Summary
Tarlada veya laboratuvarda analiz edilebilen döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) testi ile birleşen bir filtre kağıdı DNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak su kaynaklarında Fitophthora capsici zoosporları tespit etmek için bir yöntem geliştirdik.
Abstract
Fitophthora capsici birçok önemli solanaceous ve cucurbit bitkileri yılda sebze üretiminde önemli ekonomik kayıplara neden etkileyen yıkıcı bir oomycete patojendir. Fitophthora capsici toprak kaynaklı ve uzun ömürlü sağkalım yapıları (oosporlar ve konmydosporlar) nedeniyle sebze alanlarında kalıcı bir sorundur. Dağılmanın ana yöntemi, yüzeylerde veya su dolu toprak gözeneklerinde bulunan ince su filmleriyle yüzebilen ve su birikintileri ve göletlerde birikebilen tek hücreli, kamçılı sporlar olan zoosporların üretimidir. Bu nedenle, sulama havuzları patojen ve hastalık salgınları ilk noktaları nın kaynağı olabilir. Sulama suyunda P. capsici'nin tespiti geleneksel kültür temelli yöntemlerle zordur, çünkü pythium spp. gibi çevrede bulunan diğer mikroorganizmalar genellikle p. capsici'yi aşarak saptanamaz hale getirirler. Su kaynaklarında (sulama suyu, akıntı, vb.) P. capsici sporlarının varlığını belirlemek için, patojensporlarını (zoosporlar) yakalayan ve daha sonra P. capsici'nin özel amplifikasyonu için tasarlanmış yeni bir döngü aracılı isothermal amplifikasyon (LAMP) aracılığıyla patojenin DNA'sını yükseltmek için kullanılan bir el pompası tabanlı filtre kağıdı (8-10 μm) yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, geleneksel PCR'den 40 kat daha hassas olan 1.2 x 102 zoospor/mL gibi düşük bir konsantrasyondan DNA'yı yükseltebilir ve algılayabilir. Yakından ilişkili türler test edilirken çapraz amplifikasyon elde edilemedik. LAMP da bir kolorimetrik LAMP ana karışımı boya kullanılarak yapıldı, yerinde hızlı algılama için çıplak gözle okunabilir sonuçları gösteren. Bu protokol, kontamine sulama sistemleri aracılığıyla ikamet eden, biriken veya dağıtılan diğer patojenlere uyarlanabilir.
Introduction
Çiftliklerde ve kreşlerde su geri dönüşümü, su maliyetlerindeki artış ve su kullanımının ardındaki çevresel kaygılar nedeniyle giderek daha popüler hale gelmektedir. Bitki hastalıklarının yayılmasını ve oluşumunu azaltmak için yetiştiriciler için birçok sulama yöntemi geliştirilmiştir. Ne olursa olsun su kaynağı (sulama veya yağış), kaçak oluşturulur ve birçok sebze ve kreş yetiştiricileri toplamak ve runoff1geri dönüşüm için bir gölet var. Bu geri dönüşümlü,subitkileri2,3,4sulamak için kullanıldığında patojenlerin yayılması lehine olası patojen birikimi için bir rezervuar oluşturur. Oomycete bitki patojenler özellikle zoosporlar suda birikir ve birincil dağılım spor u kendine hareketli olacak gibi bu uygulamadan yarar ama yüzey suyu gerektirir5,6,7. Fitophthora capsici farklı şekillerde solanaceous ve cucurbit bitkileri önemli sayıda etkileyen8bir oomycete patojen8 . Genellikle, belirtiler fide, kök ve taç çürümesi sönümleme-off vardır; ancak salatalık, kabak, kavun, kabak, karpuz, patlıcan ve biber gibi ürünlerde, tüm hasat meyve çürüklüğü nedeniyle kaybedilebilir9. Bu bitki patojentespit bilinen yöntemler olmasına rağmen, çoğu önemli bir etkiye sahip herhangi bir önleyici fungisitler için çok geç zaten yer almış bir enfeksiyon gerektirir10.
Hedeflenen mikroorganizmaların tespiti ve tanısı için sulama suyunu test etmek için geleneksel yöntem hız ve duyarlılık başarı ve karlı ürün üretimi için çok önemli olduğunda antika bir yaklaşımdır11,12. Hedeflenen patojene duyarlı bitki dokusu (örneğin, P. capsiciiçin patlıcan) çıkarıldı ve enfeksiyon için denetlenmeden önce uzun bir süre bir sulama havuzunda asılı değiştirilmiş bir tuzak bağlı. Bitki dokusundan alınan numuneler daha sonra yarı selektif ortama (PARPH) kaplanır ve kültür gelişimi için kuluçkaya yatırılır, daha sonra morfolojik tanımlama bileşik mikroskop kullanılarak yapılır13. Seçici ortam kullanarak diğer bitki patojenleri için diğer benzer algılama yöntemleri vardır ve alt culturing önce kontamine su küçük miktarlarda kaplama14,15. Bu yöntemler her türün temel morfolojik karakterlerini tanıyabilmek için 2 ila 6 hafta arasında herhangi bir yerde, organizmayı izole etmek için birkaç tur alt-kültür ve Fitophthora diagnostik deneyimi gerektirir. Bu geleneksel yöntemler, su kaynaklarında da bulunan diğer mikroorganizmaların müdahalesi gibi faktörler nedeniyle P. capsici tarafından kontamine olan sulama suyunun tespiti için iyi çalışmaz. Pythium spp. ve su kaynaklı bakteriler gibi bazı hızlı büyüyen mikroorganizmalar p. capsici tespit edilemez,16,17yapma plaka üzerinde aşırı büyüyebilir.
