. एक स्थानांतरण पिपेट के साथ एक डिश से जितना संभव हो उतना तरल निकालें और वाहन नियंत्रण युक्त प्रीमिक्स्ड E3 जोड़ें। अन्य पकवान के लिए ब्याज के उपचार युक्त प्रीमिक्स्ड E3 के साथ दोहराएं।
  4. एक पिपेट का उपयोग करके, लार्वा को 96 अच्छी तरह से प्लेट (एक लार्वा प्रति अच्छी तरह) में स्थानांतरित करें। 7 दिनों के लिए वाहन या दवा के संपर्क में इंजेक्शन लार्वा के अस्तित्व की निगरानी करें।
    नोट: दवा को पूरी तरह से संक्रमण के दिन लागू किया जा सकता है और पूरे प्रयोग के लिए लार्वा पर रखा जा सकता है या दैनिक रूप से ताज़ा किया जा सकता है।

6. जेब्राफिश घायल और विकास और इमेजिंग के लिए फंसाने डिवाइस का उपयोग कर संक्रमित लार्वा की दैनिक इमेजिंग (zWEDGI)

  1. सुनिश्चित करें कि पिगमेंटेशन को रोकने के लिए 24 एचपीएफ में 100 माइक्रोनएम एन-फिनाइलथिओरिया (पीटीयू) के साथ लार्वा का इलाज किया जाता है और पूरे प्रयोग के लिए पीटीयू को लार्वा पर रखा जाता है।
    नोट: 75-100 माइक्रोनएम पर पीटीयू बिना किसी सकल विकासात्मक दोषों के लार्वा के पिगमेंटेशन को रोकता है24। हालांकि, पीटीयू कुछ जैविक प्रक्रियाओं25के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, और शोधकर्ताओं को पहले से निर्धारित करना चाहिए कि क्या दवा जांच के तहत किसी भी प्रक्रिया को प्रभावित कर सकती है।
  2. धारा 3 में वर्णित फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर एस्परगिलस बीजाणुओं के साथ 2 डीपीएफ पर ब्याज की लेबल सेल आबादी के साथ ट्रांसजेनिक लार्वा को संक्रमित करें। फिर, संक्रमित लार्वा को मेथिलीन नीले रंग के बिना ई3 के लगभग 500 μL/well में 48 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें।
    नोट: यहां 48 अच्छी तरह की प्लेट का उपयोग किया जाता है, क्योंकि बार-बार दैनिक इमेजिंग के दौरान लार्वा को स्थानांतरित करना आसान होता है।
  3. इमेजिंग के दिन, दो 3.5 मिमी पेट्री व्यंजन तैयार करें: 100 माइक्रोन पीटीयू के साथ एक और ई 3-ट्राइकेन के साथ एक।
  4. एक zWEDGI डिवाइस26, 27के कक्षों में E3-tricaine जोड़ें । स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, P100 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके कक्षों और निरोधक चैनल से हवा के बुलबुले हटा दें। सभी अतिरिक्त E3-tricaine निकालें, ताकि यह केवल कक्षों में है ।
  5. स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके प्लेट से एक लार्वा ऊपर करें। यदि इसे हटाने के लिए बहुत सारे तरल का उपयोग किया जाता है, तो ई 3-पीटीयू युक्त 3.5 मिमी पकवान में पिपेट करें। फिर, फिर से पिपेट करें, जितना संभव हो उतना कम तरल का उपयोग करें, और E3-ट्राइकेन में स्थानांतरित करें।
  6. एनेस्थेटाइजेशन के लिए ~ 30 एस प्रतीक्षा करें, फिर घायल और फंसाने वाले डिवाइस के लोडिंग चैंबर में स्थानांतरित करें (उदाहरण के लिए, zWEDGI)।
  7. स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे, लार्वा की स्थिति। घायल कक्ष से E3-tricaine को हटाने के लिए P100 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें और प्रतिबंध चैनल में लार्वा की पूंछ को स्थानांतरित करने के लिए लोडिंग चैंबर में छोड़ दें। सुनिश्चित करें कि लार्वा अपने पार्श्व, पृष्ठीय, या डोरसो-पार्श्व पक्ष पर तैनात है, ताकि हिंडब्रेन को उल्टे उद्देश्य लेंस के साथ चित्रित किया जा सके।
  8. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ छवि लार्वा।
  9. इमेजिंग के बाद, P100 पिपेट के साथ, लोडिंग चैंबर में निरोधक चैनल से लार्वा को पुश करने के लिए घायल कक्ष में E3-tricaine जारी करें।
  10. एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, लार्वा उठाएं और इसे वापस ई3-ट्राइकेन के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। जितना संभव हो उतना कम तरल उपयोग करके, इसे ई 3-पीटीयू के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। पीटीयू में कुल्ला और 48 अच्छी तरह से थाली में वापस हस्तांतरण।

