Hücre ölümü sırasında salınan ekstrasellüler DNA (ekDNA) proinflamatuar ve inflamasyona katkıda bulunur. Yaralanma yerinde ekDNA ölçümü hedef organda terapötik tedavinin etkinliğini belirleyebilir. Bu protokol böbrek dokusunda ekDNA ölçümü otomatikleştirmek için bir makine öğrenme aracı nın kullanımını açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Glomerülonefritte Hücre Dışı DNA'nın Yarı Nicelikselleştirilmesi için Denetimli Makine Öğrenimi
Bu makalede
Özet
Özet
Glomerüler hücre ölümü miyeloperoksidaz anti nötrofil sitoplazmik antikor ilişkili vaskülitin patolojik bir özelliğidir (MPO-AAV). Ekstrasellüler deoksiribonükleik asit (ekDNA) apoptoz, nekroz, nekroz, nötrofil ekstrasellüler tuzaklar (Nets) ve piroptoz gibi hücre ölümü farklı formları sırasında serbest bırakılır. Bu hücre ölümünün ölçümü, hücre ölümünün farklı biyokimyasal formlarını belirlemek için gerekli olan birkaç farklı biyobelirteçle zaman alıcıdır. EkDNA ölçümü genellikle serum ve idrarda böbrek hasarı için taşıyıcı anne olarak yapılır, patolojik yaralanmanın meydana geldiği gerçek hedef organda değil. Böbrekte ekDNA'nın araştırılmasındaki mevcut zorluk, hem deneysel hem de arşivlenmiş insan böbrek biyopsilerinde formalin sabit parafin gömülü doku (FFPE) yöntemlerinin olmamasıdır. Bu protokol FFPE dokusunda ekDNA için leke için gerekli adımların bir özetini sağlar (hem insan hem de murine), otofloresan sökmek ve kamuya açık kaynak ImageJ plugin eğitilebilir Weka segmentasyonu bir makine öğrenme aracı kullanarak ortaya çıkan görüntülerde ekDNA ölçmek. Eğitilebilir Weka segmentasyonu, programın ekDNA sınıflandırmayı öğrendiği glomerüli içinde ekDNA'ya uygulanır. Bu sınıflandırıcı sonraki elde edilen böbrek görüntüleri uygulanır, her bir görüntümanuel ek açıklamalar için ihtiyacı azaltarak. Eğitilebilir Weka segmentasyonunun uyarlanabilirliği, deneysel murine anti-MPO glomerülonefrit (GN) böbrek dokusunda, anti-MPO GN'ye ortak patolojik katkıda bulunan NET'leri ve ecMPO'yu tanımlamak için daha fazla gösterilmiştir. Bu yöntem, eğitilebilir Weka segmentasyon programının sağlıklı normal böbrek dokusu ile hastalıklı böbrek dokusu arasında ekDNA'yı ayırt edebilmesinin etkinliğini açıkça gösteren böbrek dokusundaki ekDNA'nın objektif analizini sağlar. Bu protokol diğer organlardaki ecDNA, NET ve ECMPO'ları tanımlamak için kolayca uyarlanabilir.
Giriş
Myeloperoksidaz anti nötrofil sitoplazmik antikor ilişkili vaskülit (MPO-AAV) önemli hücre ölümü ve deoksiribonükleik asit salınımı ile patolojik glomerüler yaralanma böbrek yetmezliği ile sonuçlanan bir otoimmün hastalıktır (DNA)1,2. DNA bir tehlike sinyali gibi davranarak bağışıklık sistemini aktive edebilir. Normal sağlıklı koşullar altında, DNA'nın nükleer konumu bağışıklık sistemine maruz kalma koruma sağlar. Patojenik süreçler veya otoimmünite sırasında hücre dışı olarak salınan kendi KENDINE DNA bağışıklık sistemi tarafından moleküler öz protein (DAMP) ile ilişkili güçlü bir proinflamatuar hasar olarak ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu yöntem, hücre ölümünün her türlü pan ekDNA'sının saptanmasını sağlar. Aynı yöntem ve antikorlar insan böbrek biyopsi stoyonu için de kullanılmaktadır (4. basamaktan). Tüm hayvan ve insan denekler Monash Üniversitesi'nden etik onayı aldı ve Monash Health, Clayton, Victoria, Avustralya.
1. DAPI ve β-Aktin ile ekDNA boyama
- 8-10 haftalık C57/Bl6 farelerde anti-miyeloperoksidaz glomerülonefrit (anti-MPO-GN) 20 günlük bir model indükleyinkontrolleri 9.
- Co2 odasını kullanarak fareleri insancıl bir şekilde ötenazi.
