Summary
Burada sunulan Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu ve kistik fibrozis faj tedavisi uygulaması için bir protokoldür (CF) zebra balığı embriyoları.
Abstract
Tanısal belirsizlik ve antimikrobiyal overprescription önemli bir sonucu olan antimikrobiyal direnç, toplumumuz ve sağlık sistemi üzerinde büyük bir etkisi ile ciddi enfeksiyonlar, komplikasyonlar ve mortalite dünya çapında giderek tanınan bir nedenidir. Özellikle, bağışıklık sistemi zayıf veya kistik fibrozis (CF) gibi önceden var olan ve kronik patolojileri olan hastalar, multiila dirençli izolasyonların görünümü ve difüzyonu ile enfeksiyonları kontrol etmek için sık antibiyotik tedavileri tabi tutulur. Bu nedenle, bakteriyel enfeksiyonlara karşı alternatif tedaviler ele acil bir ihtiyaç vardır. Bakterilerin doğal düşmanları olan bakteriyofajların kullanımı olası bir çözüm olabilir. Bu çalışmada ayrıntılı protokol CF zebra balığı embriyolarında Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonuna karşı faj tedavisi nin uygulanmasını açıklamaktadır. Zebra balığı embriyoları, CF embriyolarında öldürücülüğü, bakteriyel yükü ve pro-inflamatuar immün yanıtı azalttığı için faj tedavisinin P. aeruginosa enfeksiyonlarına karşı etkili olduğunu göstermek için P. aeruginosa ile enfekte edildi.
Introduction
Faj tedavisi, bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele için bakterilerin doğal düşmanlarının kullanımı, antibiyotiklere bakteriyel direnç yaygın hale geldikçe yenilenen ilgi topluyor1,2. Bu tedavi, Doğu Avrupa'da yıllardır kullanılan, CF olan hastalarda akciğer enfeksiyonları kür antibiyotikler için tamamlayıcı bir tedavi ve şu anda kullanılan antibiyotikler tüm dirençli bakteriler ile enfekte hastalar için olası bir tedavi alternatif olarak kabul edilebilir2,3. Antibiyotik tedavisinin avantajları bakteriyofajlar enfeksiyon yerinde çoğalmak vardır, antibiyotikler metabolize edilir ve vücuttan ortadan kaldırır ise4,5. Nitekim, farklı laboratuvarlarda izole öldürücü fajlar kokteyllerin uygulanması böcek ve memeliler6,7,,8gibi farklı hayvan modellerinde Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonlarıtedavisinde etkili olduğu kanıtlanmıştır . Faj tedavisi de randomize klinik çalışmada P. aeruginosa ve Escherichia coli ile enfekte yanık yaralarıbakteriyel yükü azaltmak mümkün olduğu gösterilmiştir9.
Zebra balığı(Danio rerio)son zamanlarda p. aeruginosa10,,11, Mycobacterium apse ve Burkolderia cepacia12dahil olmak üzere çeşitli patojenler ile enfeksiyonları incelemek için değerli bir model olarak ortaya çıkmıştır 12,13. Bakterileri doğrudan embriyo kan dolaşımına mikroenjekte ederek14,insan karşısına benzer nötrofiller ve makrofaj oluşumu ile korunmuş olan zebrabalığı doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından etkisiz hale getirilebilen sistemik bir enfeksiyon oluşturmak kolaydır. Ayrıca, yaşamın ilk ayı boyunca, zebra balığı embriyoları adaptif bağışıklık yanıtı eksikliği, onları doğuştan gelen bağışıklık eğitimi için ideal modeller yapma, hangi insan akciğer enfeksiyonları kritik savunmamekanizması15. Zebrabalığı son zamanlarda daha iyi CF başlangıcı anlamak ve yeni farmakolojik tedaviler geliştirmek için güçlü bir genetik model sistemi olarak ortaya çıktı10,16,17. Cftr knock-down CF zebrabalığı knock-down zebrabalığı morfinono enjeksiyonu ile oluşturulan bir sönümlü solunum patlaması yanıtı ve azaltılmış nötrofil göçsundu 10, cftr knock-out bozulmuş iç organ pozisyonu ve ekofrin pankreas imha yol açar ken, insan hastalığı aynalar bir fenotip16,17. En büyük ilgi p. aeruginosa bakteriyel yük önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulma oldu -ctr kaybı-fonksiyon embriyoları 8 saat post-enfeksiyon (hpi), hangi fareler ve insan bronşiyal epitel hücreleri ile elde edilen sonuçlara paralel kontroller daha2,18. cftr
Bu çalışmada, faj tedavisinin zebra balığı embriyolarında P. aeruginosa enfeksiyonlarına karşı etkili olduğunu gösterin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB türünden (Avrupa Zebrabalığı Kaynak Merkezi EZRC) yetişkin zebra balıkları(Danio rerio),bilimsel amaçlariçin kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin uluslararası (AB Direktifi 2010/63/EU) ve ulusal yönergelere (İtalyankararnamesi 4 Mart 2014, n. 26) uygun olarak muhafaza edilmektedir. Standart koşullar 14 saat Açık/10 h karanlık çevrim ve 28 ° C tank su sıcaklığı ile balık tesisinde ayarlanır.
