Summary
この論文では、脳、脊髄、髄膜など、中枢神経系内の常在免疫細胞および末梢由来の免疫細胞を調べるための2つの最適化されたプロトコルを紹介します。これらの各プロトコルは、定常状態および炎症状態下でこれらのコンパートメントを占める細胞の機能と組成を確認するのに役立ちます。
Abstract
中枢神経系(CNS)は脳と脊髄で構成され、末梢と中枢神経系の間の障壁として機能する膜層である髄膜に包まれています。CNSは免疫学的に特殊な部位であり、定常状態では、免疫特権はCNS実質で最も明白です。対照的に、髄膜には、自然免疫細胞や適応免疫細胞など、多様な常在細胞があります。CNS損傷、自己免疫、感染、さらには神経変性によって引き起こされる炎症状態の間、末梢由来の免疫細胞が実質に入り、髄膜内に居住する可能性があります。これらの細胞は、CNS疾患の病因の間に有益な作用と有害な作用の両方を行うと考えられています。この知識にもかかわらず、従来のCNS組織抽出方法では髄膜層が省略されているため、CNSコンパートメントを分析するときに髄膜が見落とされがちです。このプロトコルは、単一細胞技術、免疫組織化学、およびin situハイブリダイゼーション法によるダウンストリーム分析に適した、マウスCNS組織(すなわち、脳、脊髄、および髄膜)を迅速に分離するための2つの異なる方法を提示します。記載された方法は、CNS組織の包括的な分析を提供し、恒常性条件下でおよび疾患の病因の間にCNS区画を占める細胞の表現型、機能、および局在を評価するのに理想的である。
Introduction
中枢神経系(CNS)は免疫学的に特殊な部位です。CSF腔、髄膜、および血管系を除くCNS実質は、古典的に免疫特権部位1,2,3,4,5と見なされており、恒常性状態の間は免疫細胞が比較的ありません2,6,7。対照的に、硬膜、くも膜、および軟膜層で構成される髄膜は、CNSコンパートメントの重要な構成要素であり、疾患の病因中の恒常性免疫監視および炎症プロセスに積極的に関与しています3,6,7,8。定常状態の間、髄膜は、自然リンパ系細胞(ILC)、マクロファージ、樹状細胞(DC)、肥満細胞、T細胞、および程度は低いがB細胞を含む多数の免疫センチネル細胞をサポートする9,10,11。
髄膜は高度に血管新生した構造であり、CNSとその末梢との間にリンパ管接続を提供するリンパ管を含む8,12,13,14。CNS損傷、感染症、自己免疫、さらには神経変性によって誘発される炎症状態では、末梢由来の免疫細胞が実質に浸潤し、髄膜内の免疫ランドスケープを変化させます。細胞浸潤に続いて、髄膜は末梢由来の免疫細胞の機能的ニッチを表し、免疫細胞の凝集、局所免疫細胞の活性化、およびCNSコンパートメントでの長期生存を促進します。顕著な髄膜炎症は、多発性硬化症(MS)15、16、17、18、19、脳卒中20、21、無菌損傷22、23(すなわち、脊髄損傷および外傷性脳損傷)、片頭痛24、および微生物感染25、26を含む、CNSに影響を及ぼす複数の疾患において観察され、27、28、29。したがって、髄膜コンパートメント内の常在細胞および末梢由来免疫細胞の特性評価は、定常状態および疾患の病因におけるこれらの細胞の役割を理解するために不可欠です。
頭蓋体と椎体からの脳、脊髄、髄膜の抽出は、技術的に困難で時間がかかります。現在、3つの髄膜層すべてを無傷のままにして脳を迅速に抽出するために利用できる技術はありません。椎弓切除術は優れた脊髄組織の形態をもたらし、髄膜層を保存しますが、それは非常に時間がかかり、複雑です30,31。逆に、頭蓋骨からの脳の除去および脊髄の水圧押し出しなどのより従来の抽出方法は、CNS組織の迅速な抽出を容易にするが、くも膜および硬膜髄膜の両方がこれらの技術で失われる30,31。脳および脊髄組織の従来の単離中に硬膜およびくも膜層が省略されると、CNSコンパートメント内の細胞の不完全な分析がもたらされる。したがって、無傷の髄膜を有するCNS組織の迅速な抽出に焦点を当てた新しい技術の同定は、CNSコンパートメントの最適な分析にとって重要です。
この原稿は、マウスから脳、脊髄、髄膜を迅速に抽出するための2つの方法を提示し、CNS実質および髄膜の常在細胞および末梢由来免疫細胞の下流分析を容易にします。これらの最適化されたプロトコルは、1)ダウンストリーム分析用の単一細胞懸濁液の単離、および2)組織学的処理のための組織の準備に焦点を当てています。脳、脊髄組織、硬膜およびくも膜髄膜32から単一細胞懸濁液を得ることは、実質および髄膜コンパートメントの両方に存在する細胞の同時分析を可能にする。シングルセル懸濁液は、in vitro刺激33、酵素結合イムノスポット(ELISpot)28、34、35、フローサイトメトリー36、33、シングルセル37またはバルクトランスクリプトミクスを実行するための細胞培養アッセイなど、さまざまなアプリケーションで使用できます。さらに、無傷の頭蓋骨または脊柱を備えた脳全体と脊髄の脱灰に最適化されたプロトコルにより、周囲の骨を穏やかに脱灰し、髄膜を無傷のままにし、組織の形態を維持することができます。この方法では、実質空間と髄膜腔の両方で免疫組織化学(IHC)またはin situハイブリダイゼーション(ISH)技術を使用してタンパク質またはRNAを選択的に同定できます。CNS内の常在細胞および末梢由来免疫細胞の表現型、活性化状態、および局在の特性評価は、CNSコンパートメント内の個々の細胞タイプが恒常性と疾患の病因にどのように寄与するかを理解するために不可欠な情報を提供する可能性があります。
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Protocol
すべての動物作業は、ダートマスのガイゼル医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によってレビューおよび承認されたプロトコルを利用しています。
1.脱灰のための脳および脊髄サンプルの処理
- 脳と脊髄のサンプルの分離
- CO2吸入によりマウスを安楽死させる。CO2流量が毎分ケージ容量の10%〜30%を変位させることを確認してください。
- 鉗子を使用して、剣状突起を持ち上げ、胸郭のすぐ下の腹壁をハサミで横方向に切断し、下にある血管や臓器を切断しないように引き上げます。ダイヤフラムを横方向に切ります。
