एलक्यू α और β पैरामीटर, विकिरण खुराक स्कीमा, और वीवो खुराक जमाव के मूल्यांकन के लिए विकिरण कमीशनिंग और डोसिमेट्री

Summary

विकिरण डोसिमेट्री प्रीक्लिनिकल प्रयोगों की सटीकता को बढ़ाने और यह सुनिश्चित करने के लिए एक तकनीक प्रदान करता है कि वितरित विकिरण खुराक नैदानिक मापदंडों से निकटता से संबंधित हैं। यह प्रोटोकॉल उचित प्रयोगात्मक डिजाइन सुनिश्चित करने के लिए प्रीक्लिनिकल विकिरण प्रयोगों के दौरान प्रत्येक चरण में उठाए जाने वाले कदमों का वर्णन करता है।

Abstract

विकिरण डोसिमेट्री उच्च अनुवाद प्रासंगिकता के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल में विकिरण योजनाओं की सटीक डिलीवरी और प्रजनन क्षमता में महत्वपूर्ण है। किसी भी इन विट्रो या वीवो प्रयोगों में प्रदर्शन करने से पहले, विकिरण और व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए विशिष्ट खुराक उत्पादन का आकलन किया जाना चाहिए। आयनीकरण कक्ष, इलेक्ट्रोमीटर और ठोस पानी सेटअप का उपयोग करके, आइसोकसेंटर पर व्यापक क्षेत्रों की खुराक उत्पादन निर्धारित किया जा सकता है। आयनीकरण कक्ष के स्थान पर रेडियोक्रोमिक फिल्मों के साथ एक समान सेटअप का उपयोग करना, विभिन्न गहराई पर छोटे क्षेत्रों के लिए खुराक दर भी निर्धारित की जा सकती है। इन विट्रो क्लोनोजेनिक अस्तित्व विकिरण उपचार के जवाब में कैंसर कोशिकाओं के परख सस्ती प्रयोग है कि पारंपरिक रैखिक-चतुर्भुज मॉडल के साथ इन डेटा फिटिंग द्वारा सेल लाइनों के अंतर्निहित रेडियो संवेदनशीलता का एक उपाय प्रदान कर रहे हैं । इन परखों से अनुमानित मॉडल पैरामीटर, जीवविज्ञान प्रभावी खुराक के सिद्धांतों के साथ संयुक्त, एक विकिरण उपचार के लिए अलग-अलग अंश कार्यक्रम विकसित करने की अनुमति देता है जो ट्यूमर-असर वाले पशु प्रयोगों में समकक्ष प्रभावी खुराक प्रदान करते हैं। यह एक महत्वपूर्ण कारक पर विचार करने के लिए और वीवो विकिरण चिकित्सा कार्यक्रम में तुलना करने के लिए दिया प्रभावी खुराक में विचरण के कारण परिणामों की संभावित confounding को खत्म करने के लिए सही है । एक साथ लिया गया, यह लेख खुराक उत्पादन सत्यापन प्रीक्लिनिकल पशु और कैबिनेट विकिरणों, रेडियो-संवेदनशीलता के इन विट्रो मूल्यांकन और छोटे जीवित जीवों में विकिरण वितरण के सत्यापन के लिए एक सामान्य विधि प्रदान करता है।

Introduction

कैंसर सामूहिक रूप से अमेरिका में और दुनिया भर के कई देशों में मौत का दूसरा प्रमुख कारण^{प्रतिनिधित्व करते}है 1 । विकिरण चिकित्सा कई ट्यूमर उपप्रकारों के लिए उपचार का एक आधार है और सभी कैंसर रोगियों के लगभग आधे को प्रशासित किया जाता है^2,3 लगभग सभी कैंसरों के रोगी परिणामों में समय के साथ सुधार हुआ है क्योंकि विकिरण की खुराक देने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण तेजी से उन्नत हुए हैं और कुछ प्रभावी मल्टीमॉडल थेरेपी दृष्टिकोण विकसित किए गए थे^4,5,6, लेकिन कुछ प्रकार के ट्यूमर वाले रोगियों के लिए पुनरावृत्ति और मृत्यु दर^7,8,9अधिक रहती है । इस प्रकार, कैंसर के लिए रेडियोथेरेपी बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र बना हुआ है। कई पूर्व नैदानिक रेडियोथेरेपी अध्ययन इन विट्रो या कैंसर के पशु मॉडल के लिए विकिरण खुराक देने के लिए छोटे पैमाने पर विकिरणों के उपयोग को रोजगार देते हैं। मशीनी रेडियोबायोलॉजी विवरण या उपन्यास उपचारों की खोज करने के लिए संभावित प्रयोगों की एक भीड़ के साथ, आम नुकसान का सामना करना पड़ सकता है जो गलत निष्कर्ष, खराब प्रजनन क्षमता और बर्बाद संसाधनों का कारण बनते हैं। ये नुकसान तीन महत्वपूर्ण क्षेत्रों के भीतर आते हैं: विकिरण डोसिमेट्री, मॉडल सेल लाइनों के इन विट्रो लक्षण वर्णन, और वीवो विकिरण डोजिंग शेड्यूल और सेटअप में। अधिक उन्नत प्रयोगों से सटीक और प्रजनन योग्य परिणाम रेडियोथेरेपी अनुसंधान के इन मौलिक पहलुओं पर पूर्व ध्यान दिए बिना प्राप्त करना मुश्किल है।

यहां विस्तृत प्रोटोकॉल इन मुद्दों से बचने या कम करने के लिए एक सामान्यीकृत रणनीति का वर्णन करता है और स्वतंत्र उपयोग के लिए पहले से विकसित कई तरीकों पर खींचता है। इन विशिष्ट तरीकों को विलय कर दिया गया है ताकि प्रीक्लिनिकल रेडियोथेरेपी प्रयोगों की शुरुआत या सुधार करने में रुचि रखने वाला शोधकर्ता इसे एक मजबूत प्रयोगात्मक लेआउट के रूप में उपयोग कर सके। सुझाए गए ढांचे में छोटे पैमाने पर पशु विकिरणों को चालू करने के लिए कार्यप्रणाली, मॉडल कैंसर सेल लाइनों के बुनियादी रेडियोबायोलोजिक गुणों का निर्धारण करने के लिए, और वीवो ट्यूमर मॉडल में के लिए एक खुराक और अंश अनुसूची को उचित रूप से डिजाइन और प्रशासित करने के लिए शामिल है ।

Protocol

हैंडलिंग और प्रक्रियाओं सहित प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग से जुड़े इस प्रोटोकॉल के किसी भी कदम को मॉर्गनटाउन, वेस्ट वर्जीनिया (प्रोटोकॉल संख्या: 1604001894) में वेस्ट वर्जीनिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. खुराक उत्पादन का निर्धारण

1. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें, अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ भौतिकविज्ञानी के "इन-फैंटम मेथड" प्रोटोकॉल के आधार पर मेडिसिन टास्क ग्रुप (AAPM TG)^{61 10} और Xstrahl द्वारा निर्धारित कमीशनिंग प्रोटोकॉल के समान, निम्नलिखित सेटअप शर्तों के तहत विशेष ज्यामिति के संबंध में छोटे पशु विकिरणकर्ता के बीम उत्पादन का निर्धारण करने के लिए।
   1. 220 केवीपी और 13 एमए पर विकिरण देने के लिए विकिरण सेट करें, एक खुले मैदान (17 सेमी बाय 17 सेमी) आइसोकेंडर पर तैनात, या स्रोत से 35 सेमी। इसके अतिरिक्त, बीम को व्यापक फोकस के साथ 0.15 मिमी सीयू फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें। कुछ सेलुलर विकिरणों में केवल एक रेडियोधर्मी स्रोत होता है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग केवल एक्स-रे विकिरणों के लिए किया जा सकता है।
   2. निम्नलिखित क्रम में ठोस पानी प्रेत को संरेखित करें: 1 सेमी स्लैब, आयनीकरण कक्ष स्लॉट के साथ 2 सेमी स्लैब, 2 सेमी स्लैब, 1 सेमी स्लैब। इस क्रम में ठोस पानी प्रेत स्टैकिंग 2 सेमी की गहराई पर आयनीकरण कक्ष की स्थिति है, जिससे बैकस्कैटर के लिए 4 सेमी की अनुमति है। डोसिमेट्री सेटअप के ग्राफिकल चित्रण के लिए चित्रा 1 देखें।
      नोट: ठोस पानी के बड़े, काफी भारी ढेर को समायोजित करने के लिए, लेखकों को चर समर्थन के साथ एक कस्टम 3 डी मुद्रित सोफे के अधिग्रहण की सिफारिश करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रेत ढेर स्तर है और सामग्री की सतह भर में स्रोत से सही दूरी पर, न सिर्फ केंद्र में ।
2. माप उपकरण (यानी, एडीसीएल कैलिब्रेटेड आयनीकरण कक्ष, इलेक्ट्रोमीटर) का उपयोग करें और उपयोग किए गए सुधार कारकों का स्पष्टीकरण सामग्री की तालिका और तालिका 1 में क्रमशः पाया जा सकता है।
   नोट: कि एडीसीएल विभिन्न हाफ वैल्यू लेयर्स (एचवीएल, बीम गुणवत्ता के उपाय) के लिए कुछ बिंदुओं पर एनके_के मूल्य प्रदान करता है। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एनके_का मूल्य इकाई के मापा एचवीएल के लिए एडीसीएल मूल्यों के इंटरपोलेशन पर आधारित होना चाहिए। निर्माता हमारी इकाई के एचवीएल मापा और हम इस्तेमाल किया है कि हमारी खुराक दर उत्पादन निर्धारण में ।
3. प्रेत स्टैक सेट करें और चरण 1.1.2 में निर्दिष्ट प्रेत में आयनीकरण कक्ष डालें।
   1. प्रेत ढेर को समायोजित करें ताकि स्रोत सतह की दूरी (एसएसडी) हो, या विकिरण स्रोत से पहली सतह तक की दूरी, उचित रूप से लगाए जाने पर 33 सेमी है।
      नोट: लेखकों को एक कस्टम, 3 डी मुद्रित सोफे बनाने का सुझाव है, काफी बड़ा ठोस पानी स्लैब के आयामों का समर्थन करने के लिए । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रेत स्टैक को समतल करने के लिए एक समायोज्य घटक है।
4. 300 वी पर सेट होने वाले इलेक्ट्रोमीटर पूर्वाग्रह वोल्टेज के साथ तीन अलग-अलग एक्स-रे एक्सपोजर, एक मिनट रीडिंग का औसत लें। परिणाम को एम⁺कहा जाएगा ।
   नोट: 220 केवीपी और 13 एमए पर विकिरण देने के लिए सेट उपकरण के साथ विकिरण किया जाता है। यह अगले दो चरणों (चरण 1.5-1.6) के लिए समान है। उपयोगकर्ता सुरक्षा के लिए, यह सुनिश्चित करें कि उपचार के दौरान दरवाजे बंद रहें।
5. -150 वी पर सेट किए गए इलेक्ट्रोमीटर पूर्वाग्रह वोल्टेज के साथ तीन अलग-अलग एक्स-रे एक्सपोजर, 1 मिनट रीडिंग का एक और सेट करें। परिणाम को एम_एलकहा जाएगा ।
6. -300 वी पर सेट किए गए इलेक्ट्रोमीटर पूर्वाग्रह वोल्टेज के साथ तीन अलग-अलग एक्स-रे एक्सपोजर, 1 मिनट रीडिंग का एक और सेट करें। परिणाम को एम_एचया^एम- भी कहा जाएगा ।
7. _नीचे वर्णित समीकरण 1 और समीकरण 2 का उपयोग करके पी_पोल और पी आयन की गणना करें:
   (समीकरण 1)
   (समीकरण 2)
8. तापमान को मापने, सेल्सियस में, और दबाव, kPa में, विकिरण के अंदर एक अंशांकित डिजिटल थर्मामीटर और बैरोमीटर का उपयोग कर । फिर, समीकरण 3में_नीचे दिए गए पी टीपी की गणना करें।
   नोट: यह गणना मानती है कि एडीसीएल ने वायु केर्मा अंशांकन कारक के लिए अपना मूल्य बताते समय मानक तापमान और 22 डिग्री सेल्सियस और 101.33 किलोमीटरपीए के दबाव मूल्यों का उपयोग किया।
   (समीकरण 3)
9. कच्चे चैंबर रीडिंग, एम_एच,पी_elec,पी_पोल,पी_आयन,और पी_टीपीद्वारा गुणा करके सही कक्ष पढ़ने, एम की गणना करें। यह समीकरण समीकरण 4में नीचे पाया जा सकता है ।
   नोट: यह गणना मानती है कि एडीसीएल ने पूर्वाग्रह वोल्टेज के साथ अपने अंशांकन का प्रदर्शन किया -300V, जो एक काफी आम प्रथा है।
   (समीकरण 4)।
10. _इसकेअलावा एनके द्वारा सही कक्ष पढ़ने गुणा, [(μ_en/p)^{डब्ल्यू}_{हवा]पानी,}पी_{क्यू, चाम,}और पी_{म्यान}। पी_{म्यान} केवल पानी में प्राप्त माप के लिए की जरूरत है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल के लिए पी_{म्यान} सिर्फ 1 है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में शर्तों का उपयोग करना, बाद के तीन आइटम 1.0731 का मूल्य देते हैं। यह मूल्य बीम की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, इसलिए एचवीएल को इसे निर्धारित करने के लिए जाना जाना चाहिए। 1.0731 का मूल्य हमारी इकाई के लिए विशिष्ट है और एक उदाहरण के रूप में दिया गया है। अपनी इकाई के लिए विशिष्ट पी_{क्यू, चाम} और [(μ_{एन/पी)}^{डब्ल्यू}_{एयर]पानी} के मूल्यों का निर्धारण करने के लिए, मापा एचवीएल का उपयोग करें और टेबल सातवीं,और तालिका आठवींसे इंटरपोलेट, और AAPM TG61 प्रोटोकॉल¹⁰से चित्रा 3 और चित्रा 4 के अनुसार संदर्भ क्षेत्र के आकार के लिए सही है । हमारे मामले में, 1.0731 द्वारा एन_के गुणा पानी के लिए खुराक प्रदान करता है, डी_{डब्ल्यू,}Gy में 1 मिनट के नाममात्र समय के लिए, यह मानते हुए कि एडीसीएल एन_के मूल्य Gy/Coulumbs में दिया जाता है।
11. विकिरण का उपयोग किए जाने वाले विकिरण के अंतिम प्रभाव का निर्धारण करें। जब एक्स-रे पहली बार उत्पन्न होते हैं, तो उत्पादन कुछ सीमित समय में अपने पूर्ण मूल्य तक बढ़ जाता है। इसी तरह, जब एक्स-रे स्रोत बंद हो जाता है, तो कुछ सीमित समय में उत्पादन शून्य हो जाता है।
    1. इस संक्रमण, या अंत प्रभाव के लिए समय के लिए खाते हैं । यह समय सेटिंग्स की एक किस्म के लिए-३०० वी पर सेट विद्युत प्रकार पूर्वाग्रह वोल्टेज के साथ तीन रीडिंग के औसत लेने के द्वारा किया जा सकता है । ऐसा 6, 12, 18, 24, 30 और 60 सेकंड के लिए करें।
    2. समय के खिलाफ विद्युतमीटर रीडिंग प्लॉट और सबसे अच्छा सीधी रेखा लगता है। कुल समय, टी, एक 1 मिनट के उपचार के लिए समीकरण 5 द्वारा गणना की जा सकती है:
       (समीकरण5)।
12. समीकरण 6द्वारा दिए गए विकिरण के लिए खुराक दर की गणना करें:
    (समीकरण 6)

