Summary
이중 래스터 스캐닝 광음향 이미저를 설계하여 와이드 필드 이미징과 실시간 이미징을 통합했습니다.
Abstract
작은 동물에 혈관 네트워크의 화상 진찰은 기본적인 생물 의학 연구에서 중요한 역할을 했습니다. 광음향 이미징 기술은 작은 동물의 이미지학에 적용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 작은 동물의 넓은 분야 광음향 이미징은 높은 현면 해상도, 깊은 침투 및 여러 대조를 가진 이미지를 제공 할 수 있습니다. 또한, 실시간 광음향 영상 시스템은 작은 동물 생리적 특징의 동적 모니터링을 연구하는 데 사용될 수 있는 작은 동물 혈관의 혈역학적 활동을 관찰하는 것이 바람직하다. 여기에, 이중 래스터 스캐닝 광음향 이미저를 제시, 전환 이중 모드 이미징 기능을 특징으로. 넓은 시야 이미징은 2차원 전동 번역 단계에 의해 구동되며 실시간 이미징은 갈바노미터로 실현됩니다. 다양한 매개 변수 및 이미징 모드를 설정하여 작은 동물 혈관 네트워크의 생체 내 시각화를 수행할 수 있습니다. 실시간 이미징은 약물 유도 등의 펄스 변화 및 혈류 변화를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 넓은 필드 화상 진찰은 종양 혈관의 성장 변경을 추적하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이들은 기본적인 생물 의학 연구의 각종 분야에서 채택되기 쉽습니다.
Introduction
기본 생물 의학 분야에서, 작은 동물은 인간의 생리 적 기능을 시뮬레이션 할 수 있습니다. 따라서, 작은 동물 화상 진찰은 인간 동종 질병의 연구를 지도하고 효과적인 처리를 찾는 데 중요한 역할을한다 1. 광음향 영상(PAI)은 광학 영상 및 초음파 이미징2의장점을 결합한 비침습적 이미징 기술이다. 광음향 현미경 검사법(PAM)은 작은 동물의 기초 연구를 위한 귀중한 이미징방법이다 3. PAM은 광학 여기 및 초음파 검출4를기반으로 고해상도, 심층 침투, 고특이성 및 고대비 이미지를 쉽게 얻을 수 있습니다.
특정 파장을 가진 펄스 레이저는 조직의 내인성 크로모포러스에 의해 흡수됩니다. 이어서, 조직의 온도가 상승하여 사진 유발 초음파의 생산이 초래됩니다. 초음파는 초음파 트랜스듀서에 의해 검출 될 수있다. 신호 획득 및 이미지 재구성 후 흡수제의 공간 분포를 얻을 수 있다5. 한편으로는, 전체 기관 혈관 네트워크의 시각화는 넓은 시야를 요구합니다. 넓은 필드 스캐닝 과정은 일반적으로 고해상도6,7,8을보장하는 데 오랜 시간이 걸립니다. 다른 한편으로는, 작은 동물의 혈역학 활동을 관찰하는 것은 빠른 실시간 화상 진찰을 요구합니다. 실시간 이미징은 작은 동물의 생명 징후를 실시간으로9,10,11로연구하는 데 유익합니다. 실시간 이미징의 시야는 일반적으로 높은 업데이트 속도를 보장하기에 충분히 작습니다. 따라서, 종종 넓은 시야와 실시간 이미징을 달성하는 것 사이에는 절충이 있습니다. 이전에는 광시야 이미징 또는 실시간 이미징에 각각 2개의 서로 다른 시스템이 사용되었습니다.
