Summary
يستخدم هذا البروتوكول المروج الفلورسنت المراسلين، والمجهر الخلية الحية، واستخراج إدراج الفردية في نهج توجيهها إلى الأمام الجينية لتحديد وعزل المسوخ التنموية من التراسماتية الكلاميديا.
Abstract
يخضع مسببات الأمراض البكتيرية داخل الخلايا Chlamydia trachomatis لدورة تنموية تتكون من شكلين من أشكال النمو المنفصلة من الناحية الشكلية. الجسم الابتدائي غير replicative (EB) يبدأ العدوى من المضيف. مرة واحدة داخل, EB يفرق في الجسم التشنجي (RB). يخضع RB بعد ذلك لجولات متعددة من النسخ المتماثل، قبل التمييز مرة أخرى إلى شكل EB المعدية. هذه الدورة ضرورية لبقاء الكلاميديا حيث أن الفشل في التبديل بين أنواع الخلايا يمنع غزو المضيف أو النسخ المتماثل.
وقد أعاقت القيود في التقنيات الوراثية بسبب الطبيعة الملزمة داخل الخلايا من الكلاميديا تحديد الآليات الجزيئية المشاركة في تطوير نوع الخلية. لقد صممنا نظامًا جديدًا مزدوجًا للمروج والمراسل الذي يسمح ، بالاقتران مع المجهر الحي للخلايا ، بالتصور من نوع الخلية في الوقت الحقيقي. ولتحديد الجينات المشاركة في تنظيم تطوير نوع الخلية، تم الاستفادة من نظام المراسلات -المراسلات الحية لتطوير نهج وراثي أمامي من خلال الجمع بين الطفرات الكيميائية من سلالة المراسلين المزدوجين، والتصوير وتتبع الكلاميديا مع الحركية التنموية المتغيرة، تليها العزلة الزناة من المسوخ. هذا سير العمل الجيني المتقدم هو أداة مرنة يمكن تعديلها لاستجوابات موجهة إلى مجموعة واسعة من المسارات الوراثية.
Introduction
الكلاميديا تراشوماتيس (Ctr) هو عامل أمراض داخل الخلايا ملزم يتقدم من خلال دورة تنموية ثنائية الطور ضرورية لبقائهاوانتشارها 1. تتكون هذه الدورة من شكلين من أشكال النمو، الجسم الابتدائي (EB) والجسم الـ reticulate (RB). EB هو غير كفء النسخ المتماثل ولكن يتوسط غزو الخلية من خلال endocytosis الناجم عن المفعول2. مرة واحدة في المضيف، وEB ينضج إلى RB النسخ المتماثل. يقوم RB بإجراء جولات متعددة من النسخ قبل التحويل مرة أخرى إلى EB من أجل بدء جولات لاحقة من العدوى.
وقد حصرت مجموعة محدودة من الأدوات الوراثية معظم البحوث الكلاميدية للدراسات الكيميائية الحيوية أو استخدام أنظمة بديلة. ونتيجة لذلك، كان توضيح تنظيم الجينات والسيطرة على دورة النمو صعبة3،4. أحد أهم التحديات في مجال الكلاميديا هو التتبع الزمني عالي الدقة للدورة التنموية الكلاميدية وتحديد البروتينات المشاركة في تنظيمها. وقد تم عادة التعبير الجيني خلال الدورة التنموية الكلاميدية التي أجريت بطرق "نقطة النهاية" المدمرة بما في ذلك RNAseq، qPCR، والمجهر الخلية الثابتة5،6. على الرغم من أن هذه الأساليب قد وفرت معلومات لا تقدر بثمن ، والأساليب المستخدمة شاقة ولها دقة زمنية منخفضة5،6.
خلال العقد الماضي، وقد تقدمت التلاعب الجينية من Ctr مع إدخال التحول plasmid وأساليب لطفرات7،8،9. لهذه الدراسة، تم تطوير نظام قائم على البلازميد لرصد التطور الكلاميدي في التضمينات الفردية في الوقت الحقيقي على مدار العدوى. تم إنشاء محول الكلاميدي الذي أعرب عن كل من RB وEB خلية نوع محددة المروج مراسل. تم بناء مراسل RB محددة عن طريق دمج المروج من أوائل جين RB يوو المنبع من بروتين الفلورسنت كلوفر. EUO هو منظم النسخ الذي يقمع مجموعة فرعية من الجينات المرتبطة EBالمتأخرة 10. المروج من hctB، الذي يشفّر بروتين يشبه هيستون المشاركة في التكثيف النوكلويد EB ، تم استنساخه مباشرة من المنبع mKate2 (RFP) لإنشاء مراسل EB محددة11. وكان العمود الفقري للهركتبحفلة موسيقية- mKate2 /أووحفلة موسيقية-كلوفر p2TK2SW27. تم تضخيم المروجين hctB ويوو من الحمض النووي الجينوم Ctr-L2. وتألفت كل تسلسل المروج من ~ 100 أزواج قاعدة المنبع من موقع بدء النسخ المتوقع للجين الكلاميديال المحدد بالإضافة إلى أول 30 نووكليوتيد (10 الأحماض الأمينية) من ORF المعنية. تم الحصول على متغيرات FP الفلورسنت تجاريا كتل الجينات Codon Codon الأمثل و المستنسخة في الإطار مع أول 30 نوى كل الجينات الكلاميدية والمروج. تم استنساخ المدمر incD مباشرة المصب mKate2. تم إدراج المروج الثاني - مراسل المصب من فاصل incD. تم استبدال الجين مقاومة الأمبيسيلين(bla)في p2TK2SW2 مع الجين aadA (مقاومة سبيتينوميسين) من pBam4. وأدى ذلك إلى بناء النهائي P2TK2 -hctBحفلة موسيقية - mKate2 /أووحفلة موسيقية - كلوفر(الشكل 1A)التي تحولت إلى Ctr - L27. هذا RB / EB سلالة مراسل يسمح لمراقبة دورة النمو داخل إدراج واحد باستخدام المجهر الخلية الحية(الشكل 1B, C).
توظيف لدينا المروج مراسل بناء في تركيبة مع الطفرات الكيميائية، تم وضع بروتوكول لتتبع وعزل المستنسخين الفردية التي أظهرت تشوهات النمو من السكان المطفرة من Ctr serovar L2. يسمح هذا البروتوكول بالرصد المباشر للتضمينات الكلاميدية الفردية ، وتتبع ملامح التعبير الجيني بمرور الوقت ، وتحديد المستنسخات الكلاميدية التي تعبر عن نمط تعبير جيني تنموي معدل ، والعزلة الزناة من الكلاميديا من الشوائب الفردية.