2. एक रेडियोक्रोमिक फिल्म अंशांकन वक्र बनाना

1. आवश्यक सामग्रियों की सूची के लिए, सामग्री की तालिकादेखें।
2. पिछले प्रोटोकॉल के रूप में एक के पास समान सेट का उपयोग करना, ठोस पानी प्रेत ढेर में एक 2 सेमी गहराई पर फिल्म जगह है । ठोस पानी प्रेत का क्रम तब तक महत्वहीन है जब तक कि बिल्डअप और बैकस्केटर प्रभावों के लिए नीचे 2 सेमी ठोस पानी और नीचे 4 सेमी ठोस पानी होता है।
3. प्रोटोकॉल 1 में कमीशन की गई निर्धारित खुराक का उपयोग करके, समीकरण 7का उपयोग करके तालिका 2 में सूचीबद्ध खुराक के लिए उपचार के समय का निर्धारण करें:
   (समीकरण7)
4. फिल्म के कई टुकड़े तैयार करें यह सुनिश्चित करना कि प्रत्येक फिल्म एक ही आकार की है और स्कैन अधिग्रहण के माध्यम से उपचार से एक ही अभिविन्यास में बनी हुई है। यह निचले बाएं कोने में एक छोटा सा विकर्ण कट रखकर किया जा सकता है। इस बिंदु से प्रत्येक फिल्म आगे फिल्म के एक ही बैच से होना चाहिए ।
   नोट: मूल्यांकन किए जाने वाले प्रत्येक खुराक बिंदु के लिए 3 अलग-अलग प्रतिकृति तैयार करें।
5. सभी सुधार बंद कर दिया के साथ एक 48 बिट रंग फोटो स्कैनर का उपयोग कर कटौती टुकड़े स्कैन करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक फिल्म स्कैनिंग बिस्तर के सटीक केंद्र में रखा गया है। प्राप्त मान पूर्व-एक्सपोजर स्कैन हैं जिनका उपयोग अनएक्सपोज्ड ऑप्टिकल घनत्व^{11, 12}का निर्धारण करने के लिए किया^जाताहै। में सभी छवियों को बचाओ । प्रमुख डेटा के संपीड़न से बचने के लिए झगड़ा फ़ाइल प्रारूप।
   नोट: लेखकों फिल्मों तीन बार स्कैनिंग और एक दिया फिल्म के लिए एक मूल्य के रूप में प्राप्त औसत का उपयोग करने की सलाह देते हैं ।
6. 4 सेमी ठोस पानी के शीर्ष पर फिल्म का एक टुकड़ा रखकर फिल्मों के विकिरण शुरू करें और ऊपर शेष 2 सेमी ठोस पानी तैनात करें, जैसा कि इस खंड में पहले वर्णित है।
7. प्रेत सेट को समायोजित करें ताकि फिल्म स्रोत से समान दूरी हो क्योंकि खुराक उत्पादन का निर्धारण करते समय आयनीकरण कक्ष था। यह विकिरण का आइसोसेंट्रिक प्वाइंट है।
8. एक निर्धारित खुराक के लिए ऊपर चरण 2.3 में गणना उपचार समय कार्यक्रम।
9. तालिका 2में सूचीबद्ध प्रत्येक खुराक के लिए दोहराएं उपचार।
10. फिल्मों को प्रकाश से सुरक्षित 24 घंटे आराम करने दें।
11. पोस्ट-एक्सपोजर फिल्म स्कैन को ऊपर की तरह ही प्राप्त करें।
12. इमेजजे विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पर छवियों का आयात करें और लाल चैनल पर सभी माप करें।
    1. छवि में खींचें । इमेजजे में झगड़ा फ़ाइल प्रारूप।
    2. इमेज ड्रॉप डाउन मेन्यू पर क्लिक करें। छवि ड्रॉप डाउन मेनू से रंग का चयन करें। रंग विकल्प से विभाजन चैनलों का चयन करें।
    3. केवल लाल छवि चैनल का उपयोग करना, आयत उपकरण का उपयोग करके ब्याज का एक क्षेत्र आकर्षित करें। प्रेस सीटीआरएल + एम। परिणाम खिड़की से मतलब मूल्य टाइप करें।
    4. सभी स्कैन फिल्मों के लिए 2.12.1-2.12.4 कदम दोहराएं ।
13. उजागर और उजागर दोनों फिल्मों के लिए 1 सेमी वर्ग द्वारा एक केंद्रीय स्थित 1 सेमी में पिक्सेल मूल्य प्राप्त करें। इन मूल्यों को क्रमशः पीवी_{यू (डी)} और पीवी_(डी) के रूप में चिह्नित किया जाएगा, और समीकरण 8में वर्णित शुद्ध ऑप्टिकल घनत्व की गणना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
    (समीकरण 8) ¹³
14. फिल्म छवियों की प्रत्येक जोड़ी के लिए चरण 2.13 दोहराएं, दोनों पूर्व-एक्सपोजर और पोस्ट-एक्सपोजर।
15. नेट ऑप्टिकल घनत्व बनाम खुराक का ग्राफ प्लॉट करें और वाई = एक्स³ + बीएक्स² + सीएक्स + डी के प्रारूप में एक घन पॉलीनोमियल के लिए वक्र फिट करें। एक उदाहरण चित्रा 2 बीमें पाया जा सकता है ।

