Live-Cell Framåt genetiska tillvägagångssätt för att identifiera och isolera utvecklingsmässiga mutanter i Chlamydia trachomatis

Summary

Detta protokoll använder fluorescerande promotor-reportrar, live-cell mikroskopi, och individuell integration utvinning i en riktad framåt genetisk metod för att identifiera och isolera utvecklingsmässiga mutanter av Chlamydia trachomatis.

Abstract

Den intracellulära bakteriella patogenen Chlamydia trachomatis genomgår en utvecklingscykel som består av två morfologiskt diskreta utvecklingsformer. Den icke-replikiv elementära kroppen (EB) initierar infektion av värden. Väl inne, EB differentierar till reticulate kroppen (RB). RB genomgår sedan flera omgångar av replikering, innan de skiljer tillbaka till den smittsamma EB-formen. Denna cykel är avgörande för klamydial överlevnad som underlåtenhet att växla mellan celltyper förhindrar antingen värd invasion eller replikering.

Begränsningar i genetiska tekniker på grund av obligate intracellulära karaktär Chlamydia har hämmat identifiering av de molekylära mekanismer som deltar i cell-typ utveckling. Vi designade en ny dubbel promotor-reporter plasmid system som, tillsammans med live-cell mikroskopi, möjliggör visualisering av celltyp växling i realtid. För att identifiera gener som deltar i regleringen av cell-typ utveckling, live-cell promotorn-reporter systemet var leveraged för utvecklingen av en framåt genetisk strategi genom att kombinera kemiska mutagenes av dubbla reporter stam, imaging och spårning av Klamydia med förändrade utvecklingsmässiga kinetik, följt av klonala isolering av mutanter. Detta framåt genetiska arbetsflöde är ett flexibelt verktyg som kan ändras för riktade förhör i ett brett spektrum av genetiska vägar.

Introduction

Chlamydia trachomatis (Ctr) är en obligate intracellulär patogen som fortskrider genom en bifasisk utvecklingscykel som är avgörande för dess överlevnad och spridning¹. Denna cykel består av två utvecklingsformer, elementarkroppen (EB) och den retikulerade kroppen (RB). EB är replikering inkompetent men förmedlar cell invasion genom effector inducerad endocytos². Väl i värden mognar EB till den replikiva RB. RB genomför flera omgångar av replikering innan konvertering tillbaka till EB för att inleda efterföljande omgångar av infektion.

Det begränsade utbudet av genetiska verktyg har begränsat de flesta av klamydialforskningen till biokemiska studier eller användningen av surrogatsystem. Som en konsekvens har klarläggande av genreglering och kontroll av utvecklingscykeln varit svårt^3,4. En av de viktigare utmaningarna i chlamydial fältet är hög upplösning tidsmässiga spårning av chlamydial utvecklingscykeln och identifiering av de proteiner som deltar i dess reglering. Genuttryck under den chlamydial utvecklingscykeln har traditionellt utförts av destruktiva "slutpunkt" metoder inklusive RNAseq, qPCR, och fast cell mikroskopi^5,6. Även om dessa metoder har lämnat ovärderlig information, de tekniker som används är mödosamma och har låg tidsmässig upplösning^5,6.

Inom det senaste årtiondet, genetisk manipulation av Ctr har utvecklats med införandet av plasmid omvandling och metoder för^{mutagenes 7,8,9}. För denna studie, en plasmid-baserade system har utvecklats för att övervaka chlamydial utveckling i enskilda inneslutningar i realtid under loppet av en infektion. En chlamydial transformant skapades som uttryckte både en RB och EB cell-typ specifika promotorn-reporter. RB specifika reportern konstruerades genom att sammansöka promotorn för den tidiga RB genen euo uppströms fluorescerande proteinet Clover. EUO är en transkriptionell regulator som förtränger en delmängd av sena EB associerade gener¹⁰. Den som främjar hctB, som kodar en histon-liknande protein som deltar i EB nukleoid kondensation, var klonade direkt uppströms mKate2 (RFP) för att skapa EB specifika reporter¹¹. Ryggraden för hctBprom-mKate2/euoprom-Clover var p2TK2SW2⁷. De hctB och euo initiativtagare var förstärkt från Ctr-L2 genomiska DNA. Varje promotor sekvens bestod av ~ 100 bas par uppströms av den förutsagda transkription startplatsen för den angivna chlamydial genen plus de första 30 nukleotid (10 aminosyror) av respektive ORF. De fluorescerande FP-varianterna erhölls kommersiellt som Ctr-kodonoptimerade genblock och klonade i ram med de första 30 nukleotid av varje chlamydial gen och promotor. IncD-terminatorn klonades direkt nedströms mKate2. Den andra promotorn-reporter sattes nedströms incD-terminatorn. Ampicillinresistensgenen (bla) i p2TK2SW2 ersattes med aadA-genen (Spectinomycin-resistens) från pBam4. Detta resulterade i den slutliga konstruktionen p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figur 1A) som förvandlades till Ctr-L2⁷. Denna RB/EB-reporterstam möjlig för observation av utvecklingscykeln inom enstaka inneslutningar med hjälp av live-cell-mikroskopi (figur 1B,C).

Anställa våra initiativtagare-reporter konstruktion i kombination med kemiska mutagenes, ett protokoll utformades för att spåra och isolera enskilda kloner som uppvisade utvecklingsmässiga avvikelser från mutagenized populationer av Ctr serovar L2. Detta protokoll möjliggör direkt övervakning av enskilda chlamydial införanden, spårning av genen uttrycksprofiler över tiden, identifiera klamydial kloner som uttrycker en förändrad utvecklingsmässiga genuttryck mönster och klonal isolering av Klamydia från enskilda inneslutningar.

Även om detta protokoll har skapats speciellt för identifiering av gener som deltar i chlamydial utveckling, kan det enkelt anpassas för att förhöra valfritt antal chlamydial genetiska vägar.