이 작품은 2차원 전동 번역 단계와 2축 갈바노미터 스캐너를 기반으로 한 실시간 이미징을 기반으로 하는 와이드 필드 이미징을 통합한 이중 래스터 스캐닝 광음향 이미저(DRS-PAI)를 보고합니다. 광시야 이미징 모드(WIM)는 혈관 형태를 보여주기 위해 수행됩니다. 실시간 이미징 모드(RIM)의 경우 현재 두 가지 기능이 있습니다. 먼저 RIM은 실시간 B 스캔 이미지를 제공할 수 있습니다. 깊이 방향을 따라 혈관의 변위를 측정함으로써 호흡 또는 펄스의 특성이 드러낼 수 있습니다. 둘째, RIM은 WIM 이미지의 특정 영역을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 로컬 WIM 지역의 유사한 이미지를 제공함으로써 로컬 변경 내용을 정확하게 밝힐 수 있습니다. 이 시스템은 혈관 시각화의 넓은 현장 이미징과 로컬 동적의 실시간 이미징 사이의 유연한 전환을 설계합니다. 이 시스템은 작은 동물 화상 진찰에 대한 필요가 있는 기본적인 생물 의학 연구에서 바람직합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 중국 광저우 주 사우스 차이나 사범 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 제공하는 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 시스템 설정
- 광학 경로(도 1)
- 시스템 레이저 소스로 532 nm 펄스 레이저를 사용합니다. 레이저의 반복 속도를 10kHz로 설정하고, 출력 에너지는 100%로 설정하고, 트리거 설정을 사용자 정의 프로그램을 사용하여 외부 트리거로 설정합니다.
- 광섬유 커플러(FC1)를 통해 레이저 빔을 단일 모드 섬유(SMF)에 결합합니다. 2차원 동력 단계(모터, 최대 속도: 20mm/s)에서 광섬유 콜리메이터(FC2)를 사용하여 레이저 빔을 콜리메이트합니다.
- 2축 갈바노미터 스캐너(갈바)를 사용하여 레이저 빔을 편향시하십시오. 이동 가능한 미러(M1)를 사용하여 빔을 반사합니다. 4× 목표 렌즈를 통해 빔에 초점을 맞춥니다(OL, 숫자 조리개: 0.1).
- XY 번역기 마운트(TM)를 사용하여 자체 제작 중공 초음파 트랜스듀서(UT, 중앙 주파수: 25MHz)를 수정합니다. 대역폭: 90% 이상; 중앙 구멍 : OL12의하단에 3mm) . 초음파 트랜스듀서의 중앙 구멍을 통해 집중 빔을 전달합니다.
- 경로 스캔
- WIM 동안 필드 프로그래밍 가능한 게이트 어레이(FPGA 2)를 사용하여 Galva를 잠급니다. 사용자 정의 프로그램을 통해 적절한 검색 범위 및 스캔 속도를 설정합니다.
- RIM 동안 필드 프로그래밍 가능한 게이트 어레이(FPGA 1)를 사용하여 모터를 잠급니다. FPGA 2를 사용하여 스캔 빈도 및 스캔 포인트 수를 설정합니다. 사용자 정의 프로그램을 사용하여 시작 및 스캔 중지를 제어합니다.
- 데이터 수집
- 50dB 증폭기(AMP)를 사용하여 PA 신호를 증폭시합니다. DAQ(데이터 수집 카드)로 신호를 디지털화합니다. FPGA 1 또는 FPGA 2를 통해 트리거 신호를 가져옵니다.
- 그래픽 처리 장치(GPU)를 사용하여 데이터를 처리하고 이미지를병렬로 표시합니다(13)
- CCD 이미징 시스템
- 링 모양의 흰색 LED(색상 온도: 6500 K; 점도: 40000 럭스; 직경: 7.5cm) 조명 소스로. M1을 제거하고 고정 거울(M2)을 사용하여 빛을 반사합니다.
- PA 이미징 시스템에서 CCD 카메라(630만 화소)를 사용하여 이미지를 기록합니다. 디스플레이 소프트웨어로 이미지를 표시합니다.
