Summary
Questo protocollo utilizza promotori-reporter fluorescenti, microscopia a cellule vive e estrazione di inclusione individuale in un approccio genetico diretto in avanti per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo della Chlamydia trachomatis.
Abstract
Il patogeno batterico intracellulare Chlamydia trachomatis subisce un ciclo di sviluppo costituito da due forme di sviluppo morfologicamente discrete. Il corpo elementare non replicativo (EB) avvia l'infezione dell'host. Una volta all'interno, l'EB si differenzia nel corpo reticolato (RB). L'RB subisce quindi più cicli di replica, prima di differenziarsi di nuovo alla forma EB infettiva. Questo ciclo è essenziale per la sopravvivenza del clamidiale in quanto il mancato passaggio da un tipo di cellula all'altro impedisce l'invasione dell'host o la replica.
Le limitazioni nelle tecniche genetiche dovute alla natura intracellulare obbligata della clamidia hanno ostacolato l'identificazione dei meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo del tipo di cellula. Abbiamo progettato un nuovo sistema plasmid dual promoter-reporter che, in combinazione con la microscopia a cellule vive, consente la visualizzazione della commutazione del tipo di cellula in tempo reale. Per identificare i geni coinvolti nella regolazione dello sviluppo del tipo di cellula, il sistema promotore-reporter delle cellule vive è stato sfruttato per lo sviluppo di un approccio genetico in avanti combinando la mutagenesi chimica del ceppo dual reporter, l'imaging e il monitoraggio della clamidia con la cinetica dello sviluppo alterata, seguita dall'isolamento clonale dei mutanti. Questo flusso di lavoro genetico in avanti è uno strumento flessibile che può essere modificato per l'interrogatorio diretto in una vasta gamma di percorsi genetici.
Introduction
Chlamydia trachomatis (Ctr) è un patogeno intracellulare obbligato che progredisce attraverso un ciclo di sviluppo bifasico che è essenziale per la sua sopravvivenza e proliferazione1. Questo ciclo è costituito da due forme di sviluppo, il corpo elementare (EB) e il corpo reticolato (RB). L'EB è replica incompetente, ma media l'invasione cellulare attraverso l'endocitosi indottadall'effetto 2. Una volta nell'host, l'EB matura fino al RB replicativo. L'RB esegue più cicli di replica prima di ri convertirsi all'EB al fine di avviare successivi cicli di infezione.
La gamma limitata di strumenti genetici ha limitato la maggior parte della ricerca clamidiale a studi biochimici o all'uso di sistemi surrogati. Di conseguenza, la chiarimenta della regolazione genica e il controllo del ciclo di sviluppo è stato difficile3,4. Una delle sfide più importanti nel campo del clamidia è il monitoraggio temporale ad alta risoluzione del ciclo di sviluppo della clamidia e l'identificazione delle proteine coinvolte nella sua regolazione. L'espressione genica durante il ciclo di sviluppo chlamydiale è stata tradizionalmente eseguita da metodi distruttivi "end point", tra cui RNAseq, qPCR e microscopia a cellule fisse5,6. Anche se questi metodi hanno fornito informazioni preziose, le tecniche impiegate sono laboriose e hanno bassa risoluzione temporale5,6.
Nell'ultimo decennio, la manipolazione genetica del Ctr è progredito con l'introduzione della trasformazione plasmide e dei metodi per la mutagenesi7,8,9. Per questo studio, è stato sviluppato un sistema basato su plasmide per monitorare lo sviluppo di clamidiali nelle inclusioni individuali in tempo reale nel corso di un'infezione. È stato creato un trasformatore clamidiale che esprimeva sia un promotrice-reporter specifico di tipo cella RB che EB. Il reporter specifico RB è stato costruito fondendo il promotore del primo gene RB euo a monte della proteina fluorescente Clover. EUO è un regolatore trascrizionale che reprime un sottoinsieme di geni associati alla ceconeEB 10. Il promotore di hctB, che codifica una proteina istone-simile coinvolta nella condensazione nucleoide EB, è stato clonato direttamente a monte di mKate2 (RFP) per creare il reporter specifico EB11. La spina dorsale per hctBprom-mKate2/euoprom-Clover era p2TK2SW27. I promotori di hctB ed euo sono stati amplificati dal DNA genomico Ctr-L2. Ogni sequenza di promotore consisteva di 100 coppie di basi a monte del sito di inizio della trascrizione previsto per il gene clamidiale specificato più i primi 30 nucleotidi (10 aminoacidi) del rispettivo ORF. Le varianti di FP fluorescenti sono state ottenute commercialmente come blocchi genivi ottimizzati per il codon Ctr e clonate nel telaio con i primi 30 nucleotidi di ogni gene e promotore clamidiale. Il terminatore incD è stato clonato direttamente a valle di mKate2. Il secondo promotore-reporter è stato inserito a valle del terminatore incD. Il gene di resistenza all'ampicillina (bla) in p2TK2SW2 è stato sostituito con il gene aadA (resistenza alla spectinomicina) da pBam4. Ciò ha portato al costrutto finale p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figura 1A) che è stato trasformato in Ctr-L27. Questo ceppo di reporter RB/EB ha permesso l'osservazione del ciclo di sviluppo all'interno di singole inclusioni utilizzando la microscopia a cellule vive (Figura 1B,C).
Impiegando il nostro costrutto promotore-reporter in combinazione con la mutagenesi chimica, è stato ideato un protocollo per tracciare e isolare singoli cloni che mostravano anomalie dello sviluppo da popolazioni mutagenate di Ctr sierovar L2. Questo protocollo consente il monitoraggio diretto delle singole inclusioni clamidiali, il monitoraggio dei profili di espressione genica nel tempo, l'identificazione dei cloni clamidiali che esprimono un modello di espressione genica dello sviluppo alterata e l'isolamento clonale della clamidia dalle singole inclusioni.