على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم إنشاؤه خصيصا لتحديد الجينات المشاركة في التنمية الكلاميدية، فإنه يمكن تكييفها بسهولة لاستجواب أي عدد من المسارات الوراثية الكلاميدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تتوفر جميع البرامج النصية Python المستخدمة في هذا البروتوكول على Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. موتاجنيز مراسل الكلاميديا
ملاحظة: كان منشطاً مباشرة Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs باستخدام الإيثيل الميثانية (EMS) في وسائل الإعلام axenic CIP-1 حيث أن هذه الوسائط تدعم عملية التمثيل الغذائي EB والحفاظ على12.
- ذوبان الأسهم الكلاميدية على الجليد يحتوي على ~ 3 × 107 7 EBs تحولت مع p2TK2 -hctBprom-mKate2/أووprom-Clover مراسل plasmid وبيليه في > 14،000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 °C.
ملاحظة: كانت كائنات الكلاميديا المستخدمة في هذه التجارب 30٪ كثافة renografin تنقيتها ومجمدة في -80 درجة مئوية في 1x السكروز والفوسفات والغلوتامات العازلة (SPG). - تجاهل supernatant و resuspend بيليه EB في 100 ميكرولتر من CIP-1 العازلة مع سونيكيشن على الجليد في 10٪ السلطة لمدة 10 ق. تقسيم 100 ميكرولتر من تعليق EB إلى اثنين من 50 ميكرولتر aliquots لعينات مُمَتَعة ومُعالجة وهمية.
- إعداد 20 ملغ / مل من EMS-CIP-1 حل في أنبوب 1.5 مل ميكروسنتريفوغي. للقيام بذلك، إضافة 6.8 μL من EMS في 375 μL الحجم الكلي.
- أضف 50 ميكرولتر من حل EMS-CIP-1 إلى واحد من اسكوتات الكلاميدية للطفرات و50 ميكرولتر من CIP-1 فقط إلى aliquot الكلاميديال الآخر للطفرات الوهمية.
ملاحظة: تركيز EMS النهائي هو 10 ملغ / مل. إن التتر الكلاميدي، وتركيز نظم الإدارة البيئية، ووقت التعرض المستخدم في هذا البروتوكول يؤدي إلى انخفاض بنسبة 60-80٪ تقريبًا في ذرية العدوى. هذا المستوى من الانخفاض يتوافق مع ~ 5-20 آفات الحمض النووي لكل الجينوم الكلاميدي8. - احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وسوف تستخدم المواد الإلكترونية المُعدَّلة للعدوى مباشرة لتصيب الطبقات الأحادية في القسم 2.
تنبيه: EMS هو مادة مسرطنة معروفة. يجب أن تكون غارقة في جميع المعدات والمواد التي تأتي في اتصال مع EMS في 1 M NaOH لمدة 24 ساعة قبل التخلص منها، وينبغي استخدام القفازات في جميع الأوقات خلال البروتوكول وتنظيف المواد EMS.
2. التصوير من طفرات Ctr
- ثقافة الخلية المضيفة للتصوير وعزل Ctr المُستَطيل
- بذور 6 بئر لوحة القاع الزجاج مع 6 × 105 Cos-7 الخلايا (ATCC) في بئر في 2 مل من وسائل الإعلام كاملة (RPMI-1640 تكملها 10٪ مصل الأبقار الجنين و 10 ملغم / مل جنتاميسين). استخدام هذه اللوحة الزجاجي السفلي لتصوير Ctr المُتَمَحَّة.
- بذور 24 لوحة البوليسترين جيدا مع 1 × 105 Cos-7 الخلايا (ATCC) في بئر في 1 مل وسائل الإعلام كاملة. استخدام هذا لوحة البوليسترين لإعادة الإصابة الكلاميديا المعزولة من الفائدة.
- احتضان كل من لوحات في 5٪ CO2، 37 درجة مئوية لحوالي 18 ساعة. وبمجرد وصول الخلايا إلى التقاء، استبدل الوسائط بوسائط كاملة تكملها 1 ميكروغرام/مل من السيكلوهيكسيميد واحتضانها بين عشية وضحاها.
- إصابة ثقافة الخلية المضيفة بـ Ctr المُصابة بالطفرات
- تصيب 5 آبار من لوحة القاع الزجاجي مع ~ 6 × 105 من المواد الإهتيازية المُتَمَرَّعة في 1.5 مل/هد الجليد البارد HBSS. وهذا سيؤدي إلى وزارة الداخلية من ~ 0.3 كما ~ 70٪ معدل الوفيات المتوقع بسبب الطفرات.
- تصيب ما تبقى جيدا مع ~ 2 × 105 وهمية مطفرة EBs في 1.5 مل / جيدا الجليد HBSS الباردة. دون الطفرات، نتوقع أقل الوفيات، وبالتالي يتم استخدام ثلث inoculum لتحقيق وزارة الداخلية من ~ 0.3.
ملاحظة: تضمن وزارة الداخلية 0.3 ~ أن الخلايا المضيفة مصابة بـ EB واحد وتسمح بالفصل الكافي بين الخلايا المصابة لعزلها. - احتضان لوحة لمدة 15 دقيقة، مع هزاز، في 37 درجة مئوية.
- غسل الخلايا المضيفة المصابة مع ما قبل الدفء (37 درجة مئوية) HBSS تحتوي على 1 ملغ / مل الهيبارين تليها على الفور شطف HBSS. كرر غسل الهيبارين، على الفور شطف 2x مع HBSS لضمان إزالة الهيبارين.
ملاحظة: Heparin يمنع ويمكن عكس التفاعلات الكهروستاتيكية في وقت مبكر بين الخلية المضيفة وEBs13. يغسل الهيبارين إزالة EBs التي لم تدخل بعد الخلايا المضيفة، ومزامنة العدوى. عندما غسل الخلايا تفعل ذلك بلطف لمنع طرد الخلايا من سطح الآبار. تحتوي حلول HBSS والهبارين على مخلفات EMS ويجب وضعها في قارص تحتوي على 1 M NaOH لمدة 24 ساعة قبل التخلص منها. - استبدال HBSS مع 4 مل / بئر من قبل الدفء (37 درجة مئوية) وسائل الاعلام التصوير (وسائل الاعلام كاملة، 1 ميكروغرام / مل cycloheximide ، 20 M HPES ، وليس أحمر الفينول).
- ملء المساحات interwell مع ما قبل الدفء (37 درجة مئوية) deionized H2O للمساعدة في التحكم في درجة الحرارة والحد من التبخر. احتضان لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ل 10 ح.
- إعداد المجهر والتصوير
ملاحظة: يتم استخدام التصوير الفلوري الآلي متعدد الألوان متعدد الألوان للخلايا الحية لجمع صور الفاصل الزمني لتحديد المسوخ الكلاميدية التي تختلف في ديناميكيات التعبير الجيني التنموي. يستخدم هذا البروتوكول حزمة برامج μManager مفتوحة المصدر للتحكم الآلي في المجهر14.- بدء إعداد المجهر 10 ح بعد العدوى. تعيين حاضنة مرحلة المجهر إلى 5٪ CO2، 37 درجة مئوية. وضع المصابة 6 لوحة القاع الزجاجي جيدا في حاضنة المرحلة وإدراج ثيرمستور عينة في إنترويل H2O.
