Summary
Denne protokol udnytter fluorescerende promotor-journalister, levende celle mikroskopi, og individuel optagelse ekstraktion i en rettet frem genetisk tilgang til at identificere og isolere udviklingsmæssige mutanter af Chlamydia trachomatis.
Abstract
Det intracellulære bakteriepatogen Chlamydia trachomatis gennemgår en udviklingscyklus bestående af to morfologisk diskrete udviklingsformer. Den ikke-replikerende elementære krop (EB) initiere infektion af værten. Når inde, EB differentierer i reticulate kroppen (RB). RB gennemgår derefter flere runder af replikation, før differentiere tilbage til den smitsomme EB form. Denne cyklus er afgørende for klamydial overlevelse som manglende skifte mellem celletyper forhindrer enten vært invasion eller replikering.
Begrænsninger i genetiske teknikker på grund af klamydias forpligte intracellulære karakter har hæmmet identifikationen af de molekylære mekanismer, der er involveret i celle-type udvikling. Vi har designet et nyt dobbelt promotor-reporter plasmid system, der sammen med live-celle mikroskopi, giver mulighed for visualisering af celletype skift i realtid. For at identificere gener, der var involveret i reguleringen af celletypeudvikling, blev det levende cellepromotor-reporter-system gearet til udvikling af en fremadrettet genetisk tilgang ved at kombinere kemisk mutagenese af den dobbelte reporterstamme, billeddannelse og sporing af Klamydia med ændret udviklingskinetik efterfulgt af klonal isolering af mutanter. Denne fremadrettede genetiske arbejdsgang er et fleksibelt værktøj, der kan ændres til direkte forhør i en bred vifte af genetiske veje.
Introduction
Klamydia trachomatis (Ctr) er et obligat intracellulært patogen, der skrider frem gennem en bifasisk udviklingscyklus, der er afgørende for dets overlevelse og spredning1. Denne cyklus består af to udviklingsmæssige former, den elementære krop (EB) og reticulate kroppen (RB). EB er replikering inkompetente, men formidler celle invasion gennem effektor induceret endocytose2. Når i værten, EB modnes til repliktive RB. RB udfører flere runder af replikation før konvertering tilbage til EB for at indlede efterfølgende runder af infektion.
Den begrænsede vifte af genetiske værktøjer har begrænset det meste af den klamydial forskning til biokemiske undersøgelser eller brugen af surrogat systemer. Som følge heraf har det været vanskeligt at belyse genregulering og kontrol medudviklingscyklussen 3,4. En af de vigtigste udfordringer på klamydialområdet er den tidsmæssige sporing af den klamydiale udviklingscyklus med høj opløsning og identifikationen af de proteiner, der er involveret i reguleringen. Genekspression under den klamydiale udviklingscyklus er traditionelt blevet udført ved destruktive "endepunkt" metoder, herunder RNAseq, qPCR, og fast celle mikroskopi5,6. Selv om disse metoder har givet uvurderlige oplysninger, er de anvendte teknikker møjsommelige og har lavtidsmæssig opløsning 5,6.
Inden for det seneste årti har genetisk manipulation af Ctr udviklet sig med indførelsen af plasmid transformation og metoder til mutagenese7,8,9. Til denne undersøgelse, en plasmid-baseret system blev udviklet til at overvåge klamydial udvikling i individuelle indeslutninger i realtid i løbet af en infektion. En klamydial transformant blev skabt, der udtrykte både en RB og EB celle-type specifik promotor-reporter. RB specifikke reporter blev bygget ved at sammensmelte initiativtageren til den tidlige RB gen euo opstrøms for fluorescerende protein Clover. EUO er en transskriptionel regulator, der undertrykker en delmængde af sene EB-tilknyttede gener10. Initiativtageren til hctB, som koder en histone-lignende protein, der er involveret i EB nukleoid kondens, blev klonet direkte opstrøms for mKate2 (RFP) for at skabe EB specifikke reporter11. Rygraden for hctBprom-mKate2/euoprom-Clover var p2TK2SW27. HctB og euo promotorer blev forstærket fra Ctr-L2 genomisk DNA. Hver promotorsekvens bestod af ~100 basispar opstrøms for det forventede transskriptionsstartsted for det angivne klamydiale gen plus de første 30 nukleotid (10 aminosyrer) af den respektive ORF. De fluorescerende FP varianter blev kommercielt opnået som Ctr codon optimeret genblokke og klonet i ramme med de første 30 nukleotid af hver klamydial gen og promotor. Ind terminatoren blev klonet direkte nedstrøms for mKate2. Den anden promotor-reporter blev indsat nedstrøms for incD terminator. Ampicillinresistensgen (bla) i p2TK2SW2 blev erstattet med aadA-genet (Spectinomycin resistens) fra pBam4. Dette resulterede i den endelige konstruktion p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figur 1A), der blev omdannet til Ctr-L27. Denne RB/EB-reporterstamme gjorde det muligt at observation af udviklingscyklussen i enkeltslutninger ved hjælp af levende cellemikroskopi (figur 1B,C).
Beskæftiger vores promotor-reporter konstruere i kombination med kemisk mutagenese, en protokol blev udtænkt til at spore og isolere individuelle kloner, der udstillede udviklingsmæssige abnormiteter fra mutageniserede populationer af Ctr serovar L2. Denne protokol giver mulighed for direkte overvågning af individuelle klamydiale indeslutninger, sporing af genekspressionsprofiler over tid, identifikation af klamydiale kloner, der udtrykker et ændret udviklingsgenkspressionsmønster, og klonal isolering af klamydia fra individuelle indeslutninger.