1. Çözüm ve araçların hazırlanması
- Zebra balığı embriyoları yetiştirmek için E3 embriyo ortamı için 50x stok çözümü ve 1x çalışma çözümleri hazırlayın (Bkz. Tablo 1).
- 24 saat sonra döllenme (24 hpf) (Tablo 1bakınız) embriyo pigmentasyon engellemek için, pigmentasyon engelleme çözeltisi olun.
- Tablo 1'deaçıklandığı gibi 25x stok ve 1x çalışma Tricane anestezik çözeltisi hazırlayın.
NOT: Çözeltinin stok çözeltisine zarar verebilecek çözeltinin tekrar tekrar donmasını ve erimesini önlemek için 2 mL 25x tricaine'lik aliquots yapın ve -20 °C'de saklayın. - 100 mL'lik distile H2O'nun mikrowavable bir şişede 1 g agarose'u eriterek embriyo mikroenjeksiyonu için izler hazırlayın. Mikrodalga 1-3 dk agarose tamamen çözülene kadar.
- Zebrabalığı mikroenjeksiyon kalıplarını konumlandırın (bkz. Malzemeler Tablosu)petri kabında (90 mm x 15 mm) ters çevrilmiş ve sıvı agarose jeli yaklaşık 10 mm genişliğe dökerek tüm yüzeyi kaplayın.
- Agarose katıladıktan sonra kalıbı çıkarın. Petri kabını 1x E3 embriyo ortasıyla doldurun. Bu yaklaşık bir hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. Kullanmadan önce Tricaine içeren taze E3 ortamıile değiştirin.
NOT: Eski kalıplarda mantar veya bakteriyel kontaminasyon gelişebilir. - Mikroenjeksiyon için iğnehazırlamak ve kolları sıkarak mikropipet çekmeceonları güvenli için yangın cilalı 10 cm borosilikat kılcal kullanın. Aşağıdaki ayarları ile çekmece ayarlayın: ısı 500, hız 100, zaman 150, çekme 150.
2. P. aeruginosa (PAO1) inokül hazırlama
- GFP+P. aeruginosa zorlanma PAO119 5 mL LB suyu (Tablo 1bakınız) ve sallayarak (200 rpm) ile 37 °C'de bir gecede büyümek 1 koloni aşılayın.
- Yukarıdaki gece kültürünü OD600 = 0,1'e seyreltin 10 mL LB suyu ve 37 °C'de OD600 = 0,5'e kadar sallayarak (200 rpm) büyüyün.
- 16.100 x g'da 4 °C'de 2 dakika boyunca 2 mL'lik kültür ve hücre peletini od600 = 1'e, fizyolojik çözeltinin 1 mL'sine eşdeğer olarak 1 x 109 cfu/mL'ye yeniden askıya alın (Bkz. Tablo 1).
- Hücre süspansiyonuna fizyolojik çözeltide yaklaşık 5 x 107cfu/mL seyreltin ve 4 °C'de saklayın.
3. Faj stok hazırlama
- 1 p. aeruginosa süzme PAO1 kolonisi 5 mL LB suyu ve sarsıntı ile 37 °C gecede kuluçka. Bir gecede kültürü500 mL LB suyu içinde OD 600 = 0,01'e seyreltin ve 37 °C'de od600 = 0,05 ile büyüyün, yaklaşık 2,5 x 107 cfu/mL'ye eşdeğer.
- P. aeruginosaseyreltilmiş kültür için , 10-3enfeksiyon (M.O.I.) çokluğu elde etmek için, yaklaşık 1,25 x 107 fajekleyin. OD600 yaklaşık 0.1-0.3 (yaklaşık 3-5 saat, kullanılan faj bağlı olarak) düşer kadar sallayarak 37 °C'de kuluçka.