Protocol

Alla Python-skript som används i det här protokollet finns på Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mutagenize Reporter Klamydia

OBS: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs var direkt mutagenized med hjälp av etylmetansulfonat (EMS) i axenic media CIP-1 som detta media stöder EB metabolism och underhåll av EB smittsamhet¹².

1. Tina upp ett klamydiallager på is som innehåller ~3 x 10⁷ EBs omvandlat med p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover reporter plasmid och pellet på >14 000 x g i 30 min vid 4 °C.
   OBS: Klamydia organismer som används för dessa experiment var 30% renografin densitet renas och fryst vid -80 °C i 1x sackaros-fosfat-glutamat buffert (SPG).
2. Kassera supernatanten och resuspend EB-pelleten i 100 μL av CIP-1 buffert med ultraljudsbehandling på is vid 10% effekt för 10 s. Dela upp 100 μL av EB suspension i två 50 μL alikvoter för mutagenized och mock behandlade prover.
3. Bered 20 mg/mL EMS-CIP-1-lösning i ett separat 1,5 mL mikrocentrifugrör. För att göra det, tillsätt 6,8 μL EMS i 375 μL total volym.
4. Tillsätt 50 μL av EMS-CIP-1-lösningen i en av de chlamydial alikvoterna för mutagenes och 50 μL CIP-1 endast till den andra klamydiga alikvoten för mock mutagenesis.
   OBS: Slutlig EMS-koncentration är 10 mg/mL. Den klamydial titer, EMS koncentration, och tiden för exponering som används i detta protokoll leda till ungefär en 60-80% minskning av infektiös avkomma. Denna minskningsnivå motsvarar ~5-20 DNA-lesioner per chlamydial genom⁸.
5. Inkubera i 20 min i rumstemperatur. De mutagenized EBs kommer att användas direkt för att infektera monolayers i avsnitt 2.
   FÖRSIKTIGHET: EMS är en känd cancerframkallande. All utrustning och allt material som kommer i kontakt med EMS måste blötläggas i 1 M NaOH i 24 h före kassering, handskar ska användas hela tiden under protokollet och sanering av EMS-material.

