Summary
En protokol til kultur den mikrosporidske parasit Edhazardia aedis. Parasitten er passage fra en generation af Aedes aegypti myg til den næste via vandret overførsel på larve fase efterfulgt af lodret transmission på voksen fase. Live sporoplasmer overlever på lang sigt i inficerede æg.
Abstract
Edhazardia aedis er en mikrosporidian parasit af Aedes aegypti myg, en sygdom vektor, der overfører flere arbovirus, som forårsager millioner af sygdomstilfælde hvert år. E. aedis forårsager dødelighed og nedsat reproduktiv fitness i myg vektor og er blevet undersøgt for sit potentiale som en biocontrol agent. Den protokol, vi præsenterer for dyrkning E. aedis er baseret på sin naturlige infektion cyklus, som indebærer både vandret og lodret transmission på forskellige livsstadier af myg vært. Ae. aegypti myg er udsat for sporer i larve fase. Disse inficerede larver derefter modnes til voksne og overføre parasitten lodret til deres afkom. Inficerede afkom bruges derefter som en kilde til sporer til fremtidig horisontal transmission. Culturing E. aedis kan være udfordrende for de uindviede i betragtning af kompleksiteten af parasittens livscyklus, og denne protokol giver detaljeret vejledning og visuelle hjælpemidler til afklaring.
Introduction
Aedes aegypti er myg vektor af flere arbovirus (f.eks denguefeber, Zika, gul feber), der tilsammen skønnes at tegne sig for hundreder af millioner af sygdomstilfælde hvert år og mere end 30.000 dødsfald1,2. Behandling af sygdomme forårsaget af disse patogener er begrænset til understøttende behandling, og det er sandsynligt, at yderligere arbovirus vil opstå i fremtiden3. Kontrol af myg vektor er derfor af primær betydning, da det effektivt forhindrer overførsel af nuværende og nye patogener4. Traditionelt vektor kontrol strategier primært udnytte kemiske insekticider, men resistens over for mange almindeligt anvendte insekticider har drevet efterspørgslen efter nye metoder til vektorkontrol. En potentiel agent, der er blevet undersøgt for sine biocontrol egenskaber mod Ae. aegypti er parasitten Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, først identificeret som Nosema aedis af Kudo i 1930, er en mikrosporidian parasit af Ae. aegypti myg7. Udviklingen og reproduktionen af E. aedis er forholdsvis kompleks , og dens livscyklus kan fortsætte på fleremåder 7,8,9. En fælles udviklingscyklus er beskrevet i dybden i Becnel et al., 19897 og anvendes til laboratorieformering (Figur 1)8. Kort, cyklussen begynder, når Ae. aegypti æg lodret inficeret med E. aedis klækkes i inficerede larver, der udvikler uninucleate sporer i fedt kroppen, og normalt dør som larver eller puppe. Uninucleate sporer frigivet fra døde larver forurener levested og indtages af sunde Ae. aegypti larver. Disse sporer spire primært i fordøjelseskanalen, inficere fordøjelsesvæv af de eksponerede larver, resulterer i vandret transmission. Horisontalt inficerede larver udvikle sig til voksne (forældre generation), hvor binukleat sporer dannes. Hos hunnen invaderer disse binucleatsporer forplantningsorganerne, og deres tilknyttede sporoplasme inficerer udvikle ægceller. Disse æg klækkes derefter til inficerede larver (filialgenerering), hvilket resulterer i vertikal overførsel af parasitten og fortsættelse af cyklussen som beskrevet ovenfor.
Flere undersøgelser har undersøgt potentialet i E. aedis for biocontrol. Infektion med E. aedis har vist sig at resultere i nedsat forplantningsevne af Ae. aegypti hunner10. I et semifelteksperiment resulterede den uundative udledning af E. aedis desuden i en fuldstændig udryddelse af en test Ae. aegypti-population, der holdes i et screenet indkapslingsområde6. Mens i stand til at gennemgå nogle faser af udviklingen i et mangfoldigt sæt af myg arter, E. aedis er kun vertikalt overføres i Ae. aegypti, hvilket indikerer en høj grad af vært specificitet11,12. På samme måde lykkedes det i en laboratorievurdering af den potentielle miljørisiko i forbindelse med E. aedis,at mikrosporiderparaten ikke inficerede ikke-mållevende akvatiske fauna, herunder rovdyr, der indtog Ae. aegypti larver inficeret med E. aedis13. Disse resultater fremhæver potentialet for, at E. aedis kan anvendes i biologiske bekæmpelsesstrategier rettet mod naturlige Ae. aegypti-populationer.