NOT: PAO1 türünü etkileyen bu deney için dört faj seçilmiştir: İki Podoviridae, GenBank katılım numaraları vB_PaeP_PYO2, MF490236 ve vB_PaeP_DEV, MF490238 ve iki Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 ve vB_PaeM_E217, MF490240. Her faj için aşağıdaki adımları ayrı ayrı gerçekleştirin. - 37 °C'de 30 dakika boyunca 1 mg/mL DNase ve RNase ile inkübedin. 4 °C'de 30 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve supernatant'ı (SN) dikkatlice kurtarın. SN'yi 0,8 m gözenek çapına sahip bir filtreyle filtreleyin.
- SN'ye 58 g/L NaCl ve 105 g/L PEG6000 ekleyin. RT 20 dk'da karıştırarak eritin ve gece boyunca 4 °C'de tutun. Faj yağışı için 4 °C'de 30 dk için 20, 000 x g santrifüj. SN'yi çıkarın ve faj peletini 15 mL TN tamponunda dikkatlice eritin (Bkz. Tablo 1).
- Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi CsCl yoğunluk gradyanı ile fajları arındırın.
- SW41 rotor için poliallomer ultracentrifuge tüplerde, Tablo 1'detanımlanan dört CsCl çözeltisinin 2 mL'sini tabakalandırarak CsCl adım yoğunluğu gradyanı hazırlayın. 4 tüpün her birine 3,5 mL faj süspansiyonu ekleyin.
NOT: CsCl toksiktir, işlemek ve atmak için uygun güvenlik prosedürleri benimsemek. - Tüpleri rotora tanıtılın ve tüplerin dengeli olduğundan emin olun (iki bakan tüp arasındaki ağırlık farkı 0,01 g ≤ olmalıdır).
- 4 °C ve 100, 000 x g (SW41 rotor için 25.000 rpm) 2 saat için santrifüj. Santrifüjden sonra tüpleri yavaşça çıkarın ve dikkatlice bir destek le hareketsiz hale getirin. 19 G iğneli bir şırınga kullanarak, genellikle d=1.5 ile d=1.4 yoğunluk bölgesi arasında bulunan beyaz/opalescent bandını çizin.
- Şırıngadan gelen süspansiyonları SW60 rotor için yeni poliallomer tüplere aktarın ve tüpleri hassas bir şekilde dengelemek için d=1.4 çözeltisini kullanın.
- Süspansiyonu en az 16 saat boyunca 4 °C ve 150.0000 x g (SW60 rotor için 38.000 rpm) olarak santrifüj edin.
- Yukarıdaki gibi görünür bandı toplayın (bkz. adım 3.3.3) ve 6.000 Da kesme ile diyaliz tüplerine aktarın. Elde edilen görünür bandı 2x 2x'te 500 mL suya karşı 20 dk ve bir gecede 500 mL TN tampona karşı diyalize alın. 0,22 m gözenek filtresi ile filtre uygulayın ve 4 °C'de saklayın.
- SW41 rotor için poliallomer ultracentrifuge tüplerde, Tablo 1'detanımlanan dört CsCl çözeltisinin 2 mL'sini tabakalandırarak CsCl adım yoğunluğu gradyanı hazırlayın. 4 tüpün her birine 3,5 mL faj süspansiyonu ekleyin.
4. Faj kokteyli hazırlama
- Daha önce izole ve karakterize PAO1, bulaşmasını dört fajlar bir karışımını olun8. Karıştırmadan önce, plak tsay20ile her faj stok titresini tahmin .
- Her deneyden hemen önce aynı pfu/mL'de dört faj preparatını eşit olarak karıştırarak, 5 × 108 pfu/mL'lik genel bir titre ile faj kokteylini bir araya getirin ve doğru faj titrelerini sağlayın.
5. Cftr morpholnos mikroenjeksiyon için zebra balığı embriyolarının toplanması ve hazırlanması
NOT: Ctr morpholinos(cftr-MOs) mikroenjeksiyonu için yabani tip zebra balıklarından 1-2 hücreli embriyo toplayın.
- Bakteriyel mikroenjeksiyon deneyiki gün önce, üreme çiftleri kurmak ve daha önce açıklandığı gibi embriyoları toplamak21. AB suş yetişkin zebra balığı(Danio rerio)Avrupa Zebrafish Kaynak Merkezi, EZRC satın alındı.
- Ertesi gün, plastik bir pipet ile döllenme hemen sonra veya ince örgü süzgeç kullanarak embriyolar toplamak. Toplanan embriyoları E3 embriyosu içeren bir Petri kabına yerleştirin ve embriyo gelişimine zarar verebilecek kontaminasyonu önlemek için enkazı plastik bir pipetle dikkatlice çıkarın.
