Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av vev i sentralnervesystemet og tilhørende meninger for nedstrømsanalyse av immunceller

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

Denne artikkelen presenterer to optimaliserte protokoller for å undersøke bosatt og perifert avledede immunceller i sentralnervesystemet, inkludert hjernen, ryggmargen og hjernehinnene. Hver av disse protokollene bidrar til å fastslå funksjonen og sammensetningen av cellene som opptar disse rommene under steady state og inflammatoriske forhold.

Abstract

Sentralnervesystemet (CNS) består av hjernen og ryggmargen og er innhyllet av meningene, membranøse lag som tjener som en barriere mellom periferien og CNS. CNS er et immunologisk spesialisert sted, og i steady state forhold er immunprivilegiet mest tydelig i CNS-parenkymet. I motsetning til dette har meningene et mangfoldig utvalg av bosatt celler, inkludert medfødte og adaptive immunceller. Under inflammatoriske tilstander utløst av CNS-skade, autoimmunitet, infeksjon eller til og med nevrodegenerasjon, kan perifert avledede immunceller komme inn i parenkymet og ta bolig i hjernehinnene. Disse cellene antas å utføre både gunstige og skadelige handlinger under patogenesen av CNS-sykdommen. Til tross for denne kunnskapen blir meningene ofte oversett når man analyserer CNS-rommet, fordi konvensjonelle CNS-vevsekstraksjonsmetoder utelater meningeallagene. Denne protokollen presenterer to forskjellige metoder for rask isolering av murine CNS-vev (dvs. hjerne, ryggmarg og meninger) som er egnet for nedstrømsanalyse via enkeltcelleteknikker, immunhistokjemi og in situ hybridiseringsmetoder. De beskrevne metodene gir en omfattende analyse av CNS-vev, ideell for å vurdere fenotype, funksjon og lokalisering av celler som opptar CNS-rommet under homeostatiske forhold og under sykdomspatogenese.

Introduction

Sentralnervesystemet (CNS) er et immunologisk spesialisert sted. CNS-parenkymet, unntatt CSF-rommet, hjernehinnene og vaskulaturen, blir klassisk sett på som et immunprivilegert sted 1,2,3,4,5 og er relativt blottet for immunceller under homeostatiske forhold 2,6,7. I motsetning til dette er meningene, som består av dura-, arachnoid- og pia-lagene, avgjørende komponenter i CNS-rommet, som aktivt deltar i homeostatisk immunovervåking og inflammatoriske prosesser under sykdomspatogenesen 3,6,7,8. Under steady state-forhold støtter hjernehinnene mange immunsentinelceller, inkludert medfødte lymfoide celler (ILC), makrofager, dendrittiske celler (DC), mastceller, T-celler, og i mindre grad B-celler 9,10,11.

Meningene er svært vaskulariserte strukturer og inneholder lymfekar som gir en lymfatisk forbindelse mellom CNS og dens periferi 8,12,13,14. Ved inflammatoriske tilstander indusert av CNS-skade, infeksjoner, autoimmunitet eller til og med nevrodegenerasjon, infiltrerer perifert avledede immunceller parenkymet og endrer immunlandskapet i meningene. Etter celleinfiltrasjon kan meningene representere en funksjonell nisje for perifert avledede immunceller, fremme immuncelleaggregering, lokal immuncelleaktivering og langsiktig overlevelse i CNS-rommet. Fremtredende meningeal betennelse er observert i flere sykdommer som påvirker CNS, inkludert multippel sklerose (MS) 15,16,17,18,19, hjerneslag 20,21, steril skade 22,23 (dvs. ryggmargsskade og traumatisk hjerneskade), migrene 24 og mikrobiell infeksjon 25,26,27,28,29. Dermed er karakteriseringen av residente celler og perifert avledede immunceller i meningealrommet avgjørende for å forstå rollen til disse cellene under steady state tilstander og sykdomspatogenese.

Ekstraksjon av hjerne, ryggmarg og hjernehinner fra kranium og virvellegemer er teknisk utfordrende og tidkrevende. Det er for tiden ingen teknikker tilgjengelig for rask ekstraksjon av hjernen med alle tre meningeal lagene intakt. Mens laminektomi gir utmerket ryggmargsvevsmorfologi og bevarer meningeallagene, er det både ekstremt tidkrevende og komplisert30,31. Omvendt letter mer konvensjonelle ekstraksjonsmetoder som fjerning av hjernen fra kraniet og hydraulisk ekstrudering av ryggmargen rask ekstraksjon av CNS-vevet, men både arachnoid og dural meninges går tapt med disse teknikkene30,31. Utelatelse av dura og araknoide lag under konvensjonell isolering av hjerne- og ryggmargsvev resulterer i en ufullstendig analyse av cellene i CNS-rommet. Dermed er identifiseringen av nye teknikker fokusert på rask ekstraksjon av CNS-vev med intakte meninger avgjørende for optimal analyse av CNS-rommet.