Bu çalışmanın amacı, sulama suyunda P. capsici zoosporları saptamak için hem saha hem de laboratuvar ortamlarında kullanılabilecek hassas ve spesifik bir moleküler yöntem geliştirmektir. Protokol, p. capsici18,,191121-baz çifti (bp) parçası dayalı, özellikle P. capsiciyükseltmek mümkün yeni bir döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) astar seti gelişimini içerir. Dong ve ark. (2015) daha önce geliştirilmiş lamp astarı bu çalışma için geliştirilen tsurel ile karşılaştırıldığında kullanılmıştır20.
LAMP testi, geleneksel polimeraz zincir reaksiyonundan (PCR) daha hızlı, hassas ve spesifik olduğu kanıtlanmıştır moleküler algılama nispeten yeni bir şeklidir21. Genel olarak, geleneksel PCR tahlilleri 500 kopyanın altında (1,25 pg/μL) algılayamaz; buna karşılık, önceki çalışmalar LAMP hassasiyetinin konvansiyonel PCR'den 10 ila 1.000 kat daha yüksek olabileceğini ve genomikDNA'nın1 fg/μL'sini bile kolayca tespit edebildiği gösterilmiştir 22,23. Ayrıca, test hızla yapılabilir (genellikle 30 dk) ve yerinde (alanında) amplifikasyon için taşınabilir bir ısıtma bloğu ve pozitif bir örnek için renk değiştiren bir kolorimetrik boya kullanılarak (elektroforez ihtiyacını ortadan kaldırarak). Bu çalışmada PCR ve LAMP tahlillerinin hassasiyetini filtre çıkarma yöntemi ile karşılaştırdık. Önerilen algılama yöntemi, araştırmacıların ve uzatma ajanlarının p. capsici sporlarının varlığını iki saatten kısa bir sürede farklı su kaynaklarından kolayca tespit etmesini sağlar. Tetki nin konvansiyonel PCR'den daha hassas olduğu kanıtlanmıştır ve bir yetiştirici tarafından kullanılan sulama suyunda patojenin varlığı tespit edilerek yerinde doğrulanmıştır. Bu algılama yöntemi, yetiştiricilerin sulama için kullanılan çeşitli su kaynaklarında patojenin varlığını ve popülasyon yoğunluğunu tahmin edebilmelerini sağlayarak yıkıcı salgınları ve ekonomik kayıpları önleyecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Portatif döngü aracılı izomal amplifikasyon kullanarak sulama suyundan Fitophthora capsici yerinde tespiti
- Pompa ve filtrenin ayarlanması
- Pompa etkinleştirildiğinde, hava filtreleme şişesinin ağzından çekilecek şekilde bir el pompasına bağlı bir tüpe bir filtreleme şişesi takın.
- Buchner hunisini filtreleme şişesinin ağzına kauçuk durdurucuya tuygulayın ve uygun büyüklükteki filtre kağıdını Buchner hunisine sığdırın, böylece hava filtre kağıdından çekilir. Filtre kağıdı 15 μm tutma boyutuna sahip olmalıdır.
NOT: Filtre kağıdı, filtre kağıdının etrafında en az suyun akması için Buchner huninin kenarlarına sığmalıdır.
- Su örnekleme ve filtreleme
- Hedeflenen kaynaktan su örnekleri alın. Su enkaz küçük miktarlarda olabilir ama önemli bir tortu veya toprak değil.
- Buchner hunisinin içine yerleştirilen filtre kağıdının üzerine 1.000 mL'ye (1 Litre) kadar test suyu dökün, taşmayı önlemek için yeterince yavaş yavaş, el pompası (veya vakum) suyu çekmek için bir emme oluşturmak için kullanılırken.
NOT: Bu yöntemle test edilebilen minimum su miktarı yoktur ve en az 50 mL önerilmesine rağmen bu yöntem için maksimum 1000 mL'dir. - Buchner hunisinden filtre kağıdını çıkarın ve steril makasla küçük parçalara kesin. Protokolün gerektirdiği ekstraksiyon tamponu miktarına (manyetik boncuk bazlı ekstraksiyon için 400 μL) batırılabildiği kadar parça (8-12) 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyin. İlk küme ayıklandıktan sonra kalan filtre kağıdı parçalarını işlemeye kaydedin.
- Girdap veya başka 5 dakika boyunca her dakika 10 s için filtre kağıdı ve ekstraksiyon tampon parçaları ajite. Daha sonra, forceps kullanarak, filtre kağıdı mümkün olduğunca az çıkarma arabellek kaybetme kaldırın. Tüm parçalar girdaplı/ajite edilmiş ve ekstraksiyon arabelleği içinde ıslatılmış kadar filtre kağıt kalan parçaları ile bu adımı tekrarlayın.
- Filtre kağıdından DNA'nın manyetik boncuk bazlı çıkarılması
- 1.5 mL tüpe (şu anda yaklaşık 200-300 μL ekstraksiyon tamponu içeren) 20 μL proteinaz K ve 10 μL 10 ng/μL RNase ekleyin.
- 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka, girdap veya tüp sallamak her 3 dakika.
- Numuneye bağlama tamponu ile 500 μL manyetik boncuk ekleyin ve sallayarak iyice karıştırın. Sonra oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
- Tüm boncuklar mıknatısa çekilene kadar tüpü manyetik ayırıcı rafa 2 dakika yerleştirin. Supernatant'ı çıkarın ve atın.
- Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın. 500 μL Yıkama Tamponu 1 ekleyin ve tüpü şiddetle sallayarak boncukları yeniden askıya alın. 30 s bekleyin ve sonra manyetik ayırıcı geri tüp yerleştirin. Tüm boncuklar çıkarmadan önce mıknatıs doğru çekilen ve supernatant atılıncaya kadar 2 dk bekleyin.