2. Avbildning av mutanta Ctr

1. Värdcellskultur för bildbehandling och isolering av mutageniserad Ctr
   1. Utsäde en 6 väl glas bottenplatta med 6 x 10⁵ Cos-7 celler (ATCC) per brunn i 2 mL av kompletta medier (RPMI-1640 kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum och 10 mg/mL gentamicin). Använd denna glas bottenplatta för avbildning av mutagenized Ctr.
   2. Seeda en 24 väl polystyren platta med 1 x 10⁵ Cos-7 celler (ATCC) per brunn i 1 mL komplett media. Använd denna polystyren platta för återinfektion av isolerade Klamydia av intresse.
   3. Inkubera båda plattorna vid 5% CO₂, 37 °C i ungefär 18 h. När celler når konfluency, ersätta media med kompletta medier kompletteras med 1 μg/mL av cykloheximide och inkubera över natten.
2. Infekterar värdcellkulturen med mutagenized Ctr
   1. Infektera 5 brunnar av glaset bottenplattan med ~ 6 x 10⁵ av mutagenized EBs i 1,5 mL / väl iskall HBSS. Detta kommer att resultera i MOI av ~ 0,3 som ~ 70% dödlighet förväntas på grund av mutagenes.
   2. Infektera de återstående väl med ~ 2 x 10⁵ mock mutagenized EBs i 1,5 mL / väl iskall HBSS. Utan mutagenesis, förvänta mindre dödlighet, alltså en tredjedel av inokulat används för att uppnå MOI av ~ 0,3.
      OBS: MOI på ~ 0,3 säkerställer att värdceller infekteras av en enda EB och möjliggör tillräckligt med separation mellan infekterade celler för klonal isolering.
   3. Inkubera plattan i 15 min, med gungning, vid 37 °C.
   4. Tvätta de infekterade värdcellerna med förkrigsmed (37 °C) HBSS innehållande 1 mg/mL heparin som omedelbart följs av en HBSS-sköljning. Upprepa heparintvätt, omedelbart sköljning 2x med HBSS för att säkerställa att heparin avlägsnas.
      OBS: Heparin hämmar och kan vända de tidiga elektrostatiska interaktionerna mellan värdcellen och EBs¹³. Heparin tvättar bort EBs som ännu inte har kommit in i värdcellerna, synkronisera infektionen. När tvättceller gör det försiktigt för att förhindra att rubba cellerna från ytan av brunnarna. HBSS- och heparinlösningar innehåller rest-EMS och bör placeras i en bägare som innehåller 1 M NaOH i 24 h före kassering.
   5. Ersätt HBSS med 4 mL/brunn av förvärmda (37 °C) bildbehandlingsmedia (kompletta medier, 1 μg/mL cykloheximid, 20 mM HEPES, och ingen fenolröd).
   6. Fyll interwellutrymmena med förkrigsmed (37 °C) avjoniserad H₂O till hjälp i temperaturkontrollen och minska avdunstningen. Inkubera plattan vid 37 °C inkubator med 5% CO₂ för 10 h.
3. Mikroskop inrättas och bildframställning
   OBS: Multicolor multiposition automatiserad live-cell fluorescerande avbildning används för att samla in time-lapse bilder för att identifiera chlamydial mutanter som skiljer sig i den utvecklingsmässiga genen uttryck dynamik. Detta protokoll utnyttjar programpaketet μManager med öppen källkod för automatiserad mikroskopkontroll¹⁴.
   1. Börja mikroskopet setup 10 h post infektion. Ställ in mikroskopet skede inkubatorn till 5%_{CO 2}, 37 °C. Placera den infekterade 6 brunnsglas bottenplattan i scenen inkubatorn och sätt in provet termistor i interwell H₂O.
   2. Kalibrera XY-stadiet med hjälp av insticksprogrammet High Content Screening (HCS) . Klicka på Plugins | Förvärv Verktyg | HCS Site Generator i programvaran för μManager mikroskopkontroll (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
   3. Välj 6-väl-plåtmallen och generera en bildställningslista bestående av 12 synfält (FOV) per brunn inom HCS-insticksprogrammet (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Öppna scenens position lista och manuellt fokus och ställa in den inledande Z-positionen för varje FOV med hjälp av insticksprogrammet för scenkontroll (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Justera XY-koordinaterna för alla FOV som har saknade celler eller som inte innehåller ett enhetligt monolayer.
      OBS: På grund av den tid det tar för varje bild som ska fångas, kan ett maximalt antal 72 FOV tas per 30 min intervall.
   4. Använd en 20x objektiv för bildbehandling. Denna förstoring gör ~ 8 inneslutningar som ska avbildas per FOV samtidigt som den ger önskad upplösning.
   5. Spara befattningslistan eftersom detta kommer att användas för att lokalisera inkluderingen av intresse efter dataanalys (JoVE61365_screenfile7).
   6. Använd alternativet Autofokus i bildhanteringsprogrammet, för att ställa in fokus för automatiserad bilddiagnostik (JoVE61365_screenfile8).
   7. Använd följande val och värden för att producera de mest konsekventa fokusresultaten med hjälp av bildbaserad autofokus i μManager. I autofokusegenskaper fönstret välj OughtaFocus på rullgardinsmenyn och använd följande inställningar. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0,5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exponering: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Ja, OughtaFocus-Maximera: SharpEdges, OughtaFocus-Channel: DIC.
      OBS: Minska autofokus bildrutan genom att minska grödan faktor möjliggör mer konsekvent automatisk fokusering. Om du väljer Ja för OughtaFocus-ShowImages kan användaren visa autofokusbilden.
   8. Fånga upp utvecklingscykelns kinetik genom avbildning i 24 h med 30 min tidsintervall (JoVE61365_screenfile9). Bildbehandling mellan 12-36 HPI säkerställer att Chlamydia slutför utvecklingscykeln men inte lyse värdcellen.
   9. Bild cellen monolayers med en 250 ms exponering på 4% och 18% intensitet i GFP och RFP kanaler, respektive (JoVE61365_screenfile10). Detektera signalen Clover (GFP) genom excitation vid 470 nm med ett 514/30 nm bandpass utsläppsfilter. Detektera mKate2 (RFP) signal genom excitering vid 595 nm och med ett 641/75 nm bandpass utsläppsfilter.
      OBS: Att minimera excitation intensiteten är avgörande för att minimera fluorophore fotoblekning och fototoxicitet till Chlamydia. Minsta excitationsintensitet för att generera en löst bild med en exponering på 200- 300 ms bör fastställas empiriskt i pilotstudier.
   10. Fånga flera Z-skivor med ett intervall av fokus som slutar på vardera sidan av i fokus segmentet. I detta experiment, vid 20x förstoring, uppnåddes detta med 4 skivor vid 10 μm steg (JoVE61365_screenfile11).
   11. Välj Relativ Z för avbildning av flera segment i anskaffningsfönstret. Alternativet relativ Z använder den Z-planplats som sparas i avbildningspositionslistan som startpunkt för nästa tidsintervall. Mata in lämpliga Z-offset-värden för avbildningskanaler för fluorescens (JoVE61365_screenfile12).
       OBS: Det bildbaserade fokuseringssystemet är ofullkomligt och under en 24 h bildperiod leder detta till fokusdrift. Det konstaterades att genom att fånga 3-4 Z fokalplan för varje tidspunkt en i fokus bild bibehölls. Z-offset behövs för att korrigera för skillnaderna i fokalplan mellan de fluorescerande bildkanalerna och DIC-kanalen. Empirisk bestämning av denna Z-offset kommer att behövas.
   12. Spara bilder genom att välja rotkatalogen och namnge experimentet. Använd alternativet μManager image stack file för att spara bilder som tiff stack-filer (JoVE61365_screenfile13).
   13. Registrera de experimentella detaljerna i rutan Företagsköpskommentarer i fönstret Multi-D Acquisition (JoVE61365_screenfile13). dvs, Väl A1: Obehandlad kontroll. Tja A2-3 och B1-3: EMS Mutants. Bildbehandling: 12-36HPI. Starta bildförvärvet på 12 HPI.
       OBS: Om du använder μManager, lämna programmet, experimentell inställning, och mikroskop hårdvara körs efter experimentet är klar. De imaging webbplatser kommer att ses över för integration isolering när analysen av mutagenized befolkningen är klar.