- Makas ile deri yoluyla bir ön orta hat kesi yaparak böbrekleri çıkar....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu görüntüler, floresan lekeli FFPE böbrek dokusunda ekDNA'nın emek yoğun manuel ölçümlerini en aza indirmek için eğitilebilir Weka segmentasyonunu başarıyla kullanmak için gereken birden fazla adımı temsil eder. Bu adımlar, analiz sürecindeki her adımı özetleyen, doğrudan Weka segmentasyon programından alınan görüntülerle Şekil 1 ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Bu analizden elde edilen ölçümler, programın glomerulusta, kontrol doku.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Glomerülonefritin hem hastaların serum hem de idrarında proinflamatuar belirteçleri ölçen çoklu protokoller mevcuttur. Bu açıklanan protokol, glomerulus içindeki hücre ölümü ürünlerinin (ecDNA, NETs ve ECMPO) doğrudan analizini sağlar. Bu protokoldeki en önemli adımlar doku hazırlama ve görüntülemedir. Analiz için floresan boyama yöntemi kullanarak önemli kısıtlayıcı unsur doku otofloresanolduğunu. Formalin sabit parafin dokusu belirli floresan boyama gizleyebilir otofloresan tabidir. Slaytlar Sudan siyah batırılır boyam.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Açıklayacak bir şey yok.
Teşekkürler
Nikon C1 dik konfokal lazer tarama mikroskobu ve böbrek dokusunun işlenmesi için Monash Histoloji Platformu'nun kullanımı için Monash Mikro Görüntüleme'yi kabul ediyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sığır Serum Albümini | SIGMA | A2153 | % 5 ve% 1 çözeltiler PBS'de yapılır, toplu olarak yapılabilir ve çözüldükten sonra dondurulabilir. |
| Tavuk anti Keçi IgG (H+L) çapraz emilen antikor Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Antikor kokteylinizde herhangi bir serbest konjugattan kaçınmak için kullanmadan önce 1 dakika mini santrifüjde sıkın |
| Tavuk anti fare IgG (H+L) çapraz emilen antikor, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Antikor kokteylinizde herhangi bir serbest konjugattan kaçınmak için kullanmadan önce mini santrifüjde 1 dakika döndürün |
| Tavuk anti tavşan IgG (H + L) Çapraz emilen antikor Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Antikor kokteylinizde herhangi bir serbest konjugattan kaçınmak için kullanmadan önce 1 dakika mini santrifüjde döndürün |
| Tavuk sera | SIGMA | C5405 | %1 BSA/PBS |
| Lameller 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 Bu standart kalınlık değildir - konfokal mikroskopide |
| kullanılmak üzere tasarlanmıştırEDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Antijen alımı için TRIS ve EDTA'yı damıtılmış suya ve pH'ı 9'a ekleyin, 10x Çözelti |
| Etanol %30, %70 ve %100 | Kimyasal Tedarik | UN1170 | %100 denatüre edilmemiş etanol olarak sağlanır - damıtılmış su kullanılarak %30 ve %70 oranında seyreltin |
| Formaldehit, %4 (%10 Nötr tamponlu Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Böbrek, RT'de 16 saat boyunca 3 ml formalin içeren 5 ml'lik bir tüpe konur, formalin çeker ocakta kullanılmalıdır |
| Cam histoloji slaytları- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Pozitif yüklü kaplamalı slaytların kullanılması esastır. Antijen alma adımı sırasında doku slaytlardan yerinden çıktığından, slaytları kaplamak için poli-L-lizin kullanılmasını önermiyoruz |
| Keçi anti insan/fare MPO antikoru | R& D | AF3667 | Aliquot ve varışta eksi 80 derecede dondurun |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Temiz, 200 ml'lik boyama rafı kaplarında kullanılır, çeker ocakta kullanın |
| Hidrofobik kalem | VECTOR Labs | H-400 | Böbrek dokusunun etrafına daire çizmek için kullanın |
| Fare anti insan/fare Peptidil arginaz 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot ve varışta eksi 80 derecede dondurun |
| Nikon Ti-E ters Mikroskop'a bağlı Nikon C1 konfokal taramalı lazer kafası | Tutarlı Bilimsel | Aliquot ve varışta eksi 80 derecede dondur | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/%0.09 NaCl Makyaj Bir seferde 5L |
| Düdüklü Tencere 6L Tefal güvenli 5 Neo paslanmaz | Tefal | GSA-P2530738 | Yerel ev eşyaları mağazasından satın alındı |
| Prolong Gold DAPI | Yaşam Teknolojileri | P36962 | Damlaları doğrudan lamel üzerine uygulayın |
| Tavşan anti insan/fare Beta Aktin antikoru | ABCAM | ab8227 | Aliquot ve varışta eksi 80 derecede dondurun |
| Tavşan anti insan/fare H3Cit antikoru | ABCAM | ab5103 | Aliquot ve varışta eksi 80 derecede donma |
| Boyama rafı 24 slayt | ProScitech | H4465 | Seçilen boyama rafı, basınç altında kaynamaya ve 60 derece fırında inkübasyona dayanabilmelidir |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | % 0.3% 70 Etanol içinde 1 L'lik bir şişeye 3g ekleyin, süzün ve oda sıcaklığında 6 ay boyunca ışığa dayanıklı |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | TRIS ve EDTA'yı damıtılmış suda ve pH'ı 9'a ekleyin, antijen alımı için, 10x'lik bir çözelti içinde yapılabilir |
| Xylene | Trajan | XL005 / 20 | Çeker ocakta kullanılmalıdır |
Kaynaklar
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