Selv om denne protokol er blevet oprettet specielt til identifikation af gener, der er involveret i klamydial udvikling, det kunne let tilpasses til at afhøre et vilkårligt antal klamydiale genetiske veje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Python-scripts, der bruges i denne protokol, er tilgængelige på Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. Mutagenize Reporter Klamydia
BEMÆRK: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs blev direkte mutageniseret ved hjælp af ethylmethansulfonat (EMS) i axenic media CIP-1, da dette medie understøtter EB metabolisme og vedligeholdelse af EB infektivitet12.
- Tø en klamydial bestand på is, der indeholder ~ 3 x 107 EBs omdannet med p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover reporter plasmid og pellet på > 14.000 x g i 30 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Klamydiaorganismer, der blev anvendt til disse forsøg, var 30 % renografintætheds renset og frosset ved -80 °C i 1x saccharose-fosfat-glutamatbuffer (SPG). - Supernatanten kasseres, og EB-pellets skal opbruges i 100 μL CIP-1-buffer med sonikering på is ved 10 % effekt i 10 s. Opdel 100 μL EB-suspensionen i to 50 μL-aliquoter til mutageniserede og mockbehandlede prøver.
- Der klargørs 20 mg/ml EMS-CIP-1-opløsning i et separat 1,5 ml mikrocentrifugerør. For at gøre dette tilsættes 6,8 μL EMS i 375 μL samlet volumen.
- Der tilsættes kun 50 μL AF EMS-CIP-1-opløsningen i en af de klamydiale aliquots for mutagenese og 50 μL CIP-1 til den anden klamydial aliquot for mock mutagenese.
BEMÆRK: Den endelige EMS-koncentration er 10 mg/ml. Den klamydiale titer, EMS koncentration, og tidspunktet for eksponering, der anvendes i denne protokol føre til ca en 60-80% reduktion i smitsomme afkom. Dette reduktionsniveau svarer til ~5-20 DNA-læsioner pr. klamydialt genom8. - Inkuber i 20 min ved stuetemperatur. De mualiserede EBs vil blive anvendt direkte til at inficere monolag i afsnit 2.
FORSIGTIG: EMS er et kendt kræftfremkaldende stof. Alt udstyr og materiale, der kommer i kontakt med EMS, skal lægges i blød i 1 M NaOH i 24 timer, før de bortskaffes, handsker skal altid anvendes under protokol og oprydning af EMS-materialer.
2. Billeddannelse af mutant Ctr
- Værtscellekultur til billeddannelse og isolering af mutageniseret Ctr
- Frø en 6 godt glas bundplade med 6 x 105 Cos-7 celler (ATCC) per brønd i 2 ml komplette medier (RPMI-1640 suppleret med 10% føtal kvæg serum og 10 mg / ml gentamicin). Brug denne glasbundplade til billeddannelse af mutageniseret Ctr.
- Frø en 24 godt polystyren plade med 1 x 105 Cos-7 celler (ATCC) pr brønd i 1 ml komplet medie. Brug denne polystyren plade til reinfektion af isolerede Klamydia af interesse.
- Inkuber begge plader ved 5% CO2,37 °C i ca. 18 timer. Når cellerne når sammenløbet, erstattes medier med komplette medier suppleret med 1 μg/ml cycloheximid og inkuberes natten over.
- Inficerer værtscellekulturen med mutageniseret Ctr
- Inficere 5 brønde af glasset bundplade med ~ 6 x 105 af mutagenized EBs i 1,5 ml / godt iskold HBSS. Dette vil resultere i MOI på ~ 0,3 som ~ 70% dødelighed forventes på grund af mutagenese.
- Inficere de resterende godt med ~ 2 x 105 mock mutagenized EBs i 1,5 ml / godt iskold HBSS. Uden mutagenese, forventer mindre dødelighed, således en tredjedel af inoculum bruges til at opnå MOI på ~ 0,3.
BEMÆRK: MOI på ~ 0,3 sikrer, at værtsceller er inficeret med en enkelt EB og giver mulighed for tilstrækkelig adskillelse mellem inficerede celler for clonal isolation. - Pladen inkuberes i 15 min. med rokkende ved 37 °C.
- De inficerede værtsceller vaskes med præwarmed (37 °C) HBSS indeholdende 1 mg/ml heparin efterfulgt umiddelbart af en HBSS-skylning. Gentag heparin vask, straks skylning 2x med HBSS at sikre heparin er fjernet.
BEMÆRK: Heparin hæmmer og kan vende de tidlige elektrostatiske interaktioner mellem værtscellen og EBs13. Den heparin vasker fjerne EBs, der endnu ikke er kommet ind i værtsceller, synkronisering af infektionen. Når du vasker celler, skal du gøre det forsigtigt for at forhindre, at cellerne løsnes fra brøndens overflade. HBSS- og heparinopløsninger indeholder resterende EMS og skal anbringes i et bægerglas indeholdende 1 M NaOH i 24 timer før bortskaffelse. - Hbss erstat med 4 ml/brønd af forvarmet (37 °C) billedbehandlingsmedier (komplet medie, 1 μg/ml cycloheximide, 20 mM HEPES og ingen fenolrød).
- Fyld interwell-rummene med forvarmet (37 °C) deioniseret H2O for at hjælpe i temperaturkontrollen og reducere fordampningen. Pladen inkuberes ved 37 °C inkubator med 5% CO2 i 10 timer.
- Mikroskop opsætning og billeddannelse
BEMÆRK: Multicolor multiposition automatiseret levende celle fluorescerende billeddannelse bruges til at indsamle time-lapse billeder til at identificere klamydial mutanter, der adskiller sig i den udviklingsmæssige genekspression dynamik. Denne protokol anvender open source μManager-softwarepakken til automatiseret mikroskopkontrol14.- Begynd mikroskop setup 10 h post infektion. Indstil mikroskopstadiets inkubator til 5% CO2, 37 °C. Den inficerede 6 brøndglasbundplade anbringes i fasekubatoren, og prøven-themistoren indsættes i interwell H2O.