Anche se questo protocollo è stato creato appositamente per l'identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo del clamidiale, potrebbe essere facilmente adattato per interrogare qualsiasi numero di vie genetiche clamidiali.
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Protocol
Tutti gli script Python utilizzati in questo protocollo sono disponibili su Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. Mutagenare Reporter Chlamydia
NOTA: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/ euo prom-Clover EB sono stati direttamente mutati utilizzando metanosulfonato etilo (EMS) nel supporto assonale CIP-1 in quanto questo supporto supporta ilmetabolismoEB e il mantenimento dell'infettività EB12.
- Scongelare un brodo di clamidia su ghiaccio contenente 3 x 107 EB trasformati con il pre2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover reporter plasmid e pellet a >14,000 x g per 30 min a 4 .
NOTA: gli organismi di clamidia utilizzati per questi esperimenti sono stati purificati e congelati a -80 gradi centigradi nel buffer 1x saccarosio-fosfato-glutammato (SPG). - Scartare il supernatante e risuspendere il pellet EB in 100 L di tampone CIP-1 con sonicazione su ghiaccio al 10% di potenza per 10 s. Dividere i 100 L di sospensione EB in due aliquot da 50 L per campioni trattati mutagenati e finti.
- Preparare 20 mg/mL della soluzione EMS-CIP-1 in un tubo di microcentrifuge separato da 1,5 mL. A tale scopo, aggiungere 6,8 L di EMS in 375 L volume totale.
- Aggiungere 50 L della soluzione EMS-CIP-1 in uno degli aliquot clamidiali per la mutagenesi e 50 L di CIP-1 solo all'altro aliquot di clamidia per la mutagenesi simulata.
NOTA: la concentrazione finale dello SME è di 10 mg/mL. L'angolo di clamidiale, la concentrazione di EMS e il tempo di esposizione utilizzato in questo protocollo portano a una riduzione di circa il 60-80% della progenie infettiva. Questo livello di riduzione corrisponde a 5-20 lesioni del DNA per genoma clamidiale8. - Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Gli EB mutagenati saranno utilizzati direttamente per infettare i monostrati nella sezione 2.
CAUTION: EMS è un noto cancerogeno. Tutte le attrezzature e i materiali che entrano in contatto con EMS devono essere immersi in 1 M NaOH per 24 h prima dello smaltimento, i guanti devono essere utilizzati in ogni momento durante il protocollo e la pulizia dei materiali EMS.
2. Imaging di Ctr mutante
- Coltura cellulare ospitante per l'imaging e l'isolamento del Ctr mutagenato
- Seme di una piastra inferiore in vetro 6 con 6 x 105 cellule Cos-7 (ATCC) per pozzo in 2 mL di supporto completo (RPMI-1640 integrato con 10% siero bovino fetale e 10 mg/mL gentamicin). Utilizzare questa lastra di fondo in vetro per l'imaging del Ctr mutagenato.
- Semina una piastra di polistirolo ben 24 con 1 x 105 celle Cos-7 (ATCC) per pozzo in 1 mL supporto completo. Utilizzare questa piastra di polistirolo per la reinfezione della clamidia isolata di interesse.
- Incubare entrambe le piastre al 5% di CO2, 37 gradi centigradi per circa 18 h. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, sostituire i supporti con supporti completi integrati con 1 g/mL di cicloheximide e incubare durante la notte.
- Infettare la coltura delle cellule host con Ctr mutagenato
- Infettare 5 pozzetti della piastra di fondo in vetro con 6 x 105 MB mutagenati in HBSS a 1,5 mL/ben ghiacciato. Ciò si tradurrà nel MOI di 0,3 dollari, poiché si prevede un tasso di mortalità del 70% a causa della mutagenesi.
- Infettare il pozzo rimanente con 2 x 105 EBs finti mutagenati in HBSS freddo di 1,5 mL/well ice. Senza mutagenesi, aspettatevi meno mortalità, quindi un terzo dell'inoculum viene utilizzato per raggiungere il MOI di 0,3 dollari.
NOTA: IL MOI di 0,3 assicura che le cellule host siano infettate da un singolo EB e consente una separazione sufficiente tra le cellule infette per l'isolamento clonale. - Incubare la piastra per 15 minuti, con dondolo, a 37 gradi centigradi.
- Lavare le cellule ospitanti infette con HBSS preriguero (37 gradi centigradi) contenente 1 epatina mg/mL seguita immediatamente da un risciacquo HBSS. Ripetere il lavaggio dell'epatina, risciacquare immediatamente 2x con HBSS per garantire che l'epatina venga rimossa.
NOTA: L'eparla inibisce e può invertire le prime interazioni elettrostatiche tra la cellula ospite e gli EB13. I lavaggi di epatina rimuovono gli EB che devono ancora entrare nelle cellule host, sincronizzando l'infezione. Quando le celle di lavaggio lo fanno delicatamente per evitare di spostare le cellule dalla superficie dei pozzi. Le soluzioni HBSS ed epaina contengono EMS residuo e devono essere collocate in un becher contenente 1 M NaOH per 24 h prima dello smaltimento. - Sostituite l'HBSS con 4 mL/pozzo di supporti di imaging preriscaldato (37 gradi centigradi) (supporto completo, cicloheximide 1 g/mL, 20 mM HEPES e nessun rosso fenolo).
- Riempire gli spazi interwell con preriguermed (37 gradi centigradi) deionized H2O per aiutare nel controllo della temperatura e ridurre l'evaporazione. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi con 5% CO2 per 10 h.
- Configurazione e imaging al microscopio
NOTA: l'imaging fluorescente a cellule vive multicolore multicolore viene utilizzato per raccogliere immagini time-lapse per identificare mutanti clamidiali che differiscono nelle dinamiche dell'espressione genica dello sviluppo. Questo protocollo utilizza il pacchetto software open source di Manager per il controllo automatizzato del microscopio14.- Iniziare la configurazione del microscopio 10 h dopo l'infezione. Impostare l'incubatrice di fase del microscopio su 5% CO2, 37 gradi centigradi. Collocare la piastra inferiore in vetro 6 nell'incubatrice di fase e inserire il termore del campione nell'interwell H2O.