2. 시스템 정렬
- 물 탱크 (10cm × 10cm × 4.4 cm; 하단 창: 3 cm × 3 cm)를 선택합니다. 폴리에틸렌 멤브레인(멤브레인 두께: 10 μm)을 사용하여 전체 물 탱크를 덮습니다. 충분한 초순수물을 추가합니다.
- 작업 단계에 물 탱크를 놓습니다.
- 레이저 스위치를 켭니다. 레이저 제어 프로그램을 선택합니다. 5 분 동안 예열. 펌핑 스위치의 "ON" 버튼을 누릅니다. 레이저 매개 변수를 단계 당 1.1.1로 설정합니다. 레이저의 배플을 엽니다.
- A라인 수집 프로그램을 선택합니다. "시작" 버튼을 눌러 단일 점 신호를 캡처하고 현재 A라인 신호의 진폭과 스펙트럼을 표시합니다.
- 물 탱크의 바닥에 블레이드를 놓습니다. 어쿠스틱 커플링을 위해 수조에 UT의 하단 부분을 담급하십시오. UT의 하단 부분에 거품을 피하십시오.
- 갈바의 위치를 조정하고, UT와 OL 간에 XY 번역기를 조정하여 진동 신호를 피하고, 이것이 공초점인지 확인합니다.
- 작업 단계의 높이를 조정하여 신호의 진폭을 최대화하고 초점 위치를 결정합니다.
3. 동물 실험
- 20\u201230 g의 체중이 있는 5\u20126 주 된 BALB/c 마우스를 사용하십시오.
- 실험 전에 우레탄(1g/kg)을 사용하여 동물을 마취시화한다.
- WIM과 RIM 간의 전환을 수행합니다.
- 평면 초음파 트랜스듀서를 사용합니다. 트리머와 탈모 크림을 사용하여 마우스 뒷면의 모피를 면도합니다. 마우스를 홀더(8cm × 2.8cm × 2cm)에 놓습니다.
- 화상 진찰 영역이 초음파 젤을 사용하여 폴리에틸렌 멤브레인과 접촉하도록 허용하십시오. 접촉 부분에서 거품을 피하십시오.
- 음향 커플링을 위해 작업 단계에 홀더를 배치합니다. 2.3\u20122.4 단계를 수행하여 레이저를 시작하고 A라인 신호를 수집합니다. 2.6\u20122.7 단계를 따라 정렬합니다. 정렬 후 컬렉션을 종료하려면 "중지"를 누릅니다.
- WIM 프로그램을 선택합니다. 새로 만든 폴더의 이름을 지정합니다. "스캐닝 속도" 탭의 스캔 매개변수를 20mm/s로 설정하고, "스캐닝 영역" 탭의 "20mm*20mm", "단계" 탭에서 "20"으로 설정합니다. 수집 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
- 중지 버튼을 클릭하여 획득 후 스캔을 종료합니다. 0으로 돌아가기를 클릭하여 모터를 0으로 가져옵니다. 레이저 배플을 닫습니다. 트리거 설정을 내부 트리거로 설정합니다. 스위치를 펌핑하기 위해 OFF 버튼을 누릅니다.
- WIM 트리거를 RIM 트리거로 교체하고 외부 레이저 트리거에 연결합니다. 스위치를 펌핑하기 위해 ON 버튼을 누릅니다. 트리거 설정을 외부 트리거로 설정합니다. 종료 버튼을 클릭하여 WIM 프로그램을 종료합니다.
- 2.4 단계를 사용하여 A라인 신호를 수집합니다. 레이저 배플을 엽니다. 2.6\u20122.7 단계를 따라 정렬합니다. 정렬 후 컬렉션을 종료하려면 중지를 누릅니다.
- RIM 프로그램을 선택합니다. 새로 만든 폴더의 이름을 지정합니다. 수집 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
- 수집을 완료한 후 스캐닝을 종료하려면 중지 버튼을 클릭합니다. EXIT 버튼을 클릭하여 RIM 프로그램을 종료합니다.
- 화상 진찰의 결론에 자궁 경관 탈구를 사용하여 동물을 안락사시.