- 胸郭を肺に平行な横方向の端に沿って鎖骨まで切ります。鉗子を使用して、胸骨を持ち上げ、止血剤で胸骨を固定します。止血材を頭の上に置き、胸郭を持ち上げて心臓を露出させます。
- 鉗子を使用して、心臓の頂点近くをつかみ、心臓の右心房を切開して出口を提供します。10 mLシリンジを取り付けた25 Gの針を挿入して、10 mLの氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を左心室にゆっくりと投与し、マウスを経心灌流します。
注:灌流は、肝臓から血液がなくなるまで4〜5分かけて行う必要があります。通常、合計10 mLの1x PBSで灌流に十分ですが、必要に応じてさらに利用することもできます。透明な肝臓は通常、適切な灌流を示します。 - 鋭利なハサミを使用して、斬首によって頭を取り除きます(図1;1)。皮膚を正中線切開し(図1;2)、皮膚を目の上にひっくり返して頭蓋骨を解放します。
- 鼻骨を切って下顎骨を頭蓋骨から解放します(図1;3)。下顎骨、舌、目を取り除きます。頭蓋骨の外側に沿って切断し、外耳道に沿って組織を解放します(図1;4)。頭蓋骨を覆う余分な皮膚、筋肉、組織をすべて取り除くようにトリミングします。
- 鋭いハサミで背骨と平行に切断することにより、胸郭を脊柱から分離します(図1;5および6)。腰部の下部に小さな切り込みを入れて、脊柱を分離します(図1;7)。脊椎に沿って残っている筋肉をトリミングして取り除き、椎骨を露出させます(図1;8)。
注:固定剤パラホルムアルデヒド(PFA)とエチレンジアミン四酢酸(EDTA)脱灰バッファーの適切な浸透を得るには、脊柱と頭蓋骨から余分な組織を取り除く必要があります。
- 固定後、脱灰、凍結保存
- 鉗子を使用して、無傷の頭蓋骨または脊柱を備えた脳を、10 mLの4%PFAを含む15 mLの円錐管に入れます。適切な固定のために、チューブを4°Cで少なくとも48時間置きます。
注意: 組織の過剰固定を避けるために、72時間の固定を超えないようにしてください。脱灰前の骨標本の固定時間が延長されます。適切な固定は、脱灰の影響から組織を保護し、より良い組織形態を保証します。 - 鉗子で4%PFAから組織を取り除き、10 mLの1x PBSを含む使い捨ての14 mLチューブに5分間入れて、脳または脊髄をすすぎます。脳または脊髄を10 mLの10%EDTA(pH = 7.2〜7.4)を含む50 mLの円錐管に移します。
注:10 mLのEDTAを含むより大きなチューブを使用すると、EDTAと組織との接触面積が大きくなり、脱灰プロセスが加速されます。 - 骨が柔らかくしなやかであるかどうかを毎日チェックしてください:鉗子でEDTA溶液から組織を取り除き、それをペトリ皿の上に置き、そして25 G針で骨の柔らかさを穏やかにテストします。針が骨を容易に貫通すれば、脱灰プロセスは完了です。
- EDTA溶液から組織を取り除き、脳または脊髄を10 mLの1x PBSを含む14 mLの使い捨てチューブに移し、10分間洗浄します。洗浄を繰り返します。
注:脱灰には通常2〜3日かかります。骨がまだ十分に脱灰されていない場合は、2〜3日ごとに溶液を交換する必要があります。ただし、骨が脱灰された後のEDTAでの長時間のインキュベーションは、組織の形態を損傷する可能性があります。 - 1x PBSにスクロースを添加して、10%、20%、および30%のスクロース溶液を調製します。たとえば、10%スクロースの場合、10 gのスクロースを追加し、滅菌1x PBSを使用して容量を100 mLにします。溶液を4°Cで最大1か月間保存します。
注:スクロース溶液は微生物の増殖しやすいため、サンプルをこれらの溶液に長期間保存しないでください。 - 1x PBSから組織を取り出し、10 mLの10%スクロース溶液に入れて4°Cで保存します。ティッシュを24時間、またはチューブの底に沈むまで放置します。
- このプロセスを繰り返し、組織を最初に20%スクロース溶液に移動し、最後に30%スクロース溶液に移動します。組織を30%スクロース(少なくとも24時間)に沈め、組織包埋に進みます。
- 鉗子を使用して、無傷の頭蓋骨または脊柱を備えた脳を、10 mLの4%PFAを含む15 mLの円錐管に入れます。適切な固定のために、チューブを4°Cで少なくとも48時間置きます。
- 組織の包埋と凍結
- 鉗子を使用して、30%スクロースから組織を取り出し、ペトリ皿の上に置き、皿を傾けて組織上の余分なスクロース溶液を取り除きます。メスを使用して、組織を目的のセグメントに切断します。
- クライオモールドの底部に最適な切断温度(OCT)コンパウンドの薄層を作成し、ティッシュピースを金型に配置します。組織をOCTコンパウンドで完全に覆い、気泡がないことを確認します。
- ブロックが不透明になるまで、液体窒素38 の上にホバリングするか、ブロックを100%イソプロパノール/ドライアイススラリー39 にセットすることにより、ブロックを瞬間凍結します。クライオモールドをアルミホイルで包み、ブロックを-80°Cで保管して長期保存します。切断する前にブロックを-20°Cに移動します。
注:脱灰した脳の切片化と組織学プロトコルの実行時には、切片を大まかに扱うと頭蓋骨層と髄膜層が失われる可能性があるため、注意が必要です。
2.フローサイトメトリー染色のための髄膜およびCNS組織の調製
- 頭蓋骨と脳の摘出
- 鋭利なハサミを使用して、斬首によって頭を取り除きます(図2A;1)。はさみを使用して、皮膚を正中線切開し(図2A;2)、皮膚を目の上にひっくり返して頭蓋骨を解放します。
- はさみを大孔内に置き、皮質に沿って嗅球に向かって横方向に頭蓋骨を切断し始め、切開部を外耳道と下顎骨の上に保ちます(図2A;3)。反対側でも同じカットを行い、嗅球でカットを合わせて頭蓋骨キャップを脳から解放します(図2A;3)。
- 鉗子を使用して、頭蓋骨キャップを剥がし、25 mM HEPESを添加した5 mLの冷RPMI培地を含む15 mLの円錐管に頭蓋骨キャップを置きます。チューブを氷の上に置いてください。
- 湾曲した鉗子を使用して、鉗子を脳の基部の下に置き、持ち上げて脳を頭蓋骨のキャップから解放します。25 mM HEPESを添加した5 mLの冷RPMIを含む15 mLの円錐形のチューブに脳を置きます。処理するまでチューブを氷の上に保管してください。
