Summary
RNA-interferens är en allmänt tillämplig, kraftfull teknik för att manipulera genuttryck i specifika utvecklingsstadier. Här beskriver vi de nödvändiga stegen för att genomföra denna teknik i vattenlevande dykning skalbaggen Thermonectus marmoratus, från förvärv av gensekvenser till knockdown av gener som påverkar struktur eller beteende.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) är fortfarande en kraftfull teknik som möjliggör riktad minskning av genuttryck genom mRNA-nedbrytning. Denna teknik är tillämplig på en mängd olika organismer och är mycket effektiv i den artrika ordningen Coleoptera (skalbaggar). Här sammanfattar vi de nödvändiga stegen för att utveckla denna teknik i en ny organism och illustrera dess tillämpning på de olika utvecklingsstadier av vattenlevande dykning skalbagge Thermonectus marmoratus. Målgensekvenser kan erhållas kostnadseffektivt genom montering av transkriptomer mot en nära släkting med känd genomik eller de novo. Kandidat gen kloning utnyttjar en specifik kloning vektor (pCR4-TOPO plasmid), som gör det möjligt att syntesen av dubbelsträngad RNA (dsRNA) för någon gen med användning av en enda gemensam primer. Det syntetiserade dsRNA kan injiceras i antingen embryon för tidiga utvecklingsprocesser eller larver för senare utvecklingsprocesser. Vi illustrerar sedan hur RNAi kan injiceras i vattenlevande larver med hjälp av immobilisering i agaros. För att demonstrera tekniken, ger vi flera exempel på RNAi experiment, generera specifika knockdowns med förutsagda fenotyper. Specifikt leder RNAi för garvning genen laccase2 till nagelband ljusare i både larver och vuxna, och RNAi för ögat pigmentering genen vit producerar en ljusare / brist på pigmentering i ögonrör. Dessutom leder knockdown av en nyckellinsprotein till larver med optiska brister och en minskad förmåga att jaga byte. Kombinerat, dessa resultat exemplifierar kraften i RNAi som ett verktyg för att undersöka både morfologiska mönster och beteendemässiga drag i organismer med endast transkriptomic databaser.
Introduction
Frågan om hur specifika gener bidrar till utvecklingen av olika egenskaper är ett spännande ämne inom biologin. Under de senaste decennierna har stora framsteg gjorts när det gäller dissekera den genetiska underbyggnad av utvecklingsprocesser i ett fåtal modell organismer, såsom nematoden Caenorhabditis elegans, fruktflugan Drosophila melanogaster, och huset mus Mus musculus1. På senare tid har uppfinningen av kraftfulla gen-redigering tekniker såsom klustrade regelbundet interspaced korta palindromic upprepar (CRISPR)/Cas92 har gett möjlighet att ändra den genetiska koden för icke-modell organismer (för exempel se3,4). Som ett resultat har det skett en ökning av genetiska studier på en mängd olika organismer som inte tidigare hade kontaktats genom molekylära tekniker. Med tanke på den enorma mångfalden i vårt djurrike, med många intressanta egenskaper eller dragvarianser som bara är representerade i specifika arter, har dessa framsteg gjort det till en spännande tid för evolutionär-utvecklingsbiologi ("evo-devo") relaterat arbete. Men genomredigeringstekniker som är tillgängliga för icke-modellorganismer är relativt begränsade när det gäller de utvecklingstidspunkter som de kan tillämpas på, vilket gör det utmanande att urskilja de tidsmässiga egenskaper som är relaterade till den roll som specifika gener spelar i något drag. Dessutom är transgena tekniker ofta begränsade till gener som inte är väsentliga för överlevnad (dvs. vars knockout inte resulterar i dödlighet). Därför, medan gen-redigering tekniker har börjat bli populär, det finns fortfarande ett behov av effektiva tekniker som är tillämpliga på en mängd olika organismer vid specifika utvecklingsmässiga tidpunkter och underlätta partiella knockdowns (snarare än fullständig förlust-of-funktion). Här uppmärksammar vi RNA-interferens (RNAi), en något daterad men ändå kraftfull gennedslagsteknik5 som är särskilt värdefull som en synergistisk inställning till genredigering. Specifikt utvecklade vi förfaranden som möjliggör tillämpning av RNAi på vattenlevande dykarbaggar som ett exempel som illustrerar genomförandet av denna teknik, från förvärv av de nödvändiga molekylära sekvenserna till en framgångsrik injektion av dubbelsträngat RNA (dsRNA) i ägg och larver.
RNAi-baserade gen knockdown utnyttjar en medfödd försvarsmekanism av organismer, där dsRNA molekyler underlätta tysta invaderande nukleinsyra sekvenser, såsom virus och transposoner6. I korthet tas dsRNA upp i cellen, där det skärs i 20–25 nukleotidstycken av Dicer-enzymet. Dessa bitar aktiverar sedan bildandet av det RNA-inducerade ljuddämpningskomplexet (RISC), vilket hämmar det riktade mRNA genom att binda till det på specifika platser med hjälp av guidesträngen. Denna process leder slutligen till mRNA nedbrytning och därmed stör översättningen av mRNA i respektive protein6. Den RNAi-baserade genen knockdown teknik som presenteras här förlitar sig därför på injektion av dsRNA. För djurmodeller utvecklades ursprungligen denna teknik i C. elegans7 och D. melanogaster8 men har sedan dess framträtt som ett kraftfullt funktionellt genetiskt verktyg i icke-modellorganismer9,10. På grund av sin mycket effektiva natur i vissa insekter, RNAi kan även tillämpas i skadedjursbekämpning11.