- Kalibrer XY-fasen ved hjælp af plug-in'en (High Content Screening) (HCS). Klik på Plugins | Værktøjer til erhvervelse | HCS Site Generator i μManager mikroskop kontrol software (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
- Vælg 6-brøndpladens skabelon, og generer en billedliste bestående af 12 synsfelter (FOV) pr. brønd i HCS-pluginet (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Åbn scenepositionslisten, og fokuser manuelt, og angiv den oprindelige Z-position for hver FOV ved hjælp af Stage Control-plugin 'ens plugin)(JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Juster XY-koordinaterne for enhver FOV, der mangler celler eller ikke indeholder et ensartet monolag.
BEMÆRK: På grund af den tid, det tager for hvert billede, der skal tages, kan der maksimalt tages 72 FOV pr. interval på 30 minutter. - Brug en 20x objektiv linse til billedbehandling. Denne forstørrelse gør det muligt ~ 8 indeslutninger, der skal afbildes pr FOV samtidig give den ønskede opløsning.
- Gem positionslisten, da dette vil blive brugt til at finde de medtagelser af interesse efter dataanalyse (JoVE61365_screenfile7).
- Brug indstillingen Automatisk fokus i billedbehandlingssoftwaren til at sætte fokus på automatiseret billedbehandling (JoVE61365_screenfile8).
- Brug følgende markeringer og værdier til at opnå de mest ensartede fokusresultater ved hjælp af billedbaseret autofokus i μManager. Vælg OughtaFocus i rullemenuen Autofokus i vinduet Autofokus, og brug følgende indstillinger. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0,5, OughtaFocusCropFactor: 0,3, OughtaFocus-Eksponering: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2,5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Ja, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel: DIC.
BEMÆRK: Hvis du reducerer vinduet til automatisk fokusering ved at reducere beskæringsfaktoren, kan du fokusere mere ensartet automatisk. Hvis du vælger Ja til OughtaFocus-ShowImages, kan brugeren få vist autofokusbilledet. - Fang de kinetik af udviklingscyklussen ved billeddannelse i 24 timer med 30 min tidsintervaller (JoVE61365_screenfile9). Billeddannelse mellem 12-36 HPI sikrer, at Chlamydia fuldender udviklingscyklussen, men ikke lyser værtscellen.
- Billede af cellemonstologer med en eksponering på 250 ms ved henholdsvis 4 % og 18 % i GFP- ogRFP-kanalerne( JoVE61365_screenfile10 ). Kløversignalet (GFP) registreres ved excitation ved 470 nm med et 514/30 nm båndpasmissionsfilter. Detekter mKate2 (RFP) signalet ved excitation ved 595 nm og med et 641/75 nm båndspasmissionsfilter.
BEMÆRK: Minimering af excitation intensitet er afgørende for at minimere fluorophore fotobleaching og fototoksicitet til Klamydia. Den mindste excitationsintensitet for at generere et løst billede med en eksponering på 200-300 ms bestemmes empirisk i pilotundersøgelser. - Fang flere Z-udsnit med en fokusområde, der slutter på begge sider af in-focus-udsnittet. I dette eksperiment, ved 20x forstørrelse, dette blev opnået med 4 skiver på 10 μm trin (JoVE61365_screenfile11).
- Vælg Relativ Z til billedbehandling af flere udsnit i anskaffelsesvinduet. Indstillingen Relativ Z bruger den Z-planplacering, der er gemt på billedplaceringslisten, som udgangspunkt for næste tidsinterval. Indtast de relevante Z-offsetværdier for fluorescensbilleddannelseskanaler( JoVE61365_screenfile12).
BEMÆRK: Det billede baserede fokussystem er ufuldkomment, og over en billedperiode på 24 timer fører dette til fokusdrift. Det blev konstateret, at ved at fange 3-4 Z brændpunkter fly for hvert tidspunkt en in-focus billede blev opretholdt. Z-offset er nødvendig for at korrigere for forskellene i fokale planer mellem fluorescerende billedkanaler og DIC-kanalen. Der vil være behov for empiric bestemmelse af denne Z-offset. - Gem billeder ved at vælge rodmappen og navngive eksperimentet. Brug indstillingen μManager-billedstak til at gemme billeder som tiff stack-filer (JoVE61365_screenfile13).
- Ler de eksperimentelle oplysninger i feltet Anskaffelseskommentarer i vinduet MultiD-anskaffelse (JoVE61365_screenfile13). dvs, Nå A1: Ubehandlet kontrol. Nå A2-3 og B1-3: EMS Mutanter. Billeddannelse: 12-36HPI. Start billedopkøbet på 12 HPI.
BEMÆRK: Hvis du bruger μManager, skal du lade programmet, den eksperimentelle opsætning og mikroskophardwaren køre, når eksperimentet er fuldført. Billeddannelsesstederne vil blive taget op til fornyet overvejelse med henblik på isolation af inklusion, når analysen af den mutageniserede population er afsluttet.
3. Identificere og isolere mutageniseret klamydia med ændrede udviklingsmæssige fænotyper
- Oprette en billedstak i fokus
- Uddrag det mest i fokus billede fra Z-stakke ved hjælp af de gemte billeddata, som indeholder 4 Z udsnit pr. tidspunkt. Brug kurtosis målemulighed (Analysér | Mål) i ImageJ / FIJI til automatisk at identificere de mest i fokus Z skive (højeste kurtosis score) og skabe et nyt billede stak med netop disse in-fokus billeder. Et Python-script er inkluderet som ensupplerende fil ( Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py)for at automatisere denne proces.
