Summary
Se diseñó un imager fotoacústico de escaneo ráster dual, que integró imágenes de campo amplio e imágenes en tiempo real.
Abstract
La toma de imágenes de redes vasculares en animales pequeños ha desempeñado un papel importante en la investigación biomédica básica. La tecnología de imágenes fotoacústicas tiene un gran potencial de aplicación en la imagenología de animales pequeños. Las imágenes fotoacústicas de campo ancho de animales pequeños pueden proporcionar imágenes con alta resolución espaciotemporal, penetración profunda y múltiples contrastes. Además, el sistema de imágenes fotoacústicas en tiempo real es deseable para observar las actividades hemodinámicas de la vasculatura de animales pequeños, que se puede utilizar para investigar el monitoreo dinámico de las características fisiológicas de los animales pequeños. Aquí, se presenta un imager fotoacústico de escaneo ráster dual, con una función de imagen en doble modo conmutable. La imagen de campo ancho es impulsada por una etapa de traducción motorizada bidimensional, mientras que las imágenes en tiempo real se realizan con galvanómetros. Al establecer diferentes parámetros y modos de imagen, se puede realizar una visualización in vivo de la red vascular de animales pequeños. Las imágenes en tiempo real se pueden utilizar para observar el cambio de pulso y el cambio de flujo sanguíneo de inducido por drogas, etc. Las imágenes de campo amplio se pueden utilizar para realizar un seguimiento del cambio de crecimiento de la vasculatura tumoral. Estos son fáciles de adoptar en varias áreas de la investigación básica de biomedicina.
Introduction
En el campo biomédico básico, los animales pequeños pueden simular la función fisiológica humana. Por lo tanto, la imagen de los animales pequeños desempeña un papel importante en la orientación de la investigación de las enfermedades homólogas humanas y la búsqueda de un tratamiento eficaz1. La imagen fotoacústica (PAI) es una técnica de imagen no invasiva que combina las ventajas de las imágenes ópticas y las imágenes por ultrasonido2. La microscopía fotoacústica (PAM) es un valioso método de imagen para la investigación básica de animales pequeños3. PAM puede obtener fácilmente imágenes de alta resolución, penetración profunda, alta especificidad y alto contraste basadas en excitación óptica y detección de ultrasonido4.
Un láser de pulso con una longitud de onda específica es absorbido por cromoforos endógenos de los tejidos. Posteriormente, la temperatura del tejido aumenta, lo que resulta en la producción de ondas ultrasónicas inducidas por foto. Las ondas ultrasónicas pueden ser detectadas por un transductor ultrasónico. Después de la adquisición de la señal y la reconstrucción de la imagen, la distribución espacial del absorbente se puede obtener5. Por un lado, la visualización de la red vascular de órgano entero requiere un amplio campo de visión. El proceso de escaneo de campo ancho suele tardar mucho tiempo en garantizar la alta resolución6,7,8. Por otro lado, observar las actividades hemodinámicas de los animales pequeños requiere imágenes rápidas en tiempo real. La imagen en tiempo real es beneficiosa para estudiar los signos vitales de los animales pequeños en tiempo real9,10,11. El campo de visión de las imágenes en tiempo real suele ser lo suficientemente pequeño como para garantizar una alta tasa de actualización. Por lo tanto, a menudo hay un equilibrio entre lograr un amplio campo de visión y imágenes en tiempo real. Anteriormente, se utilizaban dos sistemas diferentes para imágenes de campo amplio o imágenes en tiempo real, por separado.
Este trabajo informa de un imager fotoacústico de escaneo ráster dual (DRS-PAI), que integró imágenes de campo amplio basadas en una etapa de traducción motorizada bidimensional e imágenes en tiempo real basadas en un escáner de galvanómetros de dos ejes. El modo de imagen de campo ancho (WIM) se realiza para mostrar morfología vascular. Para el modo de imagen en tiempo real (RIM), actualmente hay dos funciones. En primer lugar, RIM puede proporcionar imágenes de escaneo B en tiempo real. Al medir el desplazamiento de la vasculatura a lo largo de la dirección de profundidad, se pueden revelar las características de la respiración o el pulso. En segundo lugar, el RIM puede medir cuantitativamente el área específica de la imagen WIM. Al proporcionar imágenes comparables de las regiones WIM locales, los detalles del cambio local se pueden revelar con precisión. El sistema diseña una transición flexible entre imágenes de campo amplio de visualización vascular e imágenes en tiempo real de la dinámica local. El sistema es deseable en la investigación biomédica básica donde hay una necesidad de imágenes de animales pequeños.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices proporcionadas por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Normal del Sur de China, Guangzhou, China.