Representative Results

जेब्राफिश लार्वा के हिंडब्रेन में एस्परगिलस बीजाणुओं के माइक्रोइंजेक्शन के बाद, संक्रमण परिणाम के बाद जीवित रहने, सीएफयू और लाइव इमेजिंग सहित कई परखें हो सकती हैं। अस्तित्व की परख में, 1-7 डीपीआई जीवित संक्रमित लार्वा की संख्या पर नजर रखी गई थी। जब वाइल्डटाइप लार्वा का अनुपचारित छोड़ दिया गया, तो बहुत कम मौत देखी गई, जिसमें ~ 80%-100% लार्वा प्रयोग की संपूर्णता(चित्रा 1) जीवित रहते हैं। यदि लार्वा इम्यूनोसप्रेस्ड थे, जैसे कोर्टिकोस्टेरॉयड दवा डेक्सामेथासोन (10 माइक्रोन) के संपर्क में आने से, काफी कम अस्तित्व(चित्र 1)देखा गया था।

जब ए फ्यूमिगटस बीजाणुओं से संक्रमित वाइल्डटाइप लार्वा से 7 दिन के प्रयोग में सीएफयू की मात्रा निर्धारित की गई थी, तो समय के साथ धीमी निकासी(चित्रा 2 ए)के साथ बीजाणुओं का हठ देखा गया था। 1, 2, 3, 5, और 7 डीपीआई पर जीवित बीजाणुओं की संख्या को सामान्य बनाया गया था, जो प्रतिकृति(चित्रा 2B)में दृढ़ता और निकासी की तुलना करने के लिए 0 डीपीआई पर इंजेक्ट किए गए बीजाणुओं की संख्या को सामान्य बनाया गया था।

ल्यूकोसेंट प्रोटीन के साथ ल्यूकोसेंट प्रोटीन में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली ट्रांसजेनिक फिश लाइनों का उपयोग ल्यूकोसाइट भर्ती और व्यवहार के साथ-साथ फंगल अंकुरण और विकास13दोनों की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। जब मैक्रोफेज लेबल किए गए थे (जैसे, टीजी(mpeg1:H2B-GFP),),लार्वा के ~ 50% में मैक्रोफेज क्लस्टरिंग आमतौर पर 2-3 डीपीआई(चित्रा 3 ए)से शुरू होता था। न्यूट्रोफिल(टीजी(lyz: BFP))भर्ती में आम तौर पर देरी हुई थी, मुख्य रूप से फंगल अंकुरण के बाद होने वाली(चित्रा 3A)। जबकि अधिकांश लार्वा(चित्रा 3 ए)में पूरे प्रयोग के लिए फंगल बोझ कायम रहा, निकासी(चित्रा 3B) देखीगई। कुछ लार्वा में, हिंडब्रेन के बाहर फंगल बोझ भी बाद में संक्रमण में देखा गया था, फंगल प्रसार के कारण, मैक्रोफेज में होने की संभावना।

इटिक वेसिकल के आसपास का क्षेत्र एक संभावित स्थान है जहां यह प्रसार पाया जा सकता है(चित्र 3सी)। इन टिप्पणियों को पूरे प्रयोग(चित्र 4)के दौरान कई व्यक्तिगत लार्वा में मात्रा निर्धारित की गई थी। आमतौर पर, 5 डीपीआई(चित्रा 4 ए)द्वारा ~ 60% लार्वा में अंकुरण देखा गया था। Phagocyte क्लस्टर क्षेत्र, मैक्रोफेज भर्ती, और न्यूट्रोफिल भर्ती दोनों समय के साथ और लार्वा भर में बदलती हैं, कुछ प्रयोग भर में रुझान और समय के साथ कुछ हल(चित्रा 4बी, सी, डी)।