- Steril suda iki morfinno stok çözeltisini (1 mM) 0,25 pmol/embriyo ATG-MO + 0,25 pmol/embriyo splice-MO'ya seyrelterek 5 μL morfin enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. Embriyo enjeksiyonunu takip etmek için, morpholno enjeksiyon çözeltisi karışımına 0.5 μL fenol kırmızısı ekleyin.
- Bir mikroenjeksiyon iğnesini, ince jel yükleme ucuna sahip 20 μL'lik bir mikropipet kullanarak morpholno karışım çözeltisinin yaklaşık 5 0L'si ile yükleyin. İğneyi bir standa bağlanan mikromanipülatöre sabitle ve stereomikroskop altında yerleştirin.
NOT: Mikroenjektör pompasının basıncı onu iteceği için çözeltinin iğnenin ucuna ulaşması gerekli değildir. - İğne ucunu ince steril cımbızla keserek iğnenin ucunu kırpın. Mikroskobun oküler bir ölçek çubuğu kullanarak damla çapını ölçün. Alternatif olarak, bir mikrometre slayt üzerine mineral yağ bir damla oluşturmak ve damlacık boyutunu değerlendirmek için yağ damla içine çözelti enjekte ederek mikroenjeksiyon hacmi ayarlayın. 2 nL hacim enjekte etmek için 156 μm çapında bir damla kullanın.
- Kullanılan iğneye bağlı olarak doğru enjeksiyon hacmini elde etmek için kompanzasyon basıncını 15 hPa'ya, enjeksiyon süresini 0,5 s'e ve enjeksiyon basıncını 300 ile 600 hPa arasında ayarlayarak mikroenjektörü ayarlayın.
- Plastik bir pipet ile embriyoları adım 5.2'den 96 mm çapında ki Petri kabına yerleştirilmiş bir camın üzerine yerleştirin.
NOT: Çok fazla E3 orta embriyoların chorion içine mikroenjeksiyon iğne uygun penetrasyon önleyecektir. - Daha önce açıklandığı gibi embriyo içine 2 nL enjekte etmek için chorion ve daha sonra iğne ile sarısı nüfuz22.
- Enjekte edilen embriyoları E3 orta ile petri kabına yerleştirin ve 28 °C'de bir kuvöze koyarak ertesi güne kadar geliştirmelerini sağlar.
6. Bakteri ve faj kokteyli ile zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyonu
NOT: Sistemik bir enfeksiyon gerçekleştirmek için, embriyo genellikle 26 hpf sonra başlar kan dolaşımı na sahip olmalıdır.
- Sonra 26 hpf (zebrabalığı gelişim aşamalarında Kimmel bakın21)pronase çözeltisi ile pronase çözeltisi ile pronase tozu 2 mg / mL konsantrasyonda E3 ortamda eriterek hazırlanan embriyolar. Yavaşça chorion kırmak için embriyolar pipet. Pronase/E3 ortamını atın ve tüm pronase'yi çıkarmak için yemeği taze E3 ile birkaç kez durulayın.
- E3 ortamda anti-balık embriyoları anestezi ktrikoin içeren yaklaşık 5 dk önce enjeksiyonlar.
- Pipet anestezi embriyoları parça içine adım 1 hazırlanan. Yanal pozisyonda embriyolar hattı için ince bir jel yükleme ucu kullanın.
- Bölüm 5'te açıklandığı gibi p. aeruginosa preparatının yaklaşık 5 μL'si ile bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.
- İğneyi, sarısı kesesinin üzerine yayılmaya başladığı Cuvier kanalının başlangıç noktasına yerleştirin. 1-3 nL hacim enjekte edin ve hacmin doğrudan kanal içinde genişleyip dolaşıma girmesini sağlayın.
- Enjekte edilen her 50 embriyodan yaklaşık olarak sonra, enjeksiyon hacminin aynı kalıp karip karip devam edip etmeyin kontrol etmek için 100 μL steril PBS ile 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne bir damla bakteri enjekte edin. CFU'yu değerlendirmek için bir gecede 37 °C'de LB agar Üzerinde inoculum plakası (Bkz. Tablo 1).
- Mikroenjekte edilmiş embriyoları taze E3 orta + PTU ile iki temiz Petri kabına aktarın ve 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Seçilen iki zaman noktasında: bakteri enjeksiyonundan 30 dakika veya 3 saat sonra, Petri yemeklerinden birini kuvözden bakteri enjekte edilmiş embriyolarla dışarı atın ve 6.3'te faj kokteyli enjeksiyonu için açıklandığı şekilde pistte hizalayın.