Som forskningsverktyg har RNAi använts för att undersöka hur viktiga molekylär-utvecklingsmässiga vägar fungerar i icke-traditionella insektsmodeller. Till exempel har RNAi i mjölbaggen Tribolium castaneum varit avgörande för att bestämma hur djupt bevarade gener bidrar till specifika egenskaper i att skalbagge, som exemplifieras för utveckling av specifikt formade vingar12,13,14 och ögon15,16. De tekniker som ligger till grund för manipulationerna i T. castaneum har beskrivitsväl 17 och förlitar sig på förmågan att immobilisera relativt torra ägg och larver på en klibbig yta. Sådan immobilisering är dock inte möjligt för de våta utvecklingsmässiga former av vattenlevande organismer som Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratus. Som är fallet för många icke-traditionella modell organismer, saknar det en kommenterad arvsmassa. För att manipulera genuttryck i någon organism utan ett genom, är ett rimligt och kostnadseffektivt första steg att generera transkriptomer och identifiera de förmodade nukleotidsekvenserna av de uttryckta gener av intresse baserat på sekvenslikhet med relaterade men mer etablerade modellorganismer, i detta fall främst Tribolium (Coleoptera) och Drosophila gener.
Här, för att visa hur RNAi kan användas på en vattenlevande organism, diskuterar vi först protokoll och programvara för RNA extraktion och transkriptom generation och assemblage, som möjliggör identifiering av specifika riktade gensekvenser. Vi sammanfattar sedan nödvändiga steg för syntetisera genspecifika dsRNA. Därefter illustrerar vi hur ägg kan injiceras i en vattenmiljö och visa inkubation protokoll för odling utveckla embryon. Dessutom visar vi hur agarosgel kan användas för att helt immobilisera larver under injektionsprocessen, en teknik som i allmänhet är användbar under olika förfaranden och som skulle kunna appliceras på en mängd olika leddjur. För att visa hur RNAi kan appliceras på olika utvecklingsstadier, inkluderar vi ett exempel där vi tystade ögonpigmen vit i embryon. Dessutom beskriver vi ett exempel där garvning genen laccase2(lac2) tystades under både den andra larval instar (att påverka larver av den tredje larval instar) och den tredje larval instar (att påverka vuxna). Slutligen visar vi att injektionen av en lägre koncentration av dsRNA leder till partiell knockdown, vilket visar att denna teknik också kan tillämpas på gener där förlust-of-funktion är känt för att vara dödliga.
Protocol
1. RNA-isolering och de novo transkriptom montering
- Utför total RNA-isolering från sent stadium tredje instar dykning skalbagge larv ögonrör och vuxna skalbaggar med hjälp av en RNA-isolering kit (se Tabell of Materials) som är utformad för lipid-rik vävnad. Isolera totalt RNA från T. marmoratus och sekvens det efter tidigare beskrivna metoder18.
- De novo transkriptom montering
OBS: För att montera transkriptom de novo kan olika bioinformatikplattformar användas (se Table of Materials). Dessa plattformar är kommersiellt tillgängliga och finns i vissa fall som Unix-baserade kommandoradsskript. Eftersom monteringen är de novo, rekommenderas att sätta ihop transkriptomerna självständigt på två plattformar och jämföra resultaten för att utesluta falska positiva eller falska negativ.- För att börja montera transkriptomerna, ladda upp de råa läsningarna på respektive bioinformatikplattform.
OBS: Dessa filer är oftast komprimerade och i formatet FASTQSANGER. Gz. Det finns ingen anledning att dekomprimera filerna som detta format accepteras i nästa steg. - Med hjälp av den trimmomatic kommandoraden, trimma den råa läsningar för att ta bort adapter sekvenser eller korta läsningar som faller under standardtröskeln. Dekomprimera den trimmade råa läser; filerna kommer nu att vara i FASTQ-formatet. Concatenate den FASTQ rå läser för varje prov för att erhålla filer som är redo för de novo montering.
- Montera de hopdragna råläsningarna de novo med hjälp av något kommandoradsskript som kan montera transkriptomer de novo. Spara den monterade transkriptom, som nu kommer att ha en lista över contigs med sina respektive sekvenser, som en FASTA-fil. För att öka täckningen av församlingen, kombinera och montera flera transkriptomer för samma art.
OBS: Denna process ökar chanserna att generera mer exakta contigs och är särskilt viktigt om låga kopia nummer gener är av intresse. - När de väl har monterats, bedöm transkriptomet för fullständighet genom att beräkna täckningspoäng (programvara för utvärdering av täckning är fritt tillgänglig, se Tabell över material).
OBS: En transkriptom med en täckning poäng >75% anses vara bra. Relevansen av denna poäng beror dock på orsaken till transkriptomgenerering. Till exempel, om transkriptomet används för att identifiera låg kopia nummer gener, då en poäng >85% är bättre, eftersom det innebär större täckning. - Kommentera de novo-ihopsatt transkriptom med hjälp av ett grundläggande lokalt justeringssökverktyg (BLAST; se Table of Materials).
OBS: För detta experiment, var transkriptomet kommenterades främst mot en databas med kända Drosophila proteiner och en databas med kända skalbagge proteiner. Listan över annoteringar kan laddas ner som en kalkylbladsfil och contig/contigs som anger sekvenslikhet med andra organismers proteiner kan laddas ner som en FASTA-fil. - Identifiera contig nummer / nummer av proteinet av intresse och extrahera nukleotidsekvenser. Använd BLAST för att identifiera om proteinspecifika bevarade regioner (till exempel homeobox-domäner) finns i den kommenterade nukleotidsekvensen av intresse. Kontrollera andra contigs med samma annotering för nukleotidsekvens överlappningar för att generera sekvensen av en gen-specifika avskrift.