- 脊柱と脊髄組織の摘出
- 鉗子と鋭利なはさみを使用して、脊椎と平行に切断することにより、胸郭を脊柱から分離します(図2A;4および5)。腰部の下部に小さな切り込みを入れて、脊柱を分離します(図2A;6)。脊椎に沿って残っている筋肉をトリミングして取り除き、椎骨を露出させます(図2A;7)。
- 極細の外科用ハサミを脊柱内に置き、柱の横縁に沿って切断します(図2C)。反対側の側縁を完全に切断して、脊柱を前部と後部に分割します。
注意: 脊髄は脊柱に付着したままになります。 - 鉗子を使用して、脊柱から脊髄をゆっくりと慎重に剥がし、25 mM HEPESを含む5 mLの冷RPMIを含む15 mLの円錐管に組織を置きます。脊柱の前部と後部を、25 mM HEPESを含む5 mLの冷RPMIを含む15 mLの円錐管に移します。
- 単一細胞懸濁液を調製するための髄膜の除去
- 鉗子を使用して、RPMIメディアから頭蓋骨キャップを取り外します。鋭い鉗子(#7鉗子; 材料表)、頭蓋骨キャップの外縁の周りに刻み込み(図2B)、頭蓋骨キャップの端から髄膜を剥がし、硬膜およびくも膜髄膜を除去するためにこすります。髄膜をペトリ皿に置きます。
注:脳と脊髄の両方から髄膜を除去するには練習が必要です。ユーザーが髄膜の抽出が困難であると感じた場合は、解剖顕微鏡を使用して除去を支援してください。 - チューブから脊柱を取り外します。鋭利な鉗子を使用して、脊柱の縁の周りに印を付けて髄膜を解放し、湾曲した鉗子を使用して椎骨の端から髄膜を剥がします。髄膜をペトリ皿に置きます。
- ナイロンメッシュストレーナーを50mLのコニカルチューブに入れます。髄膜をストレーナーに移し、25 mM HEPESを補給した3 mLのRPMIを追加します。5 mLシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナーを通して組織と培地を粉砕します。
- 5 mLの血清学的ピペットを使用して、目に見えるすべての組織がストレーナーを通過するまで、さらに2〜3 mLのRPMI / HEPES培地でストレーナーを洗浄します。
注:フローサイトメトリー分析に適切な細胞数を得るには、複数の動物の髄膜を一緒にプールする必要がある場合があります。この実験(図3 および図4)では、 4〜5匹のマウスの脳と脊髄髄膜を一緒にプールしました。サンプルがプールされている場合、組織の過熱を防ぐために、ナイロンメッシュストレーナーを介して組織を粉砕するために追加の媒体が必要になります。 - 10 mLの血清学的ピペットを使用して、細胞と培地を新しい15 mLコニカルチューブに移します。10 mLの血清学的ピペットを使用して、50 mLのコニカルチューブを5 mLの培地で洗浄し、残りの細胞を収集します。450 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
- 真空のパスツールピペットを使用して、細胞ペレットを避けるように注意しながら上清を吸引し、細胞を適切な容量とバッファーに再懸濁します。
- 単一細胞懸濁液をカウントするには、トリパンブルー排除色素(1:10希釈)とRPMIを使用して、少量の細胞(つまり、5〜10 μL)を希釈します。10 μLの希釈液を血球計算盤に加えます。
- 前述のようにセルを数えます40,41、精度のために少なくとも2つの16平方グリッドを平均します。
注: 図3では、例えば、髄膜からのプールされたペレット状の細胞を、下流表面染色のために250 μLの蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファー(1x PBS、1%FBSを含む)に再懸濁しました。計数のために細胞を1:10に希釈した(5 μL細胞、5 μLトリパンブルー、40 μL RPMI)。この希釈により、16平方グリッドあたり50〜100個の細胞が得られ、細胞が密集しすぎたり重なりすぎたり、まばらすぎたりしないため、より正確な細胞カウントが保証されます。プールされた脳および脊髄髄膜からの有核細胞数は以下の通りであった:偽治療マウスからの髄膜= 100,000〜150,000細胞、およびTheilerマウス脳脊髄炎ウイルス誘発脱髄疾患(TMEV-IDD)マウスからの髄膜= 300,000〜350,000細胞。細胞数は、収集、処理の精度、および髄膜炎症が存在するかどうかによって異なります。 - FACS表面(図3)14、36、42、43、44、細胞内染色プロトコル33、45、in vitro刺激、細胞培養アッセイ33、46、47、ELISPOTアッセイ28、34、35、およびバルクまたはシングルセルなどの所望の単一細胞技術に進むトランスクリプトミクス37,48。
注意: 処理ステップの合間にすべてのチューブを氷上に保管してください。
- 鉗子を使用して、RPMIメディアから頭蓋骨キャップを取り外します。鋭い鉗子(#7鉗子; 材料表)、頭蓋骨キャップの外縁の周りに刻み込み(図2B)、頭蓋骨キャップの端から髄膜を剥がし、硬膜およびくも膜髄膜を除去するためにこすります。髄膜をペトリ皿に置きます。
- 脳および脊髄組織の単一細胞懸濁液の調製
- チューブから組織とメディアを注ぎ、メディアを含む脳または脊髄組織を100 mmペトリ皿の上部に移します。鉗子を使用して、組織をペトリ皿の底に移動します。滅菌かみそりの刃で脳または脊髄を細かく刻みます。かみそりの刃を使用して、細かく刻んだ組織をこすりながらプレートの底に移動し、組織を集めます。
注:以下の酵素消化プロトコルでは、最大2つの脊髄をプールして処理することができます。脳は個別に処理する必要があります。 - 5 mLの血清学的ピペットを使用して、10%ウシ胎児血清(FCS)を添加した3 mLのRPMIをペトリ皿に加えます。10 mLの血清学的ピペットを使用して、上下にピペットで移動し、培地中の組織を再懸濁し、15 mLのコニカルチューブに移します。
注:ダウンストリームアプリケーションがシングルセルまたはバルクRNAシーケンシング解析または細胞培養である場合は、FCSロットをテストして、解析前に細胞が活性化されていないことを確認する必要があります。あるいは、10%FCSのRPMIの代わりに、0.04%のBSAを含む1x PBSを使用して細胞を処理することもできます。 - 10 mLの血清学的ピペットを使用して、さらに2 mLの培地でシャーレを洗浄し、残留組織を収集し、総容量5 mLの円錐管に移します。処理ステップの合間にチューブを氷上に保ちます。