- Calibrare lo stage XY utilizzando il plug-in High Content Screening (HCS). Fare clic su Plugins Strumenti di acquisizione Generatore di siti HCS nel software di controllo del microscopio di Manager (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
- Selezionare il modello di piastra a 6 well e generare un elenco di posizione di imaging costituito da 12 campi di visualizzazione (FOV) per pozzo all'interno del plug-in HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Aprite l'Elenco posizione stage e impostate manualmente la posizione iniziale per ogni FOV utilizzando il plug-in Controllo stage (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Regolare le coordinate XY di qualsiasi FOV che contiene celle mancanti o non contiene un monostrato uniforme.
NOTA: A causa del tempo necessario per l'immagine da acquisire, è possibile acquisire un numero massimo di 72 FOV per ogni intervallo di 30 minuti. - Utilizzare un obiettivo 20x per l'imaging. Questo ingrandimento consente di eseguire l'immagine di 8 inclusioni per FOV, pur fornendo la risoluzione desiderata.
- Salvare l'elenco delle posizioni in quanto verrà utilizzato per individuare le inclusioni di interesse dopo l'analisi dei dati (JoVE61365_screenfile7).
- Utilizzare l'opzione Messa a fuoco automatica nel software di imaging per impostare la messa a fuoco per l'imaging automatico (JoVE61365_screenfile8).
- Usa le selezioni e i valori seguenti per produrre i risultati dello stato attivo più coerenti usando la messa a fuoco automatica basata sull'immagine in . Nella finestra delle proprietà Messa a fuoco automatica selezionare OughtaFocus dal menu a discesa e utilizzare le impostazioni seguenti. OughtaFocus-SearchRange_m: 350, OughtaFocus-Tolerance_m: 0,5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Yes, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel:
NOTA: la riduzione della finestra di imaging di messa a fuoco automatica riducendo il fattore di ritaglio consente una messa a fuoco automatica più coerente. Se si seleziona Sì per OughtaFocus-ShowImages, l'utente può visualizzare l'immagine di messa a fuoco automatica. - Catturare la cinetica del ciclo di sviluppo mediante l'imaging per 24 h con intervalli di tempo di 30 minuti (JoVE61365_screenfile9). L'imaging tra 12-36 HPI assicura che La clamidia completi il ciclo di sviluppo ma non lyse la cella ospite.
- Immagine dei monostrati cellulari con un'esposizione di 250 ms con un'intensità del 4% e del 18% rispettivamente nei canali GFP e RFP(JoVE61365_screenfile10). Rileva il segnale del trifoglio (GFP) per eccitazione a 470 nm con un filtro per le emissioni del bandpass da 514/30 nm. Rilevare il segnale mKate2 (RFP) per eccitazione a 595 nm e con un filtro per le emissioni del bandpass da 641/75 nm.
NOTA: Ridurre al minimo l'intensità dell'eccitazione è fondamentale per ridurre al minimo la fotovoltaia del fluoroforo e la fototossicità alla Clamidia. L'intensità minima di eccitazione per generare un'immagine risolta con un'esposizione di 200-300 ms deve essere determinata empiricamente negli studi pilota. - Catturate più sezioni z con un intervallo di messa a fuoco che termina su entrambi i lati della sezione in-focus. In questo esperimento, con un ingrandimento 20x, questo è stato ottenuto con 4 fette a 10 gradini(JoVE61365_screenfile11).
- Selezionare Relativo per l'imaging di più sezioni nella finestra di acquisizione. L'opzione relativa , utilizza la posizione del piano di stampa salvata nell'elenco delle posizioni di imaging come punto di partenza per l'intervallo di tempo successivo. Immettere i valori di offset z appropriati per i canali di imaging a fluorescenza (JoVE61365_screenfile12).
NOTA: Il sistema di messa a fuoco basato su immagini è imperfetto e in un periodo di imaging di 24 h questo porta alla deriva di messa a fuoco. Si è scoperto che catturando 3-4 piani focali per ogni punto di tempo è stata mantenuta un'immagine a fuoco. Per correggere le differenze nei piani focali tra i canali di immagine fluorescenti e il canale DIC, è necessario correggere l'offset z. Sarà necessaria la determinazione empirica di questo offset z. - Salvare le immagini selezionando la directory radice e assegnando un nome all'esperimento. Utilizzate l'opzione file stack immagine di Manager per salvare le immagini come file di stack tiff (JoVE61365_screenfile13).
- Registrare i dettagli sperimentali nella casella Commenti acquisizioni della finestra Acquisizione multiD (JoVE61365_screenfile13). vale a esempio, Bene A1: Controllo non trattato. Bene A2-3 e B1-3: Mutanti EMS. Immagine: 12-36HPI. Avviare l'acquisizione dell'immagine a 12 HPI.
NOTA: se si utilizza il comando , lasciare il programma, la configurazione sperimentale e l'hardware del microscopio in esecuzione al termine dell'esperimento. I siti di imaging saranno riviti per l'isolamento dell'inclusione una volta completata l'analisi della popolazione mutagenata.
3. Identificare e isolare la clamidia mutagenata con fenotipi dello sviluppo alterati
- Creazione di una pila di immagini in primo tempo
- Estrarre l'immagine più attiva dalle pile di z utilizzando i dati dell'immagine salvati che contengono 4 sezioni per punto di tempo. Utilizzare l'opzione di misurazione della curtosi ( Misurare) in ImageJ/FIJI per identificare automaticamente la sezione più a fuoco - sezione (punteggio di curtosi più alto) e creare una nuova pila di immagini con solo queste immagini in-focus. Uno script Python è incluso come file supplementare (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) per automatizzare questo processo.