- معايرة المرحلة XY باستخدام عالية المحتوى فحص(HCS)المساعد. انقر على الإضافات | أدوات الاستحواذ | HCS موقع مولد في μManager برنامج التحكم في المجهر (JoVE61365_screenfile1 ، JoVE61365_screenfile2).
- حدد قالب لوحة 6-well وإنشاء قائمة موضع التصوير تتكون من 12 حقول الرؤية (FOV) في جيدا داخل البرنامج المساعد HCS (JoVE61365_screenfile3، JoVE61365_screenfile4). فتح قائمة موضع المرحلة والتركيز يدويا وتعيين موقف Z الأولية لكل FOV باستخدام البرنامج المساعد التحكم في المرحلة (JoVE61365_screenfile5، JoVE61365_screenfile6). ضبط إحداثيات س ص من أي FOV التي تحتوي على خلايا مفقودة أو لا يحتوي على أحادية الطبقات موحدة.
ملاحظة: نظراً للوقت الذي يستغرقه كل صورة ليتم التقاطها، يمكن أن يتم أخذ الحد الأقصى لعدد 72 FOV لكل فاصل زمني 30 دقيقة. - استخدم عدسة 20x الهدف للتصوير. يسمح هذا التكبير ~ 8 إدراج أن تكون صورة لكل FOV في حين لا تزال توفر القرار المطلوب.
- حفظ قائمة المناصب حيث سيتم استخدام هذا لتحديد موقع إدراجات الفائدة بعد تحليل البيانات (JoVE61365_screenfile7).
- استخدم خيار التركيز التلقائي في برنامج التصوير، لتعيين التركيز على التصوير التلقائي(JoVE61365_screenfile8).
- استخدم التحديدات والقيم التالية لإنتاج نتائج التركيز الأكثر اتساقًا باستخدام التركيز البؤري التلقائي المستند إلى الصورة في μManager. في نافذة خصائص التركيز التلقائي حدد OughtaFocus من القائمة المنسدلة واستخدم الإعدادات التالية. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350، OughtaFocus-Tolerance_μm: 0.5، OughtaFocusCropFactor: 0.3، OughtaFocus-التعرض: 20، OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5، OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14، OughtaFocus-ShowImages: نعم، OughtaFocus-تكبير: شاربججيس، OughtaFocus-channel: DIC.
ملاحظة: تقليل نافذة تصوير التركيز التلقائي عن طريق تقليل عامل الاقتصاص يسمح بتركيز تلقائي أكثر اتساقًا. تحديد نعم ل OughtaFocus-ShowImages يسمح للمستخدم لعرض صورة التركيز التلقائي. - التقاط الحركية من دورة النمو عن طريق التصوير لمدة 24 ساعة مع 30 دقيقة من الفترات الزمنية (JoVE61365_screenfile9). التصوير بين 12-36 HPI يضمن أن الكلاميديا يكمل دورة النمو ولكن لا lyse الخلية المضيفة.
- صورة أحادية الخلية مع التعرض 250 مللي في 4٪ وكثافة 18٪ في قنوات GFP وRFP، على التوالي (JoVE61365_screenfile10). الكشف عن إشارة كلوفر (GFP) عن طريق الإثارة في 470 نانومتر مع مرشح انبعاثات 514/30 نانومتر bandpass. الكشف عن إشارة mKate2 (RFP) عن طريق الإثارة في 595 نانومتر ومع مرشح انبعاثات 641/75 نانومتر bandpass.
ملاحظة: التقليل من شدة الإثارة أمر بالغ الأهمية للتقليل من الفلوروفور photobleaching وضويتوسيكية الكلاميديا. وينبغي أن يحدد تجريبيا في الدراسات التجريبية الحد الأدنى من كثافة الإثارة لتوليد صورة محلولة مع التعرض 200-300 مللي ثانية. - التقط شرائح Z متعددة مع نطاق من التركيز الذي ينتهي على جانبي الشريحة في التركيز. في هذه التجربة، في التكبير 20x، تم تحقيق ذلك مع 4 شرائح في 10 μm الخطوات (JoVE61365_screenfile11).
- حدد النسبي Z لتصوير شرائح متعددة في نافذة الامتلاك. يستخدم الخيار Z النسبي موقع المستوى Z المحفوظ في قائمة موضع التصوير كنقطة بداية للفترة الزمنية التالية. إدخال قيم إزاحة Z المناسبة للقنوات المتألقة للتصوير (JoVE61365_screenfile12).
ملاحظة: نظام التركيز القائم على الصورة غير كامل وعلى مدى فترة تصوير 24 ساعة وهذا يؤدي إلى الانجراف التركيز. ووجد أنه من خلال التقاط طائرات 3-4 Z البؤرية لكل نقطة زمنية تم الاحتفاظ بصورة في التركيز. Z-إزاحة مطلوب لتصحيح الاختلافات في ال طائرات التنسيق بين قنوات الصورة الفلورسنت وقناة DIC. سيكون هناك حاجة إلى تحديد تجريبي لهذا الإزاحة Z. - حفظ الصور عن طريق تحديد الدليل الجذر وتسمية التجربة. استخدم خيار ملف μManager ملف كومة الصور لحفظ الصور كملفات مكدس tiff (JoVE61365_screenfile13).
- سجل التفاصيل التجريبية في مربع تعليقات المقتنيات في إطار الاكتساب متعدد الأبعاد (JoVE61365_screenfile13). أي، حسنا A1: السيطرة غير المعالجة. حسنا A2-3 و B1-3: نظم الإدارة البيئية المسوخ. التصوير: 12-36HPI. ابدأ عملية الحصول على الصورة عند 12 حصاناً.
ملاحظة: إذا كان استخدام μManager، اترك البرنامج، والإعداد التجريبي، وأجهزة المجهر قيد التشغيل بعد اكتمال التجربة. وسوف يعاد النظر في مواقع التصوير لعزلها بعد الانتهاء من تحليل السكان المُكملين.
3. تحديد وعزل الكلاميديا المطفرة مع الأنماط الظاهرية التنموية المتغيرة
- إنشاء رصة صورة في التركيز البؤري
- استخراج الصورة الأكثر في التركيز من Z - مداخن باستخدام البيانات المحفوظة الصورة التي تحتوي على 4 شرائح Z في نقطة الوقت. استخدام خيار قياس التدّح(تحليل | قياس)في ImageJ / FIJI لتحديد تلقائيا أكثر في شريحة Z التركيز (أعلى درجة كورتوس) وخلق كومة صورة جديدة مع هذه الصور فقط في التركيز. يتم تضمين البرنامج النصي بيثون كملف تكميلي (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) لأتمتة هذه العملية.
