Summary
Presentert her er en protokoll for Pseudomonas aeruginosa infeksjon og phage terapi søknad i cystisk fibrose (CF) sebrafisk embryoer.
Abstract
Antimikrobiell resistens, en viktig konsekvens av diagnostisk usikkerhet og antimikrobiell overresept, er en stadig mer anerkjent årsak til alvorlige infeksjoner, komplikasjoner og dødelighet over hele verden med stor innvirkning på vårt samfunn og på helsesystemet. Spesielt blir pasienter med nedsatt immunforsvar eller eksisterende og kroniske patologier, som cystisk fibrose (CF), utsatt for hyppige antibiotikabehandlinger for å kontrollere infeksjonene med utseende og diffusjon av multiresistente isolater. Derfor er det et presserende behov for å ta opp alternative terapier for å motvirke bakterielle infeksjoner. Bruk av bakteriofages, de naturlige fiender av bakterier, kan være en mulig løsning. Protokollen som er beskrevet i dette arbeidet beskriver anvendelsen av phage terapi mot Pseudomonas aeruginosa infeksjon i CF sebrafisk embryoer. Sebrafisk embryoer ble infisert med P. aeruginosa for å vise at phage terapi er effektiv mot P. aeruginosa infeksjoner som det reduserer dødelighet, bakteriell byrde og pro-inflammatorisk immunrespons i CF embryoer.
Introduction
Phage terapi, bruk av naturlige fiender av bakterier for å bekjempe bakterielle infeksjoner, får fornyet interesse som bakteriell motstand mot antibiotika blir utbredt1,2. Denne terapien, som brukes i flere tiår i Øst-Europa, kan betraktes som en komplementær behandling for antibiotika i herding av lungeinfeksjoner hos pasienter med CF og et mulig terapeutisk alternativ for pasienter smittet med bakterier som er resistente mot alle de som er i brukantibiotika 2,3. Fordelene med antibiotikabehandling er at bakteriofag multipliserer på infeksjonsstedet, mens antibiotika metaboliseres og elimineres fra kroppen4,5. Faktisk har administrasjonen av cocktailer av virulent phages isolert i forskjellige laboratorier vist seg å være effektive i behandling av Pseudomonas aeruginosa infeksjoner i dyremodeller så forskjellige som insekter og pattedyr6,7,8. Phage terapi ble også vist å være i stand til å redusere bakteriell byrde i brannsår infisert med P. aeruginosa og Escherichia coli i en randomisert klinisk studie9.
Sebrafisk (Danio rerio) har nylig dukket opp som en verdifull modell for å studere infeksjoner med flere patogener, inkludert P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus og Burkolderia cepacia12,13. Ved å mikroinjisere bakterier direkte inn iembryoblodsirkulasjonen 14 er det lett å etablere en systemisk infeksjon som motvirkes av sebrafisken medfødt immunsystem, som er evolusjonært bevart med nøytrofiler og makrofaggenerasjon som ligner på det menneskelige motstykket. Videre, i løpet av den første måneden av livet, mangler sebrafiskembryoer den adaptive immunresponsen, noe som gjør dem ideelle modeller for å studere den medfødte immuniteten, som er den kritiske forsvarsmekanismen i menneskeligelungeinfeksjoner 15. Sebrafisk dukket nylig opp som et kraftig genetisk modellsystem for å bedre forstå CF-utbruddet og å utvikle nye farmakologiske behandlinger10,,16,,17. CF sebrafisk modell av cftr knock-down generert med morpholino injeksjon i sebrafisk presenterte en dempet respiratorisk burst respons og redusert nøytrofilmigrasjon 10, mens cftr knock-out fører til nedsatt indre organ posisjon og ødeleggelsen av eksokrin bukspyttkjertelen, en fenotype som speiler menneskelig sykdom16,17. Av størst interesse var funnet at P. aeruginosa bakteriell byrde var betydelig høyere i cftr-tap av funksjon embryoer enn i kontroller ved 8 timer etter infeksjon (hpi), som paralleller resultatene oppnådd med mus og humane bronkial epitelceller2,18.