Dette manuskriptet presenterer to metoder for rask ekstraksjon av hjerne, ryggmarg og hjernehinner fra mus, noe som letter nedstrømsanalysen av residente celler og perifert avledede immunceller i CNS-parenkymet og meningene. Disse optimaliserte protokollene fokuserer på 1) isolering av enkeltcellesuspensjoner for nedstrømsanalyse og 2) klargjøring av vev for histologisk behandling. Oppnåelse av enkeltcellede suspensjoner fra hjernen, ryggmargsvev og durale og araknoide meninger32 muliggjør samtidig analyse av celler som bor i både parenkymale og meningeale rom. Enkeltcellesuspensjoner kan brukes i forskjellige applikasjoner, inkludert cellekulturanalyser for å utføre in vitro-stimulering 33, enzymbundet immunospot (ELISpot) 28,34,35, flowcytometri 36,33 og enkeltcelle 37 eller bulktranskriptomikk. I tillegg tillater den optimaliserte protokollen for avkalkning av hele hjerner og ryggmarger med henholdsvis intakte hodeskaller eller vertebrale kolonner en mild avkalkning av det omkringliggende beinet, slik at meningene er intakte og opprettholder vevsmorfologien. Denne metoden muliggjør selektiv identifisering av proteiner eller RNA ved bruk av immunhistokjemi (IHC) eller in situ hybridisering (ISH) teknikker innenfor både parenkym- og meningealrom. Karakteriseringen av fenotype, aktiveringstilstand og lokalisering av residente celler og perifert avledede immunceller i CNS kan gi informasjon som er avgjørende for å forstå hvordan individuelle celletyper i CNS-rommet bidrar til homeostase og sykdomspatogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt dyrearbeid benytter protokoller som er gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Geisel School of Medicine i Dartmouth.

1. Behandling av hjerne- og ryggmargsprøver for avkalkning

  1. Isolering av hjerne- og ryggmargsprøver
    1. Avlive musen via CO2 -innånding. Sørg for at CO2 -strømningshastigheten fortrenger 10%-30% av merdvolumet per minutt.
    2. Bruk tang, løft xiphoid-prosessen, og kutt bukveggen lateralt like under ribbeholderen med saks, trekk opp for å unngå å kutte underliggende blodkar eller organer. Skjær gjennom membranen sideveis.
    3. Klipp ribbeholderen langs sidekantene parallelt med lungene opp til kragebeinet. Bruk tang, løft brystbenet og klem brystbenet med en hemostat. Plasser hemostaten over hodet for å løfte brystkassen bort og avsløre hjertet.
    4. Bruk tang, ta tak i hjertet nær toppunktet og gjør et snitt i høyre atrium i hjertet for å gi et utløp. Sett inn en 25 G kanyle med en 10 ml sprøyte festet for sakte å administrere 10 ml iskaldt 1x fosfat bufret saltvann (PBS) inn i venstre ventrikkel for å transkardielt perfisere musen.
      MERK: Perfusjon bør skje over 4-5 minutter til leveren er tømt for blod. Totalt 10 ml 1x PBS er vanligvis nok til perfusjon, men mer kan utnyttes om nødvendig. En klar lever indikerer vanligvis tilstrekkelig perfusjon.
    5. Bruk skarp saks til å fjerne hodet ved halshugging (figur 1; 1). Gjør et midtlinjesnitt i huden (figur 1; 2) og snu huden over øynene for å frigjøre skallen.
    6. Skjær i nesebenet for å frigjøre kjeven fra skallen (figur 1; 3). Fjern mandibelen, tungen og øynene. Skjær langs de laterale aspektene av skallen for å frigjøre vevet langs den eksterne øregangen (figur 1; 4). Trim for å fjerne all overflødig hud, muskler og vev som ligger over skallen.
    7. Separer ribbeholderen fra ryggsøylen ved å kutte parallelt med ryggraden med skarp saks (figur 1; 5 og 6). Lag et lite kutt i det nedre lumbalområdet for å isolere ryggsøylen (figur 1; 7). Trim og fjern eventuell gjenværende muskel langs ryggraden for å eksponere ryggvirvlene (figur 1; 8).
      MERK: Fjerning av overflødig vev fra ryggsøylen og skallen er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig penetrasjon av fikserende paraformaldehyd (PFA) og etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) avkalkningsbuffer.
  2. Postfiksering, avkalking og kryopreservering
    1. Bruk tang til å plassere hjernen med den intakte skallen eller ryggsøylen i et 15 ml konisk rør inneholdende 10 ml 4% PFA. Plasser slangene ved 4 °C i minst 48 timer for tilstrekkelig fiksering.
      MERK: For å unngå overfiksering av vevet, må du ikke overstige 72 timer fiksering. Fikseringstider forlenges for beinprøver før avkalkning. Tilstrekkelig fiksering vil beskytte vevet mot virkningene av avkalkningen og sikre bedre vevsmorfologi.
    2. Skyll hjernen eller ryggmargen ved å fjerne vevet fra 4% PFA med tang og plassere vevet i et engangs 14 ml rør med 10 ml 1x PBS i 5 minutter. Overfør hjernen eller ryggmargen til et 50 ml konisk rør med 10 ml 10% EDTA (pH = 7,2-7,4).
      MERK: Bruk av et større rør med 10 ml EDTA gir EDTA et større kontaktområde med vevet og akselererer avkalkningsprosessen.
    3. Sjekk daglig om beinet er mykt og bøyelig: fjern vevet fra EDTA-løsningen med tang, legg det på en petriskål og test forsiktig benmykheten med en 25 G nål. Hvis nålen lett trenger inn i beinet, er avkalkningsprosessen fullført.
    4. Fjern vevet fra EDTA-oppløsningen og overfør hjernen eller ryggmargen til et 14 ml engangsrør inneholdende 10 ml 1x PBS og vask i 10 minutter. Gjenta vasken.
      MERK: Avkalkning tar vanligvis 2-3 dager. Løsningen bør endres hver 2-3 dager dersom beinet ennå ikke er tilstrekkelig avkalket. Imidlertid kan langvarig inkubasjon i EDTA etter at beinet har blitt avkalket skade vevsmorfologien.
    5. Forbered 10%, 20% og 30% sukroseløsninger ved å tilsette sukrose til 1x PBS. For eksempel, for 10% sukrose, tilsett 10 g sukrose og bring volumet til 100 ml ved bruk av steril 1x PBS. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C i opptil 1 måned.
      MERK: Sukroseløsninger er utsatt for mikroorganismevekst, så prøver bør ikke lagres i lengre perioder i disse løsningene.
    6. Fjern vevet fra 1x PBS, legg det i 10 ml 10% sukroseoppløsning og oppbevar det ved 4 °C. La vevet sitte i 24 timer eller til det synker til bunnen av røret.
    7. Gjenta denne prosessen, flytt vevet til en 20% sukroseløsning først og til slutt til en 30% sukroseløsning. La vevet synke i 30% sukrose (minst 24 timer) og fortsett til vevsfostring.
  3. Vevsinnbygging og frysing
    1. Bruk tang, fjern vevet fra 30% sukrose, legg det på en petriskål og vipp fatet for å kvitte seg med overflødig sukroseoppløsning på vevet. Bruk en skalpell, kutt vevet i ønskede segmenter.
    2. Lag et tynt lag med optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse i bunnen av kryomold og plasser vevstykket (e) i formen. Dekk vevet helt med OCT-forbindelsen, og sørg for at ingen bobler er tilstede.
    3. Blitsfrys blokkene ved å sveve over flytende nitrogen38 eller sette blokkene på en 100% isopropanol / tørrisoppslemming39 til blokken er ugjennomsiktig. Pakk kryomoldene inn i aluminiumsfolie og oppbevar blokkene ved -80 °C for langtidsoppbevaring. Flytt blokker til -20 °C før seksjonering.
      MERK: Det må utvises forsiktighet ved seksjonering og utførelse av histologiprotokoller på avkalkede hjerner, da hodeskallen og meningeallagene kan gå tapt hvis seksjonene håndteres grovt.