1. Configuración del sistema
- Trayectoria óptica (Figura 1)
- Utilice un láser de pulso de 532 nm como fuente láser del sistema. Establezca la tasa de repetición del láser en 10 kHz, la energía de salida en 100% y la configuración del disparador en disparador externo mediante un programa definido por el usuario.
- Acopla el rayo láser a la fibra monomodo (SMF) a través de un acoplador de fibra óptica (FC1). Coteja el rayo láser utilizando un colimador de fibra óptica (FC2) en una etapa motorizada bidimensional (Motor, velocidad máxima: 20 mm/s).
- Desvíe el rayo láser utilizando un escáner de galvanómetro de dos ejes (Galva). Utilice un espejo movible (M1) para reflejar la viga. Enfoque el haz a través de una lente objetiva de 4× (OL, apertura numérica: 0.1).
- Utilice un soporte de traductor XY (TM) para fijar el transductor ultrasónico hueco hecho a sí mismo (UT, frecuencia central: 25 MHz; Ancho de banda: más del 90%; Orificio central: 3 mm) en la parte inferior del OL12. Pase el haz enfocado a través del agujero central del transductor ultrasónico.
- Ruta de escaneo
- Bloquee el Galva utilizando una matriz de compuerta programable en campo (FPGA 2) durante WIM. Establezca el rango de escaneo y la velocidad de escaneo adecuados mediante un programa definido por el usuario.
- Bloquee el motor utilizando una matriz de compuerta programable en campo (FPGA 1) durante RIM. Establezca la frecuencia de escaneo y el número de puntos de escaneo mediante FPGA 2. Utilice un programa definido por el usuario para controlar el inicio y detener el análisis.
- Adquisición de datos
- Utilice un amplificador de 50 dB (AMP) para amplificar la señal PA. Digitalice la señal por la tarjeta de adquisición de datos (DAQ). Obtenga la señal del gatillo a través de FPGA 1 o FPGA 2.
- Utilice una unidad de procesamiento de gráficos (GPU) para procesar datos y mostrar imágenes en paralelo13.
- Sistema de imágenes CCD
- Utilice un LED blanco en forma de anillo (Temperatura de color: 6500 K; Iluminancia: 40000 lux; Diámetro: 7,5 cm) como fuente de iluminación. Retire M1, utilice un espejo fijo (M2) para reflejar la luz.
- Grabe las imágenes con una cámara CCD (6,3 millones de píxeles) en el sistema de imágenes pa. Visualice las imágenes con un software de visualización.
2. Alineación del sistema
- Seleccione un depósito de agua (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; ventana inferior: 3 cm × 3 cm). Cubra todo el depósito de agua utilizando una membrana de polietileno (membrana gruesa: 10 μm). Agregue suficiente agua ultrapura.
- Coloque el tanque de agua en el escenario de trabajo.
- Encienda el interruptor láser. Seleccione el programa de control láser. Precalentamiento durante 5 minutos. Pulse el botón "ON" del interruptor de bombeo. Establezca los parámetros láser según el paso 1.1.1. Abra el deflector del láser.
- Seleccione el programa recopilado de línea A. Pulse el botón "Inicio" para capturar la señal de un solo punto y mostrar la amplitud y el espectro de la señal de línea A actual.
- Coloque una cuchilla en la parte inferior del tanque de agua. Sumerja la parte inferior de UT en el tanque de agua para el acoplamiento acústico. Evite burbujas en la parte inferior de UT.
- Ajuste la posición de Galva, ajuste el traductor XY entre UT y OL para evitar la señal de oscilación, y asegúrese de que esto es confocal.
- Ajuste la altura de la etapa de trabajo para maximizar la amplitud de la señal y determine la posición de enfoque.
3. Experimento con animales
- Utilice un ratón BALB/c de 5\u20126 semanas de edad con un peso corporal de 20\u201230 g.
- Anestesiar al animal usando uretano (1 g/kg) inyectado por vía intraperitoneally antes del experimento.
- Realice la transición entre WIM y RIM.
- Utilice un transductor ultrasónico plano. Afeita el pelaje en la parte posterior del ratón con una recortadora y una crema depilatoria. Coloque el ratón sobre el soporte (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) en posición propensa.