NOT: Manyetik boncukların ayırıcıya manyetize olmasını beklerken, tüpün kapağına ve kenarlarına yapışmış manyetik boncukları yerinden çıkarabilen ve daha fazla sayıda boncuk eklenmesine neden olan tüpü ters çevirmenizi öneririz. - 500 μL Yıkama Tamponu 2 ile adım 1.3.5'i tekrarlayın.
- %80 etanol 500 μL ile adım 1.3.5 tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında (18-27 °C) kapağı açık 15 dakika boyunca manyetik boncuk peletini hava kurutun. Sıcaklıklar izin vermezse, kapağı 15 dakika açık eldivenli bir elde kuluçkaya yatırın.
- Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın. 50 μL elütion tamponu ekleyin ve 1 dakika boyunca yukarı ve aşağı borular oluşturarak boncukları yeniden askıya alın.
- Tüpü manyetik ayırıcıya geri yerleştirin. DNA depolama için ayrı bir tüp için boncuk rahatsız etmeden supernatant aktarmadan önce 2 dakika bekleyin.
NOT: Burada deneme devam etmeden önce duraklatılmış olabilir. Çıkarılan DNA buzda veya -20 °C'lik bir dondurucuda saklanmalıdır.
- Yeni geliştirilen LAMP tofmu uygulaması
- Lamp astar karışımını her F3 ve B3 astarının 0,2 μM'sini, her Loop-F ve Loop-B astarının 0,8 μM'sini ve her FIP ve BIP astarının 1,6 μM'sini kullanarak hazırlayın(Tablo 2).
- Tek bir PCR tüpüne veya 8 tüp şeridindeki her bir tüpe aşağıdaki LAMP çözeltisini ekleyin: 2,5 μL astar karışımı (adım 1.4.1), 12.5 μL LAVA LAMP ana karışımı, 1 μL çıkarılan DNA ve 9 μL ddH2O. Toplam hacim 25 μL'dir.
NOT: Kolorimetrik boyalı taşınabilir amplifikasyon aleti (örneğin, Genie III) kullanıyorsanız (örneğin, Warmstart), bölüm 2.4.2- 2.4.3'e bakın. - İki tüpü pozitif ve negatif kontroller olarak belirleyin. Pozitif kontrol için LAVA LAMP kiti tarafından sağlanan bir kontrol veya bilinen pozitif DNA örneğini kullanın. Negatif kontrol için ddH2O kullanın. Her ikisi için de, 1 μL'lik çıkarılan DNA'yı pozitif kontrol veya ddH2O'nun 1 000'i yerine türün.
- Numuneleri 45 dakika boyunca 64 °C'ye ayarlanmış bir ısı bloğuna (veya taşınabilir amplifikasyon aletine) ayarlayın.
NOT: Burada manyetik boncuk bazlı ekstraksiyon yerine diğer ekstraksiyon yöntemleri kullanılabilir. CTAB ve ticari DNA çıkarma kiti hem başarıyla standart protokolleri kullanılarak test edildi ve bitki örneği için filtre kağıt parçaları yerine24,25. Sonuçlar Tablo 2'dekarşılaştırıldı. DNA konsantrasyonu ölçülebiliyorsa, 1-10 ng genomik DNA kullanın.
- Sonuçların görselleştirilmesi
- Laboratuvar ortamında gerçekleştirilirse, amplifikasyon ürünlerini her numunenin 5 μL'sini %1'lik bir agarose jeline yükleyerek, jel elektroforez makinesinde çalıştırarak ve uv görüntüleme makinesinde görüntüleyerek görüntüleyin.
- Kolorimetrik boya (örneğin, Warmstart) kullanıldıysa, sonuçları pozitif veya negatif olarak belirlemek için renk değişikliğini görüntüleyin.
- Taşınabilir bir amplifikasyon aleti (örneğin, Genie III) kullanıldıysa, sonuçları belirlemek için ekrandaki amplifikasyon grafiğini görüntüleyin.
- Daha önce geliştirilmiş PCR tsömünün uygulanması
NOT: Geleneksel bir PCR tonu kullanıyorsanız, 1-3 adımları aynı kalır ve aşağıdaki adımlar 1.4 ve 1.5 adımları yerine uygulanmalıdır.- Aşağıdaki bileşenleri içeren tek tek tüplere her DNA ekstraksiyonundan 1 μL ekleyin: 12,5 μL Yeşil PCR ana karışımı, 9,5 μL ddH2O ve 1 μL ileri ve geri astar(Tablo 2).
- Mikrocentrifuge kullanarak her numuneyi aşağı doğru çevirin ve tüpleri termal döngüye yerleştirin.
- Önceki yayınlara uygun olarak aşağıdaki termal döngü ayarlarını kullanın: 5 dk için 94 °C, 30 s için 94 °C'de 30 döngü denatürasyon, 30 s için 54 °C'de annealing, 1 dk için 72 °C'de uzatma ve 10 dk için 72 °C'de son uzatma.
- % 1 agarose jel ürün çalıştırın. Olumlu reaksiyonlar ~ 508 bp bir bant boyutu na sahip olacak UV ışığı altında bantların varlığını gözlemleyin.
- Geleneksel algılama yöntemi
NOT: Patojen tespiti için birden fazla seçici kaplama yöntemi vardır ve aşağıdaki P. capsiciiçin genel bir protokoldür.- İlk olarak, sağlıklı bir patlıcan meyve (P. capsiciiçin duyarlı bir ev sahibi) elde ve% 70 izopropil alkol ile meyve yüzeyi yıkayarak yüzey sterilize.
- Bir yüzdürme cihazı (polietilen köpük veya diğer) ile süt kasaları içine patlıcan meyve yerleştirin ve sulama havuzları içine dağıtmak. Her yem kapanını tek bir noktaya sabitleyin ve su haznesinde (geri dönüştürülmüş sulama suyu) en az 7 gün veya meyve çürümesi belirtileri gözlemlenene kadar tuzakları bırakın. Meyvetoplamak ve laboratuvara taşımak.