2. Fremstilling av meningene og CNS-vevene for farging av flowcytometri

  1. Trekker ut hodeskallehetten og hjernen
    1. Bruk skarp saks til å fjerne hodet ved halshugging (figur 2A; 1). Bruk en saks til å lage et midtlinjesnitt i huden (figur 2A; 2) og snu huden over øynene for å frigjøre skallen.
    2. Plasser saksen i foramen magna og begynn å kutte skallen lateralt langs cortices mot olfaktorisk pære, holde snittene over den eksterne auditive meatus og mandible (figur 2A; 3). Utfør de samme kuttene på motsatt side, med kutt som møtes ved luktepæren for å frigjøre skallehetten fra hjernen (figur 2A; 3).
    3. Bruk tang, riv av hodeskallehetten og plasser hodeskallehetten i et 15 ml konisk rør inneholdende 5 ml kaldt RPMI-medium tilsatt 25 mM HEPES. Hold røret på is.
    4. Bruk buede tang, plasser tangen under bunnen av hjernen, og løft for å frigjøre hjernen fra skallehetten. Plasser hjernen i et 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml kald RPMI supplert med 25 mM HEPES. Hold røret på is til behandling.
  2. Ekstrahering av vertebral kolonne og ryggmargsvev
    1. Bruk tang og skarp saks til å skille brystkassen fra ryggsøylen ved å skjære parallelt med ryggraden (figur 2A; 4 og 5). Lag et lite kutt i det nedre lumbalområdet for å isolere virvelsøylen (figur 2A; 6). Trim og fjern eventuelle gjenværende muskler langs ryggraden for å eksponere ryggvirvlene (figur 2A; 7).
    2. Plasser den ekstra fine kirurgisaksen i virvelsøylen og klipp langs sidekanten av søylen (figur 2C). Klipp motsatt sidekant helt for å dele vertebral kolonnen i en fremre og bakre del.
      MERK: Ryggmargen vil forbli festet til vertebral kolonnen.
    3. Bruk tang, fjern ryggmargen sakte og forsiktig fra virvelsøylen og plasser vevet i et 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml kald RPMI med 25 mM HEPES. Overfør de fremre og bakre delene av ryggsøylen til et 15 ml konisk rør inneholdende 5 ml kald RPMI med 25 mM HEPES.
  3. Fjerning av hjernehinnene for å forberede encellede suspensjoner
    1. Bruk tang, fjern hodeskallehetten fra RPMI-mediet. Bruke skarp tang (#7 tang; Materialfortegnelse), skår rundt ytterkanten av skallehetten (figur 2B) og riv hjernehinnene vekk fra kanten av skallehetten, skrap for å fjerne durale og araknoide meninger. Legg hjernehinnene på en petriskål.
      MERK: Fjerning av hjernehinnene fra både hjernen og ryggmargen krever praksis. Hvis brukeren opplever problemer med å trekke ut meningene, bruke en dissekere mikroskop for å hjelpe til med fjerning.
    2. Fjern vertebral kolonnen fra røret. Bruk skarpe tang, score rundt kantene på vertebral kolonnen for å frigjøre meninges og peel bort meninges fra kanten av vertebra ved hjelp av buede tang. Legg hjernehinnene på en petriskål.
    3. Plasser en nylonnettsil i et 50 ml konisk rør. Flytt meningene inn i silen og tilsett 3 ml RPMI supplert med 25 mM HEPES. Bruk stempelet fra en 5 ml sprøyte til å slipe vevet og mediet gjennom silen.
    4. Bruk en 5 ml serologisk pipette til å vaske silen med ytterligere 2 til 3 ml RPMI/HEPES-medier til alt synlig vev har passert gjennom silen.
      MERK: For å oppnå tilstrekkelig celletall for flowcytometrisk analyse, kan det være nødvendig å slå sammen meninger fra flere dyr. I dette forsøket (figur 3 og figur 4) ble hjerne- og ryggmargshjernehinnene fra 4–5 mus slått sammen. Hvis prøvene er samlet, vil det være nødvendig med ytterligere medier for å male vevet gjennom nylonnettsilen for å forhindre overoppheting av vevet.
    5. Bruk en 10 ml serologisk pipette til å overføre cellene og mediet til et nytt 15 ml konisk rør. Bruk en 10 ml serologisk pipette til å vaske det 50 ml koniske røret med 5 ml medier for å samle opp eventuelle gjenværende celler. Sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletere cellene.
    6. Bruk en Pasteur-pipette med vakuum, aspirer supernatanten, pass på å unngå cellepelleten og resuspender cellene i et passende volum og buffer.
    7. For å telle enkeltcellesuspensjonen, fortynn et lite volum av cellene (dvs. 5-10 μL) ved hjelp av trypanblått ekskluderingsfargestoff (1:10 fortynning) og RPMI. Tilsett 10 μL av fortynningen til hemocytometeret.
    8. Tell cellene som tidligere beskrevet40,41, i gjennomsnitt minst to 16 kvadratrutenett for nøyaktighet.