- ピペットを使用して、コラゲナーゼI粉末をハンクス平衡塩溶液(HBSS)培地に再懸濁し、所望の濃度(すなわち、100 mg / mL)を得る。細かく切った組織サンプルを含むコニカルチューブにコラゲナーゼタイプIを加えて、目的の最終濃度(つまり、1 mg/mLで50 μL)を取得します。
注:コラゲナーゼの濃度が高いほど細胞収量は増加しますが、細胞表面マーカーを切断する可能性があります。したがって、コラゲナーゼIロットを滴定して、必要なすべての細胞表面マーカーを無傷で最大数の生細胞を得るために必要な最適濃度を決定する必要があります。例えば、コラゲナーゼIは、単一の脳または脊髄サンプルで0.5 mg / mL、1 mg / mL、および2 mg / mLの最終濃度でテストされました。細胞生存率はトリパンブルー排除法を用いて決定し、細胞表面マーカーCD45、CD19、およびCD4をフローサイトメトリーにより評価した。1 mg/mL濃度のコラゲナーゼIは、目的のすべての細胞表面マーカーを保持しながら、最高の生細胞数をもたらしました。したがって、この濃度は、これらの細胞型を調べるさらなる実験に使用された。 - 0.15 M塩化ナトリウムを使用してDNase I粉末を目的のストック濃度に穏やかに再懸濁します。再懸濁したDNase Iを細切組織サンプルを含む円錐管に加えて、最終濃度20 U/mLを得ます。
注:DNase Iロットは、mLあたりの活性の単位によって異なります。組織サンプルに添加される濃度は、ストックバイアルのミリリットルあたりの活性単位に基づいて変化します。サンプルあたりの最終的な所望の濃度は20 U/mLです。 - チューブを37°Cの水浴中のチューブラックに入れ、40分間インキュベートします。15分ごとにチューブを反転させて、組織を酵素と完全に混合します。インキュベーション後、500 μLの0.1 M EDTA(pH = 7.2)を各チューブに最終濃度0.01 M EDTAまで加え、さらに5分間インキュベートしてコラゲナーゼを不活性化します。
- 10 mL 血清学的ピペットを使用して、10% FCS を添加した RPMI 9 mL を各チューブに加え、各チューブの容量を~14.5 mLにします。450 x g で4°Cで5分間遠心分離します。真空のパスツールピペットを使用して、細胞ペレットに触れないように注意しながら上清を吸引します。
- 5 mLの血清学的ピペットを使用して、3 mLのストック100%等張密度勾配溶液を細胞ペレットを含むチューブに加えます。10 mL 血清学的ピペットを使用して、RPMI 10% FCS 培地を追加して最終容量を 10 mL にし、細胞ペレットを再懸濁して 30% ストック等張密度勾配溶液層を作成します。
注:100%ストック等張密度勾配培地を事前に準備し、分注し、4°Cで最大3か月間保存します。100%ストック等張密度勾配溶液を調製するには、密度勾配媒体希釈バッファーで密度勾配媒体(材料表)を希釈します。密度勾配培地希釈バッファー(80.0 g/L NaCl, 3.0 g/L KCl; 0.73 g/L Na 2 HP0 4, 0.20 g/L KH2HP04; 20.0 g/L グルコース)を準備し、真空フィルターシステムを使用してろ過滅菌します。1部の密度勾配希釈バッファーと9部の密度勾配媒体を混合することにより、100%ストックの等張密度勾配溶液を作ります。よく混ぜる。 - 70%ストック等張密度勾配溶液下敷きを追加する前に、各チューブをよく反転させて混合します。1 mLのストック70%等張密度勾配溶液を含む1 mLの血清学的ピペットをチューブの底に挿入します。泡を作らないように注意しながら、1 mLの溶液をゆっくりと下敷きます。血清学的ピペットをチューブからゆっくりと取り外し、勾配を乱さないように注意します。
注:70%アンダーレイの場合、100%ストック等張密度勾配溶液をRPMIメディアを使用して70%に希釈する必要があります(つまり、7 mLのストック100等張密度勾配溶液と3 mLのRPMIメディアをよく混合します)。さらに、ミエリン破片を除去し、遠心分離後にグラジエント界面で純粋な単一細胞懸濁液を得るためには、清潔で乱されない70%アンダーレイを作成することが不可欠です。 - 800 x g で4°Cで30分間、ブレーキなしで遠心分離します。ミエリン破片層を含む上清を、細胞層を乱さないように注意しながら、チューブ内に2〜3 mL残るまで吸引します。1 mLピペットを使用して30/70%密度勾配の間の細胞層を回収し、新しい15 mLコニカルチューブに移します。
- 10 mL 血清学的ピペットを使用して、RPMI 10% FCS 培地を添加し、最終容量を 15 mL にします。450 x g を4°Cで5分間遠心分離します。
注:このステップでは、必要に応じて2つのチューブのセル層をプールできます。2本以上のチューブをプールしないと、高密度グラジエント培地の濃度のために細胞がペレット化されません。 - 細胞ペレットを乱さないように上清を注意深く吸引します。血球計算盤を使用して細胞をカウントするために、細胞を適切な容量/バッファーに再懸濁します(例:下流表面染色のために、単一の脊髄を250 μLのFACSバッファーに再懸濁します)(図3)。
- 1 mLピペットを使用して、細胞懸濁液をフィルタートップチューブの上部に移し(材料表)、細胞をチューブの底までろ過して、残っているミエリンの破片を取り除きます。
- トリパンブルー排除色素を用いて、希釈し、精度40、41のために少なくとも2つの16平方グリッドを平均化することによって血球計算盤上で細胞を計数した。
- 目的の単一細胞解析手法に進みます。
注:様々な形態のコラゲナーゼ(すなわち、D、タイプI、タイプII、タイプIV)を用いて、免疫細胞、ミクログリア(図3)、星状細胞、周皮細胞、内皮細胞49、およびニューロン50 をすべて効率的に単離することができる。結果のために得られた有核細胞数は、滴定コラゲナーゼI酵素を使用して以下の通りであった:偽処理された脳全体= 500,000〜600,000細胞;TMEV-IDD脳全体= 800,000〜1,000,000細胞;偽処理された脊髄全体= 150,000〜200,000細胞;TMEV-IDD脊髄全体= 300,000〜400,000。細胞数は、収集、処理の精度、およびCNS炎症が存在するかどうかによって異なります。