I dette arbeidet viser vi at phage terapi er effektiv mot P. aeruginosa infeksjoner i sebrafisk embryoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksen sebrafisk (Danio rerio) fra AB-stammen (European Zebrafish Resource Center EZRC) opprettholdes i henhold til internasjonale (EU-direktiv 2010/63/EU) og nasjonale retningslinjer (italiensk dekret4. mars 2014, n. 26) om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Standardforholdene er satt i fiskeanlegget med en 14 timer lys / 10 h mørk syklus og tankvanntemperatur ved 28 ° C.
1. Utarbeidelse av løsninger og verktøy
- Klargjør en 50x lagerløsning og 1x arbeidsløsninger for E3 embryomedium for dyrking av sebrafiskembryoer (se tabell 1).
- Lag pigmenteringsblokkeringsløsning, for å blokkere embryopigmenteringen fra 24 timer etter befruktning (24 hk) (se tabell 1).
- Forbered 25x lager og 1x arbeider Tricane bedøvelse løsning som beskrevet i tabell 1.
MERK: For å unngå gjentatt frysing og tining av oppløsningen som kan skade lagerløsningen, må du gjøre det mulig å lage 2 ml 25x trikain og oppbevar dem ved -20 °C. - Forbered spor for embryomikroinjeksjon ved å oppløse 1 g agarose i 100 ml destillert H2O i en mikrowavbar kolbe eller flaske. Mikrobølgeovn i 1-3 min til agarose er helt oppløst.
- Plasser sebrafisk mikroinjeksjonsformer (se Materialtabell) vendt opp ned i en petriskål (90 mm x 15 mm) og dekk hele overflaten ved å helle flytende agarosegel med en bredde på ca. 10 mm.
- Fjern formen når agarose har størknet. Fyll petriskålen med 1x E3 embryomedium. Dette kan oppbevares ved 4 °C i ca. en uke. Før bruk må det skiftes ut med det friske E3-mediet som inneholder Trikain.
MERK: Eldre former kan utvikle sopp eller bakterielle forurensninger. - Bruk brannpolerte 10 cm borosilikatkapillærer for å forberede nåler for mikroinjeksjon og fest dem til mikropipettetrekkeren ved å stramme håndtakene. Still inn avtrekkeren med følgende innstillinger: varme 500, hastighet 100, tid 150, trekk 150.
2. P. aeruginosa (PAO1) inokuspreparat
- Inokuler 1 koloni GFP+P. aeruginosa stamme PAO119 i 5 ml LB kjøttkraft (se tabell 1) og vokse over natten ved 37 °C med risting (200 o/min).
- Fortynn ovennevnte overnattingskultur til OD600 = 0,1 i 10 ml LB kjøttkraft og vokse til OD600 = 0,5 ved 37 °C med risting (200 o/min).
- Sentrifuge 2 ml av kulturen i 2 min ved 4 °C ved 16 100 x g og resuspend cellepellet til OD600 = 1, tilsvarende ca. 1 x 109 cfu/ml, i 1 ml av den fysiologiske løsningen (se tabell 1).
- Fortynn cellefjæringen til ca. 5 x 107cfu/ml i fysiologisk oppløsning og oppbevar ved 4 °C.
3. Phage lager forberedelse
- Inokuler 1 koloni av P. aeruginosa stamme PAO1 i 5 ml LB kjøttkraft og inkuber over natten ved 37 °C med risting. Fortynn nattkulturen til OD600 = 0,01 i 500 ml LB kjøttkraft og vokse ved 37 °C med risting til OD600 = 0,05, tilsvarende ca. 2,5 x 107 cfu/ml.
- Til den fortynnede kulturen i P. aeruginosa, legg til ca 1,25 x 107 phages, for å få mangfoldet av infeksjon (M.O.I.) på 10-3. Inkuber ved 37 °C ved risting til OD600 synker til ca. 0,1-0,3 (i ca. 3 til 5 timer, avhengig av phage brukt).