- قياس تعبير الفلورس في التضمينات الفردية
ملاحظة: لتحديد حركية التعبير من اثنين من المراسلين استخدام المصدر المفتوح تطبيق تحليل الصور ImageJ/FIJI و15البرنامج المساعد Trackmate . Trackmate يحدد 'البقع' (المقابلة للتضمينات في هذه الحالة) ويتبعهم من خلال كومة صورة الفاصل الزمني تسجيل موقع X، Y وكثافة الإشارة لكل إدراج على مر الزمن (JoVE61365_screenfile14). يتم حفظ هذه المعلومات كملف CSV وسيتم استيرادها إلى دفتر ملاحظات Python مخصص للتحليل.- فتح في التركيز Z- تخفيض كومة الصورة في ImageJ / FIJI باستخدام Bio-formats Importer بالنقر على الإضافات | تنسيقات حيوية | Bio-formats مستورد. حدد هايبر ستاك والمركب (JoVE61365_screenfile15، JoVE61365_screenfile16).
- طرح خلفية الصورة من خلال النقر على عملية | طرح الخلفية باستخدام نصف قطر الكرة المتداول من 50.0 بكسل وتعزيز الصورة التباين إلى 0.3٪ للبكسل المشبعة(عملية | تحسين التباين). اضرب قيم الصورة بـ 10.0 (العملية | الرياضيات | مضاعفة) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
- في Trackmate (الإضافات | تتبع | Trackmate)،حدد قطر النقطة المقدرة من 48 بكسل (يحدد تجريبيا على أساس حجم إدراج في نهاية التصوير). إنتاج مسارات التضمين غير المجزأة عن طريق تحديد مسافة الربط القصوى والمسافة القصوى لإغلاق الفجوة 8.0 بكسل وفجوة الحد الأقصى لإطار إغلاق الفجوة من 1 (JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25).
ملاحظة: لتحسين قدرة Trackmate على تحديد وتعقب التضمينات خلال الدورة بأكملها يتم إنشاء قناة صورة منفصلة عن طريق إضافة قناة prom euoوقنوات حفلة موسيقية hctBمعا باستخدام وظيفة الرياضيات الصورة في ImageJ /FIJI. ثم يتم استخدام هذه القناة من قبل Trackmate لتحديد ومتابعة التضمينات بمرور الوقت. ثم يتم تسجيل القيم الفلورية من قناة يوووهرتشبروم hctBفي القنوات 2 و 3. - تسجيل المسارات التي تفي بالحد الأدنى من المدة المستمرة: مدة المسار: 20 (JoVE61365_screenfile26). تحليل المسارات وحفظ النقاط في تعقب الإحصاءات كملف CSV (JoVE61365_screenfile27).
ملاحظة: تم تشغيل هذه العملية تلقائيًا باستخدام برنامج نصي Python مخصص يتم توفيره في البيانات التكميلية(TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
- تحديد مسارات التضمين مع ملفات تعريف تنموية معدلة
ملاحظة: لتحديد التضمينات التي تحتوي على Chlamydia مع التشكيلات الجانبية التنموية المتغيرة ، تم تصور كل مسار تضمين باستخدام كمبيوتر محمول Python. تسمح هذه التصورات بتحديد التضمينات مع ملفات تعريف التعبير الجيني الحركية التي تختلف عن السكان الذين تم علاجهم بشكل صوري. يتم توفير دفتر الملاحظات Python المستخدم لتحديد التضمينات مع البرمجة التنموية المعدلة في البيانات التكميلية (EMS_Screen-ماركداون).- استيراد بيانات تتبع التضمين من البقع في تعقبات ملفات CSV للإحصاءات في إطار بيانات Pandas باستخدام خلية الاستيراد في دفتر ملاحظات EMS_Screen Markdown Python.
- يقوم خط الأساس بتصحيح كل مسار عن طريق طرح الحد الأدنى لقيمة كل مسار من باقي قيم المسار باستخدام خلايا طرح الأساس. حفظ القيم الناتجة كملف مخلل باستخدام حفظ كخلية مخلل. سيؤدي ذلك إلى حفظ قيم القناة بشكل دائم بعد طرح الأساس لاسترجاعها لاحقاً.
ملاحظة: الطرح الأساسي يحدد شدة الفلورسنت الأولية لكل إدراج إلى صفر. - إزالة آثار من التضمينات بالقرب من حواف FOV باستخدام الخلية تصفية حواف كما قد لا يتم التقاط ملفات تعريف الفلورسنت الخاصة بهم بشكل كامل; قد تنتج هذه الآثار ملامح إيجابية كاذبة التنمية.
- معايرة الإطار (TotalFrames) القيم من شرائح الصورة إلى الوقت (وقت التشغيل ، الفاصل الزمني) القيم مع خلية معايرة الفاصل الزمني باستخدام وقت البدء التجريبي وفترة وقت التصوير. استبعاد القراءة التضمين الجزئي عن طريق تصفية تتبعات لا تمتد على مدى آخر 20 ساعة من التجربة (16-36 HPI) باستخدام خلية تصفية مدة المسار.
- المسارات منفصلة في إطارات البيانات الفردية عن طريق حالة تجريبية مع خلية معالجة تعيين. تصفية للتضمينات التي تظهر نمواً كافياً باستخدام خلية عامل تصفية للنمو. في تصفية لخلية النمو، تعيين تجريبياً لعتبة كثافة الفلوريسنس لقناة prom euoعن طريق تغيير القيم داخل السطرين الأخيرين من التعليمات البرمجية. هذا سوف تصفية الكلاميديا التي لم تنمو.
ملاحظة: كن حذراً عند إعداد مرشحات عتبة، إذا كان عامل التصفية منخفض جداً سوف تكون الأراضي مبعثر الناتج صاخبة، ولكن إذا تم تعيين تصفية المسوخ الهامة جداً قد يتم القضاء. - حساب نسبة الوفيات الناجمة عن EMS عن طريق قسمة عدد المسارات المُمَحَّعة/جيِّداً على عدد المسارات المُعالجة بالحجم المُسَرَّح/جيّدًا. مضاعفة عدد المسارات وهمية المعالجة من قبل عامل التخفيف الأولي من 3 لحساب عدد من المسارات وهمية المعالجة / جيدا. استخدم مسارات تضمين العدد وحساب خلايا معدل الوفيات لتنفيذ هذه المهمة.
- حساب الوقت إلى التعبير نصف القصوى لكل من المراسلين المبكر والمتأخر لكل مسار باستخدام الخلية حساب. وستستخدم هذه القيم لمقارنة الفئات السكانية المُمَتَّعة والمُسخنة لتحديد المُتحولين في النمو.