- チューブから組織とメディアを注ぎ、メディアを含む脳または脊髄組織を100 mmペトリ皿の上部に移します。鉗子を使用して、組織をペトリ皿の底に移動します。滅菌かみそりの刃で脳または脊髄を細かく刻みます。かみそりの刃を使用して、細かく刻んだ組織をこすりながらプレートの底に移動し、組織を集めます。
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Representative Results
この代表的な実験は、B細胞とT細胞を定量化し、恒常性状態における髄膜および実質CNSコンパートメントおよびマウス進行性MSモデル(すなわち、TMEV-IDD)におけるB細胞およびT細胞の局在を記述することを目的としていました。TMEV-IDDは、前述のようにTMEV BeAnの5 x 106 プラーク形成ユニット(PFU)による頭蓋内感染によって5週齢の雌SJLマウスで誘導されました29。
本研究では、感染後120日目の慢性TMEV-IDD中の髄膜、脳、および脊髄のB細胞とT細胞を評価しました。年齢を一致させた偽処理マウスを対照として用いた。この研究は2つの実験で構成されていました。1つ目は、細胞表面および/または細胞内抗原(n = 4偽処理、n = 5 TMEV-IDD)を評価することによって細胞組成を分析および定量するための確立された技術であるフローサイトメトリー評価用の単一細胞懸濁液の取得に焦点を当てました。2番目の実験は、脱灰された脳および脊髄組織(n = 3偽治療、n = 8 TMEV-IDD)の免疫組織化学を利用して、CNSコンパートメントにおけるB細胞およびT細胞の局在を記述することに焦点を当てた。
TMEV-IDDおよび偽治療マウスから脳、脊髄、およびプール髄膜(脳および脊髄)から単一細胞懸濁液を単離した後、表面染色プロトコルをすべてのサンプルに適用しました。簡単に説明すると、単一細胞懸濁液を固定可能な生存率排除染色(780)とともに15分間インキュベートし、洗浄し、マウス血清の存在下でFcブロックで15分間ブロッキングし、CD45を含む細胞表面マーカーに対する結合抗体で染色した(30-F11;PerCP-Cy5.5)、CD19(1D3;PE-CF594)、およびCD4(GK1.5;PE)を前述のように30分間28、29分間投与する。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメーター28、29を用いて分析した。生存率ゲーティングは、前述のように実施した28。CD45発現を評価して、CD45hi末梢由来浸潤免疫細胞(P1)をCD45loミクログリア(P2)および脳および脊髄のCD45-ニューロン、星状細胞、および希突起膠細胞(P3;図3A)。偽治療マウスでは、脊髄および脳組織にCD45hi細胞はほとんど存在しなかった。髄膜では、脳および脊髄データに使用されたCD45 hi発現に対する同じゲーティングカットオフを適用して、CD45hi免疫細胞を同定した(P1;図3C)髄膜に存在する非免疫細胞(すなわち、線維芽細胞、内皮細胞)を除外する。偽治療マウスでは、髄膜にCD45hi細胞(<0.1%)がほとんど存在しなかった。TMEV-IDD CNS組織におけるCD45hi免疫細胞のうち、CD19およびCD4の表面発現により、それぞれB細胞およびCD4 T細胞が同定された(図3B–D)。すべてのTMEV-IDD CNS組織において、偽処理マウスと比較してCD45hi免疫細胞の割合の増加が観察された(図4A)。慢性TMEV-IDDの間、脳および脊髄のCD45hi免疫細胞のうちB細胞の割合は髄膜コンパートメントと比較して高かった(図4B)。
慢性TMEV−IDD中のCNSコンパートメント内のB細胞およびT細胞の局在を同定するために、脱灰した脳および脊髄を、前述の染色プロトコルを用いた免疫組織化学を用いて評価した29。髄膜および血管系は、基底膜成分29,51および線維芽細胞網状細胞マーカー52,53であるER-TR7を用いて画定した。頭蓋骨からの脳の従来の抽出の間、軟膜層は無傷であったが、残りの髄膜層は除外された(図5A)。脊髄では、水圧押し出しにより、すべての髄膜層が欠如した(データは示さず)。脱灰した脳と脊髄の両方で、すべての髄膜層は無傷でした(図5B)。慢性TMEV-IDDにおけるB細胞およびT細胞の局在を調べるために、IgG発現を使用してアイソタイプスイッチB細胞の局在を決定し29、CD3を使用してすべてのT細胞29を視覚化しました。IgGをER-TR7で共染色したところ、アイソタイプスイッチIgG+ B細胞がCNS実質と髄膜に存在することが明らかになりました(図6A)。ER-TR7+髄膜内の細胞凝集塊には、複数のIgG+ B細胞とCD3+ T細胞が含まれていました(図6B)。
代表的な結果は、年齢を一致させた偽治療マウスとは対照的に、慢性TMEV-IDDマウスの実質および髄膜コンパートメントにおけるB細胞およびT細胞の両方の高い割合を示しています。IHC分析はさらに、TMEV-IDD組織では、B細胞とT細胞が実質に分散しているが、髄膜では密接に関連しており、炎症性凝集体を形成していることを示しました。進行性MS患者では、髄膜炎症性凝集体は、隣接する組織損傷および疾患転帰の悪化と関連している。慢性TMEV-IDDでは、CNSコンパートメント内の持続的なB細胞およびT細胞の存在および髄膜内の凝集が、組織損傷および疾患の進行に関連している可能性があります。髄膜炎症と実質炎症が脱髄、神経変性、および臨床的障害にどのように影響するかを理解するには、さらなる研究が必要です。