- Kvantificer fluorescensudtryk i individuelle indeslutninger
BEMÆRK: For at kvantificere udtrykket kinetik af de to journalister bruge open source billedanalyse ansøgning ImageJ / FIJI og plugin Trackmate15. Trackmate identificerer 'spots' (svarende til indeslutninger i dette tilfælde) og følger dem gennem en time-lapse billedstak, der registrerer X,Y-placeringen og signalintensiteten for hver optagelse over tid (JoVE61365_screenfile14). Disse oplysninger gemmes som en CSV-fil og importeres til en brugerdefineret Python-notesbog til analyse.- Åbn den i fokus Z-reducerede billedstak i ImageJ/FIJI ved hjælp af Bioformater Importør ved at klikke på Plugins | Bioformater | Bioformater Importør. Vælg Hyperstack og Composite (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
- Træk billedbaggrunden fra ved at klikke på Proces | Træk baggrund ved hjælp af en rullende kugleradius på 50,0 pixel og forøg billedkontrasten til 0,3 % for mættede pixel ( Proces| Gør kontrasten merekontrast ). Gange billedværdierne med 10,0 (Proces | Matematik | Multiplicer)( JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
- I Trackmate (Plugins | Sporing | Trackmate), skal du vælge en anslået blob diameter på 48 pixels (empirisk bestemt baseret på størrelsen af optagelsen i slutningen af billeddannelse). Fremgiv ikke-fragmenterede inklusionsspor ved at vælge en sammenkædning af max-afstand og Afstandslukning på 8,0 pixel og Hulslutning max frame gap på 1 ( JoVE61365_screenfile23 -JoVE61365_screenfile25).
BEMÆRK: For at forbedre Trackmate evne til at identificere og spore indeslutninger i hele cyklussen en separat billedkanal er skabt ved at tilføje euoprom og hctBprom sammen ved hjælp af billedet matematik funktion i ImageJ / FIJI. Denne kanal bruges derefter af Trackmate til at identificere og følge indeslutninger over tid. De fluorescerende værdier af euoprom og hctBprom kanaler registreres derefter i kanal 2 og 3. - Optag spor, der opfylder en minimal kontinuerlig varighed: Varighed af spor: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analysér sporene, og gem pletterne i sporstatistik som en CSV-fil( JoVE61365_screenfile27).
BEMÆRK: Denne proces er blevet automatiseret ved hjælp af en brugerdefineret Python script, der er fastsat i de supplerende data (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
- Identificer inklusionsspor med ændrede udviklingsprofiler
BEMÆRK: At identificere inklusioner, der indeholder Chlamydia med ændrede udviklingsprofiler blev hvert inklusionsspor visualiseret ved hjælp af Python notebook. Disse visualiseringer gør det muligt at identificere indeslutninger med kinetiske genekspressionsprofiler, der adskilte sig fra den mock-behandlede population. Python-notesbogen, der anvendes til identifikation af indeslutninger med ændret udviklingsprogrammering, findes i de supplerende data (EMS_Screen-Markdown).- Importer inklusionsspordataene fra spots i sporstatistikker til Pandas-dataramme ved hjælp af importcellen i EMS_Screen-Markdown Python Notebook.
- Baseline korrigerer hvert spor ved at trække minimumværdien for hvert spor fra resten af sporværdierne ved hjælp af cellerne Til grundlinjefratrist. Gem de resulterende værdier som en lagefil ved hjælp af cellen Gem som lage. Dette gemmer kanalværdierne permanent efter nedenttrækning af grundlinjen til senere hentning.
BEMÆRK: Baseline subtraktion indstiller startlysstofrøringsintensiteten for hver optagelse til nul. - Eliminer spor fra indeslutninger nær kanterne af FOV ved hjælp af filterkanter cellen som deres fluorescerende profiler kan ikke være fuldt fanget; disse spor kan frembringe falske positive udviklingsprofiler.
- Kalibrer rammeværdierne (totalFrames)fra billedudsnit til tidsværdier (startTime, interval) med kalibreringscellen Time-lapse ved hjælp af det eksperimentelle starttidspunkt og billedtidsintervallet. Udeluk læsninger af delvis inklusion ved at filtrere spor, der ikke strækker sig over de sidste 20 timer af eksperimentet (16-36 HPI), ved hjælp af cellen Sporvarighedsfilter.
- Adskjtyr spor i individuelle datarammer efter eksperimentel tilstand med cellen Tildel behandling. Filtrer efter indeslutninger, der udviser tilstrækkelig vækst ved hjælp af cellen Filtrer til vækst. I cellen Filtrer for Vækst skal fluorescensintensitetstærstlen for euo prom-kanalen angives empiriskved at ændre værdierne inden for de sidste to kodelinjer. Dette vil bortfiltrere klamydia, der ikke voksede.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du indstiller tærskelfiltre, hvis filteret er for lavt, vil de resulterende punktområder være støjende, men hvis filtrering er indstillet for højt, kan mutanter elimineres. - Beregn den procentvise dødelighed forårsaget af EMS ved at dividere antallet af mutageniserede spor/brønd med antallet af mock-behandlede spor/brønd. Multiplicer antallet af mock-behandlede spor med den oprindelige fortyndingsfaktor på 3 for at beregne antallet af mock-behandlede spor/brønd. Brug cellerne tæl inklusionsspor og Beregn procentdødelighedsceller til at udføre denne opgave.