- داخل خلية نصف ماكس مؤامرة استخدام حزمة تعبئة خوخه لتصور الوقت إلى نصف أقصى التعبير عن كل المروج، الرسوم البيانية في وقت حفلة موسيقية أوموإلى نصف القصوى التعبير ضد ذلك من حفلة موسيقية hctB. حدد التضمينات من السكان المتحولين الذين يقعون خارج سحابة التشتت المعالجة بالحجم الوهمي باستخدام مستكشف معرف المسار التفاعلي bokeh. دوّن إحداثيات FOV و XY من إدراجات الاهتمام (الشكل 2).
ملاحظة: اختيار تضمينات المرشحة التي تقع بشكل مرئي خارج سحابة التحكم كما سيتم إجراء التحقق والتقييم الإحصائي لكل استنساخ لاحقاً. - داخل الرسوم المتحركة مؤامرة الخلية تصور التغييرات في التعبير عن المروج الحركية بشكل حيوي من خلال الوقت عن طريق الرسوم البيانية شدة التعبير من حفلة موسيقية euoضد حفلة موسيقية hctBباستخدام أداة التآمر Plotly16. يتم استخدام وظيفة مبعثر من Plotly لتحريك التعبير الجيني مع مرور الوقت(فيديو 1).
- تصور لقطة من الرسم البياني المتحركة في مؤامرة في الخلية محدد التضمين ، رسم euoprom والتعبير حفلة موسيقية hctBعند نقطة زمنية محددة (أي 28 HPI) باستخدام حزمة خوخه (الشكل 3). تحديد التضمينات من السكان المتحولين كما هو موضح في الخطوة 3-3-8.
ملاحظة: هذا التحليل يحتاج إلى أن يتم تنفيذها بسرعة (<4 ح) حيث أن التضمينات لا تزال تتوسع وسوف تبدأ في الخلايا المضيفة lyse ~ 48 ساعة بعد الإصابة.
- عزل المسوخ التنموية عن إدراجات الاهتمام
ملاحظة: لعزل الكلاميديا عن التضمينات التي تم تحديدها على عرض تنظيم الجينات المعدلة تم استخدام ميكرومانيبولاتور مع الإبر الشعرية. تم تحديد إحداثيات Well ID و FOV و X و Y لتضمينات الاهتمام باستخدام تصور البيانات في القسم 3.3.- إعداد الإبر الشعرية عن طريق عقد مركز أنبوب الشعرية في لهب وسحب طرفي أنبوب الشعيرات الدموية حتى أنها قد فصل. إنشاء فتحة في إبرة شعرية سحبت عن طريق كسر طرف سحب على شريحة المجهر. لكسر الإبرة، ضع الطرف المغلق على الجزء المتجمد من شريحة المجهر بزاوية، ثم ضع الضغط.
ملاحظة: كانت مواصفات أنبوب الشعيرات الدموية 1.0 مم O.D. ، 0.5 ملم. - تحقق من أن فتح الإبرة هو تقريبا حجم إدراج تحت المجهر، هدف 20x.
- Prepull ~ 25-30 الإبر الشعرية لعزل إدراج المرشح (إبرة واحدة لكل إدراج).
- ملء الميكروين مع النفط المعدني ضمان عدم وجود فقاعات الهواء.
- إرفاق إبرة شعرية زجاجية إلى الحقن المجهري وطرد الزيت إلى طرف الإبرة ، وشطب أي فقاعات الهواء. ضع الإبرة الشعرية في وسائل الإعلام الكاملة ورسم وسائل الإعلام حتى منتصف الطريق. ملء إبرة شعرية مع وسائل الإعلام يمنع تلوث النفط في البئر.
- باستخدام قائمة الموضع المحفوظة في μManager من الخطوة 2.3.5، قم بترحيل إلى البئر وFOV لإدراج الاهتمام المحدد في دفتر ملاحظات التصور Python.
- استخدام عصا التحكم من micromanipulator لتوطين إبرة شعرية إلى إحداثيات س ص من إدراج الفائدة.
- استخدام قناة 595 نانومتر الإثارة لتصور EBs لاستخراج والمرحلة / DIC قناة الضوء الأبيض للتصور إبرة. مناورة إبرة شعرية لإدراج، وتمزق إدراج ومن ثم رسم EBs في إبرة شعرية باستخدام الحقن المجهري.
- طرد الـ EBs من الإبرة الشعرية إلى بئر واحد من 24 لوحة البوليسترين المعدة في الخطوة 2.1.2. إزالة إبرة شعرية واستبدالها بإبرة شعرية جديدة لاستخراج إدراج المقبل. تكرار القسم 3.4 لكافة تضمينات المرشح.
ملاحظة: لتوسيع وضمان تتر عالية بما فيه الكفاية لإعادة التصوير، احتضان عزل متحولة في 5٪ CO2، 37 درجة مئوية حاضنة حتى يتم إصابة غالبية الخلايا المضيفة (~ 1 أسبوع). وينبغي رصد الآبار عن كثب حيث أن العزلات المختلفة قد تظهر معدلات نمو مختلفة.
- إعداد الإبر الشعرية عن طريق عقد مركز أنبوب الشعرية في لهب وسحب طرفي أنبوب الشعيرات الدموية حتى أنها قد فصل. إنشاء فتحة في إبرة شعرية سحبت عن طريق كسر طرف سحب على شريحة المجهر. لكسر الإبرة، ضع الطرف المغلق على الجزء المتجمد من شريحة المجهر بزاوية، ثم ضع الضغط.
- حصاد عزل متحولة
- على الجليد، تعطيل monolayer المصابة عن طريق كشط مع طرف ميكرويبيت 1 مل. نقل وسائل الإعلام، ومخلفات الخلية، وأطلق الكلاميديا في أنبوب microcentuge 1.5 مل.
- بيليه الكلاميديا عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 4 °C،> 14،000 س ز. إزالة بيليه عظمى و resuspend في 75 ميكرولتر من الجليد البارد 1X SPG. Aliquot إلى ثلاثة 1.5 مل المسمار كاب ميكروسينتريفوج أنابيب. يُخزن عند -80 درجة مئوية.
4. التحقق من المتحولة عزل الأنماط الظاهرية
- ثقافة الخلية المضيفة للتصوير المعزولة المُتَمَتَة
- بذور 96 بئر لوحة القاع الزجاج مع 1.6 × 104 Cos-7 الخلايا (ATCC) في بئر في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة. احتضان في 5٪ CO2، 37 درجة مئوية. الخلايا يجب أن تصل إلى التقاء في حوالي 24 ساعة. بعد الخلايا هي التقاء، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام كاملة تكمل مع 1 ميكروغرام / مل cycloheximide، احتضان بين عشية وضحاها.