図1:脱灰のために脳と脊髄を隔離する。 青い点線は、無傷の頭蓋骨(カット1〜4)と脊柱(カット5〜8)で脳を隔離するために行われたカットを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単一細胞技術のための脳、脊髄、髄膜の分離。 (A)青い点線は、無傷の髄膜と脳(切り傷1〜3)および脊柱(切り傷5〜7)で頭蓋骨キャップを分離するために行われた切り傷を示します。頭蓋骨の両側に横方向のカット3が作られています。(B)青い線は、頭蓋骨キャップの髄膜をスコアリングして除去するために行われた切開と、脊髄と髄膜を分離するために脊柱(両側)に行われた切断を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CNS組織におけるCD45hi浸潤免疫細胞の同定。(A)偽治療(赤)またはTMEV-IDD(青)マウスの脊髄の全生細胞の中から、CD45hi浸潤免疫細胞(P1)、CD45loミクログリア(P2)、およびCD45-希突起膠細胞、星状細胞、およびニューロンを同定するためのゲーティング戦略。最小限のCD45hi細胞が偽処理された脳と脊髄で検出されました。(B)TMEV-IDDマウスのCD45hi浸潤免疫細胞(P1)の中からCD19+ B細胞およびCD4+ T細胞を同定するためのゲーティング戦略。ゲーティング戦略は、脳組織と脊髄組織で類似していた。(C)偽治療マウス(赤)および慢性TMEV-IDDマウス(青)の髄膜におけるCD45hi細胞(P1)を同定するためのゲーティング戦略。(D)慢性TMEV-IDDマウスの髄膜におけるCD45hi浸潤免疫細胞(P1)の中からCD19+ B細胞およびCD4+ T細胞を同定するためのゲーティング戦略。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:慢性TMEV-IDDにおける中枢神経系組織におけるCD45hi 免疫細胞およびCD19+ B細胞の増加。偽治療またはTMEV-IDD髄膜、脳、および脊髄から得られたフローサイトメトリーデータの棒グラフの要約は、CD45hi 浸潤免疫細胞の割合(A)またはCD19+ B細胞の割合(B)を示しています。TMEV-IDD組織については、5匹のマウスからフローサイトメトリーデータを取得し、脊髄と脳を個別に処理し、髄膜を分析のためにプールしました。偽治療マウスについては、フローサイトメトリーデータを4匹のマウスから取得し、脊髄と脳を個別に処理し、髄膜を分析のためにプールしました。脊髄と脳のデータはSEM±平均として示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:脱灰された脳と脊髄の無傷の髄膜層。 (A)頭蓋骨キャップから抽出した脳、または(B)慢性TMEV-IDDマウスから無傷の頭蓋骨と脊柱を備えた脱灰した脳を、DAPI(青)、髄膜マーカーのラミニン(緑)、およびER-TR7(赤)について評価しました。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:免疫細胞の凝集は、慢性TMEV-IDD中の髄膜で明らかでした。 (A)慢性TMEV-IDDマウスの脱灰脊柱をIgG(緑)の存在について調べ、実質およびER-TR7+髄膜(赤)のアイソタイプスイッチ免疫細胞を同定しました。(B)CD3+ T細胞(緑)とIgG+アイソタイプスイッチB細胞(赤)をER-TR7+髄膜と共染色して、脊髄組織内の局在を評価しました。白い矢印は、髄膜内のB細胞とT細胞を強調しています。スケールバー = 50 μm。白いボックスは、トリミングされた画像用に選択された領域を示しています(右、スケールバー= 10 μm)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ホメオスタシスおよび疾患中のCNSコンパートメント内の細胞組成を評価する方法は、CNSの生理学的および病理学的状態を理解するために不可欠である。しかし、CNSの重要なバリアとして機能し、多様な免疫細胞を収容しているにもかかわらず、脳および脊髄の多くの従来の組織抽出方法ではこれらの膜の収集が不可能であるため、髄膜は分析から除外されることがよくあります。この省略は、髄膜の細胞組成と機能、および定常状態と炎症状態におけるその役割についての理解を深める上での重大な制限です。最近の研究により、髄膜コンパートメントに存在する常在免疫細胞と末梢由来免疫細胞の両方が、中枢神経系の恒常性を維持し、中枢神経系疾患の病態を駆動する上で重要な役割を果たしていることが明らかになりました。これらの研究は、実質コンパートメントだけでなく、周囲の髄膜層も分析する必要性を強調しています。ここに記載されているプロトコルは、髄膜を維持しながら脳と脊髄を迅速に分離することを可能にし、最終的には組織学的研究と単一細胞研究の両方を利用してCNSコンパートメントの包括的な下流分析を可能にします。代表的な結果は、CNSコンパートメント内の免疫細胞の評価に焦点を当てています。しかしながら、プロトコルは、ミクログリア、星状細胞、ニューロン、周皮細胞、内皮細胞、または他のCNS常在細胞を分析するように適合され得る。
記載された方法における重要なステップは、脳、脊髄、および髄膜から純粋な単一細胞懸濁液を単離し、無傷の頭蓋骨または脊柱のいずれかを有するCNS組織を得るために不可欠な組織の慎重な抽出であり、高品質の組織形態を可能にする。単一細胞懸濁液を得るための技術を実践することは、サンプルの純度を高めるだけでなく、ダウンストリームアプリケーションの細胞収量も向上させるため、組織抽出を成功させるための鍵です。同様に、無傷の頭蓋骨または脊柱を有するCNS組織を単離して骨周囲の余分な組織を適切に除去することは、高品質の形態および無傷の抗原標的を有する組織切片を得るためのすべての重要な要素である組織のより良い固定、脱灰、および凍結保存を確実にするために不可欠なステップである。