- Bir mikroenjeksiyon iğnesini, faj kokteylinin yaklaşık 5 μL'si (adım 4'te hazırlanmış) ince bir jel yükleme ucuyla yükleyin ve mikroenjektöre sabitleştirin (bkz. adım 5).
- Daha önce bakteri enjekte embriyoların Cuvier kanalında faj kokteylenjekte.
- Mikroenjekte edilmiş embriyoları taze E3 orta + PTU ile iki temiz Petri kabına aktarın ve 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
7. PAO1 ve fajlar enjekte edilen embriyoların bakteriyükünün değerlendirilmesi
- 8 hpi'de pipet 15 anestezili embriyo Petri kabından 1,5 mL santrifüj tüpüne kadar uzanır.
- Anestezik solüsyonu PBS 'de (PBSTritonX) 300 μL %1 Triton X-100 ile değiştirin ve embriyoları en az 15x insülin şırıngasından steril 27-G iğneile geçirerek homojenize edin.
- Seyreltilmiş homojenin 100 μL'sini steril PBS'nin 900 μL'lik kısmına aktararak steril PBS'deki homojenlerin seri seyreltmelerini hazırlayın.
- Doğal olarak amp-dirençli PAO1 suşu için seçmek için, lb agar üzerindeki seyreltmelerin plakası 100 μL ampisilin (100 μg/mL) ile eklenir ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün, kolonilerin sayısını sayın, cfu toplam sayısını belirlemek için seyreltme faktörü ile çarpmak ve CFU / enfekte embriyo ortalama sayısını elde etmek için homojenize embriyo sayısı ile bölün.
8. PAO1 ve fajenjekte edilen embriyoların öldürücülüğünün değerlendirilmesi
- PAO1 enfeksiyonunun ölümcüllüğünü değerlendirmek için enjekte edilen embriyoları stereomikroskop altında 20 hpi olarak puanlandırın ve ölü embriyolar için sayıyapın (beyaz/saydam değil).
- Enjekte edilen embriyoların %50'sinin 20 hpf'de ölümünü belirleyen pao1'in 50 (LD50) dozu yarı maksimal öldürücü konsantrasyonunu hesaplayın.
9. GFP+ PAO1 enfeksiyonunun stereomikroskop zaman atlamalı görüntülemesi için embriyo hazırlığı
- 100 mL E3 çözeltisinde %1.5 düşük erime agaroseer eriterek canlı embriyo görüntüleme için kalıbı önceden değiştirin.
- Embriyoları anestezik için %1 Tricaine ekleyin (bkz. Tablo 1).
- At 4 hpi bir cam alt çanak plastik bir pipet ile bir embriyo transferi ve sıcak düşük erime noktası agarose çözeltisi ekleyin.
- Cam alt çanağı stereomikroskop altında yerleştirin ve bir uç ile embriyoyu istenilen yönde konumlandırın. Dikkatle embriyo agarose bir damla eklemek için plastik bir pipet kullanın.
- Agarose 5-10 dakika soğumasını bekleyin ve yavaşça embriyo nemli tutmak için anestezik çözelti içeren E3 ile cam alt çanak doldurun.
- GFP+ bakteriler için floresan filtre (kanal 488 nm) ile floresan stereomikroskop altında embriyo ile cam alt çanak yerleştirin. 9, 14 ve 18 hpi aynı parametrelere sahip daha fazla satın alma kadar Petri çanak çıkarmayın.
10. Pro-inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu analizleri
- 20 hpi tricaine 1x çözeltisi ile embriyolar anestezi ve Petri çanak bir 1.5 mL santrifüj tüpü onları transfer.
- Bir duman kaputunun altında anestezik çözeltiyi çıkarın ve 200 μL guanidium hidroklorür reaktifi ile değiştirin.
- Embriyoları önce 200 μL'lik bir pipet, sonra en az 15 x steril 27 G iğneli bir insülin şırıngası ile tekrar tekrar pipetleyerek homojenize edin.
- Üreticinin talimatları uyarınca, ticari olarak kullanılabilen guanidium hidroklorür reaktiflerini kullanarak homojenize edilmiş zebra balığı embriyolarından toplam RNA ayıklayın.
- Üreticinin talimatlarına uyarak, her RNA örneğinin 1 μg'sini 2 μL 1U/μL DNase I (RNase-free) ile tedavi edin.
- Üreticinin talimatlarına göre toplam 20 μL hacimde, ticari olarak kullanılabilen kiti (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanarak ters transkripsiyon reaksiyonu (RT) için RNA'yı 1 μg DNa'yı tedavi ettim.