- إصابة الخلايا بعزل المرشح للتحقق من الفينوتيبيك
- ذوبان المستنسخات متحولة و wildtype الكلاميديا على الجليد.
- في لوحة 96 جيدا المعدة، أداء مضاعفة التسلسلية مزدوجة من عزل متحولة، وذلك باستخدام عمود واحد في عزل (11 أعمدة). ابدأ بتمييع أولي من 1:20 في 100 ميكرولتر HBSS.
ملاحظة: يتم تنفيذ التخفيف التسلسلي من الكلاميديا لضمان صور عينات متحولة في وزارة الداخلية < 1. - تصيب العمود المتبقي (12th) مع الكلاميديا ذات النمط البري في وزارة الداخلية ~ 0.5.
ملاحظة: يتم استخدام Wildtype الكلاميديا كتحكم للمقارنة ضد العزل المُتَمَرَّع. - احتضان لمدة 15 دقيقة هزاز في 37 درجة مئوية.
- غسل الخلايا المضيفة المصابة مع prewarmed (37 درجة مئوية) HBSS مع 1 ملغ / مل من الهيبارين وHBSS كما هو محدد في القسم 2.2.
- يستعاض عن 200 ميكرولتر في بئر من وسائل التصوير قبل اسخاء (37 درجة مئوية).
- ملء المساحات interwell مع ما قبل الدفء (37 درجة مئوية) deionized H2O.
- احتضان في 5٪ CO2، 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعة.
- إعداد المجهر
ملاحظة: راجع القسم 2.3 لإعداد المجهر، هذا القسم سوف يحتوي فقط على تعديلات الإعداد المطلوبة.- حدد قالب لوحة 96 جيدا من البرنامج المساعد HCS.
- تحديد تجريبي للآبار المقابلة لـ MOI < 1 لكل عزل متحول. التعبير كلوفر تحت سيطرة المروج euo هو ملاحظ في ~ 10 HPI مما يجعل التصور المبكر من التضمينات ممكن (الشكل 1B).
- حدد ثلاثة آبار لكل عزل متحولة تتوافق مع MOI < 1 وقم بإنشاء قائمة موضع تصوير تتكون من اثنين من FOV لكل بئر.
ملاحظة: يمكن التقاط 72 صورة فقط في كل فاصل زمني بسبب قيود الأجهزة، وهذا يعادل ثلاثة تخفيفات (آبار) لكل سلالة باستخدام موقعين للتصوير في البئر إذا تم تصوير 12 عينة. - سجل دورة النمو لكل عزل متحولة لمدة 36 ساعة في فترات زمنية 30 دقيقة تبدأ من 12 HPI.
- تسجيل التفاصيل التجريبية في مربع تعليقات المقتنيات. ه. ه. ، حسنا ABC1 : التحكم في النمط البري. حسنا ABC2 : سلالة متحولة 1 ، ABC3 : سلالة متحولة 2 ، الخ... التصوير: 12-48 HPI.
- ابدأ عملية الحصول على الصورة عند 12 حصاناً.
5 - تحليل البيانات من أجل عزل التحقق
- إنشاء مكدسات الصور في التركيز وقياس التعبير المفلور في التضمينات الفردية
- توليد آثار شدة الفلورسنت لكل إدراج على النحو المحدد في القسم 3-1 - 3-2.
- التحقق من عزل Ctr المُطيل
ملاحظة: للتحقق من التشكيلات الجانبية التنموية المعدلة لعزلات متحولة، يتم مقارنة ملفات تعريف التعبير الخاصة بهم إلى التشكيل الجانبي التعبيرات من النوع البري باستخدام كمبيوتر محمول Python. يتم توفير دفتر بايثون المستخدم للتحقق من استنساخ متحولة مع البرمجة التنموية المعدلة في البيانات التكميلية (clone_check -Markdown).- استيراد وتصفية بيانات التتبع التضمين في دفتر ملاحظات python clone_check Markdown كما تم في القسم 3.3.
- احسب الانحراف المعياري والمتوسط (STD) من آثار كل مجموعة تحكم عزل ونمط بري باستخدام خلية حساب الوسط والأمراض المنقولة جنسياً.
- مع رسم الرسم البياني ايزو مقابل WT خلية مؤامرة متوسط وخطأ قياسي من المتوسط (SEM) من كل استنساخ متحولة ضد عنصر تحكم wildtype لتحديد ما إذا كانت حركية التعبير متحولة تختلف عن عينة wildtype(الشكل 4).
- تحديد ما إذا كان السكان المتحولين المعزولين من قبل تآمر آثار متحولة ومقارنتها مع آثار إدراج النمط البري باستخدام مؤامرة مبعثر كما فعلت في القسم 3.3 (الخطوات 3.3.7-3.3.10) (الشكل 2، الشكل 3). إذا كان العزلة هي مجموعة سكان مختلطة فإن المؤامرة سوف تظهر مجموعة سكانية واحدة تتراكب مع النمط البري وسكان متميزين ثاني خارج سحابة مبعثر النمط البري. وإذا بدا السكان مختلطين، يمكن إعادة عزل المتحولين باستخدام الإجراء الأصلي المبين في القسم 3-4.
ملاحظة: لتحديد ما إذا كان التشكيل الجانبي التنموي للعزل يختلف إحصائياً عن النمط البري، يجب مقارنة منحنيات كل عزل بالنمط البري باستخدام ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتج عن حدوث مطفرة EMS المباشر من سلالةنا الكلاميدية المروجة - المراسلة انخفاضًا بنسبة 75٪ تقريبًا في الإصابة. باستخدام بروتوكول التصوير في الخلايا الحية الموصوفة، تم تصوير 600 إدراج تقريبًا وتتبعها على مدار فترة 24 ساعة. تم تصور حركية التعبير الفلورسنت لكلا المراسلين في كل إدراج باستخدام نصوص دفتر ملاحظات Python المخصصة. وقد تم تنفيذ نهجين التصور لتحديد Chlamydia المرشحين المُجَوَّعِيَّين من أجل العزلة. المنهجية الأولى (الخطوة 3.3.8) تصور الوقت إلى التعبير نصف القصوى من المروجين euo وhctB من المعزولات الكلاميدية الفردية في مؤامرة مبعثر التفاعلية (الشكل 2). تم تحديد التضمينات لعزلها إذا سقطت خارج سحابة التشتت المعالجة بالحجم الوهمي. تم اختيار المستنسخين المرشحين التي سقطت بصريا خارج سحابة التحكم. وتم التحقق من كل استنساخ في وقت لاحق. تم اختيار المستنسخين A3-6-67 و B3-8-58 للعزلة لأنها أنتجت أوقات أقصر إلى نصف أقصى التعبير من المروج euo وأوقات أطول لhctB (الشكل 2).