      MERK: I figur 3 ble for eksempel samlede, pelleterte celler fra meningene resuspendert i 250 μL fluorescensaktivert cellesorteringsbuffer (FACS) (1x PBS med 1% FBS) for nedstrøms overflatefarging. Cellene ble fortynnet 1:10 for telling (5 μL-celler, 5 μL trypanblått, 40 μL RPMI). Denne fortynningen ga mellom 50-100 celler per 16 kvadratiske rutenett, noe som sikrer mer nøyaktig celletelling fordi cellene verken er for tette og overlappende eller for sparsomme. Kjernecelletall fra hjerne- og ryggmargshjernehinner per mus var som følger: For hjernehinner fra humbugbehandlede mus = 100 000–150 000 celler og for hjernehinner fra Theilers murine encefalomyelittvirusindusert demyeliniserende sykdom (TMEV-IDD) mus = 300 000–350 000 celler. Celletall vil variere avhengig av presisjonen av innsamling, behandling, og hvis meningeal betennelse er tilstede.
    9. Fortsett til ønsket enkeltcelleteknikk som en FACS-overflate (figur 3) 14,36,42,43,44, intracellulære fargeprotokoller 33,45, in vitro-stimulering, cellekulturanalyser 33,46,47, ELISPOT-analyse 28,34,35 og bulk eller enkeltcelle transkriptomikk 37,48.
      MERK: Hold alle rør på is mellom behandlingstrinnene.
  4. Forbereder enkeltcellede suspensjoner av hjerne- og ryggmargsvev
    1. Overfør hjernen eller ryggmargsvevet med media til toppen av 100 mm petriskålen ved å helle vev og media fra røret. Bruk tang, flytt vevet til bunnen av petriskålen. Finhakk hjernen eller ryggmargen med et sterilt barberblad. Bruk barberbladet, flytt hakket vev til bunnen av platen ved å skrape for å samle vevet.
      MERK: For den enzymatiske fordøyelsesprotokollen nedenfor kan opptil to ryggmarger slås sammen for behandling. Hjerner skal behandles individuelt.
    2. Bruk en 5 ml serologisk pipette til petriskålen tilsett 3 ml RPMI supplert med 10 % kalveserum (FCS). Bruk en 10 ml serologisk pipette, pipette opp og ned for å resuspendere vevet i mediet og overføre til et 15 ml konisk rør.
      MERK: Hvis nedstrømsapplikasjonen er enkeltcelle- eller bulk-RNA-sekvenseringsanalyse eller cellekultur, bør FCS-partier testes for å sikre at celler ikke aktiveres før analyse. Alternativt kan celler behandles ved hjelp av 1x PBS med 0,04% BSA i stedet for RPMI med 10% FCS.
    3. Bruk en 10 ml serologisk pipette til å vaske petriskålen med ytterligere 2 ml medier for å samle opp eventuelt gjenværende vev og overføre til en konisk tube for et totalt volum på 5 ml. Hold rørene på is mellom behandlingstrinnene.
    4. Bruk en pipette til å resuspendere kollagenase I-pulveret i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-medier for å oppnå ønsket konsentrasjon (dvs. 100 mg/ml). Legg til kollagenase type I til det koniske røret som inneholder hakket vevsprøve for å oppnå ønsket sluttkonsentrasjon (dvs. 50 μL for 1 mg / ml).
      MERK: Høyere konsentrasjoner av kollagenase vil øke celleutbyttet, men kan spalte celleoverflatemarkører. Derfor bør kollagenase I-partier titreres for å bestemme den optimale konsentrasjonen som trengs for å oppnå det høyeste antallet levedyktige celler med alle nødvendige celleoverflatemarkører intakte. For eksempel ble kollagenase I testet ved endelige konsentrasjoner på 0,5 mg / ml, 1 mg / ml og 2 mg / ml på enkelthjerne- eller ryggmargsprøver. Cellenes levedyktighet ble bestemt ved hjelp av trypanblå eksklusjonsmetode, og celleoverflatemarkørene CD45, CD19 og CD4 ble vurdert ved flowcytometri. En 1 mg / ml konsentrasjon av kollagenase I ga det høyeste levende celletallet samtidig som alle celleoverflatemarkører av interesse ble beholdt. Dermed ble denne konsentrasjonen brukt til videre eksperimenter som undersøkte disse celletypene.
    5. Forsiktig resuspendere DNase I pulver med 0,15 M natriumklorid til ønsket stamkonsentrasjon. Tilsett den resuspenderte DNase I til det koniske røret som inneholder hakket vevsprøve for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 U / ml.
      MERK: DNase I-partier varierer etter aktivitetsenheter per ml. Konsentrasjonen som skal tilsettes vevsprøven vil endres basert på hetteglassets aktivitetsenheter per milliliter. Endelig ønsket konsentrasjon per prøve er 20 U/ml.
    6. Legg slangene i et rørstativ i et vannbad på 37 °C og rug i 40 minutter. Inverter rørene hvert 15. minutt for å blande vevet grundig med enzymer. Etter inkubering, tilsett 500 μL 0,1 M EDTA (pH = 7,2) til hvert rør for en endelig konsentrasjon på 0,01 M EDTA og inkuber i ytterligere 5 minutter for å inaktivere kollagenasen.