- Enfekte dokuların küçük parçalarını çıkarmadan önce steril bir kaputta meyveyi durulayın ve kurulayın ve 25 mg/L pentakloronitrobenzene, %0.0005 pimaricin, 250 mg/L ampisilin, 10 mg/L rifampisin ve 50 mg/L himexazol ile değiştirilen PARPH ortamının bir tabağına yerleştirin. 25 °C'de 5 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
- Yalıtımdan 4 gün sonra geleneksel morfolojik tanımlama için plakaları bileşik mikroskop altında görüntüleyin.
2. Zoospor konsantrasyonunun algılama sınırının belirlenmesi
- Zoospor süspansiyon yapma
- V8 agar üzerinde incubate P. capsici (100 mL V8 suyu, 900 mL ddH2O, 1 g CaCO3) plakalar 1 hafta boyunca 26 °C. Birden fazla plaka zoospor süspansiyon daha büyük bir miktar elde etmek için kullanılabilir.
- Sporlaşmayı uyarmak için 3 gün boyunca oda sıcaklığında sürekli ışık altında plakaları kuluçkaya yatırın.
- Her plakaya 15 mL ddH2O ekleyerek plakaları takın ve 25 dakika boyunca 4 °C'lik bir buzdolabına koyun. Sonra 30 dakika oda sıcaklığına dönün.
- Zoosporları ve pipetleri tüm plakalardan tek bir 50 mL tüpe çıkarmak için plakaları çalkalayın.
- Zoospor konsantrasyonunun doğru bir tahminini elde etmek için, bir hemositometre üzerine spor süspansiyonunun 10 μL'sini ekleyin ve zoosporları saymak ve ortalama konsantrasyonu tahmin etmek için mikroskop altında gözlemleyin.
- Seri seyreltme
- Ayrı bir tüpe spor süspansiyonunun 1 mL'sini ve 9 mL ddH2O'yu ekleyin. Bu adımı, istediğiniz kadar 10 kat seyreltme için tekrarlayın.
- Spore çözeltileri daha sonra filtrasyon yöntemi kullanılarak önceki protokole göre DNA ekstraksiyonu için gönderilir.
NOT: Daha büyük bir süspansiyon hacmi isteniyorsa, hacmiiki katı: 2 mL spor süspansiyonu ve 18 mL ddH2O.
- Zoospor konsantrasyon limitinin saptanması
- Açıkça olumlu sonuçlar gözlenene kadar her seri seyreltme tek tek taht yoluyla çalıştırarak spor algılama sınırı nı değerlendirin. Son seyreltme elde edildikten sonra, 2 faktörüyle seyreltin (bu örnekte 4,8 ila 2,4) ve daha doğru bir algılama sınırı elde etmek için tahlil tekrar çalıştırın.
- LAMP yönteminin geliştirilmesi ve optimizasyonu
NOT: LAMP astarları, Ek Şekil 2'degösterildiği gibi P. capsici 'nin (Li ve ark.19)1121 baz çifti (bp) parçasına göre tasarlanmıştır.- Kolorimetrik boya (örneğin, Warmstart) kullanılıyorsa, aşağıdaki çözeltiyi kullanın: 2,5 μL astar karışımı, 12,5 μL kolorimetrik boya, 0,5 μL Yeşil floresan boya, 1 μL çıkarılan DNA ve 8,5 μL ddH2O. Toplam hacim 25 μL'dir.
- LAVALAMP mastermix ile taşınabilir amplifikasyon aleti kullanırken, üretici tarafından tavsiye edilen 3 dakika için 95 °C'lik bir başlangıç adıma sahip olmak, ancak bu gerekli değildir. Renk değişikliği veya amplifikasyon grafiğini gözlemlemek için son bir basamak gerekmez. Ticari kolorimetrik boya kullanılacaksa, ısınma adımı atmayın.
- Aşağıdaki yöntemlerden biri LAMP tahsin sonuçları görüntüleyin: bir% agarose jel veya görünüm çıplak gözle veya Genie III gerçek zamanlı amplifikasyon ekranında görünümü ile bir UV görüntüleme makinesi kullanarak örnekleri çalıştırın.
- Taşınabilir amplifikasyon cihazını kullanarak ve hız ve hassasiyet düzeyi için gerçek zamanlı amplifikasyon grafiği kullanılarak analiz edilerek LAMP testinin sıcaklığını optimize edin. En yüksek hassasiyet seviyesine sahip en hızlı amplifikasyonu belirlemek için numuneleri benzersiz sıcaklıklarda çalıştırın.
- Çıkarılan DNA'nın seri seyreltilmesi (adım 2.2.1'deki spor süspansiyonunda olduğu gibi) ve her seyreltme için LAMP reaksiyonu için daha önce açıklandığı gibi reaksiyon koşullarını koruyarak geliştirilen LAMP testinin algılama limitini belirleyin.
- Algılama sınırı tayini ve geleneksel PCR yöntemi ile karşılaştırılması
- Geleneksel PCR'nin algılama düzeyini LAMP testi ile karşılaştırmak için bölüm 1.3'teki adımlarda çıkarılan DNA'yı kullanın.
- 1 μL ileri ve ters PCR astar(Tablo 2), 12,5 μL Yeşil PCR Mastermix ve 9,5 μL ddH2O içeren bir PCR tüpüne toplam 25 μL için 1 000 DNA ekleyin.
- Aşağıdaki koşulları kullanarak termal döngüdeki numuneleri yükseltin: 5 dk için 94 °C, 30 s için 94 °C'de 30 döngü denatürasyon, 30 s için 54 °C'de annealing, 1 dk için 72 °C'de uzatma ve 10 dakika için 72 °C'de son uzatma.