- Beregn tiden til halvmaksimalt udtryk for både Calculate tidlige og sene reportere for hvert spor ved hjælp af calculatecellen. Disse værdier vil blive brugt til at sammenligne mutageniserede og håne populationer for at identificere udviklings mutanter.
- Inden for Half-Max Plot celle bruge bokeh plotte pakke til at visualisere tiden til halv-max udtryk for hver promotor,graftegning euo prom tid til halv-maksimal udtryk mod hctBprom. Identificer indeslutninger fra den mutante population, der falder uden for den mock-behandlede scatter sky ved hjælp af bokeh interaktive spor ID explorer. Noter FOV- og XY-koordinaterne for de inkluderende stoffer af interesse (figur 2).
BEMÆRK: Vælg kandidatinteatføjelser, der visuelt falder uden for kontrolskyen, da verifikation og statistisk evaluering af hver klon udføres efterfølgende. - Inden for Animated Plot celle visualisere ændringer i promotor udtryk kinetik dynamisk gennem tiden ved grafer udtrykket intensiteter af euoprom mod hctBprom ved hjælp af plotte værktøj Plotly16. Plotlys spredningsfunktion bruges til at animere genets udtryk over tid (Video 1).
- Visualiser et øjebliksbillede fra plott animerede graf i inklusionssøgningscellen, der afbilder euoprom- og hctBprom-udtryk på et bestemt tidspunkt (dvs. 28 HPI) ved hjælp af bokeh-pakken (Figur 3). Identificer inklusioner fra den mutante population som beskrevet i trin 3.3.8.
BEMÆRK: Denne analyse skal udføres hurtigt (<4 h), da indeslutningerne stadig udvides og vil begynde at lyse værtsceller ~ 48 h efter infektion.
- Isoler udviklings mutanter fra indeslutninger af interesse
BEMÆRK: For at isolere Klamydia fra de indeslutninger, der var fast besluttet på at vise ændret genregulering en mikromanipulator med kapillær nåle blev ansat. Well ID, FOV og X,Y koordinaterne for inklusioner af interesse blev fastlagt ved hjælp af datavisualiseringen i afsnit 3.3.- Forbered kapillærnåle ved at holde midten af kapillærrøret i en flamme og trække begge ender af kapillærrøret, indtil det er adskilt. Opret en åbning i den trak kapillær nål ved at bryde den trak spids på et mikroskop dias. For at bryde nålen skal den lukkede spids sættes på den matterede del af mikroskopsliden i en vinkel og trykkes.
BEMÆRK: Kapillær rør specifikationer var 1,0 mm O.D., 0,5 mm ID. - Kontroller, at nåleåbningen er omtrent på størrelse med en optagelse under et mikroskop, 20x mål.
- Prepull ~ 25-30 kapillær nåle til isolering af kandidat indeslutninger (en nål pr optagelse).
- Fyld mikroinjektoren med mineralsk olie, der sikrer, at der ikke er luftbobler til stede.
- Fastgør en glaskapillær nål til mikroinjector og udvise olie til spidsen af nålen, expunging eventuelle luftbobler. Anlæft kapillærn i hele medier og træk medier op halvvejs. Påfyldning af kapillærnålen med medier forhindrer olieforurening i brønden.
- Brug den gemte position liste i μManager fra trin 2.3.5, migrere til brønden og FOV af en inddragelse af interesse identificeret i Python visualisering notebook.
- Brug mikromanipulatorens joystick til at lokalisere kapillærnålen til XY-koordinaterne for medtagelsen af interesse.
- Brug 595 nm excitation kanal til at visualisere EBs for ekstraktion og fase / DIC hvidt lys kanal for nål visualisering. Manøvrer kapillærnålen til optagelse, brud optagelse og derefter trække EBs ind i kapillær nålen ved hjælp af mikroinjektor.
- Uddrive EBs fra kapillærnålen i en enkelt brønd af den forberedte 24 godt polystyren plade tilberedt i trin 2.1.2. Fjern kapillærnålen og udskift den med en frisk kapillær nål til næste optagelsesekstraktion. Gentag afsnit 3.4 for alle kandidatslutslutafslutninger.
BEMÆRK: For ekspansion og for at sikre en høj nok titer til re-imaging, inkubere mutant isolater i en 5% CO2,37 °C inkubator, indtil de fleste af værtscellerne er inficeret (~ 1 uge). Brønde bør overvåges nøje, da forskellige isolater kan udvise forskellige vækstrater.
- Forbered kapillærnåle ved at holde midten af kapillærrøret i en flamme og trække begge ender af kapillærrøret, indtil det er adskilt. Opret en åbning i den trak kapillær nål ved at bryde den trak spids på et mikroskop dias. For at bryde nålen skal den lukkede spids sættes på den matterede del af mikroskopsliden i en vinkel og trykkes.
- Høst mutant isolater
- På is, forstyrre den inficerede monolag ved at skrabe med en 1 ml mikropipette spids. Overfør medier, cellerester og frigav klamydia til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Pellet klamydia ved centrifugering i 30 minutter ved 4 °C, >14.000 x g. Fjern supernatanten og den resuspenderede pellet i 75 μL iskold 1x SPG. Aliquot i tre 1,5 ml skrue-cap mikrocentrifuge rør. Opbevares ved -80 °C.
4. Kontrol af mutant isolat fænotyper
- Værtscellekultur til billeddiagnostiske mutageniserede isolater
- Frø en 96 godt glas bundplade med 1,6 x 104 Cos-7 celler (ATCC) pr brønd i 100 μL af komplette medier. Inkuberes ved 5% CO2, 37 °C. Cellerne skal nå sammenløbet ca. 24 timer. Når cellerne er sammenløbet, erstattes medier med komplette medier suppleret med 1 μg/ml cycloheximid, inkuberes natten over.