OBS: Identifiera contigs med sekvens överlappning är vanligtvis inte möjligt för alla gener, särskilt för låg kopia nummer gener. - Om genens fullängdssekvens behövs, börja med den kontig som har den högsta sekvenslikheten som initieringspunkt för att identifiera nukleotidsekvensen för hela den mogna avskriften med tekniker som 3′ och 5′ snabb förstärkning av cDNA-ändar (RACE19).
- Anteckna den församling som erhållits från den andra plattformen som följer steg 1.2.4–1.2.7.
OBS: Helst bör resultaten vara liknande för de proteiner av intresse; täckningen kan dock skilja sig åt mellan plattformarna i viss utsträckning. - Använd den monterade transkriptomen för att syntetisera artspecifikt dsRNA enligt avsnitt 2.
- För att börja montera transkriptomerna, ladda upp de råa läsningarna på respektive bioinformatikplattform.
2. Kloning och genspecifik dsRNA-syntes
OBS: Genspecifik kloning och dsRNA-syntes har beskrivits i detalj för T. castaneum20,21,22. Följande steg är en kort översikt.
- Kloning, bakterieomvandling och plasmidsekvensering
- Isolera totalt RNA från organismen (enligt beskrivningen i steg 1.1) och skapa kompletterande DNA (cDNA) med hjälp av en omvänd transkriptionssats (se Tabell över material). Identifiera en eller två 100–1000 bp nukleotidsekvenser från contigs som är specifika för de gener av intresse.
- Design primer par som spänner över hela identifierade sträcka av nukleotider och förstärka sekvensen genom en polymeras kedjereaktion (PCR). Lägg till ett extra 30 min steg i slutet för att skapa 3′ adeninöverhäng i den förstärkta DNA-produkten. Rena denna produkt med hjälp av en PCR-reningssats (se Table of Materials).
- Klona den renade produkten till en pCR4-TOPO plasmidvektor (se Table of Materials) som följer leverantörens protokoll som medföljer kloningssatsen. Använda värme-chock behandling omvandla de klonade plasmiderna till behöriga bakterieceller (stam: E.coli DH10B) efter säljarens protokoll för behöriga celler (se Tabell över material), och skärm för framgångsrikt omvandlas celler.
OBS: Plattor med kolonier kan lindas in i paraffinfilm för att behålla fukten och förvaras vid 4 °C i upp till en månad. - Plocka kolonier av transformerade celler med en 10 μL pipettspets och kultur i lysogeny buljong (LB) som innehåller ampicillin (50 μg/mL) i en shaker-inkubator vid 37 °C och 200 rpm för 24 h.
OBS: För långtidslagring kan odlade celler spädas 1:1 med 100% glycerol och frysas vid -80 °C som glycerollager. - Isolera plasmider som innehåller den gen av intresse från denna kultur med hjälp av en miniprep isolering kit (se Tabell över material). Förvara de isolerade plasmiderna (minipreps) vid -20 °C efter att ha bedömt avkastningenspektrofotometriskt. Specifikt, mät provabsorbansen vid 260 nm, 280 nm och 230 nm. Beräkna nyckeltalen A260/A280 för kvantifiering av DNA, och A260/A230 för kvantifiering av DNA-renhet.
OBS: En 260/280 förhållandet 1,8 är allmänt accepterad som tillräckligt rent DNA, nyckeltal lägre än 1,5 indikera förekomsten av restextraktionsreagenser såsom fenol. 260/230-talet bör vara större än eller lika med 260/280-talet. Lägre förhållanden indikerar restreagenskontaminering. Avkastningen varierar typiskt från 100 till 500 ng/μL. - Sekvens den isolerade minipreps att bekräfta att den genspecifika fragment har framgångsrikt integrerats, att flankeras mellan 5′ T7 och 3′ T3 promotorn regioner i plasmiden; detta kan göras med hjälp av universal T7 och T3 sekvensering primers22. Använd miniprepsen med den genspecifika sekvensen av intresse för dsRNA-preparatet.
- Isolera totalt RNA från organismen (enligt beskrivningen i steg 1.1) och skapa kompletterande DNA (cDNA) med hjälp av en omvänd transkriptionssats (se Tabell över material). Identifiera en eller två 100–1000 bp nukleotidsekvenser från contigs som är specifika för de gener av intresse.
- PCR-förstärkning och in vitro dsRNA-syntes
- PCR-förstärkning och produktrening
- Utforma plasmidspecifika eller genspecifika primers som har T7 promotorn sekvens på sina 5' sidor (se referens22 för detaljer) för att förstärka en linjär fragment av den infogade genen. Optimera utbytet genom att ställa in minst 10 reaktioner på 20 μL vardera.
OBS: Den resulterande produkten flankeras av två 20 bp T7-bindningsställen för polymeras. - Rena PCR-produkten med hjälp av en PCR-produktreningssats (se Table of Materials), som följer leverantörens kolumnbaserade elueringsprotokoll. För att öka avkastningen, upprepa det slutliga elueringssteget upp till 3 gånger med samma eluent. Bedöm avkastningen spektrofotometriskt.
OBS: Avkastningen varierar vanligtvis från 100 till 700 ng/μL. Denna renad produkt kan förvaras vid -20 °C tills vidare används.
- Utforma plasmidspecifika eller genspecifika primers som har T7 promotorn sekvens på sina 5' sidor (se referens22 för detaljer) för att förstärka en linjär fragment av den infogade genen. Optimera utbytet genom att ställa in minst 10 reaktioner på 20 μL vardera.
- In vitro dsRNA syntes och rening
- Använd den genspecifika PCR-renade produkten för att syntetisera dsRNA in vitro enligt protokollet för en dsRNA-syntessats av val. Om det behövs, förläng inkubationstiden för ökad dsRNA-produktion.