3. Identifiera och isolera mutagenized Chlamydia med förändrade utvecklingsmässiga fenotyper

1. Skapa en i-fokus-bildstack
   1. Extrahera den mest i fokus bilden från Z-stackar med hjälp av sparade bilddata som innehåller 4 Z-segment per tidspunkt. Använd alternativet för kurtosismätning (Analysera | Measure) i ImageJ /FIJI för att automatiskt identifiera de mest i fokus Z-skiva (högsta kurtosis poäng) och skapa en ny bild stack med just dessa i fokus bilder. Ett Python-skript ingår som en tilläggsfil (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) för att automatisera den här processen.
2. Kvantifiera fluorescensuttryck i individuella inneslutningar
   OBS: För att kvantifiera uttrycket kinetik av de två reportrar använda öppen källkod bild analys ansökan ImageJ /FIJI och plugin Trackmate¹⁵. Trackmate identifierar 'spots' (som motsvarar inkluderingen i detta fall) och följer dem genom en time-lapse-bildstack som registrerar X,Y-platsen och signalintensiteten för varje inkluderingöver tid( JoVE61365_screenfile14 ). Den här informationen sparas som en CSV-fil och kommer att importeras till en anpassad bärbar dator för Python för analys.
   1. Öppna i-fokus Z-reducerad bildstapel i ImageJ/FIJI med hjälp av Bio-format Importer genom att klicka på Plugins | Bio-Format | Bio-format Importör. Välj Hyperstack och Komposit (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
   2. Subtrahera bilden bakgrunden genom att klicka på Process | Subtrahera Bakgrund med hjälp av en Rullande kulradie på 50,0 pixlar och förbättra bildkontrasten till 0,3 % för Mättade pixlar (Process | Förbättra Kontrast). Multiplicera bildvärdena med 10.0 (Process | Matematik | Multiplicera) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
   3. I Trackmate (Plugins | Spårning | Trackmate), välj en uppskattad blob diameter på 48 pixlar (empiriskt bestäms baserat på storleken på inkludering i slutet av avbildning). Producera icke-fragmenterade inkluderingsspår genom att välja en Länka maxavstånd och Gap-stängning max avstånd på 8,0 pixlar och Gap-closing max ramgap på 1 (JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25).
      OBS: För att förbättra Trackmate förmåga att identifiera och spåra inneslutningar över hela cykeln en separat bild kanal skapas genom att lägga till euoprom och hctBprom kanaler tillsammans med hjälp av bilden matematik funktion i ImageJ / FIJI. Den här kanalen används sedan av Trackmate för att identifiera och följa inneslutningar över tid. De fluorescerande värdena för euo-balenoch hctBprom-kanalerna registreras sedan i kanal 2 och 3.
   4. Registrera spår som uppfyller en minsta kontinuerlig varaktighet: Spårlängd: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analysera spåren och spara spårstatistiken Spots i spår som en CSV-fil (JoVE61365_screenfile27).
      OBS: Denna process har automatiserats med hjälp av ett anpassat Python-skript som tillhandahålls i de kompletterande data (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
3. Identifiera inkluderingsspår med ändrade utvecklingsprofiler
   OBS: För att identifiera inneslutningar som innehåller Chlamydia med ändrade utvecklingsprofiler visualiserades varje inklusionsspår med hjälp av bärbara Python- datorer. Dessa visualiseringar möjliggör identifiering av införanden med kinetiska genuttryck profiler som skilde sig från den mock-behandlade befolkningen. Den bärbara datorn Python som används för identifiering av inneslutningar med förändrad utvecklingsprogrammering tillhandahålls i de kompletterande uppgifterna (EMS_Screen-Markdown).
   1. Importera inkluderingsspårdata från Spots in tracks statistik CSV-filer i Pandas dataram med hjälp av Importera cellen i EMS_Screen-Markdown Python Notebook.
   2. Baslinje korrigera varje spår genom att subtrahera det minsta värdet för varje spår från resten av spårvärdena med hjälp av cellerna Originalplan Subtrahera. Spara de resulterande värdena som en pickle-fil med hjälp av Spara som pickle-cellen. Detta kommer att spara kanalvärdena permanent efter baslinje subtraktion för senare hämtning.
      OBS: Baslinje subtraktion ställer in startlysrörsintensiteten för varje inkludering till noll.
   3. Eliminera spår från inneslutningar nära kanterna på FOV med hjälp av Filter Edges cellen som deras fluorescerande profiler kanske inte är helt fångas; dessa spår kan ge falska positiva utvecklingsprofiler.
   4. Kalibrera ram - värden (totalFrames) från bildsegmenten till tid (startTime, interval) värden med Time-lapse Calibration-cellen med hjälp av den experimentella starttiden och bildtagningstidsintervallet. Uteslut partiell inkludering läsningar genom att filtrera ut spår som inte sträcker sig över de senaste 20 h i experimentet (16-36 HPI) med hjälp av Spåra varaktighet Filter cell.
   5. Separera spår i enskilda dataramar genom experimentellt tillstånd med assign treatment-cellen. Filter för inneslutningar som uppvisar tillräcklig tillväxt med hjälp av cellen Filter för tillväxt. I cellen Filter för tillväxt ställer empiriskt tröskeln för fluorescensintensitet för euo-promkanalengenom att ändra värdena inom de två sista kodraderna. Detta kommer att filtrera bort Klamydia som inte växte.
      OBS: Var försiktig när du ställer in tröskelfilter, om filtret är för lågt kommer de resulterande scatter-tomterna att vara bullriga, men om filtreringen är inställd för hög kan viktiga mutanter elimineras.
   6. Beräkna procentdödlighet som ems orsakas genom att dividera antalet mutageniserade spår/brunn med antalet mock-behandlade spår/brunn. Multiplicera antalet mock-behandlade spår med den initiala utspädningsfaktorn 3 för att beräkna antalet mock-behandlade spår/brunn. Använd cellerna Räkna inkluderingsspår och Beräkna procentdödlighet för att utföra den här uppgiften.
   7. Beräkna tiden till halv-maximal uttryck för både tidiga och sena reportrar för varje spår med hjälp av Beräkna cellen. Dessa värden kommer att användas för att jämföra mutagenized och håna populationer för att identifiera utvecklingsmässiga mutanter.
   8. Inom Half-Max Plot cellen använda bokeh plottning paketet för att visualisera tiden till halv-max uttryck för varje promotor, grafer euoprom tid till halv-maximal uttryck mot den av HCTBprom. Identifiera inklusioner från den mutanta populationen som faller utanför det mock-behandlade scatter-molnet med hjälp av den interaktiva spår-ID-utforskaren för bokeh. Anteckna FOV- och XY-koordinaterna för inkluderingen av intresse (figur 2).
      OBS: Plocka kandidatinklusioner som visuellt faller utanför kontrollmolnet som verifiering och statistisk utvärdering av varje klon kommer att utföras senare.
   9. Inom den animerade Plot cell visualisera förändringar i promotorn uttryck kinetik dynamiskt genom tiden genom att grafera uttrycksintensiteter euoprom mot hctBprom med hjälp av plottningsverktyget Plotly¹⁶. Scatter-funktionen för Plotly används för att animera genuttrycket över tid (Video 1).
   10. Visualisera en ögonblicksbild från Plotly animerade grafen i Inclusion Locator cell, plottning euoprom och hctBprom uttryck vid en viss tidpunkt (dvs. 28 HPI) med hjälp av bokeh paketet (Figur 3). Identifiera inneslutningar från den muterade populationen enligt beskrivningen i steg 3.3.8.
       OBS: Denna analys måste utföras snabbt (<4 h) eftersom inneslutningar fortfarande expanderar och kommer att börja lyse värdceller ~ 48 h efter infektion.
4. Isolera utvecklingsmutanter från inkluderingen av intresse
   OBS: Att isolera Klamydia från de inneslutningar som var fast beslutna att visa förändrad genreglering en micromanipulator med kapillär nålar var anställd. Well ID, FOV och X,Y koordinater för inneslutningar av intresse bestämdes med hjälp av datavisualiseringen i avsnitt 3.3.
   1. Förbered kapillärnålar genom att hålla kapillärrörets mitt i en låga och dra i kapillärrörets båda ändar tills det har separerat. Skapa en öppning i den dragna kapillärnålen genom att bryta den dragna spetsen på ett mikroskopsglas. För att bryta nålen, placera den stängda spetsen på den frostade delen av mikroskopet glida i en vinkel och tillämpa tryck.
      OBS: Kapillärrörsspecifikationer var 1,0 mm O.D., 0,5 mm I.D.
   2. Kontrollera att nålöppningen är ungefär lika stor som en inkludering under mikroskop, 20x-målsättning.
   3. Prepull ~ 25-30 kapillär nålar för isolering av kandidat införanden (en nål per inkludering).
   4. Fyll mikroinjektor med mineralolja se till att inga luftbubblor finns.
   5. Fäst en glas kapillär nål till mikroinjektorn och utvisa olja till spetsen av nålen, utplåna eventuella luftbubblor. Placera kapillärnålen i komplett media och dra upp media halvvägs. Påfyllning av kapillärnålen med media förhindrar oljekontaminering i brunnen.
   6. Med hjälp av den sparade position listan i μManager från steg 2.3.5, migrera till brunnen och FOV av en inkludering av intresse som identifierats i Python visualisering anteckningsbok.
   7. Använd mikromanipulatorns joystick för att lokalisera kapillärnålen till XY-koordinaterna för inklusionen av intresse.
   8. Använd 595 nm excitation kanal för att visualisera EBs för extraktion och fas / DIC vitt ljus kanal för nål visualisering. Manövrera kapillärnålen till inklusionen, spräcka inklusionen och dra sedan in EBs i kapillärnålen med hjälp av mikroinjektorn.
   9. Utvisa EBs från kapillärnålen till en enda brunn av den förberedda 24 väl polystyrenplattan beredd i steg 2.1.2. Ta bort kapillärnålen och byt ut mot en färsk kapillär nål för nästa inkluderingsextraktion. Upprepa avsnitt 3.4 för alla inkluderingen av kandidater.
      OBS: För expansion och för att säkerställa en tillräckligt hög titer för ny avbildning, inkubera mutanta isolat i en 5% CO₂, 37 °C inkubator tills majoriteten av värdcellerna är infekterade (~ 1 vecka). Brunnar bör övervakas noga eftersom olika isolat kan uppvisa olika tillväxttakt.
5. Skörd mutanta isolat
   1. På is, stör den infekterade monolayern genom att skrapa med en 1 mL mikropipettespets. Överför media, cell skräp, och släppte Klamydia i en 1,5 mL mikrocentrifug röret.
   2. Pellet Klamydia genom centrifugering i 30 min vid 4 °C, >14 000 x g. Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i 75 μL iskall 1x SPG. Alikvot i tre 1,5 mL skruvlocksmikrocentrifugrör. Förvaras vid -80 °C.