- Inficere celler med kandidatisoler til fænotopypisk verifikation
- Tø mutant kloner og wildtype Klamydia på is.
- I den forberedte 96 brøndplade udføres en dobbelt seriel fortynding af mutantisoler ved hjælp af en kolonne pr. isolat (11 kolonner). Start med en indledende fortynding på 1:20 i 100 μl HBSS.
BEMÆRK: Seriel fortynding af Klamydia udføres for at sikre, at mutantprøver afbildes ved en MOI < 1. - Inficere den resterende (12.) kolonne med wildtype Klamydia på MOI ~ 0,5.
BEMÆRK: Wildtype Klamydia anvendes som en kontrol til sammenligning med mutageniserede isolater. - Inkuberes i 15 min rokke ved 37 °C.
- Inficerede værtsceller vaskes med prævarmet (37 °C) HBSS med 1 mg/ml heparin og HBSS som anført i punkt 2.2.
- Udskift med 200 μL pr. brønd af forvarmet (37 °C) billedbehandlingsmedie.
- Fyld interwellrummene med forvarmet (37 °C) deioniseret H2O.
- Inkuberes ved 5% CO2, 37 °C i 10 timer.
- Opsætning af mikroskop
BEMÆRK: Se afsnit 2.3 for opsætning af mikroskoper, dette afsnit indeholder kun de nødvendige opsætningsændringer.- Vælg 96 godt plade skabelon fra HCS plugin.
- Empirisk bestemme brønde svarende til en MOI < 1 for hver mutant isolat. Kløver udtryk under kontrol af euo promotor kan observeres på ~ 10 HPI gør tidlig visualisering af indeslutninger muligt (Figur 1B).
- Vælg tre brønde pr. mutant isolat, der svarer til en MOI < 1 og generere en billeddannelse position liste bestående af to FOV per brønd.
BEMÆRK: Kun 72 billeder kan tages per tidsinterval på grund af hardware begrænsninger, dette svarer til tre fortyndinger (brønde) pr stamme ved hjælp af to billedbehandlingssteder pr godt, hvis 12 prøver er afbildet. - Der registreres udviklingscyklussen for hver mutant isolat i 36 timer ved 30 min tidsintervaller startende ved 12 HPI.
- Optag de eksperimentelle detaljer i feltet Anskaffelseskommentarer. dvs, Nå ABC1: wildtype kontrol. Nå ABC2: Mutant stamme 1, ABC3: Mutant stamme 2, etc ... Billeddannelse: 12-48 HPI.
- Start billedopkøbet på 12 HPI.
5. Dataanalyse til isolerifikation
- Oprette in-focus-billedstakke og kvantificere fluorescensudtryk i individuelle indeslutninger
- Der genereres lysstofrør for hver optagelse som angivet i punkt 3.1 - 3.2.
- Kontroller ctr-mutageniserede isolater
BEMÆRK: For at kontrollere mutantisol isolaters ændrede udviklingsprofiler sammenlignes deres udtryksprofiler med wildtype-udtryksprofilen ved hjælp af Python notebook. Python notebook bruges til verifikation af mutant kloner med ændret udviklingsmæssige programmering leveres i de supplerende data (clone_check-Markdown).- Importer og filtrer inklusionssporingsdataene i clone_check-Markdown Python-notesbogen, som udført i afsnit 3.3.
- Middelværdi- og standardafvigelse (STD) beregnes fra sporene af hver population af isole- og wildtypekontrol ved hjælp af cellen Beregn middelværdi og STD.
- Med figur Iso vs WT-celleplottet er middel- og standardfejlen ved middelværdien (SEM) for hver mutant klon mod wildtype-betjeningen for at afgøre, om det mutante udtrykskinetik afviger fra vildtypeprøven ( Figur4).
- Afgøre, om den isolerede mutante population er klonet ved at afbilde mutantsporingerne og sammenligne dem med spor af wildtypeindføjelse ved hjælp af et spredningsskeplot som udført i punkt 3.3 (trin 3.3.7-3.3.10) (Figur 2, Figur 3). Hvis isolatet er en blandet population plottet vil vise en befolkning overlaying med wildtype og en anden særskilt befolkning uden for wildtype scatter sky. Hvis populationen ser blandet ud, kan mutanten isoleres igen ved hjælp af den oprindelige procedure, der er beskrevet i punkt 3.4.
BEMÆRK: For at afgøre, om et isolats udviklingsprofil er statistisk forskellig fra wildtype, skal kurverne for hver isolat sammenlignes med wildtype ved hjælp af ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Direkte EMS mutagenese af vores promotor-reporter klamydial stamme resulterede i en ~ 75% reduktion i infektivitet. Ved hjælp af den beskrevne live-celle billeddannelse protokol, ~ 600 indeslutninger blev afbildet og spores over en 24 timer periode. Den fluorescerende udtryk kinetik af begge journalister i hver optagelse blev visualiseret ved hjælp af brugerdefinerede Python notebook scripts. To visualisering tilgange blev gennemført for at identificere kandidat mutagenized Chlamydia for isolation. Den første metode (trin 3.3.8) visualiserer tiden til halvmaksimal ekspression af euo- og hctB-initiativtagere fra individuelle klamydiale isolater i et interaktivt scatterplot (Figur 2). Indeslutninger blev identificeret for isolation, hvis de faldt uden for mock-behandlet scatter sky. Kandidat kloner blev plukket, der visuelt faldt uden for kontrol sky. Kontrollen af hver klon blev foretaget efterfølgende. Kloner A3-6-67 og B3-8-58 blev udvalgt til isolation, da de producerede kortere tider til halvmaksimalt udtryk fra euo-promotoren og længere tider for HCTB (Figur 2).