På trods af at E. aedis viser lovende til brug i vektor kontrol, der er udfordringer til dyrkning og implementering af det i bred skala. E. aedis sporer mister smitteevne på mindre end én dag ved kolde temperaturer (dvs. 5 °C). Selv ved varmere temperaturer (dvs. 25 °C) mister sporer hurtigt smitteevne i løbet af tre uger14. Derudover skal E. aedis dyrkes i levende Ae. aegypti myg og kontrolleret dosering af sunde larve myg er nødvendig for at sikre afslutningen af livscyklus og for at forhindre sammenbrud af befolkningen, der anvendes til kultur8. Kravet om in vivo-dyrkning udgør en udfordring; de seneste fremskridt inden for opdræt af myggemasser og robotteknologi (f.eks. Vi forventer, at visualisering af denne metode vil øge adgangen til E. aedis opdræt protokol og give flere forskere til at undersøge den grundlæggende biologi og anvendt potentiale i dette system. Vi forventer også, at det vil lette øget samarbejde med ingeniører, robotister, og den bredere teknologi sektor, som kan tjene til at forbedre masseopdragelse af E. aedis.
Figur 1: E. aedis propagation i Ae. aegypti. Formering af E. aedis begynder med udklækning E. aedis inficerede æg. Inficerede larver opdrættes til 4th instar, E. aedis sporer er isoleret fra disse larver, og sporerne bruges til oralt at inficere sunde 2 nd / 3rd instar larver opdrættet fra en ikke-inficeret kobling af æg(vandrettransmission). Disse oralt inficerede larver opdrættes derefter til voksenalderen (forældregeneration) og lægger æg inficeret med E. aedis (vertikal transmission). Inficerede æg (filial generation) derefter udklækket til at fortsætte infektionen cyklus og parasit kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
1. dag 0
- Hatch Ae. aegypti æg inficeret med E. aedis ved at placere i larve opdræt bakke med 1 L deioniseret (DI) vand. Tilsæt 50 mg fiskefoder.
BEMÆRK: På tidspunktet for offentliggørelsen er en laboratoriestamme af E. aedis kun tilgængelig fra laboratorier, der aktivt forsker i parasitten, da E. aedis ikke kan lagres på lang sigt, og inficerede æg ikke i øjeblikket opbevares i depoter. Forskere interesseret i at arbejde med E. aedis kan kontakte den tilsvarende forfatter til at anmode inficerede æg.
BEMÆRK: Det er generelt ikke nødvendigt at klække et stort antal inficerede æg. ti E. aedis-inficerede Ae. aegypti larver er tilstrækkelige til at ≥ 1000 sunde larver.
BEMÆRK: For alle dele af denne protokol husede vi myg ved følgende forhold: 14 h/10 h lys/ mørk cyklus, 27 °C temperatur og 80% relativ luftfugtighed.
2. dag 1
- Efter udklækning reduceres larvernes massetæthed til ~ 100 larver pr. bakke, hvilket gør nye bakker efter behov (også med 1 L DI vand).
- Tilsæt et stykke tør kattefoder til hver bakke. Genopfyld mad, når de er forarmet, men giver ikke et overskud af mad. Et stykke kattefoder (~ 200 mg) hver tredje dag er tilstrækkelig.
BEMÆRK: Juster fødevarens mængde afhængigt af de specifikke opdrætsforhold (dvs. reducere fødevarer, hvis vandet bliver uklart, eller larver dør, forøg mad, hvis larver er alvorligt forsinket i udviklingen). Andre fodringsregimer og/eller opdrætsforhold end dem, der foreslås her, kan anvendes, men det kan være nødvendigt at justere timingen af denne standardprotokol.
3. Dag 4\u20125
- Når inficerede larver er 3rd - 4th instars, luge sund / uinficeret Ae. aegypti æg i en ny bakke.