3. क्लोनोजेनिक परख के माध्यम से विशिष्ट कैंसर सेल लाइनों के लिए α/β मूल्य का निर्धारण

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल फ्रेंकन एट अल¹⁴ द्वारा वर्णित तरीकों का एक संशोधित संस्करण है और चित्र 3में देखा जा सकता है ।

1. कोशिकाओं को ~ 80% तक बढ़ाएं। इस प्रयोग के लिए कोशिकाओं के अधिक-कॉन्फ्लेंट स्रोतों का उपयोग करने से बचें, क्योंकि यह आवश्यक है कि कोशिकाएं कोशिका विकास के लॉग-चरण में हों। चित्रा 3Cमें प्रदर्शित प्रतिनिधि क्लोनोजेनिक परख परिणामों के लिए, मस्तिष्क-उष्णकटिबंधीय एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं को दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में सुसंस्कृत किया गया था, जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक थे और एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेटेड थे।
2. कॉलोनी परख के लिए वांछित घनत्व पर कोशिकाओं बीज। सीडिंग के दौरान सटीक कमजोर पड़ने परख की चढ़ाना दक्षता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। कई प्रतिकृति प्लेट करने के लिए सुनिश्चित हो।
3. इस कदम के साथ आगे बढ़ें यदि विकिरण उपचार सेल चढ़ाना(चित्रा 3A)से पहले होगा । वैकल्पिक रूप से, 3.4 कदम के लिए आगे बढ़ें यदि सेल चढ़ाना विकिरण उपचार से पहले होगा।
   1. संस्कृति फ्लास्क पर वांछित विकिरण उपचार करें। किसी भी अतिरिक्त उपचार (यानी दवा उपचार) से पहले या इसके बाद किसी भी बिंदु पर किया जा सकता है। चित्रा 3Cमें प्रतिनिधि परिणामों के लिए, विकिरण उपचार चढ़ाना कोशिकाओं के बाद हुई, चरण 3.4 में विस्तृत।
   2. पसंदीदा ट्राइप्सिनाइजेशन विधि का उपयोग करके कोशिकाओं को निकालें और एक एकल सेल निलंबन बनाएं। संस्कृति मीडिया को हटाएं और फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करने के लिए रिकॉम्बिनेंट एंजाइम (जैसे, ट्रिपल एक्सप्रेस) जोड़ें। लगभग 3 मिनट के लिए एंजाइम के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट जब तक कोशिकाओं को अलग किया गया के रूप में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर का पता चला । कोशिका संस्कृति मीडिया की बराबर मात्रा का उपयोग करके एंजाइम को बेअसर करें। 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं और संस्कृति माध्यम में वांछित एकाग्रता के लिए पुनर्प्र निर्भर करती हैं।
   3. कई प्रतिकृति में वांछित घनत्व पर कोशिकाओं को प्लेट करें।
   4. पहले 24 घंटे के बाद ताजा मीडिया के साथ बदलें ।
   5. हर 2-3 दिन में मीडिया को बदलते रहें।
   6. जब तक नियंत्रण कालोनियों प्रति कॉलोनी, ~ 9-14 दिनों में 50 कोशिकाओं से अधिक नहीं हो जाती है, तब तक खेती कोशिकाओं को जारी रखें। नियंत्रण कालोनियों उन उपचार समूहों है कि कोई विकिरण खुराक प्राप्त कर रहे हैं । दवा उपचार का उपयोग कर प्रयोगों के लिए के रूप में अच्छी तरह से, दवा डोजिंग के साथ एक और नियंत्रण समूह लेकिन कोई विकिरण उपचार भी आवश्यकता होगी ।
4. विकिरण उपचार(चित्रा 3B) से पहले कोशिकाओं को सीडिंग करते समय इस कदम के साथ आगे बढ़ें।
   1. पसंदीदा ट्राइप्सिनाइजेशन विधि का उपयोग करके कोशिकाओं को निकालें और एक एकल सेल निलंबन बनाएं।
   2. कोशिकाओं को कई प्रतिकृतियों में वांछित घनत्व पर रखें।
   3. कोशिकाओं को रात भर प्लेट का पालन करने की अनुमति दें।
   4. वांछित विकिरण खुराक प्रदर्शन करते हैं। अतिरिक्त उपचार, जैसे दवा डोजिंग, इस चरण से पहले या बाद में किसी भी बिंदु पर किया जा सकता है, जब तक कि कोशिकाएं अपने उपचार प्लेटों से जुड़ी होती हैं। चित्रा 3Cमें प्रतिनिधि परिणामों के लिए, 1250 मस्तिष्क-उष्णकटिबंधीय एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को उपचार से पहले चढ़ाया गया था (चरण 3.4)। फिर, कोशिकाओं को एक्स-रे के 3 Gy के साथ विकिरण से 3 घंटे पहले 15 एनएम डॉक्सोरुबिसिन के साथ इलाज किया गया।
   5. शुरुआती 24 घंटे के बाद मीडिया को बदलें ।
   6. हर 2-3 दिन में मीडिया को बदलें।
   7. संस्कृति इलाज कोशिकाओं जब तक नियंत्रण समूह कालोनियों ५० कोशिकाओं से अधिक है, ~ 9-14 दिन । नियंत्रण कालोनियों उन उपचार समूहों है कि कोई विकिरण खुराक प्राप्त कर रहे हैं । दवा उपचार का उपयोग कर प्रयोगों के लिए के रूप में अच्छी तरह से, दवा डोजिंग के साथ एक और नियंत्रण समूह लेकिन कोई विकिरण उपचार भी आवश्यकता होगी ।
5. कुओं या व्यंजनों से संस्कृति मीडिया निकालें, और PBS के साथ धो ।
6. हिमनदों एसीटिक एसिड और मेथनॉल के 1:7 (v:v) समाधान में 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
7. फिक्सेशन समाधान निकालें।
8. निर्धारण के बाद, 30 मिनट के लिए दाग कोशिकाओं, या 2 घंटे यदि समय उपलब्ध है, एक 2.5-5.0 मिलीग्राम के साथ कमरे के तापमान पर क्रिस्टल वायलेट के एक 4:1 (v:v) आसुत पानी और मेथनॉल के समाधान में ।
9. धुंधला समाधान निकालें और एक बड़े, कमरे के तापमान पानी स्नान में कोशिकाओं को धोने ।
   नोट: बहते पानी के नीचे न धोएं।
10. प्रत्येक उपचार समूह में कालोनियों की परिणामी संख्या की गणना करें और प्रत्येक प्लेट के अस्तित्व के अंश की गणना करें।
11. इसी खुराक के खिलाफ अस्तित्व के अंश को प्लॉट करें, और एक घातीय फिट के साथ वक्र फिट करें।
12. α/β मूल्य का अनुमान लगाने के लिए, नीचे पाए गए रैखिक-चतुर्भुज समीकरण में प्रत्येक समायोज्य मापदंडों के लिए मूल्यों का अनुमान लगाने के लिए उपरोक्त भूखंड के घातीय फिट का उपयोग करें:
    (समीकरण 9)
    नोट: कोशिकाओं का विकिरण आमतौर पर किसी भी कोलिमेशन के बिना आइसोकेमरर में किया जा सकता है बशर्ते क्षेत्र का आकार अच्छी तरह से प्लेटों या पेट्री व्यंजनों को समायोजित करने के लिए काफी बड़ा हो। इस प्रोटोकॉल में संभावित नुकसान में कोई कॉलोनी गठन, स्पष्ट सेल विकास के साथ महत्वपूर्ण सेल माइग्रेशन, लेकिन कोई सच्ची उपनिवेश, या गैर-बाँझ विकिरण कक्ष में उपचार के कारण संदूषण जैसी पैदावार शामिल हो सकती है।