Den anden visualiseringsmetode til identifikation af indeslutninger med ændret kinetik (trin 3.3.9-10) identificerer individuelle indeslutninger baseret på visualisering af dynamisk genekspression fra de to initiativtagere (Video 1). Igen, kandidat kloner med dynamisk optagelse udtryk mønstre, der var mærkbart forskellig fra kontrol indeslutninger blev plukket. B3-6-62 blev valgt på grund af øget fluorescerende akkumulering fra euo promotor mellem 23 og 29 HPI (Video 1). Et øjebliksbillede af den animerede graf blev taget for at identificere placeringen af de medføjelser af interesse (figur 3).
Ved hjælp af de to visualiseringsmetoder blev der identificeret i alt 24 inklusioner til isolering. Af de 24 isolerer i alt viste 10 differentialkinetik ved testning igen. Disse isolater faldt i tre fæotypiske kategorier; 8 isolater udviste nedsat euoprom udtryk på ~ 24 HPI, svarende til tidspunktet for RB-EB konvertering, som det fremgår af klon A3-6-67 (Figur 4A). De resterende to kloner viste unikke fænoypiske profiler, B3-8-58 isolatet også udstillet nedsat euoprom udtryk på ~ 24 HPI, men en samlet stigning i hctBprom udtryk (Figur 4B), mens B3-6-62 udtrykt forhøjede niveauer af fluorescens fra euo promotor efterfulgt af et pludseligt tab af udtryk i begge initiativtagere (Figur 4C). En analyse af de levende cellemikrografer for mutant B3-6-62 viste, at der forekom lysis i celler, der var inficeret med denne mutant, meget tidligere end i wildtype-inficerede celler (Video 2).
Figur 1: Overvågning af celle-type udvikling med Ctr promotor-reportere.
(A) Skematisk af initiativtager-reporter konstruktion, p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover. (B) Levende celle mikrograf af euoprom-Clover og hctBprom-mKate2 udtryk i Ctr på 10 HPI (C) Live-celle mikrograf af Ctr udtrykke euoprom-Clover og hctBprom-mKate2 på 36 HPI. Skalabar: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Identifikation af repræsentative isolater A3-6-67 og B3-8-58 ved visualisering af tiden til halvmaksimalt udtryk for hver promotor.
Den interaktive graf bruges til at identificere mutageniserede klamydia, der udviser udtryksprofiler, der adskiller sig fra den mock-behandlede kontrol scatter sky. Hvert punkt på grafen repræsenterer en enkelt optagelse. Inklusionspletter A3-6-67 og B3-8-58 fremhæves, da de falder uden for den mock-behandlede sky, der begge udviser kortere tid til halvmaksimal ekspression af euo-promotoren i kombination med længere tid til halvmaksimal ekspression af hctB. euoprom: x-akse, hctBprom: y-akse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Interaktivt øjebliksbillede til identifikation af inklusionsplacering.
Grafen præsenteres er et øjebliksbillede på 28 HPI fra den animerede scatter plot (Video 1) og blev brugt til at identificere FOV og XY koordinere placeringen af indeslutninger af interesse. B3-6-62 er vist som det blev valgt til isolation fra den animerede scatter plot. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kontrol af repræsentative mutantisoler.
Udviklingsprofiler af mutageniserede isolater A3-6, B3-8 og B3-6. (A) A3-6 mutant udviser et fald euoprom udtryk på ~ 24 HPI. (B) B3-8 mutant isolat udviser et fald euoprom udtryk på ~ 24 HPI, men en samlet stigning i HCTBprom udtryk. (C) B3-6 isolat udviser øget niveauer af euoprom udtryk efterfulgt af et pludseligt tab af udtryk i begge initiativtagere på ~ 40 HPI. Hver prøve er gennemsnittet af den angivne population, n > 25. Sky repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Arbejdsgang for rettet fremad genetisk analyse af promotor-reporter Ctr:
Ctr-L2-p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs blev direkte mutageniseret med EMS i axenic media, CIP-1. Mutageniserede EBs blev brugt til at inficere Cos-7 celle monolag til billeddannelse og fluorescerende udtryk analyse. Klamydia udtrykke ændrede udviklingsmæssige dynamik blev identificeret ved visualisering i interaktive grafer. Indeslutninger med ændrede udviklingsprofiler blev isoleret ved hjælp af en mikromanipulator. Isolaternes fænotyper blev verificeret ved reinfektion. Mutant isolater udsættes for WGS til at identificere DNA-læsioner forbundet med fænotyper. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Identifikation af mutageniseret klamydia, der udviser divergerende udtrykskinetik ved hjælp af et dynamisk genudtryksplot. Promotor udtryk for euo og hctB for individuelle indeslutninger blev plottet og visualiseret gennem tiden for at identificere mutagenized Klamydia med ændret udtryk dynamik. B3-6-62 blev valgt til isolation, da det udviser højere euoprom udtryk i forhold til wildtype sky. euoprom: x-akse, hctBprom: y-akse. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Repræsentativ mutant B3-6-62 forårsager for tidlig værtscellelysis. Time-lapse levende celle mikrograf af B3-6-62 inficerede værtsceller gennemgår for tidlig lysis (~ 40 HPI). Klik her for at downloade denne video.
Supplerende filer. Klik her for at downloade disse filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissekere de mekanismer, der styrer den klamydiale udviklingsmæssige cyklus er blevet hæmmet af begrænsningerne i de aktuelt tilgængelige genetiske værktøjer. Ved at anvende vores promotor-reporter Chlamydia i forbindelse med live-celle automatiseret mikroskopi, et system blev bygget, som gør det muligt at overvåge celle-type udvikling i individuelle indeslutninger over en 24 timer periode. Dette system har i kombination med kemisk mutagenese og isolation af direkte inklusion etableret en metode til hurtigt og klonisk at vælge Klamydia, der udtrykker ændrede udviklingsprofiler (figur 5).