MERK: Fire phages ble valgt for dette eksperimentet som infiserer PAO1-stamme: to Podoviridae, GenBank-tiltredelsesnumre vB_PaeP_PYO2, MF490236 og vB_PaeP_DEV, MF490238 og to Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 og vB_PaeM_E217, MF490240. Utfør trinnene nedenfor for hver phage individuelt. - Inkuber lysatet med 1 mg/ml DNase og RNase i 30 min ved 37 °C. Sentrifuge ved 5000 x g i 30 min ved 4 °C og kom deg forsiktig tilbake det overnaturlige (SN). Filtrer SN med et filter med en porediameter på 0,8 μm.
- Legg til 58 g/l nacl og 105 g/l PEG6000 til SN. Oppløs ved omrøring ved RT 20 min og hold den deretter over natten ved 4 °C. Sentrifuge ved 20, 000 x g for 30 min ved 4 °C for phage nedbør. Fjern SN og oppløs forsiktig phage pellet i 15 ml TN-buffer (se tabell 1).
- Rens phages med CsCl tetthet gradient som beskrevet i trinnene nedenfor.
- I en polyallomer ultracentrifuge rør for SW41 rotor, forberede en CsCl trinn tetthet gradient ved stratifisering 2 ml av de fire CsCl løsninger beskrevet i tabell 1. Tilsett 3,5 ml phage suspensjon i hver av de 4 rørene.
MERK: CsCl er giftig, vedta riktige sikkerhetsprosedyrer for å håndtere og kaste den. - Introdder rørene i rotoren og sørg for at rørene er balansert (vektforskjellen mellom de to vendte rørene må være ≤ 0.01g).
- Sentrifuge i 2 t ved 4 °C og 100, 000 x g (25 000 o/min for SW41 rotor). Etter sentrifugering, fjern sakte rørene og fjern dem forsiktig på en støtte. Bruk en sprøyte med 19 G kanyle til å tegne opp det hvite/opaliserende båndet som vanligvis ligger mellom d=1,5 og området med d=1,4 tetthet.
- Overfør suspensjonene fra sprøyten til nye polyallomerrør for SW60-rotoren og bruk oppløsningen d=1,4 til å balansere rørene nøyaktig.
- Sentrifuger suspensjonen ved 4 °C og 150 0000 x g (38 000 o/min for SW60-rotoren) i minst 16 timer.
- Samle det synlige båndet som ovenfor (se trinn 3.3.3) og overfør dem til dialyserør med 6000 Da cut-off. Dialyser det oppnådde synlige båndet 2x i 20 min mot 500 ml vann og over natten mot 500 ml TN-buffer. Filtrer med et 0,22 μm porefilter og oppbevar ved 4 °C.
- I en polyallomer ultracentrifuge rør for SW41 rotor, forberede en CsCl trinn tetthet gradient ved stratifisering 2 ml av de fire CsCl løsninger beskrevet i tabell 1. Tilsett 3,5 ml phage suspensjon i hver av de 4 rørene.
4. Phage cocktail forberedelse
- Lag en blanding av fire phages som infiserer stammen PAO1, tidligere isolert og preget8. Før blanding, estimer titer av hver phage lager ved plakkanalyse 20.
- Monter phage cocktail, med en samlet titer på 5 × 108 pfu / ml, ved å blande fire phage preparater på samme pfu / ml umiddelbart før hvert eksperiment, for å sikre nøyaktig phage titers.
5. Innsamling og fremstilling av sebrafiskembryoer for cftr morpholinos mikroinjeksjon
MERK: Samle 1-2 celle embryoer fra vill type sebrafisk for cftr morpholinos (cftr-MOs) mikroinjeksjon.
- To dager før bakteriemikroinjeksjonseksperimentet, sett opp avlspar og samle embryoer som beskrevet tidligere21. Voksen sebrafisk (Danio rerio) av AB-stammen ble kjøpt fra European Zebrafish Resource Center, EZRC.
- Dagen etter, samle embryoene umiddelbart etter befruktning med en plastpipette eller ved hjelp av en finmasket sil. Legg de oppsamlede embryoene i en petriskål som inneholder E3-embryomediet, og fjern forsiktig ruskene med en plastpipette for å unngå kontaminering som kan skade embryoutviklingen.