- RT reaksiyonunun 1:6 seyreltilmesinin 1,5 μL'sini kullanarak 1x SYBR Green mastermix içeren 10 μL'lik toplam hacimde RT qPCR reaksiyonu gerçekleştirin. Normalleştirme amacıyla, ev tutma genleri rpl8 ve pro-inflamatuar sitokinler için astarkullanın, TNF-α ve IL-1β için astar kullanın (Tablo 2'yebakınız). qPCR protokolü oldu: döngü 1 adım 1: 95 °C, 2 dk, bir kez tekrarlayın; döngüsü 2: adım 1 95 °C, 10 s, adım 2 55 °C, 30 s, tekrar 40x; döngüsü 3: adım 1 72 °C, 15 dk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan sonuçlar ve rakamlar cftr morfonoenjeksiyonu ile üretilen CF embriyolarına daha önce10 ve adım 5'te açıklandığı gibi atıfta bulunulmuştur. CF fenotipini doğrulamak için, daha önce açıklandığı gibi kalp, karaciğer ve pankreas gibi iç organların bozulmuş pozisyonu17 (Şekil 1)dikkate alındı. Benzer sonuçlar, önceki yayınımızda bildirilen WT embriyoları durumunda elde edilebildi19.
PAO1 ile enfekte CF embriyolarında faj tedavisi ile bakteriyel yük azaltıldı. Ayrıca, 15 embriyodan oluşan grupları homojenleştirerek 8 hpi'deki bakteri yükünü değerlendirdik: PAO1 enfekte embriyolarda bulunan ortalama bakteri sayısı (cfu/embriyo) faj uygulaması ndan sonra yaklaşık %20'ye düşürüldü, böylece faj kokteylinin varlığında daha az ciddi bir enfeksiyonu doğruladık (Şekil 2).
GFP+ bakteri PAO1 ile enfekte CF embriyolarda faj tedavisi ile öldürücülük azaltıldı. CF zebra balığı embriyoları 48 hpf 20 hpi (30 cfu/ embriyo, Şekil 3A)sonra% 50 öldürücü neden bir dozda PAO1 suşu GFP+ bakteri enjekte edildi. Enjeksiyon yeri, sistemik bir enfeksiyon oluşturmak için yutk veya Cuvier Kanalı'ydı. PAO1 enfeksiyonuna karşı faj tedavisi eşit karışık faj kokteyli (300-500 pfu/embriyo) 2 nL enjekte edilerek test edildi. Enjeksiyon iki farklı zaman noktasında yapıldı: 30 dk (erken) ve 7 saat (geç) bakteriyel enjeksiyon dan sonra. Her iki durumda da öldürücülük 20 hpi'de azaltıldı ve bu da faj tedavisinin etkili olduğunu gösterdi (Şekil 3B).
Canlı görüntüleme ile, floresan stereomikroskop kullanarak, biz de Cf embriyolarda GFP+ PAO1 enjekte enfeksiyon ilerlemesini takip ve yumurta kesesi üzerinde floresan bakterilerin yayılmasını azaltmada faj tedavisinin etkinliğini gösterdi. CF+PAO1 enjekte edilen embriyo 4, 9, 14 ve 18 hpi'de GFP+ bakteri çoğalması Şekil 4'ünüst tarafında gösterilirken, bakterilere karşı faj hareketi nedeniyle daha az floresan olan CF+PAO1+faj embriyosu alt kısımda gösterilmiştir (Şekil 4).
Faj tedavisi CF embriyolarında PAO1 enfeksiyonunun oluşturduğu inflamatuar yanıtı azalttı. Biz, ayrıca, PAO1 ve PAO1 tarafından oluşturulan bağışıklık yanıtı değerlendirildi + fajlar enjeksiyonu 8 hpi. Beklendiği gibi, qPCR teknikleri ile analiz edilen pro-inflamatuar sitokinlerin TNF-a ve IL-1β ekspresyonu pao1 enjeksiyonu sonrasında kontrollere göre önemli ölçüde artmış, faj kokteylinin eş enjeksiyonu ile azalmıştır(Şekil 5A,B).