- 혈관 시각화의 WIM을 수행합니다.
- 집중 초음파 트랜스듀서를 사용하소서(중앙 주파수: 25MHz; 대역폭: 90% 이상; 초점 거리 : 8mm). 마우스 귀 또는 두피의 머리카락을 제거합니다.
- 메스를 사용하여 마우스의 두개골 측두엽의 측면(두개골에 대한 깊이)의 측면에 작은 절개를 합니다. 안과 가위를 사용하여 이 절개부터 시작합니다. 두개골의 바깥쪽 주위에 두피를 자른다. 출혈 점을 압축하여 출혈을 멈춥춥시다. 정상적인 식염수로 상처를 씻으시다. 마우스를 홀더에 놓습니다.
- 화상 진찰 영역이 초음파 젤을 사용하여 폴리에틸렌 멤브레인과 접촉하도록 허용하십시오. 접촉부위(보충도 1)에서거품을 피하십시오.
- 음향 커플링을 위해 작업 단계에 홀더를 배치합니다. 2.3\u20122.4 단계를 사용하여 레이저를 열고 A 라인 신호를 수집합니다. 2.6\u20122.7 단계를 사용하여 정렬합니다. 정렬 후 컬렉션을 종료하려면 중지를 누릅니다.
- WIM 프로그램을 선택합니다. 새로 만든 폴더의 이름을 지정합니다. "스캐닝 속도" 탭에서 스캐닝 매개변수를 "10mm/s", "스캐닝 영역" 탭 아래에 "10mm*10mm", "단계" 탭에서 "10"으로 설정합니다. 수집 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
- 수집을 완료한 후 스캐닝을 종료하려면 중지 버튼을 클릭합니다. 0으로 돌아가기를 클릭하여 모터가 0으로 돌아오도록 합니다. 종료 버튼을 클릭하여 WIM 프로그램을 종료합니다.
- 동물이 마취 하에 있는 동안 시술의 결론에 동물을 안락사.
- 집중 초음파 트랜스듀서를 사용하소서(중앙 주파수: 25MHz; 대역폭: 90% 이상; 초점 거리 : 8mm). 마우스 귀 또는 두피의 머리카락을 제거합니다.
- 작은 동물의 동적 모니터링을 위해 RIM을 수행합니다.
- 마우스 복부의 머리카락을 면도합니다. 마우스를 홀더에 놓습니다.
- 화상 진찰 영역이 초음파 젤을 사용하여 폴리에틸렌 멤브레인과 접촉하도록 허용하십시오. 접촉 영역에서 거품을 피하십시오.
- 음향 커플링을 위해 작업 단계에 홀더를 배치합니다. 단계 2.3\u20122.4를 수행하여 레이저를 시작하고 A라인 신호를 수집합니다. 2.6\u20122.7 단계를 수행하여 정렬합니다. 정렬 후 컬렉션을 종료하려면 중지를 누릅니다.
- RIM 프로그램을 선택합니다. 새로 만든 폴더의 이름을 지정합니다. 수집 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
- 수집을 완료한 후 스캐닝을 종료하려면 중지 버튼을 클릭합니다. EXIT 버튼을 클릭하여 RIM 프로그램을 종료합니다.
- RIM 데이터를 사용하여 사용자 정의 프로그램에 의한 깊이 방향을 따라 최대 진폭 투영(MAP)을 재구성합니다. 동물의 동적 변화를 관찰한다.
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Representative Results
DRS-PAI의 회로도는 도 1에표시됩니다. 이 시스템은 RIM을 통해 WIM 간에 유연하고 반복 가능한 전환을 가능하게 합니다. 획득한 PA 신호는 PA B-스캔 및 MAP 이미지를 생성하기 위해 신속하게 처리됩니다. CCD 카메라는 샘플 사진을 제공할 수 있습니다.