- Quantificare l'espressione di fluorescenza nelle singole inclusioni
NOTA: per quantificare la cinetica dell'espressione dei due reporter utilizzare l'applicazione di analisi delle immagini open source ImageJ/FIJI e il plugin Trackmate15. Trackmate identifica i "punti" (corrispondenti alle inclusioni in questo caso) e li segue attraverso uno stack di immagini time-lapse che registra la posizione X,Y e l'intensità del segnale per ogni inclusionenel tempo( JoVE61365_screenfile14 ). Queste informazioni vengono salvate come file CSV e verranno importate in un blocco appunti Python personalizzato per l'analisi.- Aprire la pila di immagini ridotta a fuoco in ImageJ/FIJI utilizzando l'utilità di importazione dei formati bio facendo clic su Plugins . Bio-Formati Importatore di bio-formati. Selezionare Hyperstack e Composito (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
- Sottrarre lo sfondo dell'immagine facendo clic su Processo Sottrarre lo sfondo utilizzando un raggio della sfera di rotolamento di 50,0 pixel e migliorare il contrasto dell'immagine allo 0,3% per i pixel saturi (Processo Migliora contrasto). Moltiplicare i valori dell'immagine per 10,0 (Processo Proprietà Math . Moltiplica) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
- In Trackmate (Plugins Proprietà Tracking . Trackmate), selezionare un diametro del BLOB stimato di 48 pixel (determinato empiricamente in base alle dimensioni dell'inclusione alla fine dell'imaging). Produrre tracce di inclusione non frammentate selezionando una distanza massima di collegamento e una distanza massima di chiusura di 8,0 pixel e uno spazio massimo di frame di chiusura gap di 1 ( JoVE61365_screenfile23- JoVE61365_screenfile25).
NOTA: Per migliorare la capacità di Trackmate di identificare e tenere traccia delle inclusioni nell'intero ciclo, viene creato un canale immagine separato aggiungendo i canali del prom euoprom e hctButilizzando la funzione matematica dell'immagine in ImageJ/FIJI. Questo canale viene quindi utilizzato da Trackmate per identificare e seguire le inclusioni nel tempo. I valori fluorescenti dei canali di prom euo e hctBprom vengono quindi registrati nei canali 2 e 3. - Registrare le tracce che soddisfano una durata continua minima: Durata della traccia: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analizzare le tracce e salvare i punti nelle statistiche traccia come file CSV (JoVE61365_screenfile27).
NOTA: questo processo è stato automatizzato utilizzando uno script Python personalizzato fornito nei dati supplementari (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
- Identificare le tracce di inclusione con profili di sviluppo alterati
NOTA: per identificare le inclusioni contenenti Chlamydia con profili di sviluppo alterati, ogni traccia di inclusione è stata visualizzata utilizzando il notebook Python. Queste visualizzazioni consentono l'identificazione di inclusioni con profili di espressione genica cinetica che differivano dalla popolazione trattata in modo fittizio. Il notebook Python utilizzato per l'identificazione delle inclusioni con programmazione dello sviluppo alterata è fornito nei dati supplementari (EMS_Screen-Markdown).- Importa i dati della traccia di inclusione dai file CSV delle statistiche Spot in tracks in Pandas utilizzando la cella Import nel EMS_Screen-Markdown Python Notebook.
- La linea di base corregge ogni traccia sottraendo il valore minimo di ogni traccia dal resto dei valori della traccia utilizzando le celle Sottrai linea di base. Salvare i valori risultanti come file di sottaceto utilizzando la cella Salva come sottaceto. In questo modo i valori del canale verranno salvati in modo permanente dopo la sottrazione della linea di base per un successivo recupero.
NOTA: la sottrazione della linea di base imposta l'intensità fluorescente iniziale di ogni inclusione su zero. - Eliminare le tracce dalle inclusioni vicino ai bordi del FOV utilizzando la cella Filtra bordi poiché i profili fluorescenti potrebbero non essere completamente acquisiti; queste tracce possono produrre profili di sviluppo falsi positivi.
- Calibrare i valori del fotogramma (totalFrames) dalle sezioni dell'immagine ai valori di tempo (startTime, interval) con la cella Time-lapse Calibration utilizzando l'ora di inizio sperimentale e l'intervallo di tempo di imaging. Escludere le letture di inclusione parziale filtrando le tracce che non si estendono negli ultimi 20 h dell'esperimento (16-36 HPI) utilizzando la cella Filtro durata traccia.
- Separare le tracce in singoli frame di dati in base alla condizione sperimentale con la cella Assegna trattamento. Filtrare le inclusioni che presentano una crescita sufficiente utilizzando la cella Filtro per crescita. Nella cella Filtro per crescita, impostare empiricamente la soglia di intensità di fluorescenza per il canale del prom euomodificando i valori all'interno delle ultime due righe di codice. Questo scenografo Chlamydia che non è cresciuto.
NOTA: quando si impostano i filtri di soglia, se il filtro è troppo basso, i grafici a dispersione risultanti saranno rumorosi, ma se il filtro è impostato su mutanti importanti troppo alti potrebbero essere eliminati. - Calcolare la mortalità percentuale causata da EMS dividendo il numero di tracce mutagenizzate/bene per il numero di tracce/tracce trattate in modo fittizio/bene. Moltiplicare il numero di tracce trattate in modo fittizio per il fattore di diluizione iniziale di 3 per calcolare il numero di tracce/ben trattate in modo fittizio. Utilizzare le celle Conteggio tracce di inclusione e Calcola mortalità percentuale per eseguire questa attività.
- Calcolare il tempo a espressione semi-massima per i giornalisti in anticipo e in ritardo per ogni traccia utilizzando la cella Calcola. Questi valori saranno utilizzati per confrontare popolazioni mutagene e fittizie per identificare i mutanti dello sviluppo.