- Örnekleri bir elektroforez makinesinde %1 agarose jel üzerinde çalıştırın ve UV görüntüleme makinesinde görüntüleyin. Hariç bant boyutu 508 bp idi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LAMP yönteminin optimizasyonu
Bu çalışmada, portatif döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) analizi ile sulama suyunda Fitophthora capsici varlığı saptandı. İlk olarak, önerilen LAMP testi farklı LAMP astar konsantrasyonları test edilerek optimize edildi [F3, B3 (her biri 0.1-0.5 μM); LF, LB (her biri 0,5-1,0 μM) ve FIP, BIP (her biri 0,8-2,4 μM)], süreler (30-70 dk) ve sıcaklıklar (55-70 °C). Bu çalışmada kullanılan son LAMP astar karışımı: 0.2 μM her F3 ve B3 astar, 0.8 μM her Loop-F ve Loop-B astar, 1.6 μM her FIP ve BIP astar. Portatif amplifikasyon cihazında (örneğin, Genie III) ek negatif amplifikasyon olmadan en hızlı reaksiyonu hangi sıcaklığın gerçekleştirildi belirlenerek reaksiyon sıcaklığının optimizasyonu yapıldı. En uygun sıcaklığın 64 °C olduğu doğrulandı (veriler gösterilmedi). 64 °C'de tazyikin çalıştırılması için en uygun süre 45 dakika ydı, çünkü tespit için pozitif olan en düşük konsantrasyonlar (1,2 x 102 spor/mL) hala 40 dakika ile yükseltilirken, daha yüksek konsantrasyonlar 20 dakika(Şekil 2D)olarak yükseltildi. Amplifikatör LAMP ürünleri daha fazla% 1 agarose jel bir nükleik asit lekesi ile amplifikasyon onaylamak için lekeli gözlendi. Tüm tepkiler en az üç kez tekrarlandı.
P. capsici izole Tennessee, Florida ve Gürcistan alınmıştır ve yöntemlerde açıklanan aynı protokole sunuldu. P. capsici izolasyonlarının tüm örnekleri, tüm test çalıştırmalarında başarıyla yükseltilmiştir(Şekil 3).
Portatif LAMP testi ile sulama suyunda Fitophthora capsici'nin tespiti ve hassasiyet testi
P. capsici spor süspansiyonlarının seri seyreltilmesi ile bu filtre kağıt bazlı LAMP yöntemini laboratuvar koşullarında standartlaştırdık (Şekil 1). Seri seyreltmeler 4.8 x 104 zoospor/mL'den başlayan p. capsici spor süspansiyonundan yapıldı ve lamba titreşisi triplicate olarak çalıştırıldı. DNA ekstraksiyonu için kullanılan yönteme bağlı olarak DNA konsantrasyonu yerine spor konsantrasyonları gösterilmiştir. CTAB DNA ekstraksiyonu en yüksek spor konsantrasyonu Nanodrop ile ölçülen 4.5 ng/μL idi ve manyetik boncuk DNA çıkarma protokolü 3.8 ng/μL26'yaçıktı. Yeni tasarlanan LAMP astar seti, tüm ekstraksiyon yöntemleriyle 1,2 x 102 spor/mL(Şekil 2B, 2C, & 2D)gibi düşük bir konsantrasyon algılayabilir. Taşınabilir amplifikasyon cihazında amplifikasyon grafiğinde gösterilen hassasiyet, uv görüntüsünde ek hassasiyet olmadan gösterilenle aynıydı. Aynı seri seyreltme alan algılama için çıplak göze duyarlılık düzeyini belirlemek için kolorimetrik boya kullanılarak bir LAMP reaksiyonu çalıştırıldı. En düşük gözlemlenebilir konsantrasyon 4.8 x 103 spor/mL(Şekil 2C)idi.
Bu testin gerçek dünya örnekleri kullanılarak değerlendirilmek üzere, Gürcistan'ın Tift İlçesi'nde ticari sebze üretimi için kullanılan yedi göletten su örnekleri toplanmıştır(Tablo 1, Şekil 5, ve Ek Şekil 1). 7 gölet dışında, 3 pozitif LAMP sonuçları gösterdi (P1, P4, ve P6)(Şekil 6A, 6B, & 6C). Bu sonuçlar, taşınabilir filtre kağıt tabanlı LAMP yöntemi nin düşük zoospor konsantrasyonu ile bile patojenin saptanmasında çok yararlı olabileceğini düşündürmektedir. Bu, P. capsici tarafından sulama suyu kontaminasyonunun taranması için PCR'den daha hassas bir algılama tayini olarak LAMP'nin uygulanabilirliğini gösterir.
Farklı yöntemlerin karşılaştırmalı analizi: Geleneksel yemleme, geleneksel PCR ve taşınabilir LAMP tabanlı tahlil
LAMP'nin algılama hassasiyetini konvansiyonel PCR ile karşılaştırmak için, spor süspansiyonlarının seri seyreltilmesinden elde edilen DNA PCR reaksiyonu ile çalıştırıldı. Sonuçlar, konvansiyonel PCR'nin LAMP'den 40 kat daha az hassas olduğunu, sadece zoospor konsantrasyonu 4.8 x 103 spor/mL(Şekil 2A)kadar düşük olduğunu göstermiştir. Ayrıca, filtrelenmiş sulama havuzu suyundan elde edilen DNA örnekleri konvansiyonel PCR kullanılarak test edildi ve üç pozitif örnekten sadece biri (P4) beklenen bant boyutu artı bazı bulaşma ve spesifik olmayan bantlar ile sonuçlanan önemli kirleticiler olarak başarıyla yükseltildi(Şekil 6D). Tablo 3, zaman, maliyet, duyarlılık ve gerekli hazırlık gibi değişkenleri kullanarak algılama yöntemleri arasındaki farkları görüntüler. LAMP bu üç yöntem arasında en ucuz yöntem di ve aynı zamanda amplifikasyon için 30-60 dk arasında değişen en hızlı oldu (DNA ekstraksiyon hariç). Konvansiyonel PCR amplifikasyon için 120-180 dk arasında değişmektedir (DNA ekstraksiyonu hariç).