4. Verifiering av mutanta isolatet fenotyper

1. Värdcellskultur för bildframställning mutageniserade isolat
   1. Utsäde en 96 brunnsglas bottenplatta med 1,6 x 10⁴ Cos-7 celler (ATCC) per brunn i 100 μL av kompletta medier. Inkubera vid 5%_{CO 2}, 37 °C. Celler ska nå konfluency i ungefär 24 h. Efter celler är konfluenta, ersätta media med komplett media kompletteras med 1 μg/mL cycloheximide, inkubera över natten.
2. Infektera celler med kandidatiso isolat för fenotypisk verifiering
   1. Tina mutanta kloner och vildtyp Klamydia på is.
   2. I den förberedda 96 brunnsplattan utför du en tvåfaldig serieutspädning av mutanta isolat, med hjälp av en kolumn per isolat (11 kolumner). Börja med en initial utspädning på 1:20 i 100 μl HBSS.
      OBS: Serieutspädning av Chlamydia utförs för att säkerställa att muterade prover avbildas vid en MOI < 1.
   3. Infektera den återstående (12: e) kolumnen med wildtype Klamydia vid MOI ~ 0,5.
      OBS: Wildtype Klamydia används som en kontroll för jämförelse mot mutagenized isolat.
   4. Inkubera i 15 min gungning vid 37 °C.
   5. Tvätta infekterade värdceller med förkrigsmed (37 °C) HBSS med 1 mg/mL heparin och HBSS enligt specifikt i avsnitt 2.2.
   6. Ersätt med 200 μL per brunn av förvärmda (37 °C) bildbehandlingsmedia.
   7. Fyll interwellutrymmena med förkrigsmed (37 °C) avjoniserad H₂O.
   8. Inkubera vid 5%_{CO 2}, 37 °C i 10 h.
3. Mikroskop setup
   OBS: Se avsnitt 2.3 för mikroskop setup, kommer detta avsnitt endast innehålla de nödvändiga inställningsmodifieringarna.
   1. Välj 96 väl plattan mall från HCS plugin.
   2. Empiriskt bestämma brunnar som motsvarar en MOI < 1 för varje mutant isolat. Klöveruttryck under kontroll av euo promotorn är observerbara på ~ 10 HPI gör tidig visualisering av inneslutningar möjligt (Figur 1B).
   3. Välj tre brunnar per mutantisol som motsvarar en MOI < 1 och generera en avbildningspositionslista bestående av två FOV per brunn.
      OBS: Endast 72 bilder kan tas per tidsintervall på grund av hårdvara begränsningar, detta motsvarar tre utspädningar (brunnar) per stam med hjälp av två imaging platser per brunn om 12 prover avbildas.
   4. Registrera utvecklingscykeln för varje mutanta isolatet för 36 h med 30 min tidsintervall som börjar på 12 HPI.
   5. Registrera de experimentella detaljerna i rutan Företagshämtningar kommentarer. i. e., Tja ABC1: wildtype kontroll. Tja ABC2: Mutant stam 1, ABC3: Mutant stam 2, etc... Bildbehandling: 12-48 HPI.
   6. Starta bildförvärvet på 12 HPI.