- Bedöma reaktionens progression utifrån reaktionsblandningens opacitet (ju större mängd av dsRNA-produkten är, desto högre är grumligheten). Vid slutet av inkubationen, stoppa reaktionen med hjälp av en DNase behandling. För att göra det tillsätt 1 μL från ett bestånd av 2 U/ μL, till reaktionsblandningen. Utöka denna behandling till 1–2 h för att säkerställa den optimala nedbrytningen av mall-DNA.
- Rena dsRNA med en reningssats eller via följande steg.
- Späd den resulterande produkten med 115 μL nukleasfritt vatten och tillsätt 15 μL av 3 M natriumacetat. Tillsätt 2 volymer iskall 100% etanol till denna reaktionsblandning och fäll ut dsRNA över natten vid -20 °C.
OBS: I detta led kan prover förvaras säkert utan att det slutliga utbytet påverkas. - Centrifugera fällningen vid 0 °C i 20 min vid 9000 x g och kassera supernatanten. Tvätta produkten en gång med iskall 70% etanol och centrifug i 15 min vid 13000 x g.
- Avlägsna supernatanten och lufttorka pelleten i 5–15 min. Resuspend pelleten i upp till 40 μL nukleasfritt vatten (denna volym kan justeras utifrån den isolerade pelletsstorleken) och bedöm avkastnings- och renhetspektrofotometriskt, enligt beskrivningen i 2.1.4.
- Förvara det renade dsRNA vid -20 °C tills vidare användning. Använd det renade dsRNA för injektion i önskat utvecklingsstadium.
- Späd den resulterande produkten med 115 μL nukleasfritt vatten och tillsätt 15 μL av 3 M natriumacetat. Tillsätt 2 volymer iskall 100% etanol till denna reaktionsblandning och fäll ut dsRNA över natten vid -20 °C.
- PCR-förstärkning och produktrening
3. Insamling och beredning av tidiga steg T. marmoratusembryon för dsRNA-injektioner
- Bered en agarosplatta för inkubation av T. marmoratus embryon.
- Först, lös 20 mg lågsmält agarospulver i 100 mL autoklaverat destillerat vatten (2% agaros) och koka sedan denna blandning i en mikrovågsugn tills en klar lösning erhålls. Var försiktig med den varma lösningen, eftersom luftbubblor kan göra att den svämmar över.
- Dispensera denna lösning i en liten Petriskål. För att göra spår (som kommer att hålla embryona) på ytan av agarosplattan, placera tre 1–2 mm breda plaströr (såsom spetsarna på plastöverföringspipetsar) på ytan av den flytande agarose innan den stelnar.
- När agarose stelnar, använd ett par trubbiga tlyck för att ta bort dessa rör. Tillsätt 500 μL autoklaverat destillerat vatten med hjälp av en P1000-mikropipette för att täcka dessa fördjupningar i agaros.
- Med hjälp av en fin naturlig hårpensel samlar du upp T. marmoratus embryon som är 5–8 h gamla från skalbaggens häckningsplatser i en glashålasrätt fylld med autoklaverat destillerat vatten. Övervaka häckningsplatserna ofta för att försäkra att de erhållna äggen är i rätt ålder.
- Dechorionate embryona under en stereomicroscope med hjälp av fina dissekeringstlyktor. För att göra det, visualisera chorion under mikroskopet (vid önskad förstoring) genom att placera ljuskällan i en lämplig vinkel, sedan ta tag i chorion från två sidor med vassa tång, rippa den öppen, och försiktigt skjuter embryot ut. Eftersom det finns två lager, se till att båda tas bort.
- Med hjälp av en fin naturlig hårpensel, överför försiktigt embryona från glashålaskålen till agarosplattan och ordna dem i spåren under ett stereomikroskop. Var mycket försiktig under denna process, som dechorionated embryon är mycket bräcklig. Använd de beredda embryona för dsRNA-injektioner.
OBS: Den något tjockare änden är den sida av embryot som huvudet kommer att utvecklas i.
4. dsRNA mikroinjektioner i tidigt skede T. marmoratus embryon
- För att injicera embryon i tidigt skede med genspecifikt dsRNA, preparera mikroinjektionsnålar med hjälp av en nåldragare för mikroinjection (se Tabell of Materials). Medan visualisera nålspetsen under ett stereomikroskop, använd ett par fina tlykningar för att bryta nålspetsen, vilket skapar en skarp kant. Helst bryta nålspetsen diagonalt så att en skarpare kant kvar på ena sidan, vilket gör det möjligt att komma in i embryot samtidigt som den orsakar minimal skada.
- Tina den renade lager dsRNA-lösningen på is, tillsätt 1 μL av 10x injektion buffert och toppa den med dubbel destillerat vatten, att göra 10 μL injektionslösning. För injektioner är en dsRNA-koncentration på 1 μg/μL vanligtvis lämplig men kan justeras enligt de resulterande djurens fenotypiska svårighetsgrad).
OBS: Förbered 1 mL 10x injektionsbuffert22 genom att tillsätta 10 μL av 0,1 M natriumfosfatbuffert (gjord genom att blanda 8,5 mL på 1 M Na2HPO4 och 1,5 mL av 1 M NaH2PO4 justerat till ett pH 7,6 vid 25 °C med 100 μL på 0,5 M KCl), 100 μL livsmedelsfärgämne och 790 μL dubbeldestillerat vatten.- Med hjälp av en P10-pipett, fyll tillbaka mikroinjektionsnålen med den fungerande dsRNA-lösningen. När lösningen har fyllt nålspetsen fäster du den på en mikronålshållare som är ansluten till ett mikroinjektionssystem som utnyttjar tryckutmatningsteknik (se Tabell över material).