Figure 1
चित्रा 1: संक्रमित लार्वा का प्रतिनिधि अस्तित्व विश्लेषण। एस्परगिलस-संक्रमितलार्वा वाहन नियंत्रण (डीएमएसओ) या डेक्सामेथासोन (डेक्स) के संपर्क में थे, और अस्तित्व पर नजर रखी गई थी। डेटा तीन पूल्ड प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं। औसत इंजेक्शन CFUs: DMSO = 30, डेक्स = 29 (पी मूल्य और जोखिम अनुपात कॉक्स आनुपातिक खतरा प्रतिगमन विश्लेषण, ****p < ०.०००१) द्वारा गणना की गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इंजेक्शन (0 डीपीआई) के तुरंत बाद और संक्रमण पाठ्यक्रम (2, 3, 5, और 7 डीपीआई) के दौरान व्यक्तिगत संक्रमित लार्वा से प्रतिनिधि सीएलयू मायने रखता है। प्रत्येक समय बिंदु और दोहराने के लिए सीआईयू की गणना करने के लिए आठ संक्रमित लार्वा को समरूप और चढ़ाया गया था। (A)एक दोहराने से उदाहरण डेटा । प्रत्येक बिंदु एक लार्वा का प्रतिनिधित्व करता है, बार प्रत्येक समय बिंदु के लिए साधनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ख)सीएलयू की गिनती को प्रत्येक दोहराने के लिए 0 डीपीआई पर सीआईयू काउंट में सामान्यीकृत किया गया था, और तीन प्रतिकृतियां एकत्र की गई थीं । अनुमानित सीमांत साधनों और मानक त्रुटियों के संदर्भ में विचरण और संक्षेप के विश्लेषण का उपयोग करके प्रायोगिक स्थितियों के बीच डेटा की तुलना की गई थी । एस्टरिक्स 0 डीपीआई (*पी < 0.05, * * पी < 0.01, *पी < 0.0001) पर सीआईयू की तुलना में सांख्यिकीय महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: संक्रमण प्रयोगों से प्रतिनिधि छवियां। फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज (mpeg1: H2B-GFP) और न्यूट्रोफिल (lyz: BFP) के साथ पीटीयू-इलाज लार्वा को आरएफपी-एक्सप्रेसिंग ए फ्यूमिगटसके साथ इंजेक्ट किया गया था । एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लाइव, संक्रमित लार्वा को बार-बार 2, 3 और 5 डीपीआई पर इमेज किया गया था। अधिकतम तीव्रता जेड प्रक्षेपण छवियों को प्रदर्शित कर रहे हैं। लार्वा के योजनाबद्ध प्रत्येक पैनल के लिए इमेजिंग के स्थान का संकेत देते हैं। सभी पैमाने पर सलाखों के 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं, इनसेट पैमाने सलाखों के अलावा, जो 25 माइक्रोन हैं।(A)दिखाए गए चित्र 2, 3 और 5 डीपीआई पर लिए गए एकल लार्वा से हैं, जो एक विशिष्ट संक्रमण प्रगति का प्रतिनिधित्व करते हैं। इंसेट 3 और 5 दिन में फंगल अंकुरण दिखाते हैं । (ख)लार्वा के सबसेट की प्रतिनिधि छवि जो संक्रमण को साफ कर सकती है, कम फंगल बोझ और 5 डीपीआई पर ज्यादा सूजन नहीं। (ग)लार्वा के सबसेट की प्रतिनिधि छवि जिसमें संक्रमण बाद के समय बिंदुओं पर हिंडब्रेन से बाहर फैलता है । इस छवि में, कवक, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल को इकोटिकल वेसिकल के आसपास और नीचे पाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: इमेजिंग प्रयोगों का प्रतिनिधि परिमाणीकरण। चित्रा 3 में प्रायोगिक सेटअप से छवियों को कवक अंकुरण और ल्यूकोसाइट भर्ती के लिए विश्लेषण किया गया । (क)प्रत्येक दिन अंकुरित बीजाणुओं की उपस्थिति के लिए लार्वा बनाए गए थे, और अंकुरण के साथ लार्वा के प्रतिशत की गणना की गई थी। (B,C,D) प्रत्येक व्यक्ति लार्वा को एक अलग रंग रेखा के रूप में दर्शाया जाता है। प्रत्येक लार्वा के लिए 5 दिन के प्रयोग के दौरान फागोसाइट क्लस्टर उपस्थिति और आकार (बी), मैक्रोफेज रिक्रूटमेंट (सी), और न्यूट्रोफिल रिक्रूटमेंट (डी) का पालन किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित संक्रमण मॉडल मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, मेजबान-रोगजनक बातचीत, और फंगलरोगजनक12, 13,14,15का विश्लेषण करनेकेलिए फायदेमंद है। यह जानकारी फ्लोरोसेंट-लेबल वाले रोगजनकों और मेजबान कोशिकाओं13,लार्वा अस्तित्व और समय के साथ सीएलयू दृढ़ता के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग से ली जा सकती है।