髄膜から単一細胞懸濁液を単離するためのプロトコルの1つの制限は、硬膜およびくも膜髄膜32,54の取得に焦点を当てている一方で、星状細胞プロセスを介して脳または脊髄に付着したままのピアスの単離を省略していることです。軟膜に存在する細胞は髄膜コンパートメントの必須成分であるが、それを適切に単離するのに膨大な時間を要するため、単一細胞懸濁液調製中に軟膜を除外することが決定された55。同様に、プロトコルは頭蓋骨の上部分の髄膜を得ることにのみ焦点を当てており、脳および脈絡叢における陥入髄膜の分離を除外している。陥入髄膜および脈絡叢の収集は、時間のかかる手順であるが、以前に公開されたプロトコル55に従って実施することができる。どちらの場合も、髄膜層の一部を省略するという選択は、それらを分離するのに必要な時間によるものでした。フローサイトメトリー、細胞培養アッセイ、RNAシーケンシング(RNAseq)などのダウンストリームアプリケーションに必要なシングルセル懸濁液を調製するために使用されるプロトコルのタイミングは、細胞の生存率とデータ品質を向上させるために重要です。したがって、特定の研究課題に応じて、サンプルの分離時間と髄膜の抽出の完全性のバランスをとる必要があります。現在のプロトコルでは、硬膜およびくも膜髄膜からの単一細胞懸濁製剤のみが得られ、その結果をCNS髄膜全体に外挿する能力が制限される。ただし、これらの方法を、髄膜の3層を持つ組織切片全体のIHCまたはISH分析と組み合わせて使用 すると、実質および髄膜コンパートメントの細胞および分子動態をより完全に理解できます。
プロトコルの別の制限は、特に恒常性状態の間に、硬膜およびくも膜髄膜から得られる低い細胞数である。しかしながら、脊髄、脳、または髄膜の細胞数が特定の標的細胞集団の分析には低すぎると考えられる場合、その分析に必要な最小細胞数は、希少事象分析に特化した先行文献に記載されているように、所与の精度(例えば、5%変動係数)に必要な事象の総数を推定することによって決定することができる56.次に、これらの計算を使用して、目的の細胞集団を分析するのに十分な細胞数を取得するために、複数の動物からのサンプルをプールする必要があるかどうかを判断できます。
記載された方法は、一般的に無視されている髄膜コンパートメントを含むように分析を拡張することにより、CNSコンパートメント内の細胞動態の調査に不可欠な進歩を提供します。これらのプロトコルにより、脳、脊髄、硬膜およびくも膜髄膜を個別に抽出して、単一細胞懸濁液を生成できます。さらに、脱灰プロトコルにより、3つの髄膜層を含む脳または脊髄組織を含む組織切片の組織学的分析が可能になります。EDTAを利用することで、ゆっくりとした穏やかな脱灰プロセスが得られ、高品質の組織形態が要求される標本(IHCやISHなど)に最適です。このプロトコルでは、7.2〜7.4のpHを使用して脱灰速度を遅くし、無傷の組織形態の維持を保証し、脱灰時間が短いが組織形態の質に影響を与える強酸および弱酸(塩酸やトリクロロ酢酸など)よりも明らかに有利です。
髄膜から単一細胞懸濁液を単離しようとする将来の方法は、CNS組織および脳内の陥入髄膜から髄膜層を完全に分離するために必要な時間を短縮するためのプロトコルの開発に焦点を当てるべきである。3つの髄膜層の完全な複合体を取得すると、分析のための細胞数が増えるだけでなく、CNSを囲む髄膜を占有する常在免疫細胞と浸潤免疫細胞のより包括的な評価も提供されます。同時に、脱灰された脳と脊髄の準備に焦点を当てた将来のプロトコルは、組織形態の質を維持しながら組織の脱灰を促進することを目的とした新しい薬剤を特定することを目指すべきです。しかし、全体として、二重およびくも膜髄膜を含むCNS単一細胞懸濁液を分析する下流アプリケーションは、包括的な組織切片分析と組み合わせて実行され、CNSコンパートメント内の細胞表現型、機能、および局在の詳細な理解を提供することができる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、ダートマスの比較医学研究センター(CCMR)のスタッフに、これらの研究に使用されたマウスの専門家によるケアに感謝しています。ボルンシュタイン研究基金はこの研究に資金を提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | any | N/A | |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | 37002D | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-12R centrifuge | |
| Collagenase I | Worthington | LS004196 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 525-1069 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Cover glass | Hauser Scientific | 5000 | |
| Cryomold | VWR | 18000-128 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-14 | |
| Disposable polystyrene tube, 14 mL | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| Disposable Scalpel | Fisher Scientific | NC0595256 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dry ice | Airgas | N/A | |
| Durmont #7Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco | 0105-500g | |
| Ethanol, 100% | any | N/A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Filter top tube, 5 mL | VWR | 352235 | |
| Fixable viability stain 780 | Becton Dickinson | 565388 | |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-546-146 | |
| Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-586-146 | |
| Goat anti-rabbit 488 | Jackson immunoresearch | 111-545-144 | |
| Goat anti-rat 594 | Jackson immunoresearch | 112-585-167 | |