Son olarak, astar özgüllüğünü belirlemek için, yakından ilişkili oopirat patojenlerin örnekleri (Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ültimum, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoides, ve Pythium aphanidermatum) elde edildi, DNA tutarlılık için aynı protokol kullanılarak ayıklandı ve olumlu ve negatif kontrol ile yeni LAMP tahtı ile değerlendirildi (Şekil 4) primers özgüllüğünü belirlemek için. Hedef olmayan tüm numuneler 45 dk için optimize edilmiş 64 °C kullanılarak negatif çıktı. Bu gerçek zamanlı amplifikasyon grafiğinde gözlendi ve UV ışığı altında% 1 agarose jel üzerinde görüntülendi.
Şekil 1: Laboratuvar koşullarında konsantre spor süspansiyonunun seri seyreltilmesinden Fitophthora capsici'de yer alan farklı adımları gösteren diyagram. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fitophthora capsicitespiti için sınırın laboratuvar optimizasyonu. (A) Konvansiyonel PCR titreti seri seyreltme faktörleri üzerinde spesifik P. capsici astarlar kullanılarak gerçekleştirildi ve %1 agarose jel üzerinde görselleştirildi. 1, Merdiven; 2-7, 4.8 x 104,4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 102 sporlar/mL, sırasıyla ve 7, negatif su kontrolü. (B) LAMP seri seyreltme faktörleri % 1 agarose jel üzerinde görselleştirilmiş. 1-6, azalan spor konsantrasyonu: 4.8 x 104, 4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 10sporlar /mL, ve 7, negatif su kontrolü. (C) LAMP sonuçları kolorimetrik boya kullanılarak görselleştirilmiştir. 1-6, azalan spor konsantrasyonu: 4.8 x 104, 4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 10sporlar /mL, ve 7, negatif su kontrolü. (D) AMPLifikasyon grafiğinde görselleştirilmiş LAMP sonuçları. Kırmızı = 4.8 x 104, Koyu mavi = 4.8 x 103, Turuncu = 4.8 x 102, Açık mavi = 2.4 x 102, Yeşil = 1.2 x 10 sporlar/mL, Pembe = Negatif kontrol (diğer Fitophthora türleri), Sarı = ddH2O.2 (E) Gerçek zamanlı sonuçlarda gösterilen değerlerin niceliğini gösteren standart bir eğri. Ln (Spor sayısı) X ekseninde ve Y ekseninde amplifikasyon dakika gösterilir. (F) Lamp tsay yayınlanan astar ile (Dong ve ark. 2015) seri seyreltme faktörleri üzerinde% 1 agarose jel görselleştirilmiş. 1-6, azalan spor konsantrasyonu: 4.8 x 104, 4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 10sporlar /mL, ve 7, negatif su kontrolü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: P. capsici DNA'sının çeşitli yerlerden amplifikasyonu. (A) LAMP sonuçları % 1 agarose jel görselleştirilmiş. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, Negatif kontrol. 1 ve 2'deki örnekler TN'den izole edildi; fl izole örnekleri 3 ve 4; örnekler 5 ve 6 GA. (B) Sonuçları kolorimetrik boya kullanılarak görüntülendi izole edildi. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2. (C) Sonuçlar amplifikasyon grafiğinde görselleştirilmiştir. Kırmızı, PC_TN1; Turuncu, PCTN2; Sarı, PC_FL1; Yeşil, PC_FL2; Koyu mavi, PC_GA1; Açık mavi, PC_GA2; Pembe, negatif kontrol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hedef olmayan türler P. capsici'den DNA kullanılarak LAMP testinin özgüllük tayini. (A) AGAROSE jel üzerinde ilgili hedef olmayan türler ile LAMP tsay reaksiyonu ve% 1 agarose jel görselleştirilmiş. L, Merdiven; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ültimum var. ültimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Negatif kontrol; 8, Fitophthora capsica. (B) LAMP sonuçları kolorimetrik boya kullanılarak görselleştirildi. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ültimum var. ültimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Negatif kontrol; 8, Fitophthora capsici (C) LAMP sonuçları amplifikasyon grafiğinde görselleştirilmiş. Kırmızı = Fitophthora capcisi, diğer tüm hedef olmayan tür örnekleri amplifikatöre edilmedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Fitophthora capsici'nin sahada saptanması için geri dönüştürülmüş suyun numune alınması ve işlenmesini gösteren resimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Sulama suyu kaynaklarında Fitophthora capsici yerinde tespit sonuçları. (A) Agarose jel Güney Gürcistan'da yedi çiftlikten test edilen su LAMP amplifikasyon sonuçları gösteren. Soldan sağa örnek isimler: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negatif kontrol, N. (B) LAMBA sonuçları alan örneklerinin warmstart colorimetric boyakullanılarak görselleştirildi: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negatif kontrol, N. (C) Grafik kullanarak alan örneklerinin LAMPampcation sonuçları. Kırmızı: P1, Yeşil: P2, Mor: P3, Sarı: P4, Mavi: P5, Turuncu: P6, Pembe: P7, Negatif kontrol, N. (D) Agarose jel belirli astarpc-1/PC-2 kullanarak amplifikasyon geleneksel PCR sonuçlarını gösteren (sadece bir site daha not LAMP üç karşılaştırıldığında pozitif test). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gölet adı | İlçe, Eyalet | Sulama için hedef bitkileri | PCR Algılama | LAMBA Algılama | Hastalık Öyküsü (Y/N) |
| P1 | Tift, GA | Sebze | | + | N |
| P2 | Tift, GA | Sebze | - | - | N |
| P3 | Tift, GA | Sebze | - | - | N |
| P4 | Tift, GA | Sebze | + | + | N |
| P5 | Tift, GA | Sebze | - | - | N |
| P6 | Tift, GA | Sebze | - | + | N |
| P7 | Tift, GA | Sebze | - | - | N |
Tablo 1: Güney GA sulama suyu tespiti.