- All'interno della cella Half-Max Plot utilizzare il pacchetto di plottaggio bokeh per visualizzare il tempo a metà-max espressione di ogni promotore, grafico il tempo di prom euoa espressione semi-massima rispetto a quella del prom hctB. Identificare le inclusioni dalla popolazione mutante che non rientrano nella nube di dispersione trattata in modo fittizio utilizzando l'esploratore id traccia interattivo bokeh. Prendere nota delle coordinate FOV e XY delle inclusioni di interesse (Figura 2).
NOTA: selezionare le inclusioni candidate che non rientrano visivamente nel cloud di controllo come verifica e valutazione statistica di ogni clone verranno eseguite successivamente. - All'interno della cella Grafico animato visualizzare le modifiche nella cinetica dell'espressione promoter in modo dinamico nel tempo, rappresentando graficamente le intensità di espressione di euoprom rispetto al prom hctButilizzando lo strumento di stampa Plotly16. La funzione scatter di Plotly viene utilizzata per animare l'espressione genica nel tempo (Video 1).
- Visualizzare uno snapshot dal grafico animato Plotly nella cella Inclusion Locator, tracciando l'espressione delprom euo prom e hctBin un momento specifico (ad esempio 28 HPI) utilizzando il pacchetto bokeh (Figura 3). Identificare le inclusioni dalla popolazione mutante come descritto nel passaggio 3.3.8.
NOTA: Questa analisi deve essere eseguita rapidamente (<4 h) poiché le inclusioni sono ancora in espansione e inizierà a lyse cellule host 48 h dopo l'infezione.
- Isolare i mutanti dello sviluppo dalle inclusioni di interesse
NOTA: Per isolare la clamidia dalle inclusioni che sono state determinate per visualizzare la regolazione genica alterata è stato impiegato un micromanipolatore con aghi capillari. Le coordinate Well ID, FOV e X,Y delle inclusioni di interesse sono state determinate utilizzando la visualizzazione dei dati nella sezione 3.3.- Preparare gli aghi capillari tenendo il centro del tubo capillare in una fiamma e tirando entrambe le estremità del tubo capillare fino a quando non si è separato. Creare un'apertura nell'ago capillare tirato rompendo la punta tirata su un scivolo al microscopio. Per rompere l'ago, posizionare la punta chiusa sulla porzione smerigliata del farse al microscopio ad angolo e applicare la pressione.
NOTA: le specifiche dei tubi capillari erano 1,0 mm D.D., 0,5 mm I.D. - Controllare che l'apertura dell'ago sia approssimativamente delle dimensioni di un'inclusione al microscopio, obiettivo 20x.
- Prepull 25-30 aghi capillari per l'isolamento delle inclusioni dei candidati (un ago per inclusione).
- Riempire il microiniettore con olio minerale assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.
- Attaccare un ago capillare di vetro al microiniettore ed espellere l'olio sulla punta dell'ago, espellendo eventuali bolle d'aria. Posizionare l'ago capillare in un supporto completo e disegnare i supporti a metà strada. Riempire l'ago capillare con supporti previene la contaminazione dell'olio nel pozzo.
- Utilizzando l'elenco delle posizione salvate in 2.3.5, eseguire la migrazione al pozzo e foV di un'inclusione di interesse identificata nel blocco appunti di visualizzazione Python.
- Utilizzare il joystick del micromanipulatore per localizzare l'ago capillare alle coordinate XY dell'inclusione di interesse.
- Utilizzare il canale di eccitazione di 595 nm per visualizzare gli EB per l'estrazione e il canale di luce bianca phase/DIC per la visualizzazione dell'ago. Manovra l'ago capillare per l'inclusione, rompere l'inclusione e poi disegnare gli EBs nell'ago capillare utilizzando il microiniettore.
- Espellere gli EB dall'ago capillare in un unico pozzo della piastra di polistirolo preparata al punto 2.1.2. Rimuovere l'ago capillare e sostituirlo con un ago capillare fresco per la prossima estrazione di inclusione. Ripetere la sezione 3.4 per tutte le inclusioni candidate.
NOTA: per l'espansione e per garantire un titer abbastanza alto per la ri-imaging, incubare isolati mutanti in un incubatore di CO2, 37 gradi centigradi fino a quando la maggior parte delle cellule ospitanti sono infettate (1 settimana). I pozzi dovrebbero essere monitorati attentamente in quanto diversi isolati possono presentare tassi di crescita diversi.
- Preparare gli aghi capillari tenendo il centro del tubo capillare in una fiamma e tirando entrambe le estremità del tubo capillare fino a quando non si è separato. Creare un'apertura nell'ago capillare tirato rompendo la punta tirata su un scivolo al microscopio. Per rompere l'ago, posizionare la punta chiusa sulla porzione smerigliata del farse al microscopio ad angolo e applicare la pressione.
- Raccogliere isolati mutanti
- Sul ghiaccio, interrompere il monostrato infetto raschiando con una punta di micropipetta da 1 mL. Trasferire i supporti, i detriti delle cellule e la Chlamydia rilasciata in un tubo microcentrifuge da 1,5 mL.
- Pellet Chlamydia per centrifugazione per 30 min a 4 gradi centigradi, >14.000 x g. Rimuovere il pellet supernatant e resuspend in 75 L di ghiaccio freddo 1x SPG. Aliquot in tre tubi microcentrifuge a vite da 1,5 mL. Conservare a -80 gradi centigradi.
4. Verifica dei fenotipi isolari mutanti
- Coltura cellulare host per l'imaging di isolati mutagenati
- Semina una piastra inferiore in vetro 96 con 1,6 x 104 celle Cos-7 (ATCC) per pozzo in 100 l di supporti completi. Incubare al 5% CO2, 37 . Le cellule dovrebbero raggiungere la confluenza in circa 24 h. Dopo che le cellule sono confluenti, sostituire i supporti con supporti completi integrati con cicloheximide 1 g/mL, incubare durante la notte.