5. Dataanalys för isolatverifiering

1. Skapa i-fokus bildstaplar och kvantifiera fluorescens uttryck i enskilda inneslutningar
   1. Generera fluorescerande intensitetsspår för varje inklusion enligt vad som anges i avsnitt 3.1 - 3.2.
2. Verifiera Ctr-mutageniserade isolat
   OBS: För att verifiera de förändrade utvecklingsprofilerna för mutantisover, jämförs deras uttrycksprofiler med profilen för att använda python-anteckningsboken för uttryck. Den bärbara datorn Python som används för verifiering av mutantkloner med förändrad utvecklingsprogrammering tillhandahålls i de kompletterande uppgifterna (clone_check-Markdown).
   1. Importera och filtrera inklusionsspårningsdata i clone_check-Markdown Python-anteckningsboken som gjort i avsnitt 3.3.
   2. Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen (STD) från spåren av varje isolat- och wildtype-kontrollpopulation med hjälp av cellen Beräkna medelvärde & STD.
   3. Med cellen Graph Iso vs WT-plot medelvärdet och standardfelet för medelvärdet (SEM) för varje mutantklon mot wildtype-kontrollen för att avgöra om mutantuttrycket kinetik avviker från vildtypsprovet (figur 4).
   4. Fastställ om den isolerade mutanta populationen är klonal genom att plotta de muterade spåren och jämföra dem med wildtype-inklusionsspår med hjälp av en spridningsyttning som gjorts i avsnitt 3.3 (steg 3.3.7-3.3.10) (figur 2, figur 3). Om isolatet är en blandad population kommer handlingen att visa en population som överläggs med wildtype och en andra distinkt population utanför wildtype scatter-molnet. Om befolkningen ser blandade mutanten kan åter isoleras med hjälp av den ursprungliga proceduren som beskrivs i avsnitt 3.4.
      OBS: För att avgöra om utvecklingsprofilen för ett isolat är statistiskt annorlunda från wildtype kurvorna för varje isolat bör jämföras med wildtype med hjälp av ANOVA.

Representative Results

Direkt EMS mutagenesis av våra promotor-reporter chlamydial stam resulterade i en ~ 75% minskning av smittsamhet. Med hjälp av den beskrivna live-cell imaging-protokollet, ~ 600 inneslutningar var avbildas och spåras över en 24 h period. Det fluorescerande uttrycket kinetik för båda reportrarna i varje inklusion visualiserades med hjälp av anpassade Skript för bärbara Python-datorer. Två visualisering metoder genomfördes för att identifiera kandidat mutagenized Klamydia för isolering. Den första metodiken (steg 3.3.8) visualiserar tiden till halv-maximala uttryck för euo och hctB-promotorer från enskilda klamydialisover i en interaktiv scatter-plot (Figur 2). Inneslutningar identifierades för isolering om de föll utanför det hånbehandlade scattermolnet. Kandidatkloner plockades som visuellt föll utanför kontrollmolnet. Verifiering av varje klon utfördes därefter. Klonerna A3-6-67 och B3-8-58 valdes ut för isolering då de producerade kortare tider till halv-maximalt uttryck från euo-promotorn och längre tider för hctB (Figur 2).

Den andra visualiseringsmetoden för att identifiera inneslutningar med förändrad kinetik (steg 3.3.9-10) identifierar individuella inneslutningar baserat på visualisering av dynamiska genuttryck från de två initiativtagarna (Video 1). Återigen, kandidat kloner med dynamisk inkludering uttryck mönster som var märkbart skild från kontroll inneslutningar plockades. B3-6-62 valdes på grund av ökad lysrörsackumulering från euo promotorn mellan 23 och 29 HPI (Video 1). En ögonblicksbild av den animerade grafen togs för att identifiera platsen för inklusionerna av intresse (Figur 3).

Med hjälp av de två visualiseringsmetoderna identifierades totalt 24 inneslutningar för isolering. Av de 24 totala isolaten visade 10 differentiell kinetik vid omtestning. Dessa isolat föll i tre fenotypiska kategorier; 8 isolat uppvisade minskat euoprom uttryck på ~ 24 HPI, motsvarande tiden för RB-EB konvertering, vilket framgår av klonen A3-6-67 (Figur 4A). De återstående två klonerna visas unika fenotypiska profiler, B3-8-58 isolatet uppvisade också minskade euoprom uttryck på ~ 24 HPI, ändå en total ökning av HCTBbalen uttryck (Figur 4B), medan B3-6-62 uttryckt ökade nivåer av fluorescens från euo promotorn följt av en plötslig förlust av uttryck i båda initiativtagarna (Figur 4C). Analys av de levande-cell mikrografer för mutant B3-6-62 visade att värdcell lys inträffade i celler som smittats med denna mutant mycket tidigare än i wildtype infekterade celler (Video 2).