Klamydiale EP'er er metabolisk aktive uden for værten , når de forsendes med intracellulæreioniske tilstandeog enenergikilde5 ,12. Denne EB axenic metabolisme blev gearede til mutagenisere renset EBs uden for værtsceller. I denne protokol blev metaboliserende EBs direkte mutageniseret med EMS. Det blev bemærket, at EMS-behandlingen effektivt reducerede EB's levedygtighed og genererede EB'er, der frembragte variable udviklingskinetik som forventet.
Det anslås, at den beskrevne EMS mutagenesis protokol genererer ~ 5-20 DNA ændringer / EB. Den levende-celle mikroskopi workflow beskrevet er i stand til billeddannelse ~ 8 indeslutninger pr synsfelt (FOV) og 72 FOVs hver i en 30 min interval. Derfor anslås det, at virkningerne af ~ 3000-10.000 mutationer kan visualiseres pr køre. Flere kørsler (3-5) vil resultere i visualisering af virkningerne af 9.000-50.000 mutationer. Ctr-L2-genomet koder ~850 gener, hvilket tyder på, at denne protokol vil resultere i visualisering af >10 mutationer pr. gen. Disse skøn viser, at genomdækningen, selv om den ikke er fuldstændig, bør være tilstrækkelig.
Styrken af denne protokol er evnen til at spore og registrere udtrykket kinetik af flere promotor-journalister på den fælles optagelse beslutning i nær realtid. Forward genetik er afhængig af observerbare fænotyper og klonal isolation. Tidligere metoder til fremadrettet genetik i Klamydia påberåbte sig statiske observationer og plaquing med agar overlays8. Med vores metode registreres dynamisk promotoraktivitet i hele udviklingscyklussen og visualiseres derefter for at identificere indeslutninger, der indeholder Klamydia med ændret genekspressionskinetik. Identifikation af kandidatinklusion ved hjælp af flere parametre (dvs. tid til halvmaksimalt udtryk og total fluorescerende intensitet på et givet tidspunkt) resulterer i forskellige mutantpuljer, der viser forskellige udviklingskinetik. Disse klamydia er tilbøjelige til at have unikke mutationer, der påvirker reguleringen af separate genetiske veje. Det faktum, at disse profiler kan optages live og visualiseres efter et par timer giver tid til at lokalisere og isolere indeslutninger af interesse fra den inficerede monolayer. Selv om vi fokuserede på genudfoldelsesdynamikken under udviklingen, kan alternative genjournalister bruges til at sonde andre lovgivningsmæssige veje.
Afhængigt af de genetiske veje, der afhøres, bør der udvises forsigtighed med tilføjelse af cycloheximide til værtsceller. Selvom inkubation med cycloheximid forbedrer monolayers billeddannelsesegenskaber ved at blokere replikering af værtscellerne; denne effekt opnås ved at hæmme værtsproteinsyntesen. Hæmning af de novo host proteinsyntese kan påvirke resultaterne af den genetiske skærm afhængigt af det stillede spørgsmål.
Fototoksicitet og fotobleaching er store forhindringer i langsigtet tidsforfald mikroskopi. For at løse disse problemer bør de særlige karakteristika ved hvert fluorescerende protein overvejes forud for forsøg. Kløver og mKate2 har korte modning gange (20-30 m) er photostable, og udviser relativt store kvanteudbytter17,18. Disse kvaliteter giver mulighed for at reducere excitation intensitet og eksponeringstid, hvilket reducerer mængden af fototoksicitet og fotobleaching afholdt. Fase / DIC hvidt lys kanal blev ansat til autofokusering som dette spektrum af lys var mindre fototoksisk til Klamydia.
Til denne protokol blev EMS anvendt som kemisk mutagen. EMS forårsager G:C til A:T overgange via guanine alkylering19. Men, denne protokol kan udvides til at omfatte alternative mutagener, der kan fremkalde andre former for genomiske mutationer. For eksempel, acridines er en klasse af DNA intercalating forbindelser, der inducerer indels, øge chancen for rammeskift og derfor null mutationer20.
Med fremskridt i klamydial transformation teknikker, muterede gener, der er forbundet med fænoypisk komplementering grupper kan blive slået ud via indsættelsesgenafbrydelse og genetisk komplementering til verifikation af genotype-fænotype linkage9. Genvinding af mutanter, der blokerer RB til EB-udvikling, kan være problematisk, da interessemutationer kan producere klamydia, der ikke kan reinfect-værtsceller. Denne teknik kan ændres for at identificere udviklingsgener af statistiske associationer (GWAS). Genomerne af Klamydia fra isolerede indeslutninger kan direkte sekvenseres uden ekspansion og verifikation. Den høje gennemløb karakter af denne teknik ville gøre statistiske foreninger muligt. Igen kan verifikation af disse associationer testes gennem genafbrydelse og komplementering9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Anders Omsland på Washington State University for at levere CIP-1 axenic medier. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskuddet R01AI130072, R21AI135691 og R21AI113617. Yderligere støtte blev ydet af startfonde fra University of Idaho og Center for Modeling Complex Interactions gennem deres NIH tilskud P20GM104420.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
- AbdelRahman, Y., Belland, R.
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
- Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
- Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
- Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
- Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
- Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
- Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
- Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
- Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
- Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14-20 (2010).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Plotly Technologies Inc. Collaborative data science. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
- Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
- Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).