- Infettare le cellule con isolati candidati per la verifica fenotipico
- Thaw cloni mutanti e chlamydia wildtype sul ghiaccio.
- Nella piastra del pozzo preparato 96, eseguire una diluizione seriale su due volte degli isolati mutanti, utilizzando una colonna per isolato (11 colonne). Iniziare con una diluizione iniziale di 1:20 in HBSS 100.
NOTA: la diluizione seriale della clamidia viene eseguita per garantire che i campioni mutanti siano immagini in un MOI < 1. - Infettare la colonna rimanente (12a) con Chlamydia wildtype a MOI 0,5.
NOTA: Wildtype Chlamydia viene utilizzato come controllo per il confronto con gli isolati mutageni. - Incubare per 15 minuti a dondolo a 37 gradi centigradi.
- Lavare le cellule ospitanti infette con HBSS preriguersato (37 gradi centigradi) con 1 mg/mL di eparla e HBSS come specificato nella sezione 2.2.
- Sostituirlo con 200 L per pozzo di supporti di imaging prebellico (37 gradi centigradi).
- Riempire gli spazi interwell con preriguermed (37 gradi centigradi) deionized H2O.
- Incubare al 5% CO2, 37 c per 10 h.
- Configurazione del microscopio
NOTA: fare riferimento alla sezione 2.3 per la configurazione del microscopio, questa sezione conterrà solo le modifiche di installazione necessarie.- Selezionare il modello di piastra 96 bene dal plugin HCS.
- Determina empiricamente i pozzi corrispondenti a un MOI < 1 per ogni isolato mutante. L'espressione del trifoglio sotto il controllo del promotore euo è osservabile a 10 HPI rendendo possibile la visualizzazione anticipata delle inclusioni ( Figura1B).
- Selezionare tre pozzetti per isolata mutata che corrispondono a un MOI < 1 e generare un elenco di posizione di imaging costituito da due FOV per pozzo.
NOTA: solo 72 immagini possono essere prese per intervallo di tempo a causa di vincoli hardware, questo equivale a tre diluizioni (pozzi) per ceppo utilizzando due siti di imaging per pozzo se vengono 12 campioni. - Registrare il ciclo di sviluppo di ogni isolato mutante per 36 h a intervalli di tempo di 30 minuti a partire da 12 HPI.
- Registrare i dettagli sperimentali nella casella Commenti acquisizioni. vale a i., ad esempio, ben ABC1: controllo wildtype. Bene ABC2: ceppo mutante 1, ABC3: ceppo mutante 2, ecc ... Immagini: 12-48 HPI.
- Avviare l'acquisizione dell'immagine a 12 HPI.
5. Analisi dei dati per la verifica dell'isolamento
- Creare pile di immagini in-focus e quantificare l'espressione di fluorescenza nelle singole inclusioni
- Generare tracce di intensità fluorescente per ogni inclusione come specificato nella sezione 3.1 - 3.2.
- Verificare gli isolati mutagenati Ctr
NOTA: per verificare i profili di sviluppo alterati degli isolati mutanti, i relativi profili di espressione vengono confrontati con il profilo dell'espressione wildtype utilizzando il blocco appunti Python. Il notebook Python utilizzato per la verifica dei cloni mutanti con programmazione dello sviluppo alterata è disponibile nei dati supplementari (clone_check-Markdown).- Importare e filtrare i dati di traccia di inclusione nel blocco appunti python clone_check-Markdown come descritto nella sezione 3.3.
- Calcolare la media e la deviazione standard (STD) dalle tracce di ogni popolazione di controllo isolato e wildtype utilizzando la cella Calcola media e STD.
- Con la tabella Graph Iso vs WT, tracciare la media e l'errore standard della media (SEM) di ogni clone mutante rispetto al controllo wildtype per determinare se la cinetica dell'espressione mutante è divergente rispetto al campione wildtype (Figura 4).
- Determinare se la popolazione mutante isolata è clonale tracciando le tracce mutanti e confrontandole con le tracce di inclusione wildtype utilizzando un grafico a dispersione come illustrato nella sezione 3.3 (passaggi 3.3.7-3.3.10) (Figura 2, Figura 3). Se l'isolato è una popolazione mista, il grafico mostrerà una popolazione sovrapposta a wildtype e una seconda popolazione distinta al di fuori della nube di dispersione wildtype. Se la popolazione sembra mista, il mutante può essere nuovamente isolato utilizzando la procedura originale descritta nella sezione 3.4.
NOTA: Per determinare se il profilo di sviluppo di un isolato è statisticamente diverso da wildtype, le curve per ogni isolato devono essere confrontate con wildtype utilizzando ANOVA.
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Representative Results
La mutagenesi diretta dello SME del nostro ceppo clamidiale promotore-reporter ha comportato una riduzione dell'infettività del 75%. Utilizzando il protocollo di imaging a cellule vive descritto, sono state registrate e monitorate 600 inclusioni in un periodo di 24 ore. La cinetica dell'espressione fluorescente di entrambi i reporter in ogni inclusione è stata vista utilizzando script di notebook Python personalizzati. Sono stati implementati due approcci di visualizzazione per identificare la clamidia mutagenata candidata per l'isolamento. La prima metodologia (passaggio 3.3.8) visualizza il tempo di espressione semi-massima dei promotori euo e hctB da singoli isolati clamidiali in un grafico a dispersione interattivo (Figura 2). Le inclusioni sono state identificate per l'isolamento se sono cadute al di fuori della nube di dispersione trattata in modo fittizio. Sono stati scelti cloni candidati che cadevano visivamente al di fuori della nuvola di controllo. La verifica di ogni clone è stata eseguita successivamente. I cloni A3-6-67 e B3-8-58 sono stati selezionati per l'isolamento in quanto hanno prodotto tempi più brevi all'espressione semi-massima dal promotore euo e tempi più lunghi per hctB (Figura 2).