Figur 1: Övervakning av utvecklingen av celltyp med Ctr promotor-reportrar.
(A) Schematiska för promotorn-reporter konstruktion, p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover. (B) Live-cell mikrograf av euoprom-Clover och hctBprom-mKate2 uttryck i Ctr vid 10 HPI (C) Live-cell mikrograf av Ctr uttrycker euoprom-Clover och hctBprom-mKate2 på 36 HPI. Skala bar: 20 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 2: Identifiering av representativa isolat A3-6-67 och B3-8-58 genom visualisering av tiden till halv-maximal uttryck för varje promotor.
Den interaktiva grafen används för att identifiera mutagenized Chlamydia uppvisar uttryck profiler som skiljer sig från den mock-behandlade kontroll scatter moln. Varje plats på grafen representerar en enda inkludering. Inklusionsfläckar A3-6-67 och B3-8-58 markeras när de faller utanför det mock-behandlade molnet, båda uppvisar kortare tid till halv-maximal uttryck för euo promotorn i kombination med längre tid till halv-maximal uttryck för hctB. euoprom: x-axel, hctBprom: y-axeln. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 3: Interaktiv ögonblicksbild för identifiering av inkluderingsplats.
Grafen som presenteras är en ögonblicksbild på 28 HPI från den animerade scatter plot (Video 1) och användes för att identifiera FOV och XY samordna platsen för inneslutningar av intresse. B3-6-62 visas som det valdes för isolering från den animerade scatter plot. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 4: Verifiering av representativa mutantisover.
Utvecklingsprofiler av mutageniserade isolat A3-6, B3-8, och B3-6. (A) Den A3-6 mutant uppvisar en minskning euoprom uttryck på ~ 24 HPI. (B) Den B3-8 mutanta isolatet uppvisar en minskning euoprom uttryck på ~ 24 HPI, men en övergripande ökning av hctBprom uttryck. (C) Den B3-6 isolatet uppvisar ökade nivåer av euoprom uttryck följt av en plötslig förlust av uttryck i båda initiativtagarna på ~ 40 HPI. Varje prov är medelvärdet av den angivna populationen, n > 25. Cloud representerar SEM. Klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 5: Arbetsflöde för riktad framåt genetisk analys av promotor-reporter Ctr:
Ctr-L2-p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs var direkt mutagenized med EMS i axenic media, CIP-1. Mutagenized EBs användes för att infektera Cos-7 cell monolayers för bildframställning och fluorescerande uttryck analys. Klamydia uttrycker förändrade utvecklingsmässiga dynamik identifierades genom visualisering i interaktiva grafer. Inneslutningar med ändrade utvecklingsprofiler isolerades med hjälp av en micromanipulator. Fenotyper av isolaten kontrollerades vid återinfektion. Mutant isolat utsätts för WGS att identifiera DNA-skador som är associerade med fenotyper. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Video 1: Identifiering av mutagenized Klamydia uppvisar divergerande uttryck kinetik med hjälp av en dynamisk gen uttryck tomt. Promotorn uttryck för euo och hctB för enskilda införanden var plottade och visualiseras genom tiden för att identifiera mutagenized Klamydia med ändrade uttryck dynamik. B3-6-62 valdes för isolering som det uppvisar högre euoprom uttryck i jämförelse med den wildtype molnet. euoprom: x-axel, hctBprom: y-axeln. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.

Video 2: Representativ mutant B3-6-62 orsakar för tidig värd-cell lys. Time-lapse live-cell mikrograf av B3-6-62 infekterade värd-celler genomgår för tidig lys (~ 40 HPI). Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.

Kompletterande filer. Vänligen klicka här för att ladda ner dessa filer.

Discussion

Dissekera de mekanismer som styr den klamydial utvecklingscykeln har hindrats av begränsningarna i den för närvarande tillgängliga genetiska verktyg. Anställa vår promotor-reporter Klamydia i samband med live-cell automatiserad mikroskopi, ett system byggdes som möjliggör övervakning av cell-typ utveckling i enskilda inneslutningar under en 24 h period. Detta system, i kombination med kemisk mutagenes och direkt inkludering isolering har etablerat en metod för att snabbt och klonalt välja Klamydia uttrycka förändrade utvecklingsprofiler (Figur 5).

Chlamydial EBs är metaboliskt aktiva utanför värden när de tillhandahålls med intracellulära joniska förhållanden och en^{energikälla 5,12}. Detta EB axenic metabolism var leveraged att mutagenize renas EBs utanför värdceller. I detta protokoll, metabolisera EBs var direkt mutagenized med EMS. Det observerades att EMS-behandlingen effektivt minskade EB-lönsamheten och genererade EBs som producerade variabla utvecklingskinetik som förväntat.

Det uppskattas att det beskrivna EMS mutagenesis-protokollet genererar ~5-20 DNA-ändringar/EB. Den levande-cell mikroskopi arbetsflödet beskrivs kan avbildning ~ 8 inneslutningar per synfält (FOV) och 72 FOVs varje i en 30 min intervall. Därför uppskattas att effekterna av ~ 3000-10.000 mutationer kan visualiseras per körning. Flera körningar (3-5) kommer att resultera i visualisering av effekterna av 9.000-50.000 mutationer. Den Ctr-L2 genomet kodar ~ 850 gener, vilket tyder på detta protokoll kommer att resultera i visualisering av >10 mutationer per gen. Dessa uppskattningar visar att genomtäckningen, även om den inte är fullständig, bör vara tillräcklig.

Styrkan i detta protokoll är förmågan att spåra och spela in uttryckskinetiken hos flera promotor-reportrar vid den enda integrationsupplösningen i nära realtid. Framåt genetik bygger på observerbara fenotyper och klonal isolering. Tidigare metoder för framåt genetik i Klamydia åberopas statiska observationer och plaquing med agar överlägg⁸. Med vår metodik registreras dynamisk promotoraktivitet under hela utvecklingscykeln och visualiseras sedan för att identifiera inneslutningar som innehåller Klamydia med förändrad genuttryckskinetik. Identifiera kandidat införanden med hjälp av flera parametrar (dvs. tiden till halv-maximal uttryck och total fluorescerande intensitet vid en viss tidpunkt) resulterar i distinkta mutant pooler som visar olika utvecklingsmässiga kinetik. Dessa Klamydia har sannolikt unika mutationer som påverkar regleringen av separata genetiska vägar. Det faktum att dessa profiler kan spelas in live och visualiseras efter några timmar ger tid att lokalisera och isolera inneslutningar av intresse från den infekterade monolayer. Även om vi fokuserade på genuttrycksdynamiken under utvecklingen, kan alternativa genreportrar användas för att undersöka andra regulatoriska vägar.