DRS-PAI의 모든 구성 요소는 이미저 설정(그림2)에통합및 조립되어 조립 및 조작이 용이합니다. WIM에서는 2차원 전동 단계의 연속 래스터 스캐닝이 사용됩니다. 실행 단계의 신호가 기록됩니다. 데이터 수집은 스테이지의 균일한 번역 중에 진행되었습니다. RIM에서 2축 갈바노미터 스캐너가 사용되었습니다. 데이터는 갈바 스캐닝(그림3)과동기적으로 수집되었다.
여기서, 각 이미징 모드를 가진 견본의 혈관 심상이 집합되었다. 도 4A는 WIM에서 마우스의 MAP 이미지를 다시 보여줍니다. 이미징 시간은 약 33분이었습니다. 그림 4B는 RIM 동안 마우스의 B 스캔 이미지를 보여줍니다. RIM의 전체 프로세스는 비디오 1에표시됩니다. 그런 다음, 집중 된 초음파 트랜스듀서가 사용되었습니다. 마우스 귀와 뇌의 혈관 망은 도 5에도시된다. 이미징 시간은 약 16 분이었습니다. 이는 DRS-PAI가 넓은 필드 혈관을 이미지화하는 능력을 보여줍니다. 또한, 도 6A는 이미징 범위에 혈관이 포함되어 있음을 보여준다. RIM의 이미징 범위는 중성 초음파 트랜스듀서의 사용으로 인해 약 100 μm입니다. 마우스 복부의 깊이 방향을 따라 시간 대 시간 6B에배위 이미지가 표시됩니다. 비디오 2는 혈관 변위 과정을 보여주고 현재 펄스 또는 호흡 곡선을 얻는 과정을 보여줍니다.
그림 1: DRS-PAI 시스템의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DRS-PAI 시스템의 설계.
(A)DRS-PAI 시스템의 사진. (B)패널은 레이저 경로 조립을 위한 설정 사진을 나타낸다. (C)패널은 레이저 경로 조립을 위한 3D 모델을 나타낸다. (D)패널은 2축 고속 갈바노미터 스캐너 어셈블리를 나타낸다. (E)패널은 프로브 어셈블리를 나타낸다. (F)패널은 CCD 광학 경로 어셈블리를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다양한 이미징 모드에 대한 검사 설정입니다.
(A)WIM의 스캔 경로. (B)RIM의 스캔 경로. (C)두 개의 이미징 모드의 트리거 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 마우스 뒷면의 광음향 WIM 및 RIM입니다.
(A)WIM에서 마우스의 MAP 이미지. (B)RIM에서 마우스의 B 스캔 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 마우스의 광음향 WIM.
(A)WIM에서 마우스 귀의 MAP 이미지. (B)WIM에서 마우스 뇌의 MAP 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 마우스 복부의 광음향 림.
(A)RIM에서 마우스 복부의 B 스캔 이미지. (B)마우스 복부의 깊이 방향을 따라 있는 MAP 이미지대 RIM의 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 마우스 뒷면의 RIM 프로세스입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 마우스 복부의 깊이 방향을 따라 맵 이미지의 프로세스와 시간. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 폴리에틸렌 멤브레인과 접촉하는 이미징 영역의 일부입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 혈관의 구조와 혈액의 관련 동적 변화를 포착하기 위해 설계 및 개발된 비침습적 혈관 시각화를 위한 이중 래스터 스캐닝 광음향 소형 동물 심화를 제시했습니다. DRS-PAI의 장점은 WIM과 RIM을 하나의 시스템으로 통합하여 작은 동물의 혈관 동적 및 혈관 네트워크 구조를 보다 쉽게 연구할 수 있다는 것입니다. 이 시스템은 고해상도 광야 혈관 시각화 및 실시간 혈액 역학을 제공할 수 있습니다.