4. चर प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए विशिष्ट खुराक उत्पादन का निर्धारण

1. वांछित क्षेत्र के आकार और स्रोत से दूरी पर निर्णय लें।
   नोट: कोलिमेशन खुराक दर को बदल देगा चाहे एक्स-रे स्रोत से कोलिमेटर का आकार या दूरी हो।
2. बिल्डअप और बैकस्कैटर प्रदान करने के लिए ठोस पानी प्रेत का उपयोग करना, सही अभिविन्यास में फिल्म का एक टुकड़ा है जो प्रयोगात्मक डिजाइन को सबसे अच्छा चित्रित करता है।
   नोट: किसी भी प्रयोगात्मक सेटअप के लिए ठोस पानी किसी दिए गए डिजाइन का सबसे सटीक प्रतिनिधित्व प्रदान नहीं कर सकता है। इसके बजाय हम वास्तविक प्रयोग के जहाजों (यानी, पेट्री डिश, अच्छी तरह से प्लेटें, छोटे पशु प्रेत, आदि) का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
3. 1 (एन = 3) और 2 (एन = 3) मिनट के लिए विकिरण फिल्मों ।
4. फिल्मों को प्रकाश से सुरक्षित 24 घंटे आराम करने दें।
5. धारा 2से प्रक्रियाओं का पालन करते हुए प्रत्येक फिल्म का शुद्ध ऑप्टिकल घनत्व निर्धारित करें । नेट ऑप्टिकल घनत्व से खुराक निर्धारित करने के लिए फिल्म अंशांकन वक्र का उपयोग करें।
6. आउटपुट खुराक दर के रूप में₁मिनट, डी 1 पर खुराक निर्धारित करें, Ḋ, समीकरण 10 द्वारा परिभाषित इस प्रयोगात्मक सेटअप के लिए इस प्रकार है:
   (समीकरण 10)
7. इसी तरह, समीकरण 11 द्वारा 2 मिनट पर खुराक को इस प्रकार कैल्यूलेट करें:
   (समीकरण 11)
8. अंतिम प्रभाव के कारण, उपरोक्त गणनाओं के लिए खुराक दर थोड़ी अलग हो सकती है। वांछित प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए डी_{एक्सपी} की गणना करने के लिए इस कारण से, समीकरण 12में दर्शाए गए व्यक्तिगत डी_{एक्सपी} के औसत का उपयोग करें:
   (समीकरण 12)
9. इस औसत का उपयोग करना, समीकरण 13में इस विशेष सेटअप के लिए किसी भी वांछित खुराक के इलाज के लिए समय को परिभाषित करें:
   (समीकरण 13)

5. ब्याज के शारीरिक स्थान में ट्यूमर असर चूहों का इलाज

1. संस्था के आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित सुरक्षित और मानवीय संज्ञाहरण तकनीकों के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें।
2. वांछित प्रयोगात्मक डिजाइन में दर्शाए गए अनुसार एनेस्थेटाइज्ड जानवर को संयम में रखें।
3. यह चरण वैकल्पिक है, यदि उपलब्ध नहीं है तो 5.6 चरण के लिए आगे बढ़ें। एल्यूमीनियम फिल्टर का उपयोग कर कोलिमेशन के बिना माउस के ऑनबोर्ड पोर्टल कैमरे का उपयोग करके एक रेडियोग्राम प्राप्त करें।
4. जगह में कोलिमेशन के साथ एक दूसरा रेडियोग्राम प्राप्त करें।
5. बीम पोजिशनिंग प्रदर्शित करने के लिए इमेजजे में रेडियोग्राम ओवरले करें।
6. पूर्व निर्धारित α/β मूल्य का उपयोग करना, खुराक योजना है कि सबसे उचित दृष्टिकोण प्रदान करता है एक अनुसंधान सवाल का जवाब निर्धारित (यानी, अगर 3 Gy के 10 अंशों में दिया 30Gy की एक खुराक के प्रभाव मॉडल चाहते हैं, लेकिन केवल चार अंश देना चाहते हैं) । समीकरण 14 का उपयोग करना, 10 के एक ग्रहण α/β मूल्य के साथ (इस मूल्य प्रोटोकॉल 3में व्यक्तिगत कैंसर सेल लाइनों के लिए निर्धारित किया जा सकता है) और एक बिस्तर 30 Gy/10 एफ के समान, 6 Gy के 4 अंशों में 24 Gy के साथ इलाज ।
7. वांछित खुराक के लिए दिए गए निर्धारित समय के लिए पशु का इलाज करें।

6. वीवो में खुराक जमाव की हिस्टोलॉजिकल पुष्टि

1. प्रोटोकॉल 5का पालन करते हुए उपचार के 1 घंटे के भीतर ब्याज के ऊतकों को¹⁵,¹⁶के^भीतरएकत्र करें . ऊतक फसल के बाद, पसंदीदा इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें। एक उदाहरण नीचे दिया गया है।
2. बर्फ ठंड 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ परफयूज जानवर।
3. पीएफए में 4 डिग्री सेल्सियस पर पोस्ट फिक्स।
4. निर्धारण के बाद, कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए 10%, 20%, और 30% सुक्रोज में क्रमिक रूप से ऊतक को ठीक करें।
5. जिलेटिन में ऊतक एम्बेड करें और क्रमिक रूप से 4% पीएफए में ठीक करें और फिर कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए 10-30% सुक्रोज में।
6. ब्लॉक ट्रिम करें और 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
7. 20-30 माइक्रोन वर्गों में ऊतक टुकड़ा।
8. इम्यूनोदाता एक छह अच्छी तरह से प्लेट^{17, 18}में मुक्त अस्थाई वर्गों के रूप में स्लाइड ।
   1. 1% ट्राइटन में 1.83% lysine के साथ एक शेखर पर तीन बार धोएं और 30 मिनट के लिए परमीलित करें, और 4% गर्मी-निष्क्रिय बकरी सीरम।
   2. 24 घंटे के लिए एंटी-γH2AX एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट सेक्शन, इसके बाद वांछित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 2 घंटे की इनक्यूबेशन।
   3. पसंदीदा बढ़ते मीडिया का उपयोग करके ग्लास कवरलिप के साथ कवरलिप स्लाइड।
9. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर छवि।