माइक्रोइंजेक्शन तकनीक इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है और विभिन्न माइक्रोइंजेक्शन उपकरण और सेटअप का उपयोग करते समय समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। विशेष रूप से, इंजेक्शन का दबाव और समय दो प्रमुख चर हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है कि सुई द्वारा बाहर निकाली गई मात्रा ~ 3 एनएल है। सुई का आकार जैसा कि इसे संदंश के साथ कतरन द्वारा निर्धारित किया जाता है, इंजेक्शन दिए जा रहे बीजाणुओं की संख्या को भी नियंत्रित करता है; हालांकि, एक बड़ा उद्घाटन लार्वा को ऊतक क्षति पहुंचा सकता है। दूसरी ओर, एक खोलने के बहुत छोटे अपेक्षाकृत बड़े बीजाणुओं (>2 माइक्रोन) को बाहर करने की अनुमति नहीं देंगे और सुई क्लोजिंग का कारण बन सकते हैं। यदि ऐसा होता है, सुई को थोड़ा बड़ा खोलने के लिए पीछे हटना जा सकता है।

बैक्टीरिया के माइक्रोइंजेक्शन के लिए अन्य प्रोटोकॉल पीवीपी-40 का उपयोग करते हैं ताकि एक समरूप इंजेक्शन मिश्रण को बनाए रखने में मदद मिल सके, लेकिन हमें एस्परगिलस बीजाणुओं के साथ इस वाहक का उपयोग करने में कोई लाभ नहीं मिला है। सुई के क्लोजिंग को सुई लोड करने से पहले किसी भी झुरमुट को तोड़ने के लिए फंगल तैयारी को अच्छी तरह से भंवर से कम किया जा सकता है। कभी-कभी, सुई में एक रोकना भी अस्थायी रूप से दबाव या इंजेक्शन समय को बढ़ाकर और माइक्रोइंजेक्टर को ट्रिगर करके उखाड़ फेंका जा सकता है जबकि सुई लार्वा के आसपास के तरल में होती है। दबाव और इंजेक्शन समय तो पिछले स्तर ों को फिर से कम किया जाना चाहिए । अन्य मामलों में, एक क्लॉग को हटाया नहीं जा सकता है, और एक नई सुई को लोड और रीकैलिब्रेटेड करने की आवश्यकता होती है।