- Sätt på mikroinjektionssystemet och den trycksatta lufttillförseln. Med hjälp av mikroventilen på mikroinjektionssystemet justerar du insprutningstrycket till 15 psi. Justera injektionens längd med hjälp av tidsjusteringsratten (ställ in den på "Sekunder").
- Eftersom injektionen varaktighet beror på den nödvändiga injektionsvolymen, om det behövs, justera denna parameter på mikroinjektionssystemet före varje injektion. Använd en injektionsvolym på 1–2 nL för tidiga steg T. marmoratus embryon.
OBS: Högre injektionsvolymer tenderar att störa överlevnadsfrekvensen för embryot.
- Eftersom injektionen varaktighet beror på den nödvändiga injektionsvolymen, om det behövs, justera denna parameter på mikroinjektionssystemet före varje injektion. Använd en injektionsvolym på 1–2 nL för tidiga steg T. marmoratus embryon.
- För att mäta volymen injektionsvätska som dispenseras av mikroinjektionssystemet, kalibrera injektionsnålen genom att bedöma volymen av vätskebubblan som bildas vid nålspetsen vid injicering i luft. För T. marmoratus embryon, använd en optimal bubbelstorlek på 100–200 μm. Injektionsnålen är av god kvalitet om detta kan uppnås vid 15 psi med en injektionsduration på ~3 s.
- Rikta in nålen och agarosplattan som innehåller embryona under ett stereomikroskop, så att nålen närmar sig embryona i en vinkel mellan 45° och 60°.
- Använd mikromanipulatorn, flytta mikroaxeln långsamt medan du övervakar förloppet genom stereomikroskopet. När nålspetsen väl vidrör ytan av ett embryo, för försiktigt nålen framåt tills den genomborrar embryots yta. Perforera inte embryot djupt med nålspetsen eftersom detta kan påverka embryots överlevnad. För att minska variabiliteten, leverera injektionen i mitten av embryot.
- När nålen är inne i embryot, tryck försiktigt på injektionsknappen av mikroinjektorn för att leverera dosen av dsRNA till embryot. Efter att ha injicerat 1–2 nL dsRNA, dra långsamt tillbaka nålen från embryot, så att den inte får embryot att brista.
- Injicera de andra embryona på ett liknande sätt. Om mikroinjektionsnålen blir blockerad under proceduren, avblockera den genom att öka injektionstrycket och varaktigheten. Visuellt identifiera framgångsrikt injicerade embryon genom närvaron av en färgad plats på platsen för injektionen (eftersom injektionsbufferten innehåller livsmedelsfärg).
- Placera försiktigt skålen med injicerade embryon i en fuktighetskammare.
- För att konstruera en sådan kammare, ta någon plastlåda med ett lock, sterilisera den med 70% etanol, låt den torka, och placera vävnad indränkt i autoklaverat vatten i botten för att ge en fuktig miljö. Placera denna fuktighetskammare i en inkubator med lämplig temperatur (i detta fall 25 °C) och ljuscykel på 14 h ljus och 10 h mörk.
- Låt injicerade embryon utvecklas till första instar larver, vilket kräver 4–5 dagar. Övervaka framstegen i embryots utveckling dagligen med hjälp av ett stereomikroskop för att identifiera morfologiskt synliga knockdown-fenotyper som avbildas i figur 2.
- Dokumentera detta framsteg genom att ta digitala bilder med hjälp av en högupplöst kamera. Avlägsna döda embryon och fyll på vattnet på agarosplattan dagligen för att undvika uttorkning och eventuell spridning av mikrobiell kontaminering till andra överlevande embryon under inkubationstiden.
- Utför lämpliga kontroller för dsRNA-injektioner, inklusive buffertinjektioner, injektioner av dsRNA som syntetiseras mot avkänningssträngen av genen av intresse, och injektioner av dsRNA syntetiserade mot sekvenser som inte finns inom målorganismen. Bekräfta RNAi knockdown med ytterligare molekylära metoder22.
5. Beredning av T. marmoratuslarver för dsRNA-injektioner
OBS: Till skillnad från embryon i tidigt stadium är T. marmoratuslarver relativt robusta och kan injiceras med större volymer. Till exempel kan andra instars injiceras med upp till 2 μL dsRNA arbetslösning och tredje instars med minst 3 μL utan märkbara negativa effekter på överlevnadsfrekvensen. För att injicera dsRNA är det bra att immobilisera larver genom att bädda in dem i agaros.
- Innan du samlar ihop larverna, smält 2% agaros och hålla den i ett vattenbad vid 60–70 °C för att behålla den i flytande form. Förbered en immobilisering skålen genom att hälla smält 2% uppstod i en liten Petri skålen och sedan kyla tills stelnat. Använd trubbiga tövövingar för att göra ett grunt spår i agarosplattan (ungefär lika stor som leddjuret som ska bäddas in) för varje djur som kommer att injiceras.
- Samla unga larver på lämpligt utvecklingsstadium (ett stadium före det stadium som önskas för analys). För att göra detta, dränera noggrant vattnet från odlingskopparna som innehåller larverna och följ stegen som nämns nedan.
- Anaesthetize på is (försiktigt plocka larven ut från sin vattenkopp och placera den försiktigt på is) tills larven visar inga anmärkningsvärda rörelser. Använd trubbiga, mjuka tokpar för att försiktigt lyfta larven från isen och placera den på immobiliseringsstadiet med halsen och kroppen i spåret men dess svans som ligger ovanför agarosytan så att den inte kommer att täckas, vilket gör att man kan fortsätta andas genom sina svansspiraklar.