- Bag på tætheder sådan, at sunde Ae. aegypti nå 2nd - 3rd instar i 48-72 h. I vores hænder kan dette opnås ved hjælp af tætheder på 200 \u2012300 larver pr. 1 L vand med ad libitum adgang til mad. Klækning partier af sunde æg over flere dage kan garantere, at larver er på det rigtige stadium, når det er nødvendigt.
4. Dag 7\u20128: Vandret transmission
BEMÆRK: Dosering af sunde larver med E. aedis kan ikke udføres, før uninukleate sporer er i stort antal inficerede larver (1 x 104 – 1 x 106 per larver). Dette sker sent i 4th instar fase (Figur 2).
- Høst og kvantificere uninucleate sporer.
- Brug en overførselpipette (man kan være nødt til at skære spidsen til en bredere diameter) for at flytte 10 inficerede larver til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Fjern avlsvand med et overførselsrør og vask én gang ved at tilsætte ~ 1 ml rent DI-vand. Fjern vaskevandet med et pipet, tilsæt 500 μL rent DI-vand til de 10 larver, og homogeniser ved hjælp af en støder og mekanisk homogenisator.
- Kvantificer sporer ved hjælp af et hæmocytometer ved 400x forstørrelse.
BEMÆRK: Uninukleatsporer kan identificeres ved deres særskilte pyriformformformning (dvs. pæreform; Figur 2A).
- Dosis sund Ae. aegypti larver med E. aedis.
- Lav frisk larvemad gylle ved at blande 1,2 g leverpulver, 0,8 g ølgær og 100 ml vand.
BEMÆRK: Fødevarer behøver ikke at være friske, hvis de er autoklaveret og opbevares ved 4 °C, indtil de anvendes. - Transfer 100 2nd - 3rd instar sund Ae. aegypti larver i 150 ml bægerglas eller prøve kopper.
- Dosis hvert bæger af 100 larver med 5 x 104 – 1 x 105 sporer.
- Der tilsættes 2 ml larvemadsal og DI-vand til et endeligt volumen på 100 ml.
- Lav frisk larvemad gylle ved at blande 1,2 g leverpulver, 0,8 g ølgær og 100 ml vand.
- Efter 12-24 timers eksponering overføres eksponerede larver til opdrætsbakker og bagtil til voksenalderen efter en standard opdrætsprotokol16.
5. Overvågning og vertikal transmission
- Monitor dosed larver til pupation og overføre pupper, som de udvikler sig til en fremkomsten kop i et bur. Sukkerfoder voksne ad libitum (pr.16,17). Eclosing voksne vil blive smittet af E. aedis.
- Blodfoder voksne (som pr16,17) og indsamle æg. Vertikal transmission af E. aedis sker på dette trin.
BEMÆRK: Hvis der gives yderligere blodmåltider, så snart ovipositionen er færdig, kan hunnerne lægge mindst én ekstra kobling af æg, før voksne lider (ofte pludselig) høj dødelighed. - Brug disse Ae. aegypti æg inficeret med E. aedis at fortsætte formeringsstarter med trin 1 i denne protokol.
BEMÆRK: Æg kan opbevares i 2 - 3 måneder under passende betingelser16. - Rengør alle materialer, der kom i kontakt med E. aedis, med 10 % blegemiddel og autoklavering (hvis det er muligt) for at undgå kontaminering.
Representative Results
E. aedis-inficerede Ae. aegypti Liverpool -æg(LVP 1b12)blev udklækket som beskrevet i protokollen ovenfor. I 4th instar fase, visuelle tegn på infektion kunne observeres, herunder hvide spore cyster i hele fedt organer inficerede larver (et eksempel på denne fænotype er vist i figur 2B). Uninukleate sporer blev høstet fra 4th instar larver ved homogenisering 10 larver i 500 μL DI vand. Disse sporer var pyriforme (pæreformede) og let synlige ved 400x (Figur 2A). Ved hjælp af et hæmocytometer blev der beregnet et sporetal på 4,05 x 103 sporer/μL. Et hundrede sunde Ae. aegypti larver blev derefter vandret inficeret med ~ 50.000 sporer i 100 ml vand til en endelig dosis på ~ 500 sporer / larver. Larver blev opdrættet til voksenalderen (forældregeneration) og blod fodret med defibrinated kanin blod plus 1% (v / v) 100 mM adenosin tripfosfat. Vertikalt inficerede æg blev indsamlet (filial generation) og udklækket til at fortsætte E. aedis formering og kvantificere infektion succes.
Efter syv dage efter udklækningen blev 25 filialgenerationslarver overført til individuelle 1,5 ml mikrocentrifugerør og vasket én gang med DI-vand. De enkelte larver blev homogeniseret i 250 μL DI-vand- og infektionsstatus, og E. aedisbelastninger blev vurderet ved hjælp af et hæmocytometer. Vertikal infektion sats af E. aedis i filial generation blev anset for at være 96%, og den gennemsnitlige spore belastning af inficerede personer på syv dage efter udklækning var 3,31 x 105 (Range: 3,25 x 104 - 1,47 x 106; Figur 3).
Figur 2: Visualisering af E. aedis infektion i Ae. aegypti myg. a) E. aedis uninucleate pyriform sporer. Ti E. aedis-inficerede 4th instar larver blev homogeniseret i 500 μL DI vand cirka syv dage efter udklækning. 10 μL af homogenatet blev lastet på et hæmocytometer og set ved 400X. Røde pile angiver repræsentative uninucleate E. aedis sporer. (B) E. aedis inficeret 4th instar larver udvikle karakteristiske hvide spore cyster i hele deres fedt krop18. De har også almindeligt har misdannede og udspilede abdominale segmenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kulturprotokol fører til effektiv E. aedis infektion i filial generation. Ae. aegypti larver (n = 25) fra filialgenerationen blev homogeniseret individuelt i 250 μL DI vand, og 10 μL af homogenatet blev lastet på et hæmocytometer. Tilstedeværelsen af uninukleatsporer indikerede, at en positiv infektion og sporer blev kvantificeret for alle positive prøver. A) Forekomst af infektion blandt filiallarver. Grå svarer til uinficeret larver, og sort til inficeret. Tal, der vises på hvert segment, giver det absolutte antal personer i hver gruppe. B) Sporebelastning for hver inficeret person. Sorte prikker repræsenterer log10 transformeret uninucleate spore tæller for hver larver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi præsenterer her den metode, der oprindeligt er beskrevet i Hembree og Ryan, 1982 8 tilopdræt E. aedis microsporidia i Ae. aegypti myg. Stammen af E. aedis anvendes i denne undersøgelse stammer fra den oprindelige feltsamling af Stephen Hembree i Thailand i 197919. Metoden udnytter den vandrette transmission, som naturligt forekommer i transmissionscyklussen af E. aedis7, for at udbrede parasitten på en kontrolleret måde. Denne metode kan være udfordrende for nytilkomne, der ikke er bekendt med spore udseende, symptomer på infektion i larver, eller den koordinering, der kræves for at fuldføre etape opdræt / dosing protokol. Vores håb er, at de visuelle hjælpemidler, der ledsager denne protokol vil reducere adgangsbarrierer for forskere, der ønsker at kultur E. aedis.
Vi formeret E. aedis i Ae. aegypti som beskrevet ovenfor og kvantificeret succes parasitisme i filial generation. Kort, vi udklækket E. aedis inficeret Ae. aegypti æg, opdrættet dem til 4th instar, og indsamlet uninucleate E. aedis sporer fra de inficerede larver. Vi derefter vandret inficeret sunde larver med disse sporer via oral indtagelse, og opdrættet vandret inficerede larver til voksenalderen. Vi blod fodret de inficerede voksne (forældrenes generation) og indsamlede æg (filial generation), som vi hypotese ville være lodret inficeret med E. aedis parasit. Vi udklækkede æg fra filialgenerationen og indsamlede og homogeniserede en delmængde af larverne, da de var 4th instars. Vi kvantificerede procentdelen af larver, der var inficeret med E. aedis og det samlede antal spore i alle smittede personer. Vi konstaterede, at langt de fleste (96 %) af personer blev smittet, og den gennemsnitlige spore belastning af inficerede larver var ~ 105. Vi konkluderer, at vores opdræt protokol resulterede i meget vellykket udbredelse af E. aedis i Ae. aegypti myg.
Der er flere aspekter af denne protokol, der kan være særligt udfordrende for den uindviede bruger. Nedenfor tilbyder vi nogle yderligere oplysninger, der kan være til hjælp. For spørgsmål vedrørende generelle myg opdræt, en komplet guide til Ae. aegypti koloni vedligeholdelse er uden for rammerne af denne protokol. Men mange almindelige spørgsmål kan løses ved hjælp af ressourcer fra Biodefense og Emerging Infektioner Research Resources Repository16,17 herunderæg udklækning, generelle kostbehov, bolig-og miljømæssige forhold, og blod fodring. Med hensyn til tidslinjen for infektion, larver udklækket fra inficerede æg viser ikke tegn på infektion, indtil sent i 4th instar fase. Uninucleate sporer vises hurtigt, i løbet af 1-2 dage. Larver kan forekomme næsten uinficeret efter 6 dage efter udklækning, men stærkt inficeret ved dag 7 eller 8 efter udklækning. Derudover kan det være udfordrende at visualisere sporer i homogeniserede prøver, fordi der er mange andre mikrober til stede i hele myg homogenater, herunder andre eukaryote encellede organismer (f.eks gær) af samme størrelse som E. aedis uninucleate sporer. Den karakteristiske form af E. aedis sporer (figur 2A) er en meget pålidelig metode til identifikation og vil bidrage til at skelne E. aedis fra andre mikrober i homogenatet. Selv om det ikke er nødvendigt for identifikation eller kvantificering, hvis spore rensning ønskes, kan det opnås via kolloid silica densitet gradient centrifugering, som vil give mulighed for adskillelse af E. aedis sporer fra andre forurenende elementer i homogenatet. Denne proces er beskrevet i detaljer i Solter et al.20.
Temperatur og kost, der anvendes i opdræt praksis almindeligt forskellige mellem laboratorier, men variationer vil sandsynligvis stadig give en vellykket parasit formering. Mindre forskelle i larvefødetype forstyrrer ikke vellykket infektion, selvom vi ikke udtrykkeligt har testet forskellige fødevaretyper i denne protokol. Temperaturens effekt på infektionen er blevet testet, og E. aedis-infektionen viste sig at være robust ved en lang række temperaturer21. Den maksimale sporeproduktion fandt sted ved 30,8 °C, men var stadig robust ved opdrætstemperaturer helt ned til 20 °C. Sporetallet blev reduceret drastisk ved højere opdrætstemperaturer (36 °C), og derfor bør disse temperaturer undgås for denne protokol.
Forurening er altid et problem, når man arbejder med parasitter. E. aedis er en vellykket parasit af Ae. aegypti og skal derfor holdes adskilt fra ikke-inficerede laboratoriekolonier for at forhindre kontaminering. Vi anbefaler opbevaring af inficerede myg i en separat inkubator, hvis det er muligt. Vi anbefalede også, at materialer, der anvendes til mikrosporidia arbejde (f.eks larvebakker, overførsel pipetter, bure, æg indsamling kopper) er udpeget til microsporidia arbejde og ikke anvendes mere bredt i hele insektær. Alle opdræt materialer bør steriliseres med 10% blegemiddel efter brug og autoclaving kan bruges til at supplere blegemiddel sterilisation.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Spencer Blankenship for hjælp med myg opdræt. Vi takker også James N. Radl og M. Dominique Magistrado for nyttig feedback på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 - 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 - 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 - 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 - 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
- WHO. Yellow fever. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever (2019).
- WHO. Dengue and severe dengue. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Weaver, S. C. Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community. Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).
- Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection. Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).
- Becnel, J. J. Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , Adelaide, Australia. 20-24 (1990).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).
- Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).
- Hembree, S. C., Ryan, J. R. Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand. Mosquito News. 42, 49-54 (1982).
- Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).
- Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).
- Andreadis, T. G. Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes. Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).
- Becnel, J. J. Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms. Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).
- Undeen, A. H., Becnel, J. J. Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores. Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).
- Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. T. Automated mass rearing system for insect larvae. , Pub. No. US 2018/0092339 A1. USA (2018).
- Methods in Aedes Research. BEI Resources. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf (2016).
- Methods in Anopheles Research. BEI Resources. , Available from: https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf (2014).
- Desjardins, C. A., et al. Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes. Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).
- Hembree, S. C. Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand. Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).
- Solter, L. F., Becnel, J. J., Vávra, J. Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Elsevier Ltd. 329-371 (2012).
- Becnel, J. J., Undeen, A. H. Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).