현재 시스템에서광학 발동은 단일 파장 광원으로 구현되었다. 미래의 다파장 시스템은 혈액 산소 포화와 같은 다른 매개 변수를 제공 할 것입니다. 또한 혈관 직경, 혈관 밀도, 혈관 투환 등을 추정하는 등 정량적 분석을 위해 특수 영상 처리 알고리즘을 개발할 수 있습니다. 정량 분석은 질병의 조기 진단 및 처리를 위한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.
요약하자면, 이 시스템은 연구자들이 생물의학적 관련성을 가진 작은 동물 연구에 대한 고차원적인 생리학적 및 병리학적 통찰력을 얻을 수 있게 합니다. 이 시스템은 혈관 신생, 종양 미세 환경, 혈역학, 뇌의 기능적 연결, 미세 순환, 약물 반응 및 치료 반응을 포함하지만 이에 국한되지 않는 대부분의 작은 동물 연구 설정에 적응할 수 있습니다. 프로토콜 내의 중요한 단계에는 이중 스캐닝 구조의 설계, WIM의 광학 및 음향 초점의 공초점 조정, RIM내 의 음장의 중심점 조정 등이 포함됩니다.
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Disclosures
모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 된 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 저자는 원고에 관련 재정적 이익이 없으며 공개 할 다른 잠재적 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 중국 국립 자연과학 재단(61822505; 11774101; 61627827; 81630046), 중국 광동성 과학 기술 기획 프로젝트(2015B02020233016), 광저우 의 과학기술 프로그램(20101년)의 재정 지원을 인정하고자 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 bit multi-purpose digitizer | Spectrum | M3i.3221 | Data acquisition card |
| A-line collected program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Amplifier | RF Bay | LNA-650 | Amplifier |
| Depilatory Cream | Veet | 33-II | Animal depilatory |
| Fiberport Coupler | Thorlab | PAF-X-7-A | Fiber Coupler |
| Field Programmable Gate Array | Altera | Cyclone IV | Trigger Control |
| Fixed Focus Collomation Packages | Thorlabs | F240FC-532 | Fiber Collimator |
| Foused ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Graphics Processing Unit | NVIDIA | GeForce GTX 1060 | Processing data |
| Holder | Self-made | Animal fixation | |
| Laser control program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | BALB/c | Animal Model |
| Microscope camera | Mshot | MS60 | CCD camera |
| Microscope Objective | Daheng Optics | GCO-2111 | Objective Lens |
| Mirror | Daheng Optics | GCC-1011 | Moveable/Fixed Mirror |
| Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner | Century Sunny | S8107 | real-time scanner |
| Mshot image analysis system | Mshot | Display software | |
| Normal Saline | CR DOUBLE-CRANE | H34023609 | Normal Saline |
| Ophthalmic Scissors | SUJIE | Scalp Remove | |
| Planar ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Plastic Wrap | HJSJLSL | Polyethylene Membrane | |
| Program Control Software | National Instrument | LabVIEW | User-defined Program |
| Pulsed Q-swithched Laser | Laser-export | DTL-314QT | 532-nm pulse Laser |
| Real-time imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Ring-shaped white LED | Self-made | ||
| Shaver | Codos | CP-9200 | Animal Shaver |
| Single-Mode Fibers | Nufern | 460-HP | Single-mode fiber |
| Surgical Blade | SUJIE | 11 | Blade |
| Surgical Scalpel | SUJIE | 7 | Scalp Remove |
| Translation Stage | Jiancheng Optics | LS2-25T | wide-field scanning stage |
| Ultrasonic Transducer | Self-made | ||
| Ultrasound gel | GUANGGONG PAI | ZC4252418 | Acoustic Coupling |
| Urethane | Tokyo Chemical Industry | C0028 | Animal Anestheized |
| Water tank | Self-made | ||
| Wide-field imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| XY Translator Mount | Self-made |
References
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- Baik, J. W., et al. Super wide-field photoacoustic microscopy of animal and humans in vivo. IEEE Transactions on Medical Imaging. 39 (4), 975-984 (2019).
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