- Permita que la región de imágenes esté en contacto con la membrana del polietileno mediante gel de ultrasonido. Evite burbujas en la parte de contacto.
- Coloque el soporte en el escenario de trabajo para el acoplamiento acústico. Siga los pasos 2.3\u20122.4 para iniciar el láser y recoger la señal de línea A. Siga los pasos 2.6\u20122.7 para alinear. Pulse "Detener" para finalizar la colección después de la alineación.
- Seleccione el programa WIM. Asigne un nombre a la carpeta recién creada. Establezca el parámetro de escaneo en 20 mm/s en la pestaña "Velocidad de escaneo", "20 mm * 20 mm" en la pestaña "Área de escaneo" y "20" en la pestaña "Paso". Haga clic en el botón Recopilar para iniciar la exploración.
- Haga clic en el botón Detener para finalizar la exploración después de la adquisición. Haga clic en Volver a cero para poner el motor a cero. Cierre el desconcierto del láser. Establezca la configuración del desencadenador en desencadenador interno. Pulse el botón OFF para el interruptor de bombeo.
- Reemplace el disparador WIM como disparador RIM y conéctelo al disparador láser externo. Pulse el botón ON para el interruptor de bombeo. Establezca la configuración del desencadenador en el desencadenador externo. Haga clic en el botón Salir para salir del programa WIM.
- Utilice el paso 2.4 para recoger la señal de línea A. Abra el deflector láser. Siga los pasos 2.6\u20122.7 para alinear. Pulse Detener para finalizar la recopilación después de la alineación.
- Seleccione el programa RIM. Asigne un nombre a la carpeta recién creada. Haga clic en el botón Recopilar para iniciar la exploración.
- Haga clic en el botón Detener para finalizar la exploración después de completar la adquisición. Haga clic en el botón Salir para salir del programa RIM.
- Eutanasiar al animal usando dislocación cervical al final de la toma de imágenes.
- Realizar WIM de visualización vascular.
- Utilice un transductor ultrasónico enfocado (frecuencia central: 25 MHz; Ancho de banda: más del 90%; Distancia focal: 8 mm). Retire el cabello de ratones oreja o cuero cabelludo.
- Utilice un bisturí para hacer una pequeña incisión en el lado lateral de la parte superior temporal craneal del ratón (profundidad al cráneo). Utilice tijeras oftálmicas para comenzar a partir de esta incisión. Corta el cuero cabelludo alrededor del lado externo del cráneo. Comprima el punto de sangrado para detener el sangrado. Lave la herida con solución salina normal. Coloque el ratón en el soporte.
- Permita que la región de imágenes esté en contacto con la membrana del polietileno mediante gel de ultrasonido. Evite burbujas en la región de contacto(Figura suplementaria 1).
- Coloque el soporte en el escenario de trabajo para el acoplamiento acústico. Utilice los pasos 2.3\u20122.4 para abrir el láser y recoger la señal de línea A. Utilice el paso 2.6\u20122.7 para alinear. Pulse Detener para finalizar la recopilación después de la alineación.
- Seleccione programa WIM. Asigne un nombre a la carpeta recién creada. Establezca el parámetro de escaneo en "10 mm/s" en la pestaña "Velocidad de escaneo", "10 mm * 10 mm" bajo la pestaña "Área de escaneo" y "10" en la pestaña "Paso". Haga clic en el botón Recopilar para iniciar la exploración.
- Haga clic en el botón Detener para finalizar la exploración después de completar la adquisición. Haga clic en El retorno a cero para hacer que el motor vuelva a cero. Haga clic en el botón Salir para salir del programa WIM.
- Eutanasiar al animal al final del procedimiento mientras el animal todavía está bajo anestesia.
- Utilice un transductor ultrasónico enfocado (frecuencia central: 25 MHz; Ancho de banda: más del 90%; Distancia focal: 8 mm). Retire el cabello de ratones oreja o cuero cabelludo.
- Lleve a cabo RIM para el monitoreo dinámico de animales pequeños.
- Afeita el cabello del abdomen del ratón. Coloque el ratón en el soporte en posición supina.
- Permita que la región de imágenes esté en contacto con la membrana del polietileno mediante gel de ultrasonido. Evite burbujas en la región de contacto.