Representative Results

प्रोटोकॉल 1 के बाद Gy/min में एक खुराक दर प्रदान करेगा, जो विकिरण के लिए विशिष्ट है इस्तेमाल किया जा रहा है । हालांकि, विकिरण के प्रकार की परवाह किए बिना, एक ज्ञात खुराक दर के साथ एक अंशांकन वक्र प्रोटोकॉल 2 इसी तरह की फिल्मों उपज और चित्रा 2ए-बीमें एक समान अंशांकन वक्र का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है । प्रोटोकॉल 3 से एक सफल परख कोशिकाओं की अलग, अच्छी तरह से सीमांकित उपनिवेशों को उत्पीड़ित करेगी जो समरूप रूप से बैंगनी रंग की है। α/β के अनुमान की तुलना साहित्य मूल्यों या अन्य उपचार समूहों से की जा सकती है ताकि दिए गए सेल लाइन की रेडियो संवेदनशीलता की व्याख्या की जा सके । प्रोटोकॉल 2 के बाद विकसित अंशांकन वक्र का उपयोग करना और चित्रा 2 बीमें प्रदर्शित, प्रोटोकॉल 4 चित्रा 2 ए जैसा दो फिल्म नमूने प्राप्त करेगा जिसका उपयोग आवश्यक प्रयोगात्मक विकिरण समय का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। यदि एक ऑन-बोर्ड पोर्टल इमेजिंग कैमरा विकिरणकर्ता के लिए उपलब्ध है, तो छोटे जानवरों के रेडियोग्राम के साथ और बिना कोलिमेशन प्राप्त किए जा सकते हैं। इन छवियों को ओवरले करने से छोटे जानवर के सापेक्ष कोलिमेटेड विकिरण बीम की सटीक स्थिति का प्रदर्शन होगा जिसे चित्र 4 एमें दर्शाया गया है । प्रोटोकॉल 5 में सफल खुराक-बयान प्रोटोकॉल 6 के बाद पुष्टि की जा सकती है। एक संकेत है कि विकिरण एक वीवो या इन विट्रो सिस्टम में जमा किया जा रहा है डबल फंसे डीएनए टूट का पता लगाने के माध्यम से है । चित्रा 4Bमें सचित्र, एक ही माउस चित्रा 4Aमें सही गोलार्द्ध के माध्यम से पूरी तरह से इलाज किया, सकारात्मक γH2AX केवल इलाज गोलार्द्ध में धुंधला दर्शाता है । इस आंकड़े में, नाभिक दो चीजों को दिखाने के लिए DAPI के साथ दाग रहे हैं; 1) पूरे मस्तिष्क के हैं जो एंटीबॉडी विरोधी γH2AX को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के दौरान लागू किया गया था, और 2) मस्तिष्क का अनुपचारित गोलार्द्ध अन दाग रहता है।

चित्रा 1: खुराक उत्पादन के निर्धारण के लिए आयनीकरण कक्ष और पानी प्रेत की स्थापना की गई। पिक्टोग्राम एक बुनियादी सेटअप दिखाता है जो विकिरण के मंत्रिमंडल के भीतर आयनीकरण कक्ष और ठोस पानी के प्रेत का उपयोग करके डोसिमेट्री के लिए आवश्यक विभिन्न घटकों का उपयोग करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: रेडियोक्रोमिक फिल्म का उपयोग करके अंशांकन वक्र का उत्पादन। (A) बढ़तीखुराक के साथ रेडियोक्रोमिक फिल्म का प्रतिनिधि रंग परिवर्तन। शीर्ष बाएं (0 सीजीवाई); नीचे सही (2000 cGy)। (ख)नेट ऑप्टिकल घनत्व और खुराक की तुलना में संभावित रेडियोक्रोमिक फिल्म अंशांकन वक्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3: कैंसर कोशिकाओं के क्लोनोजेनिक परख। कोशिकाओं का विकिरण उपचार छह अच्छी प्लेटों/पेट्री व्यंजन(ए),या बाद(बी)में चढ़ाना से पहले किया जा सकता है । पैनल(सी)में, एक प्रतिनिधि छवि प्रोटोकॉल धारा 3 का पालन करने के बाद एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं के साथ एक सफल क्लोनोजेनिक परख का प्रदर्शन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4: स्थिति के लिए दोहरी ओवरलेड रेडियोग्राम का उपयोग (यदि उपलब्ध हो) और खुराक जमाव की पुष्टि के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला γH2AX सकारात्मक। (एक)प्रतिनिधि ने विकिरण बीम की नियुक्ति को दर्शाते हुए रेडियोग्राम को ओवरले किया । (ख)प्रतिनिधि परिणाम सही गोलार्द्ध में खुराक जमाव का संकेत देते हैं जैसा कि γH2AX तीव्रता में वृद्धि से प्रदर्शित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सुधार कारक	ख़ुलासा
एनक	एयर केर्मा अंशांकन कारक
[(μ एन/10)डब्ल्यूएयर] पानी	पानी से हवा में बड़े पैमाने पर ऊर्जा अवशोषण गुणांक का राशन; लगभग 1.05
पीक्यू, चाम	चैंबर स्टेम के लिए सुधार लेखांकन चैंबर द्वारा फोटॉन फ्लूसेंस क्षरकता को प्रभावित; लगभग 1.022
पीम्यान	आयनीकरण कक्ष की रक्षा करने वाले म्यान के लिए सुधार लेखांकन; 1 का मूल्य, चैंबर के रूप में जलरोधक है
पीपोल	ध्रुवीकरण के लिए सुधार कारक लेखांकन; प्रोटोकॉल 1 में निर्धारित
पीआयन	आयन पुनर्संयोजन के लिए सुधार कारक लेखांकन; प्रोटोकॉल 1 में निर्धारित
पीटीपी	प्रयोग के दिन टेमरपेचर और दबाव के लिए सुधार कारक एकोकुंटिंग; प्रोटोकॉल 1 में निर्धारित