Şekil 1: Cftr morfono(cftr-MOs) enjeksiyonu üzerine CF embriyolarının üretimi ve doğrulanması. (A) CF'de kalbin pozisyonu nun bozulması ve döngüye salınan embriyolar, yabani tip (WT) embriyolara göre. Kalp in situ hibridizasyon tekniği ile cmlc2 ekspresyonu ilegörselleştirilmektedir. (B) Cf embriyolarında karaciğer (ok) ve pankreasın WT. Karaciğer ve pankreasa göre bozulmuş pozisyonu in situ hibridizasyon teknikleri ile prox1a ekspresyonu ile görselleştirilmelerinde. Ölçek çubukları 100 μm'yi gösterir. liv: karaciğer; p: pankreas. Rakam19'danitibaren yeniden basılmıştır Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PAO1 veya PAO1+fajları ile enfekte CF embriyolarında bakteriyel yük.. PAO1+fajlarda cfu/embriyonun göreceli yüzdesi PAO1 embriyolarına göredir. Üç bağımsız deneyin ortalaması ve SD'si bildirilmiştir. Rakam19'danyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PAO1 ve PAO1+fajları ile enfekte CF zebra balığı embriyolarının öldürücülüğü. (A) LD50 tayini 48 hpf zebrabalığı embriyoları 1 hücreli aşamada cftr-MO ile mikroenjekte ve 48 hpf pao1 kültürünün 2 nL ile enfekte artan sayıda bakteri içeren (cfu / embriyo). Embriyoların öldürücülüğü 20 hpi idi. (B) 48 hpf'de PAO1 ile enfekte olan ve faj kokteyli (PAO1+ Φ)ile tedavi edilen CF embriyolarının 20 hpi'si öldürücüdür. Ortalama ve SD rapor altı ve dört deneyler, sırasıyla, her biri 25-40 embriyo ile vardır. Öldürücülük yüzdesine açısal dönüşüm uygulandı ve duncan testi nin ardından tek yönlü ANOVA kullanıldı. Rakam19'danyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Zebra balıklarında faj tedavisinin etkinliğinin görüntülenmesi. PAO1 enjeksiyonu (üst embriyo) ve PAO1+fajlarda faj tedavisinin etkinliği sonrasında CF embriyolarında enfeksiyonun ilerlemesi 4, 9, 14 ve 18 hpi'de enjekte edilen embriyolara (alt embriyo) enjekte edildi. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. Rakam19'danyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: PAO1 ve PAO+faj uygulamasından sonra pro- ve anti-inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu. 48 hpf'de PAO1 ve PAO1+Φ enjekte edilen CF embriyolarında RT-qPCR ile ölçülen TNF-a (A) ve IL-1β genlerinin ekspresyon düzeyleri 48 hpf'de normale döndü. Dört deneyin ortalaması ve SD'si bildirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık ANOVA tarafından Duncan testi ile değerlendirildi: TNF-a (CF) vs (CF+PAO1) p = 0.015*; (CF) vs (CF+PAO1+Φ) p = 0.019*; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,77 n.s.; IL-1β (CF) vs (CF+PAO1) p = 0.00014*** için; (CF) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0.00068***; (CF+PAO1) vs (CF+PAO1+ Φ) p = 0,031*. Rakam19'danyeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözümleri | Hazırlık |
| Anestezik stok çözeltisi 25X | Distile H2O'da 4 mg/mL Tricaine. |
| Anestezik çalışma solüsyonu 1X | distile H2O Tricaine stok çözeltisi seyreltmek 25X hazırlık 1X konsantrasyonu ulaşmak için (0.16 mg /mL) Distile H2O Tricaine. |
| CsCl d=1.3 | 50 mL TN'de 20,49 g |
| CsCl d=1.4 | 50 mL TN'de 20,28 g |
| CsCl d=1.5 | 50 mL TN'de 34,13 g |
| CsCl d=1.6 | TN 50 mL 41.2 g |
| Zebra balığı embriyosu için E3 embriyo orta | 1 L 1of E3 (distile H2O ile 50X stok seyreltmek) + 200 μl 0.05% metil mavi . RT'de saklayın. |
| E3 embriyo orta stok çözeltisi (50X) | 73.0 g NaCl, 3.15 g KCl , 9.15 g CaCl2 , ve 9.95 g MgSO4 5 L distile H2O. Mağaza RT. |
| LB agar | 10 g/L tripto, 5 g/L maya özü, 5 g/L NaCl, 10 g/L agar |
| LB suyu | 1L için: 950 mL H2O, 10 g Tripton, 10 g NaCl, 5 g Maya özü |
| PBST | PBS 1X + Triton X %1 |
| Fizyolojik çözüm | %0.9 NaCl |
| Pigmentasyon engelleme stok çözeltisi 10X | Zebrabalığı embriyosu için E3 embriyo ortasında 0.3 mg/mL fenil timuze (PTU) tozu |
| Pronase stok çözümü 5X | Zebra balığı embriyosu için E3 embriyo ortasında 5 mg/mL pronase tozu |
| TN arabelleği | 10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl |
Tablo 1: Çözümlerin hazırlanması.