- Täck larven med ett tjockt lager av agaros som fortfarande är flytande men inte farligt varm. Om det av misstag täcktes, använd tlyckorna för att frigöra svansen och de två segmenten under den från agaros. När agaros stelnar, använd larven för dsRNA-injektioner.
6. dsRNA mikroinjektioner i T. marmoratus larver
- Förbered och återfylla en mikroinjektionsnål med önskad mängd genspecifik dsRNA-arbetslösning (enligt beskrivningen i steg 4.1–4.2). Sätt fast nålen på en nålhållare som är ansluten till en manuellt kontrollerad mikroinjektionsspruta. Innan nålen sätts fast ska du dra sprutkolven hela vägen ut för att undvika att injektionstrycket har ont om mitt under ingreppet.
- Placera den immobiliserade larven så att injektionsstället, som ligger dorsally mellan den tredje och fjärde karossen platta segment, är i linje med banan för microinjection nålen i en relativt platt vinkel (nästan parallellt med scenen).
OBS: Mete nålen och larven i detta läge är viktigt, eftersom det ger sökvägen till minsta motståndet för nålspetsen för att perforera larverna med minsta möjliga skada. - När nålen och larven har placerats, för försiktigt nålspetsen in i larven med hjälp av mikromanipulatorn samtidigt som man övervakar förloppet genom ett stereomikroskop.
- Efter spetsen perforerar vävnaden, långsamt och försiktigt tillämpa tryck på sprutan. Justera insprutningstrycket genom att observera rörelsen av den färgade injektionsvätskan i nålen under mikroskopet.
- Dra försiktigt tillbaka nålen efter injektionen. Använd mjuka teds för att skala bort och därmed befria larven från agarosen. Överför tillbaka larven i en behållare med vatten (vid rumstemperatur) och låt den utvecklas vidare i en inkubator eller ett odlingsrum vid 25\u201228 °C och en ljuscykel på 14 h ljus och 10 h mörk.
- Använd lämpliga kontrollinjektioner och knockdown-kvantifieringar, som beskrivs i steg 4.10.
Representative Results
Med hjälp av det protokoll som beskrivs ovan, vi knackade ner tre olika gener,nämligen, vit , laccase2 (lac2), och Lens3 (Tabell 1), på en mängd olika utvecklingsstadier av Sunburst Diving Beetle T. marmoratus. Vi utförde RNAi i T. marmoratus genom att injicera dsRNA i ett mycket tidigt skede under embryogenesis (Figur 1A). Eftersom vissa av embryona inte överlever processen och blir nekrotiska (Figur 1B), måste de avlägsnas för att hålla de återstående embryona friska. Exemplifieras här är injektionerna av dsRNA mot den vita genen. Denna gen är välkänd i Drosophila som en av tre ATP-bindande kassett (ABC) transportörer som deltar i upptag och lagring av prekursorer av ögat pigment23. Följaktligen, dess förlust-of-funktion resulterar i en unpigmented, white-eye fenotyp. Våra resultat visar att injektionerna av dsRNA white som riktar sig mot den ortoportologvita genen i T. marmoratus embryon leder till förlust av ögonpigmentering i nyuppkomliga larver. I detta fall kännetecknas vilda typ larver av kraftigt pigmenterade ögon, och RNAi knockdown av vitt leder till olika nivåer av minskning och till och med fullständig eliminering av ögonpigment. Sammantaget observerade vi åtminstone en viss minskning av ögonfärgning i 34% av överlevande embryon (n = 35). Figur 2A jämför en kontroll individ och en individ med något ljusare ögonfärg. Bild 2B illustrerar en kraftigare knockdown hos en individ, där de mer ventrala ögonen (Ögon 2–5) i klustret är helt opigmenterade, medan ryggögonen fortfarande uppvisar viss pigmentering. Dessa skillnader belyser hur effektiviteten i knockdown kan variera regionalt, vilket möjligen är relaterat till skillnader i effekten av dsRNA-penetration i tät vävnad. En annan individ visar i huvudsak fullständig pigmentförlust i alla ögon (Figur 2C).
För att undersöka hur väl RNAi fungerar på larvstadiet av T. marmoratus, injicerade vi dsRNA inriktning garvsyra genen lac2 i andra instar larver några dagar innan de berodde på molt i tredje instars (Figur 3) och utvärderade effekten på cuticular coloration av tredje i larver. Lac2 är en typ av fenoloxidas som oxidativt konjugater proteiner för att göra dem olösliga, hårdare, och mörkare. Knockdown i mjölbaggen T. castaneum har visat sig leda till ljusare färgade individer i låga doser men anses vara dödliga i höga doser24. Figur 4 illustrerar att denna behandling också leder till ljusare färgade Sunburst Diving Beetle larver. Specifikt hade 75% av de överlevande injicerade larverna (n = 12) i detta experiment minskad pigmentering (jämfört med 0% i kontrollgruppen). Figurera 4A visar en individ med förhållandevis mild depigmentation, eftersom figurera 4C illustrerar huvudet av en T. marmoratus larva som den mörka colorationen av nagelbandet är nästan frånvarande. Depigmentering var särskilt tydligt för det centrala mörka mönstring som är typiskt för dessa larver, medan detta mönster förblev tydligt synligt i en kontrollinjicerad individ (Figur 4B). Dessutom observerades en ljusning av svansen luftstrupen, som avbildas i figur 4D. I det fall då lac2 dsRNA injicerades i tredje instar larver, erhölls lättare vuxna individer (Figur 5). Observera att vingarna av knockdown beetle är något deformerade, sannolikt på grund av dess ovanliga mjukhet.