तालिका 1: प्रोटोकॉल 1 में खुराक दर के निर्धारण के लिए आवश्यक सुधार कारक।

खुराक	एन
0.5	3
1	3
2	3
3	3
4	3
6	3
8	3
10	3
12*	3
15*	3
20*	3
* केवल व्यक्तिगत प्रयोगों के लिए 10 से अधिक खुराक के लिए आवश्यक है।

तालिका 2: रेडियोक्रोमिक फिल्म अंशांकन वक्र के उत्पादन में खुराक का उपयोग किया जाएगा।

Discussion

उपरोक्त प्रोटोकॉल विकिरण डोसिमेट्री के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल दृष्टिकोण, कैंसर सेल लाइनों में α/β मूल्यों का निर्धारण, और स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस के एक पूर्व नैदानिक मॉडल में विकिरण के लिए एक दृष्टिकोण का एक संक्षिप्त उदाहरण का वर्णन करता है । इन तरीकों का इस्तेमाल कैंसर के किसी भी मॉडल का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और यह सिर्फ स्तन कैंसर के मस्तिष्क मेटास्टेसिस तक ही सीमित नहीं है। इस खंड में हम प्रासंगिक जटिलताओं अंतर्निहित प्रीक्लिनिकल रेडियोथेरेपी प्रयोगों पर चर्चा करेंगे।

डोसिमेट्री में दो भाग शामिल हैं: 1) एक किसान कक्ष के साथ उत्पादन को कैलिब्रेट करें, ताकि एक्स-रे इकाई की खुराक दर स्थापित हो, और 2) रेडियोक्रोमिक फिल्म का उपयोग करके एक व्यावहारिक डोसिमेट्री माप प्रणाली तैयार करें। आउटपुट अंशांकन के संबंध में, टीजी-61 पानी में एक प्रजनन विधि प्रदान करता है। यहां प्रोटोकॉल गैमेक्स आरएमआई 457 ठोस पानी का उपयोग करता है, जैसा कि विकिरण के निर्माता XStrahl द्वारा अनुशंसित है। हालांकि ठोस पानी के साथ सापेक्ष डोसिमेट्री (प्रोफाइल या गहराई खुराक अधिकतम खुराक के लिए सामान्यीकृत) विश्लेषण, पानी के साथ 1% से बेहतर करने के लिए सहमत हैं, पानी की तुलना में ठोस पानी के लिए उच्च द्रव्यमान ऊर्जा अवशोषण गुणांक के कारण पूर्ण खुराक में लगभग 3 से 4% का अंतर है। हालांकि, चूंकि XStrahl प्रणाली के सभी प्रतिष्ठान आउटपुट अंशांकन के लिए ठोस जल प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं, इसलिए हमने इन मतभेदों के लिए सही नहीं किया। आउटपुट को जानने से वांछित खुराक देने के लिए आवश्यक एक्सपोजर समय की गणना की अनुमति देता है। किसान चैंबर के रूप में एक ही सेटअप में फिल्म रखने हमें फिल्म के लिए ज्ञात खुराक देने के लिए अनुमति देता है । फिल्म को स्कैन करना तो ऑप्टिकल घनत्व प्रदान करता है । फिल्म के लिए खुराक तो इसी शुद्ध ऑप्टिकल घनत्व के खिलाफ रेखांकन किया जा सकता है (ऑप्टिकल घनत्व में अंतर के बाद और जोखिम से पहले) । यह एक फिल्म अंशांकन वक्र पैदा करता है। जब हम प्रायोगिक सेटअप बदलते हैं, तो उस स्थिति में खुराक की दर बदल सकती है, क्योंकि खुराक दर क्षेत्र के आकार, गहराई और सामग्री को विकिरणित किए जाने पर निर्भर करती है। प्रयोगात्मक सेटअप के साथ फिल्म को उजागर करना हमें एक शुद्ध ऑप्टिकल घनत्व प्रदान करता है, और फिल्म अंशांकन वक्र का उपयोग करके, हम तब संबंधित खुराक निर्धारित कर सकते हैं। जब तक फिल्म विकिरणित किया गया था द्वारा इस खुराक विभाजित, हम खुराक दर मिलता है । इस खुराक दर का उपयोग दिए गए प्रयोगात्मक सेटअप के लिए वांछित खुराक देने के लिए एक्सपोजर समय की गणना करने के लिए किया जा सकता है। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल फिल्म डॉसिमेट्री से जुड़ी कई बारीकियों को संभालती है। उदाहरण के लिए, एक्सपोजर के बाद, फिल्म की सक्रिय परत में रासायनिक प्रतिक्रियाओं को लगभग पूरा करने के लिए लगभग 24 घंटे की आवश्यकता होती है। समय की इस राशि के लिए इंतजार नहीं एक कम ऑप्टिकल घनत्व के लिए नेतृत्व करेंगे।

किसी भी अध्ययन के लिए प्रजनन योग्य डोसिमेट्री के लिए किसी दिए गए विकिरण के कई प्रमुख तत्वों को जानना और समझना महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, अन्य शोधकर्ताओं को इस्तेमाल किए गए विकिरण के मेक और मॉडल को जानना और विस्तार करना महत्वपूर्ण है, स्रोत प्रकार (एक्स-रे, रेडियोधर्मी, आदि), ऊर्जा, आधा मूल्य परत, क्षेत्र का आकार, सतह और स्रोत के लिए आइसोसेंटर दूरी, सामग्री का आकार विकिरणित, विकिरणित सामग्री के बाद पहले और बैकस्कैटर से पहले और बैकस्कैटर, प्रयोग-विशिष्ट खुराक दर, अंश शिमा, सटीक डोसिमेट्री उपकरण का उपयोग किया जाता है, और डोसिमेट्री प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है। जानकारी के इन बिंदुओं के सभी क्या एकजुट किसी भी जानवर या सेल¹⁹को एक खुराक देने से पहले एक दिया किरण की गुणवत्ता का वर्णन कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल और दूसरों से जानकारी का एक और प्रासंगिक बिंदु यह है कि प्रोटोकॉल 1 में प्राप्त खुराक दर बस विकिरण का उत्पादन किया जा रहा है । किसी भी प्रयोग के लिए एक उत्पन्न रेडियोक्रोमिक फिल्म अंशांकन वक्र (प्रोटोकॉल2)के साथ तुलना करके उस विशेष सेटअप(प्रोटोकॉल 4)के लिए खुराक दर को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है।

इन विट्रो प्रयोग कैंसर सेल लाइनों के रेडियोबायोलोजिक व्यवहार के बारे में महत्वपूर्ण विवरण प्रदान करता है। इन विट्रो क्लोनोजेनिक सेल अस्तित्व परिखता है सही अनुमान है और एक सेल लाइन²⁰के अंतर्निहित रेडियो संवेदनशीलता की मात्रा, बाद में सेलुलर या छोटे पशु प्रयोगों में अंश कार्यक्रम के डिजाइन में सहायता²¹। विशेष रूप से, ये α और β के मापदंडों के लिए अनुमानित मूल्यों को बताते हैं जो समीकरण के अनुसार रेडियोथेरेपी के जवाब में सेल मृत्यु की भविष्यवाणी करने के लिए रैखिक-क्वाड्राटिक मॉडल में उपयोग किए जाते हैं:

(समीकरण 9)

जहां एस एफ क्लोनोजेनिक रूप से व्यवहार्य कोशिकाओं का जीवित अंश है, डी जीवाई में विकिरण खुराक है, और α और β पैरामीटर²²फिट हैं। α/β अनुपात सेलुलर रेडियो-संवेदनशीलता का एक अंतर्निहित उपाय प्रदान करता है, जिसमें उच्च मूल्य सेल लाइन²²की बढ़ी हुई संवेदनशीलता से सहसंबद्ध हैं । क्योंकि यह कार्यात्मक संबंध खुराक के संबंध में गैर-रैखिक है, रेडियोथेरेपी अंश योजना के जीवविज्ञान प्रभाव न केवल कुल वितरित खुराक से संबंधित हैं बल्कि अंशों की संख्या और आकार²³भी हैं। जीवविज्ञान प्रभावी खुराक (बिस्तर) एक ऊतक को दी जाने वाली सच्ची जैविक खुराक का एक उपाय है और विभिन्न अंशों की सीधी तुलना की अनुमति देता है^24,25। बिस्तर समीकरण केवल α के एक अनुमान की आवश्यकता है β/

(समीकरण 14)

जहां एन खुराक डी क्लोनोजेनिक सेल अस्तित्व के अंशों की संख्या है परख α β अनुमान/ यदि उपचार समूहों में बिस्तर के भीतर या प्रयोगों के बीच समान नहीं है तो रेडियोथेरेपी (या अन्य तौर-तरीकों के साथ रेडियोथेरेपी के संयोजन) के ऊतक या अंग प्रतिक्रिया के बारे में गलत निष्कर्ष निकाले जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, 5 Gy के 4 अंशों की तुलना में 10 Gy के 2 अंश एक ही बिस्तर नहीं निकलते हैं, और इस प्रकार इन डोजिंग योजनाओं की तुलना सीधे जीवविज्ञान प्रतिक्रिया के संदर्भ में नहीं की जा सकती है। बिस्तर समीकरण, जबकि रैखिक-चतुर्भुज मॉडल में अंतर्निहित सीमाओं के कारण अपूर्ण, मज़बूती से प्रयोगात्मक उपचार शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए समान प्रभाव का अनुमान^24,25।

क्लोनोजेनिक सेल अस्तित्व परिष्कार स्पष्ट रूप से कैंसर मॉडल में रेडियोथेरेपी प्रभावों का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन इन विट्रो प्रयोग कैंसर सेल रेडियोबायोलॉजी के मशीनी विवरणों का पता लगाने के लिए कई अतिरिक्त विकल्प प्रदान करता है। क्लोनोजेनिक सेल सर्वाइवल परख के सरल संशोधनों का उपयोग कुछ रेडियो-संवेदीकरण कीमोथेरेपी के लिए कार्रवाई के तरीकों को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जैसे कि paclitaxel या etoposide^26,27। इसके अलावा विट्रो प्रायोगिक विकल्पों में विशिष्ट सेलुलर मरम्मत मार्गों की जांच करने के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री अध्ययन शामिल हैं, जैसे γ-एच2एक्स फोसी और/या 53BP1 डबल फंसे डीएनए ब्रेक रिपेयर²⁸के लिए धुंधला । इन प्रयोगों विशेष रुचि की हो सकती है जब संयोजन चिकित्सा के साथ एक ही रूप के रूप में रेडियोथेरेपी की तुलना, खासकर जब एक दिया सेल लाइन के लिए यंत्रवादी विवरण की जांच । अन्य प्रायोगिक विकल्पों में विभिन्न चिकित्सीय परिस्थितियों^29,30,31के तहत कोशिका मृत्यु के तरीके (यानी एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस, माइटोटिक तबाही आदि) के विकिरण या विश्लेषण के लिए कोशिका की भड़काऊ प्रतिक्रिया की जन्मजात भूमिका की जांच करने के लिए साइटोकिन माप शामिल हैं। प्रयोग के इस प्रकार के पूरक या पशु प्रयोग की जगह और एक कैंसर सेल लाइन रेडियोबायोलॉजी की एक और अधिक पूरी समझ प्रदान कर सकते हैं । आचरण करने के लिए अतिरिक्त प्रयोगों की पसंद के बावजूद, प्रोटोकॉल 3 में वर्णित एक मानक क्लोनोजेनिक सेल सर्वाइवल परख सेल लाइन का एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक रेडियोबायोलोजिक आकलन है।

क्लोनोजेनिक परख और विकिरण डोसिमेट्री शोधकर्ता को अधिक सीधे नैदानिक परिदृश्यों के समान प्रयोगों की योजना बनाने का साधन प्रदान करते हैं। प्रीक्लिनिकल कैंसर छोटे कृंतक मॉडल के अलावा, अकेले विकिरण की प्रतिक्रिया का अध्ययन करना या वीवो में उपचार योजना के संदर्भ में संभव है। जानवरों का उपयोग करने से पहले, विशिष्ट सेटअप के सापेक्ष खुराक उत्पादन का निर्धारण करना महत्वपूर्ण है यदि यह खुराक^{उत्पादन 32,33}के निर्धारण के लिए उपयोग किए जाने वाले सेटअप से अलग है। जब यह & 10 मिमी के क्षेत्र के आकार के लिए एक खुराक दर का निर्धारण करने के लिए आता है, एक आयनीकरण कक्ष का उपयोग एक छोटे से क्षेत्र के भीतर संरेखण और आंशिक मात्रा औसत प्रभाव^३३के कारण कम सटीक हो जाता है । विगो इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रयोगों के संयोजन में उत्पादन निर्धारित करने के लिए रेडियोक्रोमिक फिल्म का उपयोग पिछले 16 , 34 , 35 ,^{36,37,37 , 38}में उत्पादन और खुराक जमाव निर्धारित करने के लिए किया गया है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, glacial	Sigma-Aldrich	A6283	This or comparable glacial acetic acid products are acceptable.
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158	This or comparable crystal violet products are acceptable.
Digital Baraometer	Fisher Scientific	14-650-118	For pressure and temperature measurements.
Electrometer	Standard Imaging	CDX 2000B	Calibrated by an ADCL; Need correction factor, Pelec
Film	Gafchromic	EBT3 Film	Comes in sheets of 25; calibration films and experimental films must come from same set
Ionization Chamber	Farmer	PTW TN30013	Calibrated by an ADCL @ two calibration points
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	This or comparable methanol products are acceptable.
Photo Scanner	Epson	Perfection V700	Equivalent scanners are V800, V10000, V11000, V12000
XenX	Xstrahl	NA	Irradiator used.