    7. Bruk en 10 ml serologisk pipette til å tilsette 9 ml RPMI supplert med 10 % FCS til hver tube for å bringe volumet av hvert rør til ~14,5 ml. Sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Bruk en Pasteur-pipette med vakuum, aspirer supernatanten og pass på at du ikke berører cellepelleten.
    8. Bruk en 5 ml serologisk pipette til å tilsette 3 ml isoton tetthetsoppløsning av 100 ml til røret som inneholder cellepelleten. Bruk en 10 ml serologisk pipette til å tilsette ytterligere RPMI 10 % FCS-medier for å bringe det endelige volumet til 10 ml og resuspendere cellepelleten for å skape et 30 % isotont tetthetsgradientløsningslag.
      MERK: Forbered 100 % isoton tetthetsgradientmedium på forhånd, alikot og oppbevar ved 4 °C i opptil 3 måneder. For å klargjøre 100 % stamisoton tetthetsgradientløsning, fortynn tetthetsgradientmediet (materialfortegnelsen) med tetthetsgradientmediefortynningsbuffer. Forbered tetthetsgradientmediefortynningsbufferen (80,0 g / l NaCl, 3,0 g / l KCl; 0,73 g / l Na 2 HP0 4, 0,20 g / l KH2HP04; 20,0 g /l glukose) og filtrer steriliser ved hjelp av et vakuumfiltersystem. Lag 100 % isoton tetthetsgradientløsning ved å blande 1 del tetthetsgradientfortynningsbuffer og 9 deler tetthetsgradientgradientmedier. Bland godt.
    9. Inverter og bland hvert rør godt før du legger til 70% lager isoton tetthet gradient løsning underlag. Sett inn en 1 ml serologisk pipette inneholdende 1 ml isoton tetthetsgradientoppløsning fra 70 ml i bunnen av røret. Legg sakte under 1 ml av løsningen, vær forsiktig så du ikke lager bobler. Fjern langsomt den serologiske pipetten fra røret, vær forsiktig så du ikke forstyrrer gradienten.
      MERK: For 70 % underlag skal den isotone tetthetsgradientløsningen på 100 % fortynnes til 70 % ved bruk av RPMI-medier (dvs. 7 ml 100 % isoton tetthetsgradientløsning og 3 ml RPMI-medier blandet godt). I tillegg er det viktig å skape et rent, uforstyrret 70 % underlag for fjerning av myelinrester og for å oppnå rene encellede suspensjoner ved gradientgrensesnittet etter sentrifugering.
    10. Sentrifuge ved 800 x g i 30 minutter ved 4 °C uten brems. Aspirer supernatanten, inkludert myelinrestlaget til 2-3 ml forblir i røret, og vær forsiktig så du ikke forstyrrer cellelaget. Høst cellelaget mellom 30/70 % tetthetsgradienten ved hjelp av en 1 ml pipette og overfør til et nytt 15 ml konisk rør.
    11. Bruk en 10 ml serologisk pipette til å tilsette RPMI 10 % FCS-medier for å bringe det endelige volumet til 15 ml. Sentrifuge 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
      MERK: I løpet av dette trinnet kan cellelag fra to rør samles om nødvendig. Ikke samle mer enn to rør, ellers vil cellene ikke pelletere på grunn av en mediekonsentrasjon med høy tetthet.
    12. Aspirer supernatanten forsiktig for ikke å forstyrre cellepelleten. Resuspender cellene i et passende volum / buffer for å telle cellene ved hjelp av et hemocytometer (f.eks. resuspendere en enkelt ryggmarg i 250 μL FACS-buffer for nedstrøms overflatefarging) (figur 3).
    13. Bruk en 1 ml pipette, overfør cellesuspensjonene til toppen av et filterrør (materialfortegnelse) og la cellene filtrere til bunnen av røret for å fjerne eventuelle gjenværende myelinrester.
    14. Ved hjelp av trypanblå ekskluderingsfargestoff, fortynn og telle cellene på et hemocytometer ved å gjennomsnitt minst to 16 kvadratrutenett for nøyaktighet40,41.
    15. Fortsett med ønsket enkeltcelleanalyseteknikk.
      MERK: Ved hjelp av ulike former for kollagenase (dvs. D, type I, type II, type IV), immunceller, mikroglia (figur 3), astrocytter, pericytter, endotelceller49 og nevroner50 kan alle isoleres effektivt. Kjernecelletall oppnådd for resultatene var som følger ved bruk av det titrerte kollagenase I-enzymet: Hele humbugbehandlet hjerne = 500 000–600 000 celler; Hele TMEV-IDD-hjernen = 800 000–1 000 000 celler; Hel humbugbehandlet ryggmarg = 150.000–200.000 celler; Hel TMEV-IDD ryggmarg = 300 000–400 000. Celletall vil variere avhengig av presisjonen av innsamling, behandling, og om CNS-betennelse er tilstede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette representative eksperimentet var rettet mot å kvantifisere B- og T-celler og beskrive B- og T-cellelokalisering i meningeal og parenkymale CNS-rom i homøostatiske forhold, samt i en murine progressiv MS-modell (dvs. TMEV-IDD). TMEV-IDD ble indusert hos 5 uker gamle kvinnelige SJL-mus ved intrakraniell infeksjon med 5 x 106 plakkdannende enheter (PFU) av TMEV BeAn som tidligere beskrevet29.