| Astar türü | Astar adı | Sıra 5'-3' | Kaynak | ||
| Lamba | PCA3-F3 | TGTGTGTGTGTTCGATCACA | Bu çalışma | ||
| PCA3-B3 | TTTTTGCGTGCGTCCAGA | Bu çalışma | |||
| PCA3-FIP | GACACCAAGCACTCGTACTOGTTTTTACAATTGTGCAGAGGGAGGA | Bu çalışma | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTCGGCGGCGTTTGAAAAAGGACCACCCCCG | Bu çalışma | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | Bu çalışma | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTCATTTGACTGAC | Bu çalışma | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | Zhang ve ark., 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGGAAAAGCATT | Zhang ve ark., 2006 | |||
Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan astarlar.
| Parametre | Geleneksel | Konvansiyonel PCR | Lamba |
| Duyarlılık | Na | 4.8 X 102 spor/ml | 1.2 X 102 spor/ml |
| Saat | 2 hafta veya daha uzun | 2-3 saat (DNA ekstraksiyonu dahil değildir) | 30 dakika - 1 saat (DNA ekstraksiyonu dahil değildir) |
| Hazırlık | • Medya oluşturma • Kaplama ve izolasyon ve • Tuzak tasarlamak |
• Filtre kağıdı kullanarak spor koleksiyonu • DNA çıkarma ve • PCR tsömonisi |
• Filtre kağıdı kullanarak spor koleksiyonu • DNA çıkarma ve • LAMBA tAYISI |
| Malzeme | • Otoklav • Medya ve plakalar • Kuluçka odası • Akış kaputu • Patlıcan • Süt Kasası |
• Termal çevrimci • Agar jel • Jel Doktor |
• Isı bloğu veya • Cin III |
| Maliyet | Tuzak başına $5.00 | Reaksiyon başına $0.60 | Reaksiyon başına $0.75 |
Tablo 3: P. capsici tespiti için yöntemlerin karşılaştırılması.
Ek Şekil 1: Tift İlçesi, GA ve sulama suyu örnekleri devlet içinde çeşitli yerlerden alınan konumu. Pozitif örnekler kırmızı nokta olarak gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: LAMP astar setinin tasarımı. Oklar astarların nasıl okunduğunu gösterir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fitopatojenler için sulama suyunun test edilmesi, sulama havuzları ve geri dönüştürülmüş su kullanan yetiştiriciler için çok önemli bir adımdır27. Sulama havuzları aşırı sulama suyu mevcut olabilir herhangi bir patojenler taşıyan gölet alanından gölete yönlendirilir gibi fitopatojenler bir dizi için bir rezervuar ve üreme zemin sağlar16,27. Büyük bir su kaynağında bir bitki patojenlerinin tespiti için geleneksel yöntem, havuzda asılı duyarlı konak dokusu (örneğin, meyve, yaprak) kullanarak patojen için bir yem ayarlamak ve bir enfeksiyon gerçekleşmesi için beklemek, sonra meyve / yaprakları kaldırmak ve mikroskopveya moleküler yöntemlerle tanı onaylamak13,14. Bu yöntemler, tespit testini çalıştırmak için gereken süre (2 hafta veya daha uzun) ve gerekli işçilik ve ekipman nedeniyle sınırlanmaktadır. Ayrıca, doğru sonuçlar için görsel tanı, patojen morfolojisi ve taksonomi konusunda geniş deneyim ve bilgi gereklidir. PCR, qPCR ve DNA hibridizasyonu gibi moleküler teknikler geleneksel algılama yöntemlerine göre çok daha az zaman (3-4 saat) gerektirir; ancak, pahalı ekipman ve laboratuvar ayarı gerektirir. Ayrıca, bu teknikler su büyük hacimli işlenmesi için izin vermez. Serolojik tahliller de, hedef olmayan pozitif reaksiyonlar nedeniyle tespit kabiliyetlerinde yetersiz kalmakta ve Fitophthora türleri için türe özgü tahliller geliştirilmemiştir. Döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) son zamanlarda tetkik sadece bir termal döngücü28,29yerine tek bir sıcaklık gerektirir gibi birden fazla patojenlerin hızlı ve hassas tespiti için yerinde tanı tekniği olarak kullanılmıştır . LAMP alanında görsel onay için kolorimetrik boya kullanılarak veya bir saatten az30sonuç için gerçek zamanlı bir amplifikasyon makinesi kullanılarak çalıştırılabilir.
Bu deneyin amacı, su kaynaklarında veya laboratuvarda Fitophthora capsici varlığını tespit etmek için hızlı ve hassas bir yöntem geliştirmekti. Algılama hızını artırmak ve sulama suyunda P. capsici tespit etmek için daha önce bahsedilen yöntemlerin sınırlamaları mücadele etmek için, biz sporları yakalamak ve su daha büyük bir hacim kendi DNA ayıklamak için filtre kağıdı kullanarak bir yöntem tasarlanmıştır. Sporlar filtre kağıdı tekniği kullanılarak yakalandıktan ve DNA çıkarıldıktan sonra, patojenin varlığı P. capsici'yeözgü yeni tasarlanmış LAMP astar setine göre doğrulandı. Algılama hassasiyeti ve özgüllüğü LAMP ve PCR kullanılarak karşılaştırıldı. Tüm 3 replikasyonlarda ve tüm zoospor konsantrasyonlarında LAMP daha hızlı ve daha hassas bir algılama yöntemiydi(Tablo 3). Bu yöntem geleneksel yöntemler olarak küçük bir numune hacmine sahip olmakla sınırlı değildir, çünkü bu yöntem tek seferde 1 L suya kadar test edilebilir ve patojen tespit idamesi şansını artırır. Buchner hunisi üzerinden yavaş yavaş dökme sulama suyu saniyede en fazla 40 mL hızda filtre kağıdıspor yakalama yeteneğini artırdığı belirtilmiştir.