طريقة التصور الثاني لتحديد التضمينات مع الحركية المعدلة (الخطوات 3.3.9-10) تحدد التضمينات الفردية استنادًا إلى تصور التعبير الجيني الديناميكي من المروجين(فيديو 1). مرة أخرى ، تم اختيار المستنسخين المرشحين مع أنماط التعبير التضمين الديناميكي التي كانت متميزة بشكل ملحوظ عن تضمينات التحكم. تم اختيار B3-6-62 بسبب زيادة تراكم الفلورسنت من المروج euo بين 23 و 29 HPI(فيديو 1). وقد أخذت لقطة من الرسم البياني المتحرك لتحديد موقع إدراج الفائدة(الشكل 3).
وباستخدام طريقتي التصور، تم تحديد ما مجموعه 24 إدراجاً لعزلها. ومن بين العزلات الإجمالية البالغ عددها 24 حالة، أظهرت 10 حالات حركية تفاضلية عند إعادة الاختبار. هذه العزلات سقطت في ثلاث فئات فينوكي; 8 isolates أظهرت انخفاض تعبير حفلة موسيقية euoفي ~ 24 HPI، المقابلة للوقت تحويل RB-EB، كما يتضح من استنساخ A3-6-67(الشكل 4A). المستنسخين المتبقيتين عرض فريدة من نوعها فينوتيبيك ملامح، وعزل B3-8-58 كما عرضت انخفاض تعبير حفلة موسيقية euoفي ~ 24 HPI، ولكن زيادة إجمالية في تعبير حفلة موسيقية hctB(الشكل 4B)، في حين B3-6-62 أعرب عن زيادة مستويات الفلوريس من المروج euo تليها خسارة مفاجئة للتعبير في كلا المروجين(الشكل 4C). تحليل الخلايا الحية micrographs لطفرات B3-6-62 كشفت أن خلية المضيف تحلل وقعت في الخلايا المصابة مع هذا متحولة في وقت سابق بكثير مما كانت عليه في الخلايا المصابة في النمط البري(فيديو 2).
الشكل 1: رصد تطوير الخلايا مع مراسلي Ctr المروجين.
(أ) التخطيطي لبناء المروج مراسل، p2TK2-hctBحفلة موسيقية-mKate2/أووحفلة موسيقية-كلوفر. (B) الخلية الحية micrograph من euoprom-Clover وhctBprom-mKate2 التعبير في Ctr في 10 HPI (C) يعيش الخلية micrograph من Ctr التعبير عن euoprom-Clover وhctBprom-mKate2 في 36 HPI. شريط مقياس: 20 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد الممثل يعزل A3-6-67 و B3-8-58 عن طريق التصور من الوقت إلى نصف أقصى التعبير لكل المروج.
يستخدم الرسم البياني التفاعلي لتحديد الكلاميديا المُتَمَرَّعة التي تعرض ملفات تعريف التعبير التي تختلف عن سحابة مبعثر التحكم المعالجة بالحجم الوهمي. كل بقعة في الرسم البياني تمثل إدراج واحد. يتم تسليط الضوء على بقع الاشتمال A3-6-67 و B3-8-58 لأنها تقع خارج سحابة وهمية المعالجة، وكلاهما يعرض أقصر وقت للتعبير نصف الأقصى من المروج euo في تركيبة مع وقت أطول إلى نصف أقصى التعبير عن hctB. euoحفلة موسيقية: x-axis، hctBحفلة موسيقية: y-محور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: لقطة تفاعلية لتحديد موقع الإدراج.
الرسم البياني المعروض هو لقطة في 28 HPI من مؤامرة مبعثر المتحركة(فيديو 1) وكان يستخدم لتحديد FOV و XY تنسيق الموقع من إدراج الفائدة. B3-6-62 هو مبين كما تم اختياره لعزل عن مؤامرة مبعثر المتحركة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحقق من عزلات المتحولين التمثيلية.
يعزل التشكيلات التنموية من المُمَاجَنِة A3-6 و B3-8 و B3-6. (A) A3-6 متحولة معارض انخفاض تعبير حفلة موسيقية euoفي ~ 24 HPI. (B) عزل متحولة B3-8 معارض انخفاض تعبير حفلة موسيقية euoفي ~ 24 HPI، ولكن زيادة إجمالية في التعبير حفلة موسيقية hctB. (C)وB3-6 عزل المعارض زيادة مستويات التعبير حفلة موسيقية euoتليها خسارة مفاجئة للتعبير في كل من المروجين في ~ 40 HPI. كل عينة هي متوسط السكان المحددين، n> 25. سحابة يمثل SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: سير العمل في التحليل الجيني الموجّه إلى الأمام للمروج - المراسل Ctr:
Ctr-L2-p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs تم إجراء التعديلات عليها بشكل مباشر مع EMS في وسائط أكسينيك، CIP-1. تم استخدام EBs الماطفرة لتصيب الخلايا أحادية Cos-7 للتصوير وتحليل التعبير الفلورسنت. تم تحديد الكلاميديا التعبير عن ديناميات التنمية المتغيرة من خلال التصور في الرسوم البيانية التفاعلية. تم عزل التضمينات ذات الملامح التنموية المتغيرة باستخدام ميكرومانبولاتور. تم التحقق من الأنماط الظاهرية للعزل عند إعادة الإصابة. يتم تعريض عزلات متحولة إلى WGS لتحديد آفات الحمض النووي المرتبطة بالنمط الظاهري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: تحديد الكلاميديا المُتَمَّعة التي تُظهر حركية تعبير متباينة باستخدام مؤامرة تعبير جيني ديناميكي. تم رسم تعبير المروج عن euo و hctB للتضمينات الفردية وتصوره عبر الزمن لتحديد الكلاميديا المطفرة مع ديناميكيات التعبير المتغيرة. تم اختيار B3-6-62 للعزلة لأنها تعرض تعبير حفلة موسيقية أعلى من euoبالمقارنة مع سحابة النمط البري. euoحفلة موسيقية: x-axis، hctBحفلة موسيقية: y-محور. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 2: ممثل متحولة B3-6-62 يسبب قبل الأوان خلية المضيفة تحلل. الوقت الفاصل مع الخلية الحية micrograph من B3-6-62 الخلايا المضيفة المصابة الخضوع لتحلل سابق لأوانه (~ 40 HPI). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
ملفات تكميلية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذه الملفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أعاقت القيود المفروضة على الأدوات الوراثية المتاحة حالياً تشريح الآليات التي تتحكم في دورة التطور الكلاميدية. توظيفنا لدينا المروج مراسل Chlamydia بالتعاون مع المجهر الآلي الخلية الحية، تم بناء نظام الذي يتيح رصد التنمية من نوع الخلية في إدراج الفردية على مدى فترة 24 ساعة. وقد أنشأ هذا النظام، بالاقتران مع الطفرات الكيميائية وعزلة الإدماج المباشر طريقة لتحديد الكلاميديا بسرعة وبشكل كلي التعبير عن الملامح التنموية المتغيرة(الشكل 5).