Denne studien vurderte B- og T-celler i hjernehinnene, hjernen og ryggmargen under kronisk TMEV-IDD på dag 120 etter infeksjon. Aldersmatchede skambehandlede mus ble brukt som kontroller. Studien besto av to eksperimenter. Den første fokuserte på å oppnå encellede suspensjoner for flowcytometrisk vurdering, en veletablert teknikk for å analysere og kvantifisere cellesammensetning ved å evaluere celleoverflate og/eller intracellulære antigener (n = 4 sham-behandlet; n = 5 TMEV-IDD). Det andre eksperimentet fokuserte på å beskrive B- og T-cellelokalisering i CNS-rommet ved å benytte immunhistokjemi på avkalket hjerne- og ryggmargsvev (n = 3 sham-behandlet; n = 8 TMEV-IDD).

Etter isolering av encellede suspensjoner fra hjerne, ryggmarg og hjernehinner (hjerne og ryggmarg) fra TMEV-IDD og humbugbehandlede mus, ble en overflatefargingsprotokoll brukt på alle prøver. Kort fortalt ble encellede suspensjoner inkubert med en fikserbar levedyktighetseksklusjonsflekk (780) i 15 minutter, vasket, blokkert med Fc-blokk i nærvær av museserum i 15 minutter og farget med konjugerte antistoffer for celleoverflatemarkører, inkludert CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) og CD4 (GK1.5; PE) i 30 min som tidligere beskrevet28,29. Cellene ble deretter vasket og analysert ved hjelp av et flowcytometer28,29. Levedyktighet ble gjennomført som tidligere beskrevet28. CD45-ekspresjon ble vurdert for å skille CD45hi perifert deriverte infiltrerende immunceller (P1) fra CD45lo microglia (P2) og CD45- nevroner, astrocytter og oligodendrocytter i hjerne og ryggmarg (P3; Figur 3A). Hos humbugbehandlede mus var få CD45hi-celler tilstede i ryggmargen og hjernevevet. Ihjernehinnene ble samme gating-cut-off for CD45 hi ekspresjon brukt for hjerne- og ryggmargsdata brukt for å identifisere CD45hi immunceller (P1; Figur 3C) og ekskluderer ikke-immune celler som er tilstede i meningene (dvs. fibroblaster, endotelceller). Hos humbugbehandlede mus var få CD45hi-celler (<0,1%) tilstede i hjernehinnene. Blant CD45hi immunceller i TMEV-IDD CNS-vev ble B-celler og CD4 T-celler identifisert ved overflateekspresjon av henholdsvis CD19 og CD4 (figur 3B–D). I alle TMEV-IDD CNS-vev ble det observert økte prosentandeler av CD45hi immunceller sammenlignet med humbugbehandlede mus (figur 4A). Ved kronisk TMEV-IDD var andelen B-celler blant CD45hi immunceller i hjerne og ryggmarg høyere sammenlignet med meningealrommet (figur 4B).

For å identifisere lokalisering av B-celler og T-celler i CNS-rommet under kronisk TMEV-IDD, ble avkalkede hjerner og ryggmarger evaluert ved hjelp av immunhistokjemi ved hjelp av fargeprotokollen tidligere beskrevet29. Meningene og vaskulaturen ble avgrenset ved hjelp av laminin, en kjellermembrankomponent29,51 og ER-TR7, en fibroblast retikulære cellemarkør52,53. Ved konvensjonell ekstraksjon av hjerne fra skallehetten var pialaget intakt, men de resterende meningeale lagene ble ekskludert (figur 5A). I ryggmargen resulterte hydraulisk ekstrudering i fravær av alle meningeale lag (data ikke vist). Både i avkalkede hjerner og ryggmarger var alle meningeale lag intakte (figur 5B). For å undersøke B- og T-cellelokalisering i kronisk TMEV-IDD ble IgG-ekspresjon brukt til å bestemme lokalisasjonen av isotype-svitsjede B-celler 29, og CD3 ble brukt til å visualisere alle T-celler29. Costaining IgG med ER-TR7 viste at isotypesvitsjede IgG+ B-celler var tilstede i CNS-parenkymet og meningene (figur 6A). Cellulære aggregater i ER-TR7+ meninger inneholdt flere IgG+ B-celler og CD3+ T-celler (figur 6B).

De representative resultatene viser høye prosentandeler av både B-celler og T-celler i parenkymale og meningeale rom i kroniske TMEV-IDD-mus i motsetning til aldersmatchede skambehandlede mus. IHC-analyse viste videre at i TMEV-IDD-vev ble B-celler og T-celler spredt i parenkymet, men var nært forbundet i meningene og dannet inflammatoriske aggregater. Hos progressive MS-pasienter er meningeal inflammatoriske aggregater assosiert med tilstøtende vevsskade og verre sykdomsutfall. Ved kronisk TMEV-IDD kan vedvarende B-celle- og T-celletilstedeværelse i CNS-rommet og aggregering i meningene være assosiert med vevsskade og sykdomsprogresjon. Videre studier er nødvendig for å forstå hvordan meningeal versus parenkymal betennelse påvirker demyelinisering, nevrodegenerasjon og klinisk funksjonshemming.