Algılama protokolünü doğrulamak için, P. capsici'nin bulunduğundan şüphelenilen alandan alınan su örnekleri de(Ek Şekil 1)tasarlanmış yöntemi pratik bir senaryo ile test etmek için alınmıştır. Test edilen 7 çiftlikten 3'ü LAMP testi(Şekil 6A-6C)kullanılarak P. capsici'nin varlığı pozitif iken, geleneksel PCR testi(Şekil 6D)kullanılırken sadece bir çiftlik pozitifti ve LAMP'yi sulama suyunu test etme yöntemi için daha hassas bir test olarak gösterdi. Bu filtre tabanlı LAMP testi, 1.2 x 102 zoospor/mL gibi düşük bir konsantrasyondan DNA'yı tespit edebilir ve bu testin orijinal hassasiyetinden (0.01 ng genomik DNA~5 spora eşdeğer) filtrelenmemiş zoospor süspansiyonu ile önemli ölçüde daha azdır. Dong et tarafından önceki LAMP tsay. al. (2015)20 aynı seri seyreltme üzerinde çalıştırıldı ve duyarlılık düzeyi aynıydı (Şekil 2F). Filtresiz spor çözümü ile bir PCR test için algılama düzeyi de tespit daha yüksek bir düzeyde göstermiştir (eşdeğer ~ 10 sporlar) hangi çok önceki PCR tabanlı bulgular açıktı10. Geleneksel yemleme yönteminin spor algılama limiti tek bir spor bireysel yeteneğine bağlı olarak enfeksiyona neden olabileceğinden kontrol edilmedi. Hem LAMP hem de PCR tahlillerinde bulunan azalmış hassasiyet, filtre kağıdının içinden veya çevresinden akan veya filtre kağıdına bir kez bağlanan ve %100 verimlilikle çıkarılamayan bazı sporlardan kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, bu yeni LAMP ve filtre sistemi önceki yöntemlere göre çok daha yüksek bir su hacmini işleyebilir ve analiz edebilir ve alan içi algılama için daha yüksek bir özgüllük ve hız sağlar.
Kullanılan ekstraksiyon yöntemleri, manyetik boncuk bazlı ekstraksiyon en hızlı ve bir boncuk çırpıcı veya santrifüj gibi harici makinelerin kullanımı alan içi ekstraksiyon için yararlı hale ve lamba testi taşınabilir özelliği iltifat gerektirmez. CTAB tabanlı yöntem DNA'nın en yüksek konsantrasyonunu elde etti ancak en uzun süre kaldı, ticari bitki DNA çıkarma kiti (örneğin, DNeasy) hem gerekli hem de DNA konsantrasyonu elde edilen ikinci oldu.
Hem CTAB hem de ticari bitki DNA ekstraksiyon kiti ile filtre kağıdının homojenizasyonu sırasında homojenizasyonun daha başarılı olduğu ve boncuk dövmesi veya el homojenizasyonu başlamadan önce filtre kağıdı parçaları ile tüpe CTAB çözeltisi (veya ekstraksiyon tamponu) eklenmesi durumunda daha yüksek konsantrasyon da olduğu belirtilmiştir. Boncuk dayak bir dakika için 3 kez yapıldı, ancak girdap ve her tur arasında tüp ajitasyon tüm ekstraksiyon yöntemleri tam homojenizasyon için gerekli ydi. Daha da önemlisi, filtre kağıdı tüpün kenarlarına veya altına sıkışmaya tabidir, bu nedenle filtre kağıdının duvarların dışında olduğundan emin olmak çok önemlidir, böylece homojenize olur.
Amplifikasyon için gereken toplam süre 90-120 dk olup yerinde tanı için sahada kolaylıkla yapılabilir. Bu filtre yöntemi aynı zamanda patojenin saptanması için olası şansı artırmak için önemli miktarda suyu filtrelemek için tasarlanmıştır. Bu yöntem aynı zamanda bir su kaynağında birikebilir birçok patojenler için de geçerlidir, özellikle cins gibi: Pythium, Fitophthora, Fusarium, ve bakteri; gerekli olan tek değişiklik, hedeflenen patojen için eşit derecede spesifik lamp astar seti geliştirilmesi olacaktır30.
Bu çalışmanın önemli bir sonucu sulama suyu kaynaklarında P. capsici tespiti için son derece hassas ve hızlı filtre kağıt tabanlı LAMP testi geliştirilmesidir. Bu çalışmanın geri dönüştürülmüş sulama suyunun kontaminasyonu konusunda farkındalık da artışa yol açacağını, sonunda Fitophthora ile ilişkili hastalıkların yönetimini iyileştireceğini ve bunun sonucunda üretim maliyetlerini düşüreceğini ve mahsul verimini artıracağını ugörüyoruz. Bu tür bilgiler, sebze üretiminin sürdürülebilirliğini artırmak ve sebze üretimlerinin karlılığını artırmak için son derece gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmek için hiçbir şey yok ya da çıkar çatışmaları.
Acknowledgments
Bu çalışma Gürcistan Sebze Emtia Komisyonu'nun FP00016659 projesi NIN mali desteğini aldı. Yazarlar Dr Pingsheng Ji, Georgia Üniversitesi ve Dr Anne Dorrance, Ohio State Üniversitesi Phytophthora sppsaf kültürleri sağlamak için teşekkür ederiz. Biz de çalışma boyunca teknik yardım için Li Wang ve Deloris Veney teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