Il secondo metodo di visualizzazione per identificare le inclusioni con cinetica alterata (passaggi 3.3.9-10) identifica le singole inclusioni in base alla visualizzazione dell'espressione genica dinamica da parte dei due promotori (Video 1). Anche in questo caso, sono stati selezionati cloni candidati con modelli di espressione di inclusione dinamica che erano notevolmente distinti dalle inclusioni di controllo. B3-6-62 è stato scelto a causa di un aumento dell'accumulo fluorescente da parte del promotore euo tra 23 e 29 HPI (Video 1). È stato creato uno snapshot del grafico animato per identificare la posizione delle inclusioni di interesse (Figura 3).
Utilizzando i due metodi di visualizzazione, sono state identificate 24 inclusioni per l'isolamento. Dei 24 isolati totali, 10 hanno mostrato una cinetica differenziale al momento del riesame. Questi isolati sono caduti in tre categorie fenotipi; 8 isolati hanno mostrato una diminuzione dell'espressione delprom euo a 24 HPI, corrispondente al momento della conversione RB-EB, come dimostrato dal clone A3-6-67 ( Figura4A). I restanti due cloni mostravano profili fenotipici unici, l'isolato B3-8-58 mostrava anche una diminuzione dell'espressione delprom euo a 24 HPI, ma un aumento complessivo dell'espressione del ballo hctB(Figura 4B), mentre B3-6-62 esprimeva livelli aumentati di fluorescenza dal promotore euo seguito da un'improvvisa perdita di espressione in entrambi i promotori (Figura 4C). L'analisi dei micrografi a cellule vive per il mutante B3-6-62 ha rivelato che la lisi delle cellule ospite si è verificata nelle cellule infettate da questo mutante molto prima rispetto alle cellule infette wildtype (Video 2).
Figura 1: Monitoraggio dello sviluppo di tipo cellulare con I promotori-reporter Ctr.
(A) Schematico del costrutto promotore-reporter, p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover. (B) Micrografo a cellule vive dell'espressione euoprom-Clover e hctBprom-mKate2 in Ctr a 10 HPI (C) Micrografo a celle vive di Ctr che esprime euoprom-Clover e hctBprom-mKate2 a 36 HPI. Barra della scala: 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione degli isolati rappresentativi A3-6-67 e B3-8-58 mediante la visualizzazione del tempo a espressione semi-massima per ogni promotore.
Il grafico interattivo viene utilizzato per identificare la clamidia mutagenata che presenta profili di espressione che differiscono dalla nuvola di dispersione di controllo trattata in modo fittizio. Ogni punto del grafico rappresenta una singola inclusione. I punti di inclusione A3-6-67 e B3-8-58 sono evidenziati mentre cadono al di fuori della nube finta trattata, entrambi mostrando un tempo più breve all'espressione semi-massima del promotore euo in combinazione con un tempo più lungo a espressione massima di hctB. euoprom: asse x, prom hctB:asse y. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: snapshot interattivo per l'identificazione del percorso di inclusione.
Il grafico presentato è un'istantanea a 28 HPI dal grafico a dispersione animato (Video 1) ed è stato utilizzato per identificare la posizione delle coordinate FOV e XY delle inclusioni di interesse. B3-6-62 viene visualizzato come è stato scelto per l'isolamento dal grafico a dispersione animato. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Verifica degli isolati mutanti rappresentativi.
Profili di sviluppo di isolati mutagenati A3-6, B3-8 e B3-6. (A) Il mutante A3-6 mostra un'espressione di diminuzione del ballo euoa 24 HPI. (B) L'isolato mutante B3-8 presenta un'espressione di diminuzione del ballo euoa 24 HPI, ma un aumento complessivo dell'espressione del ballo hctB. (C) L'isolato B3-6 mostra un aumento dei livelli di espressione del ballo euoseguito da un'improvvisa perdita di espressione in entrambi i promotori a 40 HPI. Ogni campione è la media della popolazione specificata, n > 25. Cloud rappresenta SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Flusso di lavoro per l'analisi genetica diretta in avanti del promotore-reporter Ctr:
Ctr-L2-p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EB sono stati direttamente mutati con EMS in supporti asciali, CIP-1. Gli EB mutagenati sono stati utilizzati per infettare i monostrati cellulari Cos-7 per l'imaging e l'analisi dell'espressione fluorescente. La clamidia che esprime dinamiche di sviluppo alterate è stata identificata dalla visualizzazione in grafici interattivi. Le inclusioni con profili di sviluppo alterati sono state isolate utilizzando un micromanipolatore. I fenotipi degli isolati sono stati verificati al momento della reinfezione. Gli isolati mutanti sono sottoposti a WGS per identificare le lesioni del DNA associate ai fenotipi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Identificazione della clamidia mutagenata che mostra una cinetica di espressione divergente utilizzando un trama di espressione genica dinamica. L'espressione promotrice di euo e hctB per le singole inclusioni è stata tracciata e vista nel tempo per identificare la clamidia mutagenata con dinamiche di espressione alterate. B3-6-62 è stato scelto per l'isolamento in quanto presenta un'espressione di ballo euosuperiore rispetto alla nube wildtype. euoprom: asse x, prom hctB:asse y. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Il mutante rappresentativo B3-6-62 causa una lisis prematuro delle cellule ospite. Micrografo a cellule vive time-lapse di cellule host infette B3-6-62 subiscono l'llisi prematura (40 HPI). Clicca qui per scaricare questo video.
File supplementari. Si prega di fare clic qui per scaricare questi file.