Förutom att förändra morfologiska egenskaper, är det möjligt att använda RNAi för att rikta gener som påverkar beteende. För att visa detta utförde vi RNAi mot en nyckellinsproteinkodande gen, Lens318, och injicerade den i andra instar larver för att påverka de optiska egenskaperna hos tredje instar larval ögon. Eventuella effekter på linsen observeras här är sannolikt eftersom ögonen på T. marmoratus larver genomgår stora ögontillväxt vid denna övergång, som också innebär stora optiska förändringar avlinsen 25. RNAi knockdown i detta experiment var mycket effektiv. Verifiering genom qPCR visade en 100% framgång; av 13 testade individer, 12 slogs ner till mindre än 10% av uttrycksnivån av kontroll individer, med den återstående individen har ett uttryck nivå 17% av kontrollnivå (opublicerad observation). På den fenotypiska nivån var endast vissa individer svårt handikappade eller oförmögna att byten fånga, vilket illustreras i figur 6 för en individ som upprepade gånger närmade sig sitt byte från ett mycket nära avstånd men konsekvent överskred den.
Tabell 1: Primersekvenser och amplikoner för vita, lac2, och Lens3 proteiner. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.
Bild 1: Illustration av embryoinjektioner. (A) Dechorionated embryon uppradade på en agaros platta och injiceras nära deras centrum med hjälp av en microinjection nål fylld med dsRNA och mat-färgämne-innehållande injektion buffert. Skalstången representerar 500 μm. (B) En individ med en mer allvarlig knockdown. Injicerade embryon hålls i en fuktighetskammare och övervakas dagligen för att göra poäng på fenotyper och avlägsna döda individer (som blir bruna). Skalstrecket representerar 5 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på fullt utvecklade embryon som injicerades med dsRNA mot vitt. (A) Jämförelse av en individ med en minskning av ögonpigmentering (vänster) och en kontrollinjicerad individ (höger). E1–E6 refererar till Ögon 1–6. (B) En individ med en mer allvarlig knockdown fenotyp, som illustrerar att, ibland, några av ögonen inom klustret är mer allvarligt drabbade av knockdown än andra. (C) Individ med en nästan färdig förlust av synar pigmentering. Skalstången representerar 200 μm; Panelerna B och C är representerade i samma skala. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Illustration av larvinjektioner. (A) Flera larver immobiliserade genom inbäddning i 2% agaros med sin svans spiracles lämnas fri från någon agaros. (B) Mikroelektod som innehåller injektionslösningen placerad så att dess spets kan tränga igenom finmembranet mellan två segment. (C) Blått injektionsfärgämne synligt vid injektionsstället efter injektionen. Skala barer representerar 1 cm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: RNAi för laccase2 appliceras på andra instar larver vilket resulterar i minskad nagelband färgning i tredje instar larver. (A) Relativt mild färgnedsättning i en lac2 RNAi individ (botten) när man jämför med en kontrollinjicerad individ (överst). Skalstången representerar 5 mm. (B) Huvud för en kontroll individ som visar det karakteristiska mörka färgade mönstret i mitten av huvudet. (C) Relativt svår knockdown av lac2 leder till en nästan fullständig förlust av centrala huvudet färgning. (D) Förlust av färgning i de stora svans nagelband av en lac2 RNAi individ (botten) jämfört med en kontroll-injiceras enskilda (överst). Skala barer i B\u2012D representerar 1 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: RNAi för laccase2 applicerad på en tredje instar larva vilket resulterar i minskad nagelbandsfärgning hos en vuxen. Knockdown individen (vänster) kännetecknas också av mycket mjuk elytra vid jämförelse med kontrollen (höger). Skalstrecket representerar 5 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Knockdown av ett större linsprotein som leder till brister i byten fånga. (A–C). Tre exempel vari en Sunburst Diving Beetle larva, där optiska underskott inducerades genom RNAi, kunde inte fånga byte (mygglarver). Representativa stillbilder valdes ut från en videoinspelning av karakteristiska byten fångar. (D) Kontroll larv fånga byte. Alla skalstreck representerar 2 cm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Vårt mål är att denna sammanställning av metoder kommer att göra RNAi allmänt tillgänglig, särskilt som detta verktyg förblir en kraftfull synergistisk teknik till CRISPR/Cas9-baserad genredigering, med fördelen att den kan tillämpas på de önskade utvecklingsstadierna av studerade organismer. För att exemplifiera denna styrka injicerade vi dsRNA i embryon och i olika larvstadium. Injektioner i ägg påverkade utvecklingen av embryon (Figur 2), injektioner i det andra larvstadiet hade uppenbara effekter på det tredje larvstadiet (Figur 4 och Figur 6), och injektioner i det tredje larvstadiet visade effekter hos de vuxna (Figur 5). Medan den exakta tidpunkten måste fastställas experimentellt, i allmänhet, injektioner träda i kraft inom några dagar. Framgången för denna process kan påverkas av längden på dsRNA-sekvensen. Här presenterade vi exempel med lite över 200 bp till mer än 800 bp. Som en allmän regel, sekvenser mellan 100 och 600 bp är att föredra att begränsa off-target effekter, men sekvenser upp till 1000 bp ge goda resultat22. En fråga när det gäller RNAi är varaktigheten av knockdown som kan uppnås genom denna teknik. Eftersom fenotyperna var terminal i varje steg, kan vi inte kommentera denna fråga baserat på våra presenterade resultat. Det har dock tidigare noterats att RNAi effekter är i allmänhet relativt långlivade, och att högre koncentrationer leder till längre varaktiga nedslagningar20.