यह प्रोटोकॉल प्रति लार्वा ~ 30-70 बीजाणुओं को इंजेक्ट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह ज्ञात है कि बीजाणु तैयार करने और मात्रा इंजेक्शन की एकाग्रता के आधार पर, यह संख्या काफी कम है। हालांकि, यह अनुभवजन्य रूप से पाया गया है कि यह इन परिस्थितियों में इंजेक्शन दिए गए बीजाणुओं की संख्या है। यह अंतर क्यों होता है अज्ञात है, लेकिन यह सुई में बीजाणु क्लंपिंग के कारण हो सकता है। बड़ी संख्या में बीजाणुओं को इंजेक्ट करने के हमारे अपने प्रयास काफी हद तक असफल रहे हैं ।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि लगभग 30-70 बीजाणु इंजेक्शन लगाए जा रहे हैं और सभी लार्वा में इंजेक्शन की स्थिरता बनाए रखते हैं, लार्वा के आसपास के E3 पर इंजेक्शन लगाकर बीजाणुओं की संख्या की जांच करें। सभी इंजेक्शन भर में हर पांच से छह लार्वा इसे दोहराएं। यदि बीजाणु गिनती बदलने लगता है, दबाव और/या इंजेक्शन समय कई लार्वा भर में बीजाणुओं की एक सुसंगत संख्या सुई करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । हालांकि, ध्यान रखा जाना चाहिए कि इंजेक्शन की खुराक मुख्य रूप से हिंडब्रेन में रहती है और मिडब्रेन और पूर्वाभास को नहीं भरती है।

एक स्थानीय संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए, बीजाणु निलंबन हिंडब्रेन वेंट्रिकल के भीतर समाहित किया जाना चाहिए। यह इंजेक्शन के ठीक बाद फिनॉल लाल धुंधला द्वारा कल्पना की जा सकती है, हालांकि लाल रंग समय के साथ फैलता है। इंजेक्शन के लिए,ोट वेसिकल के आसपास के क्षेत्र का उपयोग 45 डिग्री-65 डिग्री कोण पर वेंट्रिकल तक पहुंचने और पहुंचने के लिए किया जाता है। इस क्षेत्र में कोई मुख्य रक्त वाहिकाएं नहीं हैं, कम ऊतक क्षति का कारण बनता है, और तुरंत भर देता है। यदि वेंट्रिकल पर त्वचा छेदा जाता है, तो बीजाणु निलंबन को लीक किया जा सकता है, क्योंकि एस्परगिलस बीजाणु इंजेक्शन के लिए जिस सुई का उपयोग किया जाना चाहिए वह बैक्टीरियल निलंबन के लिए उपयोग की जाने वाली तुलना में बड़ा है। असफल इंजेक्शन या गलती से क्षतिग्रस्त लार्वा को लाल निशान बनाने के लिए या सुई के साथ पंक्ति से बाहर लार्वा को खींचकर एक-दो बार जर्दी में इंजेक्शन देकर चिह्नित किया जा सकता है। इंजेक्शन का एक सेट पूरा होने के बाद, इन लार्वा को हटा दिया जाना चाहिए और बाकी प्लेट से धोए जाने से पहले निपटाया जाना चाहिए। मेथिलीन नीले रंग के बिना E3 का उपयोग इंजेक्शन से पहले लार्वा को एनेस्थेटाइज करने और इंजेक्शन के बाद लार्वा रखने के लिए किया जाता है, क्योंकि मेथिलीन नीला एंटी-फंगल है।

इंजेक्शन के समय, सीएलयू गिनती संक्रमित मेजबान के भीतर व्यवहार्य बीजाणुओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करती है। हालांकि, यदि बीजाणु हाइफाई में अंकुरित होते हैं, तो इन्हें समरूपता के दौरान अलग व्यवहार्य "फंगल इकाइयों" में तोड़ा जा सकता है और कई उपनिवेशों को जन्म दे सकता है। या, एक अटूट बहुकोशिकीय हाइफा एक ही कॉलोनी को जन्म दे सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एक औसत, लेकिन गलत, फंगल बोझ का प्रतिनिधित्व होता है। इसे व्यक्तिगत लार्वा के देशांतर माइक्रोस्कोपी के साथ सीआईएफयू की गिनती के संयोजन से कम किया जा सकता है, जो इंजेक्शन बीजाणुओं के भाग्य का दृश्य डेटा प्रदान करता है।

स्तनधारी प्रणाली की तुलना में, जेब्राफिश लार्वा संक्रमण मॉडल अपनी ऑप्टिकल पहुंच के कारण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती और प्रतिक्रिया को लाइव अक्षुण्ण मेजबान के भीतर कल्पना की जा सकती है। यह आणविक लक्ष्यों के आनुवंशिक या रासायनिक अवरोध के साथ शामिल किया जा सकता है विश्लेषण करने के लिए कैसे प्रत्येक लक्ष्य एक जीवित जानवर में Aspergillus बीजाणुओं के खिलाफ मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है ।