- Forbered 5 μL morpholino injeksjonsvæske ved å fortynne de to morpholino lagerløsninger (1 mM) i sterilt vann til en endelig konsentrasjon på 0,25 pmol / embryo ATG-MO + 0,25 pmol / embryo skjøte-MO. For å spore embryoinjeksjonen, tilsett 0,5 μL fenolrød til morpholino injeksjonsvæsken.
- Legg en mikroinjeksjonsnål med ca. 5 μL av morpholino-blandeløsningen ved hjelp av en 20 μL mikropipette med en fin gellastespiss. Fest nålen til mikromanipulatoren som er koblet til et stativ, og plasser den under et stereomikroskop.
MERK: Det er ikke nødvendig at oppløsningen når spissen av nålen, da trykket på mikroinjektorpumpen vil presse den. - Klipp av nålens spiss ved å kutte nålespissen med fine sterile pinsett. Mål diameteren på dråpen ved hjelp av en skala bar i okulær av mikroskopet. Alternativt kan du lage en dråpe mineralolje på et mikrometersklie og sette mikroinjeksjonsvolumet ved å injisere løsningen i oljedråpet for å evaluere dråpestørrelsen. Bruk en dråpe med en diameter på 156 μm for å injisere et volum på 2 dl.
- Sett mikroinjektoren ved å justere kompensasjonstrykket til 15 hPa, injeksjonstid til 0,5 s og injeksjonstrykk mellom 300 og 600 hPa for å oppnå riktig injeksjonsvolum avhengig av kanylen som brukes.
- Med en plastpipette ordne embryoene fra trinn 5.2 på et glass plassert i en 96 mm diameter Petri skål.
MERK: For mye E3 medium vil forhindre riktig inntrengning av mikroinjeksjonsnålen i embryoenes korreksjon. - Tren inn i chorion og deretter eggeplommen med nålen for å injisere 2 nL i embryoet som beskrevet tidligere22.
- Plasser injiserte embryoer i en petriskål med E3 medium og legg dem i en inkubator ved 28 °C for å la dem utvikle seg til dagen etter.
6. Mikroinjeksjon av sebrafisk embryoer med bakterier og phage cocktail
MERK: For å utføre en systemisk infeksjon må embryoet ha blodsirkulasjon som vanligvis starter etter 26 hkf.
- Etter 26 hkf (for sebrafiskutviklingsstadier se Kimmel21) dechorionate embryoer med pronaseoppløsning tilberedt ved oppløsning av pronasepulver i E3 medium med en konsentrasjon på 2 mg/ml. Pipette embryoene forsiktig for å bryte chorion. Kast pronase/E3-mediet og skyll fatet flere ganger med frisk E3 for å fjerne alle pronase.
- Bedøve sebrafisk embryoer i E3 medium som inneholder Tricaine ca 5 min før injeksjoner.
- Pipette de bedertiserte embryoene inn i sporet tilberedt i trinn 1. Bruk en fin gel lasting tips for å linje embryoene i lateral stilling.
- Legg en mikroinjeksjonskanyle med ca. 5 μL av P. aeruginosapreparatet som beskrevet i del 5.
- Sett nålen dorsalt til utgangspunktet for kanalen i Cuvier hvor den begynner å spre seg over eggeplommeseken. Injiser et volum på 1-3 nL og sørg for at volumet ekspanderer direkte i kanalen og går inn i sirkulasjonen.
- Omtrent etter hvert 50 injiserte embryo injiseres en dråpe bakterier i et 1,5 ml sentrifugerør med 100 μL steril PBS for å sjekke om injeksjonsvolumet forblir det samme. Plate inokulumet på LB agar (se tabell 1) ved 37 °C over natten for å vurdere CFU.
- Overfør mikroinjegrerte embryoer i to rene Petri-retter med friskt E3 medium + PTU og inkuber dem ved 28 °C.
- Ved to utvalgte tidspunkter: 30 min eller 3 timer etter bakteriell injeksjon, ta ut en av Petri retter med bakteriell-injisert embryoer fra inkubatoren og justere dem i sporet som beskrevet i 6.3 for phage cocktail injeksjon.