Figure 1
Figur 1 Isolering av hjerne og ryggmarg for avkalkning. Blå stiplede linjer indikerer kutt som er gjort for å isolere hjernen med intakt skalle (kutt 1-4) og virvelsøyle (kutt 5-8). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Isolering av hjerne, ryggmarg og hjernehinner for encelleteknikker. (A) Blå stiplede linjer indikerer kutt som er gjort for å isolere skallehetten med intakte hjernehinner og hjerne (kutt 1-3) og virvelsøylen (kutt 5-7). Lateral kutt 3 er laget på begge sider av skallen. (B) Blå linje indikerer snitt gjort for å score og fjerne hjernehinnene i skallehetten og kuttene som er gjort i vertebral kolonnen (begge laterale sider) for å isolere ryggmargen og hjernehinnene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Identifisering av CD45hi infiltrerende immunceller i CNS-vev. (A) Gating strategi for identifisering av CD45hi infiltrerende immunceller (P1), CD45lo microglia (P2), og CD45-oligodendrocytter, astrocytter og nevroner blant totale levende celler i ryggmargen fra humbug-behandlet (rød) eller TMEV-IDD (blå) mus. Det ble påvist minimalt med CD45hi-celler i humbugbehandlede hjerner og ryggmarger. (B) Gating strategi for å identifisere CD19 + B-celler og CD4 + T-celler blant CD45hi infiltrerende immunceller (P1) i TMEV-IDD-mus. Gating strategier var lik for hjerne og ryggmargsvev. (C) Gating strategi for å identifisere CD45hi celler (P1) i hjernehinnene av sham-behandlet (rød) og kronisk TMEV-IDD mus (blå). (D) Gating strategi for å identifisere CD19 + B-celler og CD4 + T-celler blant CD45hi infiltrerende immunceller (P1) i hjernehinnene til kroniske TMEV-IDD-mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: CD45hi immunceller og CD19+ B-celler økt i CNS-vev ved kronisk TMEV-IDD. Søylediagrammer oppsummeringer av flowcytometridata hentet fra humbugbehandlede eller TMEV-IDD-meninger, hjerne og ryggmarg viser prosentandeler av CD45hi infiltrerende immunceller (A) eller prosentandeler av CD19+ B-celler (B). For TMEV-IDD-vev ble flowcytometridata innhentet fra fem mus, der ryggmarg og hjerne ble behandlet individuelt, mens meninger ble samlet for analyse. For humbugbehandlede mus ble flowcytometridata innhentet fra fire mus, med ryggmarg og hjerne behandlet individuelt, mens meninger ble samlet for analyse. Data for ryggmarg og hjerne vises som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5 Intakte meningeale lag i avkalket hjerne og ryggmarg. (A) Hjerner ekstrahert fra skallehetten eller (B) avkalkede hjerner med intakte hodeskaller og vertebrale kolonner fra kronisk TMEV-IDD-mus ble vurdert for DAPI (blå), meningeal markører laminin (grønn) og ER-TR7 (rød). Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6 Aggregering av immunceller ble påvist i meningene ved kronisk TMEV-IDD. (A) Avkalkede vertebrale kolonner fra kronisk TMEV-IDD-mus ble undersøkt for tilstedeværelse av IgG (grønn) for å identifisere isotype-svitsjede immunceller i parenkymet og i ER-TR7+ meningene (rød). (B) CD3+ T-celler (grønne) og IgG+ isotypesvitsjede B-celler (røde) ble kostinert med ER-TR7+ meninger for å vurdere lokalisering i ryggmargsvevet. Hvite piler markerer B- og T-celler i hjernehinnene. Skala bar = 50 μm. Hvite bokser avgrenser områder som er valgt for beskårne bilder (høyre; skalalinje = 10 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoder for evaluering av den cellulære sammensetningen i CNS-rommet under homeostase og sykdom er avgjørende for å forstå de fysiologiske og patologiske tilstandene til CNS. Til tross for at de tjener som en viktig barriere i CNS og huser et mangfoldig utvalg av immunceller, blir meningene ofte utelatt fra analyse fordi mange konvensjonelle vevsekstraksjonsmetoder for hjernen og ryggmargen ikke tillater innsamling av disse membranene. Denne utelatelsen er en kritisk begrensning i utviklingen av vår forståelse av meningenes cellulære sammensetning og funksjon og dens rolle i steady state og inflammatoriske tilstander. Nylige studier viste at både bosatt og perifert avledede immunceller bosatt i meningealrommet spiller en viktig rolle i å opprettholde homeostase i CNS, samt i å drive patogenesen av CNS-sykdommen. Disse studiene understreker behovet for å analysere ikke bare parenkymrommet, men også de omkringliggende meningeallagene. Protokollene beskrevet her tillater rask isolering av hjerne og ryggmarg samtidig som hjernehinnene bevares, noe som til slutt muliggjør en omfattende nedstrømsanalyse av CNS-rommet ved hjelp av både histologiske og enkeltcellestudier. De representative resultatene fokuserer på å vurdere immunceller i CNS-rommet; Protokollene kan imidlertid tilpasses for å analysere mikroglia, astrocytter, nevroner, pericytter, endotelceller eller andre CNS-bosatte celler.