जबकि जेब्राफिश लार्वा एस्परगिलस संक्रमण मॉडल आईए12, 13, 14,15, 16,17,18,19,20,22के विभिन्न पहलुओं का वर्णन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रहता है, विस्तार के अन्य क्षेत्र हैं। मेजबान पक्ष से, इसका उपयोग सेलुलर स्तर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का वर्णन करने के लिए किया जाता है, लेकिन इसे लक्षित रूपोलिनो, CRISPR, स्थिर उत्परिवर्ती लाइनों, या रासायनिक जोखिम के साथ जोड़कर आणविक स्तर पर प्रतिरक्षा तंत्र का विश्लेषण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। एक चेतावनी यह है कि सभी ज्ञात स्तनधारी जन्मजात प्रतिरक्षा मार्ग घटकों के लिए होमोलॉग की पहचान जेब्राफिश में नहीं की गई है।

रोगजनक पक्ष से विभिन्न प्रजातियों और उपभेदों की उग्रता का वर्णन किया गया है । भविष्य के अनुसंधान का एक आशाजनक अवसर उत्परिवर्ती एस्परगिलस उपभेदों का उपयोग यह परीक्षण करने के लिए है कि विशिष्ट जीन या प्रोटीन उग्रता कारकों के रूप में कैसे योगदान देते हैं। जिससे इन प्रोटीनों को निशाना बनाने के लिए उपन्यास एंटी फंगल दवाएं विकसित की जा सकती हैं। वर्तमान एंटी-फंगल दवाओं में मानव रोगियों में प्रभावकारिता कम होती है और कवक28में इन दवाओं के प्रति प्रतिरोध बढ़ रहा है । वीवो मॉडल में इसका उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि ये दवाएं विफल क्यों होती हैं और उपन्यास एंटी-फंगल दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक मध्यवर्ती मॉडल के रूप में। कुल मिलाकर, इस मॉडल का उपयोग करके खोजे गए निष्कर्ष एस्परगिलस-संक्रमितरोगियों के लिए प्रभावी उपचार के भविष्य के विकास को सुविधाजनक बना सकते हैं।

Disclosures

कोई संघर्ष या वित्तीय हितों का खुलासा करने के लिए ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या K22AI134677 के तहत समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont forceps #5 Roboz Surgical Instrument Co. RS-5045
Eyepiece reticle Microscope World RETR10 For calibrating needles, used in Stereomicroscope
Microinjector setup: Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Footswitch Applied Scientific Instrumentation FTSW
Micro pipet holder kit Applied Scientific Instrumentation M-Pip
Pressure injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Micromanipulator setup: Micromanipulator Narashige (Tritech) M-152
Magnetic stand and plate Tritech MINJ-HBMB
Needle puller Sutter Instrument P-97
Stereomicroscope Nikon SMZ-745
Tissuelyser II Qiagen 85300 To homogenize larvae
Material Company Catalog Number Comments/Description
Agarose Fisher BP160-500
Ampicillin sodium salt Fisher AAJ6380706
BSA, fraction V VWR AAJ65855-22
Kanamycin sulfate Fisher AAJ1792406
L spreaders Fisher 14 665 230
Microcapillary needles (no filament) World Precision Instruments (WPI) TW100-3
Microloader pipet tips VWR 89009-310 To load the needle with Aspergillus suspension
Miracloth VWR EM475855-1R To filter Aspergillus suspension
N-phenylthiourea Fisher AAL0669009 To prevent pigmentation
Phenol red, 1% solution Fisher 57254
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) Fisher AC118000500 To anesthetize larvae
Tween-20 Fisher BP337-500
Media and Solutions Components/Recipe
E3 media: 60x E3 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O
1x E3 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue)
Tricaine stock solution 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave
20x Nitrate salts 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave
Trace elements (TE) 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave

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References

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Thrikawala, S., Rosowski, E. E.… More

Thrikawala, S., Rosowski, E. E. Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (159), e61165, doi:10.3791/61165 (2020).

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