| Goat anti-rat 650 | Jackson immunoresearch | 112-605-167 | |
| Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
| Hemacytometer | Andwin Scientific | 02-671-51B | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| KCl | Fisher chemical | BP366-500 | |
| KH2PO4 (anhydrous) | Sigma Aldrich | P5655-100G | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | N/A | |
| Mouse FC block (CD16/32) | Becton Dickinson | 553141 | |
| Na2HP04 (anhydrous) | Fisher Chemical | S374-500 | |
| NaCl | Fisher chemical | S671-500 | |
| Needle, 25 gauge | Becton Dickinson | 305122 | |
| Normal mouse serum | ThermoFisher Scientific | 31881 | |
| Nylon mesh strainer | VWR | 352350 | |
| OCT | Sakura | 4583 | |
| Paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Diluted to 4% using 1 x PBS |
| Pasteur pipette, 9 inch, unplugged | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBS (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| PE Rat Anti-Mouse CD4 | Becton Dickinson | 553730 | |
| PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 | Becton Dickinson | 562329 | |
| Percoll density gradient media | GE healthcare | 17-0891-01 | |
| PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 | Becton Dickinson | 550994 | |
| Petri dish, 100 mm | VWR | 353003 | |
| pH meter | Fisher Scientific | 13-636-AB150 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Corporation | 4-000-101 | |
| Pipette 200 µl | Gilson | FA10005M | |
| Pipette tips, 1 mL | USA Scientific | 1111-2831 | |
| Pipette tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1816 | |
| Pipette, 1 mL | Gilson | FA10006M | |
| Prolong Diamond mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36962 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | Becton Dickinson | 553141 | |
| Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) | Abcam | ab16669 | |
| Rabbit anti-mouse laminin | Abcam | ab11575 | |
| Rat anti-mouse ERT-R7 | Abcam | ab51824 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Serological pipet, 1 mL | VWR | 357521 | |
| Serological pipet, 10 mL | VWR | 357551 | |
| Serological pipet, 5 mL | VWR | 357543 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-500 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-16 | |
| Surgical scissors, extra fine | Roboz | RS-5882 | |
| Syringe, 10 mL | Becton Dickinson | 302995 | |
| Syringe, 5 mL | Becton Dickinson | 309646 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| Vacuum filter system | Millipore | 20207749 | |
| Vacuum flask | Thomas Scientific | 5340-2L | |
| Vacuum in-line filter | Pall Corporation | 4402 | |
| Vacuum line | Cole Palmer | EW-06414-20 | |
| Water bath | ThermoFisher Scientific | Versa bath |
References
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