Et kritisk trinn i de beskrevne metodene er forsiktig ekstraksjon av vevet, avgjørende for både å isolere rene enkeltcellede suspensjoner fra hjerne, ryggmarg og meninger og for å oppnå CNS-vev med enten intakte hodeskaller eller vertebrale kolonner, noe som tillater vevsmorfologi av høy kvalitet. Øvelse av teknikken for å oppnå enkeltcellesuspensjoner er nøkkelen til en vellykket vevsekstraksjon fordi det ikke bare vil forbedre renheten til prøven, men også forbedre celleutbyttet for nedstrøms applikasjoner. På samme måte er praksis i isolering av CNS-vev med intakte hodeskaller eller vertebrale kolonner for tilstrekkelig å fjerne overflødig vev rundt beinet et viktig skritt som sikrer bedre fiksering, avkalkning og kryopreservering av vevet, alle viktige komponenter for å oppnå vevsseksjoner med høy kvalitet morfologi og intakte antigenmål.

En begrensning av vår protokoll for isolering av encellede suspensjoner fra meningene er at den fokuserer på å oppnå durale og araknoide meninger32,54 mens isolering av pia, som forblir festet til hjernen eller ryggmargen via astrocyttprosesser. Selv om cellene som bor i pia materen er en viktig komponent i meningealrommet, ble det besluttet å utelukke pia materen under enkeltcellesuspensjonspreparatet på grunn av den omfattende tiden som kreves for å isolere dentilstrekkelig 55. På samme måte fokuserer protokollen bare på å skaffe meninger i den øvre delen av kraniet og utelukker isoleringen av de invaginaterende meningene i hjernen og choroid plexus. Innsamling av invaginaterende meninges og choroid plexus kan utføres i henhold til tidligere publiserte protokoller55, selv om det er en tidkrevende prosedyre. I begge tilfeller var valget om å utelate en del av meningeallagene på grunn av hvor lang tid det tar å isolere dem. Tidspunktet for protokollen som brukes til å forberede enkeltcellesuspensjoner som kreves for nedstrøms applikasjoner som flowcytometri, cellekulturanalyser og RNA-sekvensering (RNAseq), er avgjørende for å forbedre cellenes levedyktighet og datakvalitet. Avhengig av det spesifikke forskningsspørsmålet bør det derfor foretas en avveining mellom prøvens isolasjonstid og grundigheten i ekstraheringen av meningene. I gjeldende protokoll oppnås bare enkeltcellede suspensjonspreparater fra dura og arachnoide meninger, noe som begrenser evnen til å ekstrapolere resultatene til hele CNS-meningene. Imidlertid, hvis disse metodene brukes i kombinasjon med IHC- eller ISH-analyse av hele vevsseksjoner med de tre lagene av meninger, kan man få en grundigere forståelse av den cellulære og molekylære dynamikken i parenkym- og meningealrommene.

En annen begrensning av protokollen er de lave celletallene oppnådd fra durale og arachnoide meninger, spesielt under homeostatiske forhold. Imidlertid, hvis celletall i ryggmargen, hjernen eller hjernehinnene anses å være for lave for analyse av en bestemt målcellepopulasjon, kan det minimale celletallet som kreves for den analysen bestemmes ved å estimere det totale antall hendelser som kreves for en gitt presisjon (f.eks. 5% variasjonskoeffisient) som beskrevet i tidligere litteratur som spesialiserer seg på sjeldne hendelsesanalyser56. Disse beregningene kan deretter brukes til å avgjøre om prøver fra flere dyr må samles for å skaffe tilstrekkelige cellenumre til å analysere cellepopulasjonen av interesse.

De beskrevne metodene gir et viktig fremskritt i undersøkelsen av den cellulære dynamikken i CNS-rommet ved å utvide analysene til å omfatte det ofte forsømte meningealrommet. Disse protokollene tillater individuell ekstraksjon av hjernen, ryggmargen og durale og araknoide meninger for å generere enkeltcellesuspensjoner. I tillegg tillater avkalkningsprotokollen histologiske analyser av vevsseksjoner som omfatter hjerne- eller ryggmargsvev inkludert de tre meningeallagene. Bruk av EDTA gir en langsom, men skånsom avkalkningsprosess, som er mest hensiktsmessig for prøver der vevsmorfologi av høy kvalitet er nødvendig (f.eks. IHC og ISH). Protokollen bruker en pH på 7,2-7,4 for å redusere avkalkningshastigheten og sikre vedlikehold av intakt vevsmorfologi, en klar fordel i forhold til sterke og svake syrer (f.eks. saltsyre og trikloreddiksyre), som har kortere avkalkningstid, men påvirker kvaliteten på vevsmorfologien.

Fremtidige metoder som søker å isolere encellede suspensjoner fra meningene, bør fokusere på å utvikle protokoller for å forkorte tiden som kreves for å grundig isolere det piale laget fra CNS-vev og de invaginaterende meningene i hjernen. Å oppnå det komplette komplekset av de tre meningeallagene vil ikke bare øke celletallene for enhver analyse, men vil også gi en mer omfattende vurdering av de bosatte og infiltrerende immuncellene som opptar meningene, som omslutter CNS. Samtidig bør fremtidige protokoller fokusert på å forberede avkalkede hjerner og ryggmarger søke å identifisere nye midler som tar sikte på å fremskynde vevsavkalkning samtidig som kvaliteten på vevsmorfologien opprettholdes. Imidlertid kan nedstrøms applikasjoner som analyserer CNS-enkeltcellesuspensjoner inkludert doble og araknoide meninger, utført i kombinasjon med omfattende vevssnittanalyse, gi en detaljert forståelse av cellefenotype, funksjon og lokalisering i CNS-rommet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker personalet ved Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) ved Dartmouth for deres ekspertpleie av musene som brukes til disse studiene. Bornstein Research Fund finansierte denne forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 159 hjernehinner sentralnervesystemet avkalkning immunhistokjemi encellesuspensjon immunceller mus
Isolering av vev i sentralnervesystemet og tilhørende meninger for nedstrømsanalyse av immunceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter