Summary
Ett protokoll för att odla mikrosporidian parasiten Edhazardia aedis. Parasiten är passaged från en generation av Aedes aegypti myggor till nästa via horisontell överföring på larvstadiet följt av vertikal överföring på vuxenstadiet. Levande sporoplasms överleva långsiktiga i infekterade ägg.
Abstract
Edhazardia aedis är en microsporidian parasit av Aedes aegypti myggor, en sjukdom vektor som överför flera arboviruses som orsakar miljontals sjukdomsfall varje år. E. aedis orsakar dödlighet och minskad reproduktiv kondition i myggvektorn och har undersökts för sin potential som ett biocontrol-medel. Det protokoll vi presenterar för odling E. aedis är baserat på dess naturliga infektionscykel, som innebär både horisontell och vertikal överföring i olika livsstadier av myggvärden. Ae. aegypti myggor exponeras för sporer i larvstadiet. Dessa infekterade larver mognar sedan till vuxna och överför parasiten vertikalt till deras avkomma. Infekterade avkommor används sedan som en källa till sporer för framtida horisontell överföring. Culturing E. aedis kan vara utmanande för den oinvigde med tanke på komplexiteten i parasitens livscykel, och detta protokoll ger detaljerad vägledning och visuella hjälpmedel för förtydligande.
Introduction
Aedes aegypti är myggvektor av flera arbovirus (t.ex. denguefeber, Zika, gula febern) som tillsammans beräknas stå för hundratals miljoner sjukdomsfall varje år och mer än 30.000 dödsfall1,2. Behandling för sjukdomar som orsakas av dessa patogener är begränsad till stödjande vård och det är troligt att ytterligare arbovirus kommer att dyka upp i framtiden3. Kontroll av myggvektorn är därför av primär betydelse, eftersom den effektivt förhindrar överföring av nuvarande och framväxande patogener4. Traditionellt använder vektorkontrollstrategier främst kemiska insekticider, men resistens mot många vanliga insekticider har drivit efterfrågan på nya metoder för vektorkontroll. En potentiell agent som har utforskats för sina biocontrol egenskaper mot Ae. aegypti är parasiten Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, först identifierades som Nosema aedis av Kudo 1930, är en microsporidian parasit av Ae. aegypti myggor7. Utvecklingen och reproduktionen av E. aedis är relativt komplex och dess livscykel kan gå tillväga på flera sätt7,8,9. En gemensam utvecklingscykel beskrivs ingående i Becnel et al., 19897 och utnyttjas för laboratorieutbredning (figur 1)8. Kortfattat börjar cykeln när Ae. aegypti ägg vertikalt infekterade med E. aedis kläcks till infekterade larver som utvecklar uninucleate sporer i fettkroppen, och brukar dö som larver eller poppar. Uninucleate sporer som frigörs från döda larver förorenar livsmiljön och intar av friska Ae. aegypti larver. Dessa sporer gror främst i matsmältningskanalen, infekterar matsmältningsvävnaden hos de exponerade larverna, vilket resulterar i horisontell överföring. Horisontellt infekterade larver utvecklas till vuxna (föräldrageneration) där binukleatesporer bildas. Hos honan invaderar dessa binukleatesporer reproduktionskanalen och deras associerade sporoplasma infekterar utvecklande äggceller. Dessa ägg kläcks sedan till infekterade larver (filial generation), vilket resulterar i vertikal överföring av parasiten och fortsättning av cykeln enligt ovan.
Flera studier har undersökt potentialen hos E. aedis för biocontrol. Infektion med E. aedis har visats resultera i minskad fortplantningsförmåga hos Ae. aegypti-honor 10. Vidare, i ett semi-fält experiment, resulterade inundative frisättning av E. aedis i total utrotning av ett test Ae. aegypti befolkningen hålls inom en skärmad kapsling6. Medan kunna genomgå några stadier av utveckling i en mångsidig uppsättning myggarter, är E. aedis endast vertikalt överförs i Ae. aegypti, vilket tyder på en hög grad av värd specificitet11,12. På samma sätt, i en laboratoriebedömning av den potentiella miljörisken i samband med E. aedis, microsporidian parasiten misslyckades med att infektera icke-mål vattenlevande fauna, inklusive rovdjur som intagen Ae. aegypti larver infekterade med E. aedis13. Dessa resultat belyser potentialen för E. aedis att användas i biologiska bekämpningsstrategier som riktar sig till naturliga Ae. aegypti populationer.
Trots att E. aedis visar löfte för användning i vektorkontroll, det finns utmaningar att kulturing och distribuera den i stor skala. E. aedisspor förlorar smittsamhet på mindre än en dag vid kalla temperaturer (dvs. 5 °C). Även vid varmare temperaturer (dvs. 25 °C), sporer förlorar snabbt smittsamhet under loppet av tre veckor14. Dessutom måste E. aedis odlas i levande Ae. aegypti myggor och kontrollerad dosning av friska larvmyggor är nödvändigt för att säkerställa slutförandet av livscykeln och för att förhindra kollaps av befolkningen som används för kultur8. Kravet på in vivo culturing utgör en utmaning; dock de senaste framstegen inom myggmassa uppfödning och robotteknik (t.ex. Massaro et al.15) skulle kunna möjliggöra storskaliga generationen av E. aedis sporer. Vi räknar med att visualisering av denna metod kommer att öka tillgängligheten till E. aedis uppfödning protokoll och tillåta fler forskare att undersöka den grundläggande biologi och tillämpad potential i detta system. Vi räknar också med att det kommer att underlätta ökade samarbeten med ingenjörer, robotister och den bredare tekniksektorn, som kan bidra till att förbättra massuppfödning av E. aedis.
Figur 1: E. aedis förökning i Ae. aegypti. Förökning av E. aedis börjar med kläckning E. aedis infekterade ägg. Infekterade larver föds upp till 4th instar, E. aedis sporer är isolerade från de larverna, och sporerna används för att peroralt infektera friska 2nd/3rd instar larver som föds upp från en icke-infekterad koppling av ägg (horisontell överföring). Dessa peroralt infekterade larver föds sedan upp till vuxen ålder (föräldrageneration) och lägger ägg som infekterats med E. aedis (vertikal överföring). Infekterade ägg (filial generation) kläcks sedan för att fortsätta infektionscykeln och parasitkulturen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Protocol
1. Dag 0
- Hatch Ae. aegypti ägg infekterade med E. aedis genom att placera i larv uppfödning facket med 1 L avjoniserat (DI) vatten. Tillsätt 50 mg fiskmat.
OBS: Vid tidpunkten för offentliggörandet, är ett laboratorium stam av E. aedis endast tillgänglig från laboratorier som aktivt forskar parasiten, som E. aedis är inte mottaglig för långtidslagring och infekterade ägg för närvarande inte lagras i förråd. Forskare som är intresserade av att arbeta med E. aedis kan kontakta motsvarande författare för att begära infekterade ägg.
OBS: Kläckning stort antal infekterade ägg är i allmänhet inte nödvändigt; tio E. aedis infekterade Ae. aegypti larver är tillräckliga för att dosera ≥ 1000 friska larver.
OBS: För alla delar av detta protokoll inhyste vi myggor vid följande förhållanden: 14 h/10 h ljus/ mörk cykel, 27 °C temperatur och 80% relativ luftfuktighet.
2. Dag 1
- Efter kläckning, minska tätheten av larver till ~ 100 larver per bricka, vilket gör nya brickor som behövs (även med 1 L DI-vatten).
- Lägg till en bit torr kattmat till varje bricka. Fylla på mat när utarmat, men inte ger ett överskott av mat. En bit kattmat (~ 200 mg) var tredje dag är tillräcklig.
OBS: Justera matmängden beroende på de specifika uppfödningsförhållandena (dvs. minska föda om vatten blir grumligt eller larver dör, öka maten om larver är kraftigt fördröjda i utvecklingen). Andra utfodringsregimer och/eller uppfödningsförhållanden än de som föreslås här kan användas men justeringar av tidpunkten för detta standardprotokoll kan behövas.
3. Dagar 4\u20125
- När infekterade larver är 3rd – 4th instars, kläcker friska/ oinfekterade Ae. aegypti ägg i en ny bricka.
- Bak vid tätheter så att friska Ae. aegypti nå 2nd – 3:e instar i 48–72 h. I våra händer kan detta uppnås med hjälp av tätheter av 200\u2012300 larver per 1 L vatten med ad libitum tillgång till mat. Kläckningssatser av friska ägg under flera dagar kan garantera att larver är i rätt skede när det behövs.
4. Dagar 7\u20128: Horisontell överföring
OBS: Dosning av friska larver med E. aedis kan inte utföras förrän uninucleate sporer är på höga tal hos infekterade larver (1 x 104 – 1 x 106 per larv). Detta sker sent i den 4 instar-stadiet (Bild 2).
- Skörda och kvantifiera ennuklet sporer.
- Använd en överföringspipett (man kan behöva skära spetsen till en bredare diameter) för att flytta 10 infekterade larver till ett 1,5 mL mikrocentrifugrör.
- Ta bort avelsvatten med en överföringspip och tvätta en gång genom att tillsätta ~1 mL rent DI-vatten. Ta bort tvättvattnet med en pipet, tillsätt 500 μL rent DI-vatten till de 10 larverna och homogenisera med hjälp av en mortelstöt och mekanisk homogenisator.
- Kvantifiera sporer med hjälp av en hemocytometer vid 400x förstoring.
OBS: Uninucleate sporer kan identifieras genom sin distinkta pyriform form (dvs, päron form; Bild 2A).
- Dos friska Ae. aegypti larver med E. aedis.
- Gör färsk larvmatslam genom att blanda 1,2 g leverpulver, 0,8 g bryggerjäst och 100 mL vatten.
OBS: Mat behöver inte vara färsk om den autoklaveras och förvaras vid 4 °C tills användning. - Överför 100 2nd – 3rd instar friska Ae. aegypti larver i 150 mL bägare eller bilagskoppar.
- Dosera varje bägare på 100 larver med 5 x 104 – 1 x 105 sporer.
- Tillsätt 2 mL larvmatslam och DI-vatten till en slutvolym på 100 mL.
- Gör färsk larvmatslam genom att blanda 1,2 g leverpulver, 0,8 g bryggerjäst och 100 mL vatten.
- Efter 12–24 h exponering, överför exponerade larver till uppfödningsbrickor och bakre till vuxen ålder efter ett standarduppfostransprotokoll16.
5. Övervakning och vertikal överföring
- Övervaka dosade larver för pupation och överför puppor när de utvecklas till en uppkomstbägare i en bur. Sockerfoder vuxna ad libitum (enligt16,17). Eclosing vuxna kommer att smittas av E. aedis.
- Blodfoder vuxna (enligt16,17) och samla ägg. Vertikal överföring av E. aedis sker vid detta steg.
OBS: Om ytterligare blodmåltider tillhandahålls så snart ovipositionen är klar, kan honorna lägga minst en ytterligare koppling av ägg innan vuxna drabbas av (ofta plötsliga) höga dödlighetsnivåer. - Använd dessa Ae. aegypti ägg infekterade med E. aedis att fortsätta förökningen börjar med steg 1 i detta protokoll.
OBS: Ägg kan förvaras i 2 – 3 månader under lämpliga förhållanden16. - Rengör alla material som kom i kontakt med E. aedis med 10% blekmedel och autoklavering (om möjligt) för att förhindra kontaminering.
Representative Results
E. aedis smittade Ae. aegypti Liverpool (LVP1b12) ägg kläcktes enligt beskrivningen i protokollet ovan. I4:e instar-stadiet kunde man observera visuella tecken på infektion, inklusive vita sporecystor i hela de infekterade larvernas fettkroppar (ett exempel på denna fenotyp visas i figur 2B). Uninucleate sporer skördades från 4th instar larver genom homogenisering 10 larver i 500 μL DI vatten. Dessa sporer var pyriform (päronformad) och lätt synliga vid 400x (Figur 2A). Med hjälp av en hemocytometer beräknades ett sporantal på 4,05 x10 3 sporer/μL. Hundra friska Ae. aegypti larver var sedan horisontellt infekterade med ~ 50.000 sporer i 100 mL vatten för en slutlig dos av ~ 500 sporer / larva. Larver var uppfödda till vuxen ålder (föräldrageneration) och blod utfodras med hjälp av defibrinated kanin blod plus 1% (v/v) 100 mM adenosintrifosfat. Vertikalt infekterade ägg samlades in (filial generation) och kläckts för att fortsätta E. aedis förökning och att kvantifiera infektion framgång.
Vid sju dagar efter kläckning överfördes 25 filial generation larver till enskilda 1,5 mL microcentrifug rör och tvättas en gång med DI vatten. Enskilda larver var homogeniserade i 250 μL av DI vatten och infektion status och E. aedis laster bedömdes med hjälp av en hemocytometer. Vertikal infektionsfrekvens av E. aedis i filial generationen konstaterades vara 96% och medelvärdet spor belastning av infekterade individer vid sju dagar efter kläckning var 3,31 x 105 (Intervall: 3,25 x 104 – 1,47 x 106; Bild 3).
Figur 2: Visualisering av E. aedisinfektion i Ae. aegypti myggor. (A) E. aedis uninucleate pyriform sporer. Tio E. aedis smittade 4th instar larver var homogeniserade i 500 μL di vatten cirka sju dagar efter kläckning. 10 μL av homogenatet var laddat på en hemocytometer och sett på 400X. Röda pilar indikerar representativa uninucleate E. aedis sporer. (B) E. aedis smittade 4th instar larver utveckla särskiljande vita spor cystor i hela sin fettkropp18. De har också ofta missbildade och utspänd buksegment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Kulturprotokollet leder till effektiv E. aedisinfektion i filialgenerationen. Ae. aegypti larver (n = 25) från filial generationen var homogeniserade individuellt i 250 μL DI vatten och 10 μL av homogenatet var lastas på en hemocytometer. Förekomst av uninucleate sporer anges en positiv infektion och sporer kvantifierades för alla positiva prover. (A) Infektionsprevalens bland filiallarver. Grå motsvarar oinfekterade larver, och svart till infekterade. Siffror som visas på varje segment ger den absoluta räkningen av individer i varje grupp. (B) Spore belastning för varje infekterad individ. Svarta punkter representerar log10 omvandlade uninucleate spor räkna för varje larva. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Vi presenterar här den metod som ursprungligen beskrevs i Hembree och Ryan, 19828 för uppfödning E. aedis microsporidia i Ae. aegypti myggor. Stammen av E. aedis som används i denna studie härleddes från den ursprungliga fältsamlingen av Stephen Hembree i Thailand 197919. Metoden kapitaliserar på horisontell överföring, vilket naturligt förekommer i transmissionscykeln av E. aedis7, för att föröka parasiten på ett kontrollerat sätt. Denna metod kan vara utmanande för nykomlingar som inte är bekanta med spor utseende, symtom på infektion i larver, eller den samordning som krävs för att framgångsrikt slutföra flera steg uppfödning/dosing protokollet. Vår förhoppning är att de visuella hjälpmedel som åtföljer detta protokoll kommer att minska hindren för inträde för forskare som vill kultur E. aedis.
Vi propagerade E. aedis i Ae. aegypti som beskrivs ovan och kvantifierade framgång parasiterar i filial generation. Kortfattat kläckte vi E. aedis infekterade Ae. aegypti ägg, uppfödda dem till 4:e instar och samlade in uninucleate E. aedis sporer från de infekterade larverna. Vi sedan horisontellt infekterade friska larver med dessa sporer via oralt intag, och uppfödda de horisontellt infekterade larverna till vuxen ålder. Vi blod utfodras de smittade vuxna (parental generation) och samlade ägg (filial generation), som vi hypotetiska skulle vara vertikalt infekterade med E. aedis parasiten. Vi kläckte ägg från filialgenerationen och samlade in och homogeniserade en delmängd av larverna när de var4:e instjärnor. Vi kvantifierade procenten av larver som var infekterade med E. aedis och den totala sporantalet hos alla infekterade individer. Vi fann att de allra flesta (96%) av individer smittades och medelvärdet spor belastning av infekterade larver var ~ 105. Vi dra slutsatsen att vår uppfödning protokoll resulterade i mycket framgångsrik förökning av E. aedis i Ae. aegypti myggor.
Det finns flera aspekter av detta protokoll som kan vara särskilt utmanande för den oinvigde användaren. Vi erbjuder nedan några ytterligare information som kan vara av hjälp. För frågor om allmän mygguppfödning, en komplett guide till Ae. aegypti koloni underhåll är utanför ramen för detta protokoll. Men många vanliga frågor kan åtgärdas genom resurser från Biodefense och Emerging Infections Research Resources Repository16,17 inklusive ägg kläckning, allmänna kostbehov, bostäder och miljöförhållanden, och blod utfodring. När det gäller tidslinjen för infektion, visar larver som kläckts från infekterade ägg inte tecken på infektion förrän sent i den4: e instar-stadiet. Uninukleerade sporer dyker upp snabbt, under loppet av 1–2 dagar. Larver kan visas praktiskt taget oinfekterade vid 6 dagar efter kläckning men mycket infekterade av dag 7 eller 8 efter kläckning. Dessutom kan det vara utmanande att visualisera sporer i homogeniserade prover eftersom det finns många andra mikrober som finns i hela mygga homogenates, inklusive andra eukaryota encelliga organismer (t.ex. jäst) av liknande storlek som E. aedis uninucleate sporer. Den särskiljande formen av E. aedis sporer (Figur 2A) är en mycket tillförlitlig metod för identifiering och kommer att bidra till att skilja E. aedis från andra mikrober i homogenatet. Även om det inte är nödvändigt för identifiering eller kvantifiering, om sporrening önskas, kan det uppnås via kolloidal kiseldioxid densitet gradient centrifugering som kommer att möjliggöra separation av E. aedis sporer från andra förorenande element i homogenatet. Denna process beskrivs i detalj i Solter et al.20.
Temperatur och kost som används i uppfödning praxis skiljer sig ofta mellan laboratorier, men variationer kommer sannolikt fortfarande att ge framgångsrik parasit förökning. Mindre skillnader i larvmattyp stör inte lyckad infektion, även om vi inte uttryckligen testade olika livsmedelstyper i detta protokoll. Effekten av temperaturen på infektion har testats och E. aedis infektion befanns vara robust vid ett brett spektrum av temperaturer21. Maximal sporproduktion skedde vid 30,8 °C men var fortfarande robust vid uppfödningstemperaturer så låga som 20 °C. Sporräkningen reducerades dramatiskt vid högre uppfödningstemperaturer (36 °C), därför bör dessa temperaturer undvikas för detta protokoll.
Kontaminering är alltid ett problem när man arbetar med parasiter. E. aedis är en framgångsrik parasit av Ae. aegypti och måste därför hållas åtskilda från icke-infekterade laboratoriekolonier för att förhindra kontaminering. Vi rekommenderar förvaring av infekterade myggor i en separat inkubator om möjligt. Vi rekommenderade också att material som används för microsporidia arbete (t.ex. larv brickor, överföring pipets, burar, ägg samling koppar) är avsedda för microsporidia arbete och inte används mer allmänt i hela insekts- och insekts- och insekts- . Alla uppfödningsmaterial bör steriliseras med 10% blekmedel efter användning och autoklavering kan användas för att komplettera blekmedelsterilisering.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Spencer Blankenship för hjälp med mygguppfödning. Vi tackar även James N. Radl och M. Dominique Magistrado för hjälpsamma synpunkter på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 - 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 - 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 - 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 - 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
- WHO. Yellow fever. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever (2019).
- WHO. Dengue and severe dengue. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Weaver, S. C. Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community. Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).
- Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection. Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).
- Becnel, J. J. Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , Adelaide, Australia. 20-24 (1990).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).
- Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).
- Hembree, S. C., Ryan, J. R. Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand. Mosquito News. 42, 49-54 (1982).
- Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).
- Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).
- Andreadis, T. G. Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes. Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).
- Becnel, J. J. Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms. Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).
- Undeen, A. H., Becnel, J. J. Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores. Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).
- Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. T. Automated mass rearing system for insect larvae. , Pub. No. US 2018/0092339 A1. USA (2018).
- Methods in Aedes Research. BEI Resources. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf (2016).
- Methods in Anopheles Research. BEI Resources. , Available from: https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf (2014).
- Desjardins, C. A., et al. Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes. Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).
- Hembree, S. C. Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand. Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).
- Solter, L. F., Becnel, J. J., Vávra, J. Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , Elsevier Ltd. 329-371 (2012).
- Becnel, J. J., Undeen, A. H. Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).