- Legg en mikroinjeksjonsnål med ca. 5 μL av phagecocktailen (tilberedt i trinn 4) med en fin gellastespiss og fest den til mikroinjektoren (se trinn 5).
- Injiser phage cocktail i kanalen av Cuvier av embryoene tidligere injisert med bakterier.
- Overfør mikroinjegrerte embryoer i to rene Petri-retter med friskt E3 medium + PTU og inkuber dem ved 28 °C.
7. Evaluering av bakteriell byrde av embryoer injisert med PAO1 og phages
- Ved 8 hk, pipette 15 bedøvet embryoer fra petriskålen til en 1,5 ml sentrifuge rør.
- Bytt bedøvelsesoppløsningen med 300 μL på 1 % Triton X-100 i PBS (PBSTritonX) og homogeniser embryoene ved å sende dem minst 15 ganger gjennom en insulinsprøyte med en steril 27 G kanyle.
- Forbered seriefortynnende homogenater i sterile PBS ved å overføre 100 μL av fortynnet homogenat til 900 μL steril PBS.
- For å velge for den naturlig amp-resistente PAO1-stammen, plate 100 μL av fortynningene på LB agar tilsatt med ampicillin (100 μg /ml), og inkuber ved 37 °C over natten.
- Dagen etter teller antall kolonier, multipliserer med fortynningsfaktoren for å bestemme det totale antallet CFU, og dividere med antall embryoer homogenisert for å oppnå gjennomsnittlig antall CFU / infisert embryo.
8. Evaluering av dødeligheten av embryoer injisert med PAO1 og phages
- For å evaluere dødeligheten av PAO1-infeksjonen, score de injiserte embryoene ved 20 hpi under et stereomikroskop og telle for de døde embryoene (hvit / ikke gjennomsiktig).
- Beregn den halvmaksimale dødelige konsentrasjonen 50 (LD50) dosen av PAO1 som bestemmer dødsfallet til 50% av injiserte embryoer ved 20 hkf.
9. Embryo forberedelse for stereomicroscope time-lapse imaging av GFP+ PAO1 infeksjon
- Klargjør formen for levende embryoavbildning ved å oppløse 1,5% lavsmelting oppsto i 100 ml E3-løsning.
- Tilsett 1 % trikain (se tabell 1) for å bedøve embryoene.
- Ved 4 hpi overføre ett embryo med en plastpipette i en glassbunnsrett og tilsett den varme lavsmeltende punkt agaroseløsningen.
- Plasser glassbunnsfatet under et stereomikroskop og med en spissposisjon er embryoet i ønsket orientering. Bruk en plastpipette til å forsiktig legge til en dråpe agarose på embryoet.
- La agarose kjølig i 5-10 min og fyll forsiktig glassbunnsfatet med E3 som inneholder bedøvelsesløsningen for å holde embryoet fuktig.
- Plasser glassbunnsfatet med embryoet under det fluorescerende stereomikroskopet med et fluorescerende filter (kanal 488 nm) for GFP+ bakterier. Ikke fjern petriskålen før ytterligere oppkjøp med de samme parametrene på 9, 14 og 18 hki.
10. Uttrykksanalyser av proinflammatoriske cytokiner
- Ved 20 hpi bedøve embryoer med trikain 1x løsning og overføre dem fra Petri parabolen til en 1,5 ml sentrifuge rør.
- Under en røykhette fjerner du bedøvelsesoppløsningen og erstattes med 200 μL guanidiumhydrokloridreagens.
- Homogenisere embryoer ved å pipetter dem repeterende gjennom en 200 μL pipette først og deretter minst 15x med en insulinsprøyte med en steril 27 G nål.
- Trekk ut totalt RNA fra homogeniserte sebrafiskembryoer ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig guanidiumhydrokloridreagenser i henhold til produsentens instruksjoner.
- Behandle 1 μg av hver prøve av RNA med 2 μL 1U/μL DNase I (RNase-fri), i følge produsentens instruksjoner.