En begränsning av denna teknik är att det fungerar bättre för vissa organismer än för andra, och det verkar inte finnas något direkt sätt att förutsäga hur bra det kommer att fungera a priori. Ändå har det visat sig fungera bra för ett stort utbud av olika organismer. Inom leddjur, detta inkluderar arachnids26, kräftdjur27, och en mängd olika insekter, med särskilt hög framgång i skalbaggar28. Ytterligare en komplikation är att skillnader i fenotyp svårighetsgrad ofta förekommer mellan individer trots tillämpningen av samma mängd dsRNA. Som illustreras i figur 2B, variation kan även förekomma inom en individ. I våra RNAi studier som riktar sig mot olika gener som är involverade i T. marmoratus larval eye utveckling, har vi ofta funnit att vissa ögon påverkas mer allvarligt än andra. Detta fenomen kan vara relaterade till den relativt täta vävnaden i ögat klustret, med dsRNA bättre kunna nå några av enheterna.
För ett framgångsrikt utförande av RNAi-experiment är det kritiskt att flera parametrar är optimerade för målgenen. Till exempel kan koncentrationen av dsRNA och längden på den riktade genen starkt påverka resultatet20. En annan kritisk parameter är hur injektionerna utförs, eftersom denna process i hög grad kan påverka överlevnadsgraden. För embryon uppnådde vi bästa resultat genom att rikta in sig på embryots centrum. En vällagd platta möjliggör injektion av 100 eller fler embryon i en enda session. För larver är det avgörande att sätta in injektionsnålen mellan segmenten. Dessa injektioner kräver mer dsRNA, och baserat på larver tillgänglighet, vår injektion uppsättningar här vanligtvis bara bestod av ett fåtal djur i taget. För alla injektioner är det avgörande att förhindra att luft kommer in i organismen.
I vissa fall kan återkopplingsslingorna i ett genreglerande nätverk och genetisk redundans påverka RNAi-fenotypernas penetrance, trots konsekventa knockdowns. Detta verkar vara fallet för våra beteendemässiga observationer av larver med mycket framgångsrika knockdowns av en framträdande lins protein, Lens318. Även om vi kontrollerade den höga effektiviteten av dessa knockdowns genom qPCR, observerades avsevärd variation i de associerade fenotyper. Detta resultat belyser behovet av korrekt kvantifiera RNAi knockdowns (för detaljer om alternativ se22). Om det inte finns någon tydlig a priori förväntan när det gäller de resulterande fenotyper, ett bra sätt att kontrollera för off-target effekterna av RNAi är att rikta samma gen med två icke-överlappande sekvenser av dsRNA och att utvärdera resultaten för vanliga fenotyper.
I motsats till genredigeringstekniker är RNAi också ett kraftfullt verktyg för att studera dödliga gener, och det finns två sätt att göra det på. Till exempel, om man är intresserad av det funktionella bidraget från en gen där förlust-of-funktion tidigt i utvecklingen är känd för att vara dödlig, en funktionell undersökning av en sådan gen kan uppnås genom att helt enkelt låta djuret utvecklas normalt och sedan slå ner genen via RNAi senare i utvecklingen (dvs. i den vuxna). Alternativt kan en gen där fullständig förlust-of-funktion är känd för att vara dödlig undersökas genom en partiell knockdown, vilket kan uppnås genom att injicera en rad dsRNA koncentrationer. Några av våra resultat visar knockdowns av lac2, som är kända för att vara dödliga om nagelbanden i insekter blir alltför mjuk24. Även lac2 RNAi skalbagge avbildas i figur 5 skulle vara osannolikt att överleva utanför laboratorieförhållanden. En annan dödlig gen skärs, som koder för en transkriptionsfaktor som är grundläggande för cell-öde specifikation i olika organsystem i leddjur och har kopplats till GLIA utveckling i Drosophila visuella systemet29. Baserat på vår erfarenhet med skära RNAi i T. marmoratus embryon, kan vi framkalla informativa öga fenotyper i embryon som har möjlighet att slutföra sina embryonala ögon utveckling (opublicerade observationer). Här, högre doser verkar leda till högre dödlighet priser, medan lägre doser resulterar i observerbara och informativa fenotyper.
Vårt protokoll inte bara listar de nödvändiga stegen för en forskare att fullfölja RNAi experiment på T. marmoratus, som illustreras, men är också allmänt tillämplig på andra organismer, särskilt vattenlevande organismer. Bland vattenlevande organismer finns det redan flera exempel inom kräftdjur som vattenlopporna Daphnia30 och räkor (för en nyligen genomgång, se hänvisning31). Det finns gott om möjligheter bland vattenlevande insekter, eftersom de har uppskattats omfatta cirka 6% av all insektsmångfald, med sannolikt mer än 200.000 arter32. Vidare har RNAi redan utförts på vattenstrids som tenderar att bebo ytan av vattenmiljöer33. Om ingen arvsmassa är närvarande, då en transkriptom kan monteras de novo. Så länge denna process avslöjar contigs av några hundra nukleotider, kan dsRNA mot specifika gener utformas. Vårt protokoll för immobiliserande insekter i agaros kommer sannolikt också att vara användbart för andra förfaranden, särskilt för mjuka, formbara och vattenlevande organismer. Sammantaget är RNAi fortfarande en kraftfull teknik för att manipulera genuttryck i en mångsidig grupp av organismer, även när inga andra molekylära och genetiska verktyg finns tillgängliga.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Josh Benoit för hans hjälp med bioinformatik Hailey Tobler för hennes hjälp med att höja Sunburst Diving Beetles och Tamara Pace för redaktionell hjälp. Denna forskning stöddes av National Science Foundation under bidrag IOS-1456757 och IOS-1856341 till EKB och IOS1557936 till YT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
- Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
- Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
- Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Mello, C. C., Conte, D.
- Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
- Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
- Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
- ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
- Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
- Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
- Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
- Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
- Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
- Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
- Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
- Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
- Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
- Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
- Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).