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Discussion
La dissezione dei meccanismi che controllano il ciclo dello sviluppo della clamidia è stata ostacolata dalle limitazioni degli strumenti genetici attualmente disponibili. Impiegando il nostro promotore-reporter Chlamydia in combinazione con la microscopia automatizzata a cellule vive, è stato costruito un sistema che consente il monitoraggio dello sviluppo del tipo di cellula nelle singole inclusioni in un periodo di 24 ore. Questo sistema, in combinazione con la mutagenesi chimica e l'isolamento diretto dell'inclusione, ha stabilito un metodo per selezionare rapidamente e clonalmente la chlamydia esprimendo profili di sviluppo alterati (Figura 5).
I DB chlamydiali sono metabolicamente attivi al di fuori dell'ospite quando sono dotati di condizioni ioniche ioni e di una fonte dienergia 5,12. Questo metabolismo assonale EB è stato sfruttato per mutagenare gli EB purificati al di fuori delle cellule ospitante. In questo protocollo, gli EB metabolizzanti sono stati direttamente mutati con EMS. È stato osservato che il trattamento EMS ha ridotto efficacemente la vitalità degli EB e ha generato EB che hanno prodotto cinetica variabile dello sviluppo come previsto.
Si stima che il protocollo di mutagenesi EMS descritto generi 5-20 cambiamenti di DNA/EB. Il flusso di lavoro di microscopia a cellule vive descritto è in grado di imaging di 8 inclusioni per campo di visualizzazione (FOV) e 72 FOV ogni in un intervallo di 30 minuti. Pertanto, si stima che gli effetti di 3000-10.000 dollari mutazioni possono essere visualizzati per ogni corsa. Più esecuzioni (3-5) si tradurrà nella visualizzazione degli effetti di 9.000-50.000 mutazioni. Il genoma di Ctr-L2 codifica geni da 850 dollari, suggerendo che questo protocollo comporterà la visualizzazione di >10 mutazioni per gene. Queste stime indicano che la copertura del genoma, anche se non completa, dovrebbe essere sufficiente.
La forza di questo protocollo è la capacità di monitorare e registrare la cinetica di espressione di più promotori-reporter alla risoluzione di inclusione singola in quasi tempo reale. La genetica in avanti si basa su fenotipi osservabili e sull'isolamento clonale. I metodi passati per la genetica in avanti in Chlamydia si basavano su osservazioni statiche e plaquing con sovrapposizioni di agar8. Con la nostra metodologia, l'attività promotrice dinamica viene registrata durante tutto il ciclo di sviluppo e quindi viene visualizzato per identificare le inclusioni che contengono la clamidia con cinetica dell'espressione genica alterata. L'identificazione delle inclusioni candidate utilizzando più parametri (ad esempio, il tempo di espressione semi-massima e l'intensità fluorescente totale in un determinato punto di tempo) si traduce in pool mutanti distinti che mostrano diverse cinetiche dello sviluppo. Queste clamidia hanno probabilmente mutazioni uniche che influenzano la regolazione di percorsi genetici separati. Il fatto che questi profili possano essere registrati dal vivo e visualizzati dopo poche ore permette di individuare e isolare le inclusioni di interesse dal monostrato infetto. Anche se ci siamo concentrati sulla dinamica dell'espressione genica durante lo sviluppo, i giornalisti geni alternativi possono essere utilizzati per sondare altri percorsi normativi.
A seconda delle vie genetiche interrogate, la cautela deve essere presa con l'aggiunta di cicloheximide alle cellule ospitanti. Sebbene l'incubazione con cicloheximide migliori le caratteristiche di imaging del monostrato bloccando la replicazione delle cellule host; questo effetto si ottiene inibendo la sintesi proteica dell'ospite. L'inibizione della sintesi proteica dell'ospite de novo potrebbe influenzare i risultati dello screening genetico a seconda della domanda posta.
La fototossicità e il fotobleaching sono i principali ostacoli nella microscopia time-lapse a lungo termine. Per superare questi problemi, le caratteristiche specifiche di ogni proteina fluorescente devono essere considerate prima della sperimentazione. Clover e mKate2 hanno tempi di maturazione brevi (20-30 m) sono fototable, e presentano rese quantici relativamente grandi17,18. Queste qualità consentono di ridurre l'intensità dell'eccitazione e il tempo di esposizione, riducendo così la quantità di fototossicità e fotobleaching sostenuti. Il canale di luce bianca phase/DIC è stato impiegato per la messa a fuoco automatica in quanto questo spettro di luce era meno fototossico per Chlamydia.
Per questo protocollo, EMS è stato utilizzato come mutageno chimico. EMS provoca transizioni da G:C a A:T tramite guanina alkylation19. Tuttavia, questo protocollo può essere ampliato per includere mutageni alternativi che possono indurre altri tipi di mutazioni genomiche. Per esempio, le acridine sono una classe di composti intercalanti del DNA che inducono indel, aumentando la possibilità di cambiamenti di cornice e quindi mutazioninulle 20.
Con i progressi nelle tecniche di trasformazione clamidiale, i geni mutati associati ai gruppi di complemento fenotipico possono essere eliminati attraverso la disgregazione genica di inserimento e l'complemento genetico per la verifica del collegamento genotipo-fenotipo9. Il recupero di mutanti che bloccano lo sviluppo da RB a EB potrebbe essere problematico in quanto mutazioni di interesse possono produrre chlamydia che non possono reinfettare le cellule ospitanti. Questa tecnica può essere modificata per identificare i geni dello sviluppo mediante associazioni statistiche (GWAS). I genomi della clamidia provenienti da inclusioni isolate possono essere sequenziati direttamente senza espansione e verifica. L'elevata produttività di questa tecnica renderebbe possibili le associazioni statistiche. Anche in questo caso, la verifica di queste associazioni può essere testata attraverso l'interruzione genica e l'complemento9.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Anders Omsland della Washington State University per aver fornito i media assonali CIP-1. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R01AI130072, R21AI135691 e R21AI113617. Ulteriore supporto è stato fornito dai fondi di avvio dell'Università dell'Idaho e del Center for Modeling Complex Interactions attraverso la loro sovvenzione NIH P20GM104420.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
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