- Bruk 1 μg DNase I behandlet RNA for omvendt transkripsjonsreaksjon (RT) ved hjelp av kommersielt tilgjengelig sett (se Materialseksjon), i et totalt volum på 20 μL i henhold til produsentens instruksjoner.
- Utfør RT qPCR-reaksjon i et totalt volum på 10 μL som inneholder 1x SYBR Grønn mastermix ved hjelp av 1,5 μL av en 1:6 fortynning av RT-reaksjon. For normaliseringsformål, bruk primere for husholdende gener rpl8 og for proinflammatoriske cytokiner, bruk primere for TNF-α og IL-1β (se tabell 2). qPCR-protokollen var: syklus 1 trinn 1: 95 °C, 2 min, gjenta én gang; syklus 2: trinn 1 95 °C, 10 s, trinn 2 55 °C, 30 s, gjenta 40x; syklus 3: trinn 1 72 °C, 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultater og tall presentert her er referert til CF embryoer generert gjennom injeksjon av cftr morpholinos som beskrevet tidligere10 og i trinn 5. For å validere CF fenotypen ble nedsatt posisjon av indre organer som hjerte, lever og bukspyttkjertel som tidligere beskrevet17 (figur 1) vurdert. Lignende resultater ble oppnådd i tilfelle av WT embryoer som rapportert i vår forrige publikasjon19.
Bakteriell byrde ble redusert ved phage terapi i CF embryoer infisert med PAO1. Videre evaluerte vi bakteriebyrden ved 8 hki ved å homogenisere grupper på 15 embryoer: gjennomsnittlig antall bakterier (cfu / embryo) tilstede i PAO1-infiserte embryoer ble redusert til ca 20% etter phage administrasjonsbehandling, og dermed bekrefter en mindre alvorlig infeksjon i nærvær av phage cocktail (figur 2).
Dødeligheten ble redusert ved phage terapi i CF embryoer infisert med GFP+ bakterier PAO1. CF sebrafisk embryoer på 48 hpf ble injisert med GFP+ bakterier av PAO1 belastningen i en dose som forårsaket 50% dødelighet etter 20 hpi (30 cfu / embryo, figur 3A). Injeksjonsstedet var eggeplommen eller kanalen cuvier å generere en systemisk infeksjon. Phage terapi mot PAO1 infeksjon ble testet ved å injisere 2 nL av like blandet phage cocktail (300-500 pfu / embryo). Injeksjonen ble utført på to forskjellige tidspunkter: 30 min (tidlig) og 7 timer (sent) etter bakteriell injeksjon. I begge tilfeller ble dødeligheten redusert ved 20 hki, noe som indikerer at phage terapi er effektiv (figur 3B).
Med levende bildebehandling, ved hjelp av et fluorescerende stereomikroskop, fulgte vi også utviklingen av infeksjonen i CF-embryoer injisert med GFP+ PAO1 og viste effekten av phage terapi for å redusere spredningen av fluorescerende bakterier over eggeplommesekken. CF+PAO1 injisert embryo med GFP+ bakterier multiplikasjon ved 4, 9, 14 og 18 hpi er vist i oversiden av figur 4,mens CF + PAO1 + phages embryo med redusert fluorescens på grunn av fage virkning mot bakterier er vist i den nederste delen (figur 4).
Phage terapi redusert den inflammatoriske responsen generert av PAO1 infeksjon i CF embryoer. Vi evaluerte også immunresponsen generert av PAO1 og PAO1 + phages injeksjon ved 8 hpi. Som forventet ble uttrykket av de proinflammatoriske cytokinene TNF-a og IL-1β analysert av qPCR-teknikker betydelig økt etter PAO1 injeksjon i forhold til kontroller, mens det ble redusert med samtidig injeksjon av phage cocktail (figur 5A, B).