- Coloque el soporte en el escenario de trabajo para el acoplamiento acústico. Realice los pasos 2.3\u20122.4 para iniciar el láser y recoger la señal de línea A. Realice el paso 2.6\u20122.7 para alinear. Pulse Detener para finalizar la recopilación después de la alineación.
- Seleccione el programa RIM. Asigne un nombre a la carpeta recién creada. Haga clic en el botón Recopilar para iniciar la exploración.
- Haga clic en el botón Detener para finalizar la exploración después de completar la adquisición. Haga clic en el botón Salir para salir del programa RIM.
- Utilice los datos rim para la reconstrucción de la proyección de amplitud máxima (MAP) a lo largo de la dirección de profundidad por programa definido por el usuario. Observe los cambios dinámicos en el animal.
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Representative Results
El esquema del DRS-PAI se muestra en la figura 1. El sistema permite una conmutación flexible y repetible entre WIM y RIM. La señal PA adquirida se procesa rápidamente para generar imágenes PA B-Scan y MAP. La cámara CCD puede proporcionar fotografías de muestras.
Todos los componentes del DRS-PAI se integran y ensamblan en una configuración de imager(Figura 2),lo que facilita el montaje y el funcionamiento. En el WIM, se utiliza el escaneo ráster continuo de una etapa motorizada bidimensional. Se registra la señal de la etapa de ejecución. La adquisición de datos se llevó a cabo durante la traducción uniforme de la etapa. En el RIM, se utilizó un escáner de galvanómetro de dos ejes. Los datos se recopilaron sincrónicamente con el escaneo de Galva (Figura 3).
Aquí se recogieron las imágenes vasculares de las muestras con cada modo de diagnóstico por imágenes. La Figura 4A muestra la imagen MAP del ratón de nuevo en WIM. El tiempo de imagen fue de aproximadamente 33 min. La Figura 4B muestra imágenes B escaneadas del ratón durante RIM. Todo el proceso de RIM se muestra en Video 1. Luego, se utilizó un transductor ultrasónico enfocado. Las redes vasculares del oído y el cerebro del ratón se muestran en la Figura 5. El tiempo de diagnóstico por imágenes fue de unos 16 minutos. Esto demuestra la capacidad de DRS-PAI para tomar imágenes de vasculatura de campo ancho. Además, la Figura 6A muestra que el rango de imágenes contiene un recipiente. El rango de imágenes de RIM es de aproximadamente 100 μm debido al uso del transductor ultrasónico enfocado. La imagen de desplazamiento a lo largo de la dirección de profundidad del abdomen del ratón frente a la hora se muestra en la Figura 6B. El video 2 muestra el proceso de desplazamiento vascular y la obtención del pulso actual o la curva de respiración.
Figura 1: El esquema del sistema DRS-PAI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El diseño del sistema DRS-PAI.
(A) La fotografía del sistema DRS-PAI. (B) El panel muestra una fotografía de la configuración para el ensamblaje del trazado láser. (C) El panel muestra el modelo 3D para el ensamblaje de trazado láser. (D) El panel muestra el conjunto rápido del escáner del galvanómetro de dos ejes. (E) El panel muestra el ensamblaje de la sonda. (F) El panel muestra el conjunto de trayectoria óptica CCD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La configuración de la exploración para diferentes modos de imagen.
(A) La ruta de escaneo de WIM. (B) La ruta de escaneo de RIM. (C) La configuración del disparador de dos modos de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El WIM fotoacústico y RIM del ratón hacia atrás.
(A) La imagen MAP del ratón de nuevo en WIM. (B) Las imágenes B-Scan del ratón de nuevo en RIM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El WIM fotoacústico de un ratón.
(A) La imagen MAP de la oreja del ratón en WIM. (B) La imagen MAP del cerebro del ratón en WIM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: El BORDE fotoacústico del abdomen del ratón.
(A) Las imágenes de escaneo B del abdomen del ratón en RIM. (B) La imagen MAP a lo largo de la dirección de profundidad del abdomen del ratón frente al tiempo en RIM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 1: El proceso de RIM del ratón hacia atrás. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 2: El proceso de imagen MAP a lo largo de la dirección de profundidad del abdomen del ratón frente al tiempo. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
Figura suplementaria 1: La parte de la región de imágenes en contacto con la membrana del polietileno. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Aquí presentamos un imager fotoacústico de animales pequeños de doble escaneo ráster para la visualización vascular no invasiva que fue diseñado y desarrollado para capturar la estructura de la vasculatura y el cambio dinámico relacionado de la sangre. La ventaja de DRS-PAI es que integra el WIM y el RIM en un solo sistema, lo que facilita el estudio de la estructura de red vascular dinámica y vascular de los animales pequeños. El sistema puede proporcionar visualización vascular de campo amplio de alta resolución y dinámicas de sangre en tiempo real.