Beroende på de genetiska vägar som förhörs, försiktighet bör tas med tillägg av cykloheximide till värdceller. Även om inkubation med cykloheximid förbättrar monolayerns bildåtergivningsegenskaper genom att blockera replikering av värdcellerna; denna effekt uppnås genom att hämma värdproteinsyntesen. Hämning av de novo host proteinsyntesen kunde påverka resultaten av den genetiska skärmen beroende på frågan som ställs.

Fototoxicitet och fotobleaching är stora hinder i långsiktig time-lapse mikroskopi. För att övervinna dessa frågor bör de specifika egenskaperna hos varje fluorescerande protein övervägas före experiment. Klöver och mKate2 har korta mognadstider (20-30 m) är photostable, och uppvisar relativt stora kvantavkastningar^17,18. Dessa kvaliteter möjliggör minskning av excitation intensitet och exponeringstid, vilket minskar mängden fototoxicitet och fotobleaching ådragit sig. Fas/DIC vitt ljus kanal var anställd för autofokusering som detta spektrum av ljus var mindre fototoxiska att Chlamydia.

För detta protokoll användes EMS som en kemisk mutagen. EMS orsakar G:C till A:T övergångar via guanin alkylation¹⁹. Detta protokoll kan dock utvidgas till att omfatta alternativa mutagener som kan framkalla andra typer av genomiska mutationer. Till exempel, acridines är en klass av DNA intercalating föreningar som inducerar indels, öka risken för ram skift och därför null mutationer²⁰.

Med framsteg inom chlamydial transformation tekniker, kan muterade gener som är associerade med fenotypiska komplementeringsgrupper slås ut via insertional gen störningar och genetisk komplementering för verifiering av genotyp-fenotyp länkage⁹. Återvinna mutanter som blockerar RB till EB utveckling kan vara problematiskt som mutationer av intresse kan producera Klamydia som inte kan återinfektera värdceller. Denna teknik kan modifieras för att identifiera utvecklingsgener genom statistiska associationer (GWAS). Genlamydias arvsmassa från isolerade inneslutningar kan direktsekvenseras utan expansion och verifiering. Den höga genomströmningskaraktären hos denna teknik skulle göra statistiska associationer möjliga. Återigen kan verifiering av dessa associationer testas genom genavbrott och komplementering⁹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well polystyrene plates	Corning	3524	Cell culture growth for reinfection of isolates
6-well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Cell culture growth for imaging
96-well glass bottom plates	Nunc	165305	Cell culture growth for imaging
Bold line CO2 Unit	OKO Labs	CO2 UNIT BL	Stage incubator CO2 control
Bold line T Unit	OKO Labs	H301-T-UNIT-BL-PLUS	Stage incubator temperature control
Borosilicate glass capillary tubes	Sutter Instrument	B1005010	Capillary tubes
BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm)	Semrock	FF01-514/30-25	Fluoescent filter cube
BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm)	Semrock	FF02-641/75-25	Fluoescent filter cube
CellTram Vario	Eppendorf	5196000030	Microinjector
Chlamydia trachmatis serovar L2	ATCC	VR-577	Chlamydia trachomatis
CIP-1 media	In house	NA	Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house.
Cos-7 cells (ATCC)	ATCC	CRL-1651	African green monkey kidney cell (host cells)
Cycloheximide	MP Biomedicals	194527	Host cell growth inhibitor
Ethyl methanesulfonate, 99%	Acros Organics	AC205260100	Mutagen
Fetal Plex	Gemini Bio-Products	100-602	Supplement for base growth media
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/Fiji	NA	Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 incubator	Eppendorf	CO1700100X	Cell culture incubation
gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2)	Integrated DNA Technologies	NA	gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2
Gentamycin 10mg/ml	Gibco	15710-064	Antibiotic for growth media
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)	Corning	21-020-CM	Host cells rinse
Heparin sodium	Amersham Life Science	16920	inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs
HEPES 1M	GE Life Sciences	SH30237.01	pH buffer for growth media
InjectMan	Eppendorf	5179 000.018	Micromanipulator
Jupyter Notebook	https://jupyter.org/	NA	Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/
Lambda 10-3	Sutter Instrument	LB10-3	Filter wheel controler
Oko Touch	OKO Labs	Oko Touch	Interface to control the Bold line T and CO2 Unit
Prior XY stage	Prior	H107	Motorized XY microscope stage
PrismR Centrifuge	Labnet	C2500-R	Temperature controlled microcentrifuge
Problot Hybridization oven	Labnet	H1200A	Rocking Incubator for infection with Chlamydia
Proscan II	Prior	H30V4	XYZ microscope stage controler
Purifier Class 2 Biosafety Cabinet	Labconco	362804	Cell culture work
RPMI-1640 (no phenol red)	Gibco	11835-030	Base growth media for imaging
RPMI-1640 (phenol red)	GE Life Sciences	SH30027.01	Base growth media
scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm)	scopeLED	F140	Excitation light
Sonic Dismembrator Model 500	Fisher Scientific	15-338-550	Sonicator, resuspending chlamydial pellet
Stage incubator	OKO Labs	H301-K-FRAME	Cluster well plate incubation chamber
sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG)	In house	NA	Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4)
T-75 Flasks	Thermo Scientific	156499	Cell culture growth
TE 300 inverted microscope	Nikon	16724	microscope
THOR LED	Thor Labs	LEDD1B	White light
Trypsin	Corning	25-052-CI	Dislodges host cells from flask for seeding into plates
Zyla sCMOS	Andor	ZYLA-5.5-USB3	imaging camera
µManager 2.0gamma	https://github.com/micro-manager/micro-manager	NA	Open sourse automated microscope control software package