Figur 1: Generasjon og validering av CF-embryoer ved cftr morpholinos (cftr-MOs) injeksjon. (A)Nedsatt stilling og løkking av hjertet i CF injisert embryoer i forhold til villtype (WT) embryoer. Hjertet visualiseres med cmlc2 uttrykk ved in situ hybridisering teknikk. (B) Nedsatt leverposisjon (piler) og bukspyttkjertel i CF-embryoer sammenlignet med WT. Lever og bukspyttkjertel visualiseres med prox1a uttrykk ved in situ hybridiseringsteknikker. Vektstenger indikerer 100 μm. liv: lever; p: bukspyttkjertel. Figuren er gjengitt fra19 Vennligst klikk her for å se en større versjon av dennefiguren.
Figur 2: Bakteriell byrde i CF-embryoer infisert med PAO1 eller PAO1+phages. Den relative prosentandelen av cfu/embryo i PAO1+phages vs PAO1 embryoer er gitt. Gjennomsnittet og SD for tre uavhengige eksperimenter rapporteres. Figuren er gjengitt fra19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dødelighet av CF sebrafisk embryoer infisert med PAO1 og med PAO1 + phages. (A)Bestemmelse av LD50 i 48 hpf sebrafisk embryoer mikroinjisert med cftr-MO på 1-celle stadium (CF embryoer) og infisert på 48 hpf med 2 nL av en kultur av PAO1 som inneholder økende antall bakterier (cfu / embryo). Dødeligheten av embryoene ble observert ved 20 hki. (B)Dødelighet ved 20 hk CF embryoer infisert med PAO1 ved 48 hkf og behandlet med phage cocktail (PAO1 + Φ). Gjennomsnittet og SD rapportert er fra henholdsvis seks og fire eksperimenter, hver med 25-40 embryoer. Kantete transformasjon ble brukt på prosentandelen av dødelighet og enveis ANOVA etterfulgt av Duncans test ble brukt. Figuren er gjengitt fra19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Avbildning av effekten av phage terapi i sebrafisk. Progresjon av infeksjonen i CF-embryoer etter PAO1 injeksjon (øvre embryo) og effekt av phage terapi i PAO1 + phages injisert embryoer (bunn embryo) på 4, 9, 14 og 18 hpi. Vektlinjen indikerer 100 mikron. Figuren er gjengitt fra19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Uttrykk for pro- og antiinflammatoriske cytokiner etter ADMINISTRERING AV PAO1 og PAO+phage. Uttrykksnivåer av TNF-a (A) og IL-1β gener målt ved RT-qPCR ved 8 hpi i CF embryoer injisert med PAO1 og PAO1 + Φ ved 48 hpf og normalisert ved hjelp av uttrykket av rpl8. Gjennomsnittet og SD for fire eksperimenter rapporteres. Statistisk signifikans ble vurdert av ANOVA etterfulgt av Duncans test: for TNF- a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0,019*; (CF+PAO1) vs .CF+PAO1+ Φ) p = 0,77 i.s.; for IL-1β (CF) vs (CF+PAO1) p = 0,00014***; (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,00068***; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,031*. Figuren er gjengitt fra19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsninger | Forberedelse |
| Bedøvelse lager løsning 25X | 4 mg/ml trikain i destillert H2O. |
| Bedøvelsesløsning 1X | fortynning idestillertH 2 O Tricaine lageroppløsning 25X forberedelse for å nå 1X konsentrasjon (0,16 mg/ml) Trikain av destillert H2O. |
| CsCl d=1.3 | 20,49 g i 50 ml TN |
| CsCl d=1.4 | 20,28 g i 50 ml TN |
| CsCl d=1.5 | 34,13 g i 50 ml TN |
| CsCl d=1.6 | 41,2 g i 50 ml TN |
| E3 embryo medium for sebrafisk embryo | 1 L 1av E3 (fortynn 50X lager med destillert H2O) + 200 μl på 0,05% metylblå . Oppbevares på RT. |
| E3 embryo medium lagerløsning (50X) | 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl , 9,15 g CaCl2 og 9,95 g MgSO4 i 5 L destillert H2O. Oppbevares ved RT. |
| LB agar | 10 g/l tryptone, 5 g/l gjærekstrakt, 5 g/l NaCl, 10 g/l agar |
| LB kjøttkraft | for 1L: 950 ml H2O, 10 g Tryptone, 10 g NaCl, 5 g gjærekstrakt |
| PBST | PBS 1X + Triton X 1% |
| Fysiologisk løsning | 0,9 % NaCl |
| Pigmentering blokkerer lagerløsning 10X | 0,3 mg/ml fenyltenytyre (PTU) pulver i E3 embryomedium for sebrafiskembryo |
| Pronase lagerløsning 5X | 5 mg/ml pronasepulver i E3 embryomedium for sebrafiskembryo |
| TN-buffer | 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl |
Tabell 1: Utarbeidelse av løsninger.