En el sistema actual, la excitación óptica se implementó con una fuente de luz de longitud de onda única. Un futuro sistema multi-longitud de onda proporcionaría otros parámetros como la saturación de oxígeno en la sangre. Además, se puede desarrollar un algoritmo especial de procesamiento de imágenes para el análisis cuantitativo, incluyendo la estimación del diámetro vascular, la densidad vascular, la tortuosidad vascular, etc. El análisis cuantitativo puede proporcionar información valiosa para el diagnóstico precoz y el tratamiento de enfermedades.
En resumen, el sistema permite a los investigadores obtener información fisiológica y patológica de alta dimensión sobre la investigación de animales pequeños con relevancia biomédica. El sistema se puede adaptar a la mayoría de los entornos de investigación de animales pequeños, incluir pero no limitado a, imágenes de angiogénesis, microambientes tumorales, hemodinámica, conexiones funcionales en el cerebro, microcirculación, respuestas a fármacos, y respuestas de terapia. Los pasos críticos dentro del protocolo incluyen el diseño de la estructura de escaneo dual, el ajuste confocal del enfoque óptico y acústico en el WIM, y el ajuste del punto central del campo de sonido en el RIM.
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Disclosures
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos aprobados del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Los autores no tienen intereses financieros relevantes en el manuscrito ni otros conflictos potenciales de interés que revelar.
Acknowledgments
A los autores les gustaría reconocer el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (61822505; 11774101; 61627827; 81630046), El Proyecto de Planificación científica y tecnológica de la provincia de Guangdong, China (2015B020233016) y El Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (Nº 2019020001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 bit multi-purpose digitizer | Spectrum | M3i.3221 | Data acquisition card |
| A-line collected program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Amplifier | RF Bay | LNA-650 | Amplifier |
| Depilatory Cream | Veet | 33-II | Animal depilatory |
| Fiberport Coupler | Thorlab | PAF-X-7-A | Fiber Coupler |
| Field Programmable Gate Array | Altera | Cyclone IV | Trigger Control |
| Fixed Focus Collomation Packages | Thorlabs | F240FC-532 | Fiber Collimator |
| Foused ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Graphics Processing Unit | NVIDIA | GeForce GTX 1060 | Processing data |
| Holder | Self-made | Animal fixation | |
| Laser control program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | BALB/c | Animal Model |
| Microscope camera | Mshot | MS60 | CCD camera |
| Microscope Objective | Daheng Optics | GCO-2111 | Objective Lens |
| Mirror | Daheng Optics | GCC-1011 | Moveable/Fixed Mirror |
| Moving Magnet Capacitive Detector Galvanometer Scanner | Century Sunny | S8107 | real-time scanner |
| Mshot image analysis system | Mshot | Display software | |
| Normal Saline | CR DOUBLE-CRANE | H34023609 | Normal Saline |
| Ophthalmic Scissors | SUJIE | Scalp Remove | |
| Planar ultrasonic transducer | Self-made | ||
| Plastic Wrap | HJSJLSL | Polyethylene Membrane | |
| Program Control Software | National Instrument | LabVIEW | User-defined Program |
| Pulsed Q-swithched Laser | Laser-export | DTL-314QT | 532-nm pulse Laser |
| Real-time imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| Ring-shaped white LED | Self-made | ||
| Shaver | Codos | CP-9200 | Animal Shaver |
| Single-Mode Fibers | Nufern | 460-HP | Single-mode fiber |
| Surgical Blade | SUJIE | 11 | Blade |
| Surgical Scalpel | SUJIE | 7 | Scalp Remove |
| Translation Stage | Jiancheng Optics | LS2-25T | wide-field scanning stage |
| Ultrasonic Transducer | Self-made | ||
| Ultrasound gel | GUANGGONG PAI | ZC4252418 | Acoustic Coupling |
| Urethane | Tokyo Chemical Industry | C0028 | Animal Anestheized |
| Water tank | Self-made | ||
| Wide-field imaging program | National Instrument | LabVIEW | User-defined program |
| XY Translator Mount | Self-made |
References
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