| Gen adı | Astar dizisi |
| TNF-alfa Fw | 5'-TGCTTCACGCTCCATAAGACC-3' |
| TNFalpha Devir | 5'-CAAGCCACCTGAAGAAAAGG-3' |
| IL1-beta Fw | 5'-TGGACTTCGCAGCACAAAATG-3' |
| IL1-beta Rev | 5'-CGTTCACTTCACGCTTGGATG-3' |
| rpl8 Fw | 5'-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3' |
| rpl8 Devir | 5'-TCCTTCACGATCCCCTTGAT-3' |
Tablo 2: RT-qPCR için kullanılan astarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, zebra balığı embriyolarında P. aeruginosa (PAO1) enfeksiyonu nun nasıl uygulanacağı ve daha önce PAO1'e bulaşabildiği tespit edilen bir faj kokteyli ile faj tedavisinin nasıl uygulanacağı protokolünü açıklanmıştır. Antibiyotik tedavisine alternatif olarak bakteriyofajkullanımı son birkaç yıldır artan ilgi olmuştur. Bunun başlıca nedeni, halk sağlığı için ciddi bir sorun teşkil eden çoklu ilaca dirençli (MDR) bakteriyel enfeksiyonların yayılmasıdır. Tabii ki, bu çalışmanın kapsamı bir hayvan modeli değil, insanlar için faj tedavisi nin uygulanması ile sınırlıdır. Ancak, cftr genini hedef alan bir morfolino enjeksiyonu ile kistik fibrozis zebrabalığı modeli oluşturduk, özellikle P.aeruginosa enfeksiyonuna duyarlı bir patogenetik modelde faj tedavisinin etkinliğini gösterdik.
Biz kolayca faj tedavisi elde edebileceğimizdikkat etmektir, bir önceki çalışmada olduğu gibi, biz izole ve farklı fajlar hem in vitro ve in vivo8 P. aeruginosa bulaşabilir karakterize . Bu adım fajların antimikrobiyal aktivitesini elde etmek için temel dir. Belirli bir bakteriyel suşa bulaşabilen fajların izolasyonu ve karakterizasyonu faj tedavisi uygulamasının kritik adımlarıdır. Gerçekten de fajların hayvan/insan konakları üzerindeki olumsuz etkilerini önlemek için lisojenik yerine litik fajlar kullanılması gerekmektedir. En önemlisi, antibiyotik direnci, virülans ve gen transferi için zararlı genlerin varlığı için faj genomları kontrol etmek gereklidir.
Faj tedavisi zaten başarıyla diğer hayvan modellerinde kullanılmıştır. Zebra balığının memeli bir model olmadığının bilincindeyiz ve fajların bazı etkileri farklı olabilir. Ancak, zebra balık nötrofiller ve makrofajlar23korunmuş bir nüfusa sahip insan ile karşılaştırılabilir doğuştan gelen bir bağışıklık sistemine sahip olduğundan, biz bağışıklık yanıtı verileri insanlarda tekrarlanabilir olabilir spekülasyon. Ayrıca, zebra balığı iyi bakteriyel enfeksiyon çalışmaları için değerlendirilir, faj tedavisi etkinliği için bir test olarak kullanımı terapötik yaklaşımlar için umut verici olabilir. Gerçekten de, bakteri Cuvier Kanalı ile dolaşıma enjekte edilirse enfeksiyon sistemik olabilir, ya da bildirilen olarak lokalize17. Hem sistemik hem de lokalize enfeksiyonlar uyguladık ve faj tedavisi uygulaması sonrasında her ikisi de azalan öldürücüve bakteriyel yükün arttığını gösterdik. Ayrıca, GFP+ floresan PAO1 bakterienjekte edildiğinden, embriyo gelişiminin farklı zaman noktalarında, fajlar enjekte edildiğinde floresan bakterilerin azalmayı doğrulayan enfeksiyonu takip etmek kolaydı.
Bilgimiz için, bu zebra balığı faj tedavisi uygulamasının ilk açıklamasıdır, bir CF arka planda P. aeruginosa karşı fajantimikrobiyal aktivite gösteri için katma değer ile, özellikle bu bakteriyel enfeksiyona duyarlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma İtalyan Kistik Fibrozis Vakfı tarafından desteklenmiştir (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo ve FFC#23/2019; Più Onlus La Mano tesa Onlus içinde Un respiro).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T.
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