| Gennavn | Primer sekvens |
| TNF-alfa Fw | 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha Rev | 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAAGG-3' |
| IL1-beta Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCACAAAATG-3' |
| IL1-beta Rev | 5'-CGTTCACTTCACGCTCTTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 Rev | 5'-TCCTTCACGATCCTTGAT-3' |
Tabell 2: Primere som brukes til RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet beskrev vi protokollen for å utføre P. aeruginosa (PAO1) infeksjon i sebrafiskembryoer og hvordan man bruker phage terapi med en cocktail av phages tidligere identifisert som i stand til å infisere PAO1 for å løse det. Bruken av bakteriofages som et alternativ til antibiotikabehandling har vært av økende interesse siden de siste årene. Dette skyldes hovedsakelig spredning av multiresistente (MDR) bakterielle infeksjoner, som utgjør et alvorlig problem for folkehelsen. Selvfølgelig er omfanget av dette arbeidet begrenset til anvendelsen av phage terapi til en dyremodell og ikke til mennesker. Vi genererte imidlertid en cystisk fibrose sebrafiskmodell med injeksjon av en morpholino rettet mot cftr-genet, noe som viser effekten av phage terapi også i en patogenetisk modell spesielt utsatt for P.aeruginosa infeksjon.
Det er å merke seg at vi lett kunne oppnå phage terapi, som i et tidligere arbeid, isolerte og karakteriserte vi forskjellige phages i stand til å infisere P. aeruginosa både in vitro og in vivo8. Dette trinnet er grunnleggende for å oppnå antimikrobiell aktivitet av phages. Isolasjon og karakterisering av phages i stand til å infisere en bestemt bakteriell belastning er kritiske trinn i phage terapi søknad. Faktisk, for å unngå bivirkninger av phages på dyret / menneskelig vert, er det nødvendig å bruke lytiske phages i stedet for de lysogene. Viktigst er det nødvendig å sjekke phage genomer for tilstedeværelse av skadelige gener som de for antibiotikaresistens, virulens og genoverføring.
Phage terapi har allerede blitt brukt i andre dyremodeller. Vi er bevisste på at sebrafisk ikke er en pattedyrmodell, og noen effekter av phages kan være forskjellige. Men siden sebrafisk har et medfødt immunsystem som kan sammenlignes med det menneskelige med en konservert populasjon av nøytrofilerog makrofager 23,spekulerer vi i at dataene om immunresponsen kan reproduseres hos mennesker. Videre er sebrafisk godt vurdert for bakterielle infeksjonsstudier, bruken som tester for phage terapi effekt kan være lovende for terapeutiske tilnærminger. Faktisk kan infeksjonen være systemisk hvis bakterier injiseres i sirkulasjonen gjennom Duct of Cuvier, eller lokalisert som rapportert17. Vi utførte både systemiske og lokaliserte infeksjoner og viste at de på samme måte genererte økt dødelighet og bakteriell byrde som begge ble redusert etter phage terapi søknad. Videre, siden GFP+ fluorescerende PAO1 bakterier ble injisert, var det lett å følge infeksjonen på forskjellige tidspunkter av embryoutvikling som bekrefter reduksjon av fluorescerende bakterier når phages ble injisert.
Så vidt vi vet, er dette den første beskrivelsen av phage terapi søknad i sebrafisk, med merverdi for demonstrasjon av phages antimikrobiell aktivitet mot P. aeruginosa i en CF bakgrunn, som er spesielt utsatt for denne bakterielle infeksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den italienske cystisk fibrose Foundation (FFC # 22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo og FFC # 23 /2019; Un respiro i più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T.
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