إنّ الـ(تاب) الكلاميّة نشطة أيضياً خارج المُضيف عندما تُقدّم مع ظروف أيونية داخل الخلايا ومصدر طاقة5،,12. وقد استُغُل هذا الأيض الفأس EB من أجل إجراء الطفرات في نقّاءات الإكتابات المُنقّية خارج الخلايا المضيفة. وفي هذا البروتوكول، تم استقلاب EBs بشكل مباشر مع EMS. ولوحظ أن معالجة نظم الإدارة البيئية قللت بفعالية من صلاحية EB وتولد حركيات نمو متغيرة كما هو متوقع.
وتشير التقديرات إلى أن بروتوكول الطفرات EMS الموصوفة يولد ~ 5-20 تغييرات الحمض النووي /EB. سير عمل المجهر في الخلايا الحية الموصوفة قادر على تصوير 8 تضمينات تقريبًا لكل مجال عرض (FOV) و 72 FOVs كل في فاصل زمني 30 دقيقة. لذلك، يقدر أن آثار ~ 3000-10،000 يمكن تصور الطفرات في تشغيل. سوف يؤدي تشغيل متعددة (3-5) في التصور من آثار 9000-50000 الطفرات. جينوم Ctr-L2 يشفر جينات ~ 850، مما يشير إلى أن هذا البروتوكول سيؤدي إلى تصور > 10 طفرات لكل جين. وتشير هذه التقديرات إلى أن تغطية الجينوم، وإن لم تكتمل، ينبغي أن تكون كافية.
قوة هذا البروتوكول هو القدرة على تتبع وتسجيل حركية التعبير من المراسلين المروجين متعددة في قرار إدراج واحد في الوقت القريب في الوقت الحقيقي. يعتمد علم الوراثة إلى الأمام على الأنماط الظاهرية القابلة للملاحظة والعزلة الزنية. اعتمدت الطرق السابقة لعلم الوراثة إلى الأمام في الكلاميديا على الملاحظات الثابتة واللهو مع تراكبات أجار8. مع منهجيتنا، يتم تسجيل نشاط المروج الديناميكي طوال دورة النمو ومن ثم تصورها لتحديد التضمينات التي تحتوي على الكلاميديا مع حركية التعبير الجيني المتغيرة. ويؤدي تحديد إدراجات المرشح باستخدام بارامترات متعددة (أي الوقت إلى التعبير نصف الأقصى وكثافة الفلورسنت الكلية في نقطة زمنية معينة) إلى تجمعات متحولة متميزة تعرض حركيات تنموية مختلفة. هذه الكلاميديا من المرجح أن يكون لها طفرات فريدة من نوعها التي تؤثر على تنظيم مسارات وراثية منفصلة. حقيقة أن هذه الملامح يمكن تسجيلها حية وتصور بعد بضع ساعات يسمح الوقت لتحديد وعزل إدراج الفائدة من monolayer المصابة. على الرغم من أننا ركزنا على ديناميات التعبير الجيني أثناء التطوير ، يمكن استخدام مراسلي الجينات البديلة للتحقيق في المسارات التنظيمية الأخرى.
اعتمادا على المسارات الجينية التي يجري استجوابها، ينبغي توخي الحذر مع إضافة cycloheximide إلى الخلايا المضيفة. على الرغم من أن الحضانة مع cycloheximide يحسن خصائص التصوير من أحادية الطبقات عن طريق منع النسخ المتماثل للخلايا المضيفة; ويتحقق هذا التأثير من خلال تثبيط تخليق البروتين المضيف. يمكن أن يؤثر تثبيط تخليق البروتين المضيف دي نوفو على نتائج الشاشة الوراثية اعتمادا على السؤال المطروح.
تعتبر السمية الضوئية وphotobleaching عقبات رئيسية في المجهر على المدى الطويل الفاصل الزمني. للتغلب على هذه القضايا، ينبغي النظر في الخصائص المحددة لكل بروتين فلوري قبل التجريب. كلوفر و mKate2 أوقات النضج قصيرة (20-30 م) هي photostable، ومعرض كميات كبيرة نسبيا غلة17،18. هذه الصفات تسمح للحد من شدة الإثارة ووقت التعرض، وبالتالي تقليل كمية الضوئية وضوبلاخات تكبدها. تم استخدام قناة الإضاءة البيضاء للمرحلة / DIC للتكفو التلقائي لأن هذا الطيف من الضوء كان أقل سخية للضوء إلى الكلاميديا.
وبالنسبة لهذا البروتوكول، استخدمت نظم الإدارة البيئية كمتاجن كيميائي. EMS يسبب G:C إلى A:T التحولات عبر الألكيلية guanine19. ومع ذلك، يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل المطفرة البديلة التي يمكن أن تحفز أنواع أخرى من الطفرات الجينومية. على سبيل المثال، acridines هي فئة من مركبات الحمض النووي intercalating التي تحفز indels، وزيادة فرصة التحولات الإطار وبالتالي الطفرات فارغة20.
مع التقدم في تقنيات التحول الكلاميدي، الجينات المتحولة التي ترتبط مع مجموعات تكملة الظاهرية يمكن أن يخرج عن طريق اضطراب الجينات الاضرائية وتكملة وراثية للتحقق من الربط بين النمط الجيني والفينوينوتا9. يمكن أن يكون استرداد المسوخ التي تمنع RB إلى تطوير EB مشكلة لأن طفرات الاهتمام قد تنتج الكلاميديا التي لا يمكنها إعادة دمج الخلايا المضيفة. ويمكن تعديل هذه التقنية لتحديد الجينات التنموية من خلال الجمعيات الإحصائية (GWAS). ويمكن تسلسل جينوم الكلاميديا من التضمينات المعزولة بشكل مباشر دون التوسع والتحقق. ومن شأن ارتفاع معدل النقل في هذه التقنية أن يجعل الارتباطات الإحصائية ممكنة. ومرة أخرى، يمكن اختبار التحقق من هذه الجمعيات من خلال اضطراب الجينات وتكملة9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور أندرس أومسلاند في جامعة ولاية واشنطن على تزويده وسائل الإعلام CIP-1 axenic. وقد دعم هذا العمل منحة المعاهد القومية للصحة R01AI130072، R21AI135691 وR21AI113617. تم تقديم دعم إضافي من خلال أموال الشركات الناشئة من جامعة أيداهو ومركز التفاعلات المعقدة للعارضات من خلال منحة المعاهد القومية للصحة P20GM104420.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
- AbdelRahman, Y., Belland, R.
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
- Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
- Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
- Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
- Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
- Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
- Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
- Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
- Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
- Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14-20 (2010).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Plotly Technologies Inc. Collaborative data science. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
- Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
- Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).
