Summary
Stråling dosimetry gir en teknikk for å forbedre nøyaktigheten av prekliniske eksperimenter og sikre at strålingsdoser levert er nært knyttet til kliniske parametere. Denne protokollen beskriver tiltak som skal tas i hver fase under prekliniske strålingseksperimenter for å sikre riktig eksperimentell design.
Abstract
Stråling dosimetry er avgjørende i nøyaktig levering og reproduserbarhet av strålingsordninger i prekliniske modeller for høy translasjonell relevans. Før du utfører in vitro- eller in vivo-eksperimenter, må den spesifikke doseproduksjonen for irradiatoren og individuelle eksperimentelle design vurderes. Ved hjelp av et ioniseringskammer, elektrometer og fastvannsoppsett kan doseutgangen av brede felt ved isocenter bestemmes. Ved hjelp av et lignende oppsett med radiokrome filmer i stedet for ioniseringskammeret, kan dosepriser for mindre felt på forskjellige dybder også bestemmes. In vitro klonogene overlevelsesanalyser av kreftceller som svar på strålebehandling er billige eksperimenter som gir et mål på iboende radiofølsomhet av cellelinjer ved å tilpasse disse dataene med den tradisjonelle lineære kvadratiske modellen. Modellparametere anslått fra disse analysene, kombinert med prinsippene for biologiske effektive doser, gjør det mulig å utvikle varierende fraksjoneringsplaner for strålebehandling som gir tilsvarende effektive doser i tumorbærende dyreforsøk. Dette er en viktig faktor å vurdere og korrigere for i å sammenligne in vivo strålebehandling tidsplaner for å eliminere potensielle forvirrende resultater på grunn av varians i de leverte effektive doser. Samlet gir denne artikkelen en generell metode for doseutgangsverifisering prekliniske dyre- og kabinettradioradioatorer, in vitro-vurdering av radiofølsomhet og verifisering av strålingslevering i små levende organismer.
Introduction
Kreft representerer kollektivt den nest ledende dødsårsaken i USA og i mange land rundt om i verden1. Strålebehandling er en hjørnestein i behandlingen for mange tumorundertyper og administreres til omtrent halvparten av alle kreftpasienter2,3. Pasientutfall for nesten alle kreftformer har forbedret seg over tid etter hvert som utstyr som brukes til å levere strålingsdoser har stadig avansert og noen effektive multimodalterapitilnærmingerble utviklet 4,5,6,men tilbakefall og dødelighet for pasienter med visse typer svulster forblir høye7,8,9. Dermed fortsetter strålebehandling for kreft å være et aktivt område for grunnleggende og klinisk forskning. Mange prekliniske strålebehandlingsstudier benytter bruk av småskala irradiatorer for å levere strålingsdoser til in vitro- eller dyremodeller av kreft. Med en rekke potensielle eksperimenter for å gjennomføre å utforske mekanistiske radiobiologidetaljer eller nye behandlinger, kan det oppstå vanlige fallgruver som fører til feil konklusjoner, dårlig reproduserbarhet og bortkastede ressurser. Disse fallgruvene faller innenfor tre viktige områder: irradiator dosimetry, in vitro karakterisering av modellcellelinjer, og in vivo bestråling tidsplan og oppsett. Nøyaktige og reproduserbare resultater fra mer avanserte eksperimenter er vanskelig å oppnå uten forutgående oppmerksomhet til disse grunnleggende aspektene ved strålebehandlingsforskning.
Protokollen som er beskrevet her beskriver en generalisert strategi for å unngå eller redusere disse problemene og trekker på flere tidligere utviklede metoder beregnet for uavhengig bruk. Disse distinkte metodene har blitt slått sammen slik at en forsker som er interessert i å begynne eller forbedre prekliniske strålebehandlingseksperimenter, kan bruke dette som en robust eksperimentell layout. Det foreslåtte rammeverket inkluderer metodikk for igangkjøring av småskala dyreradiradiatorer, for å bestemme grunnleggende radiobiologiske egenskaper av modellkreftcellelinjer, og for riktig utforming og administrering av en nedsendelses- og fraksjoneringsplan for in vivo tumormodeller.
Protocol
Alle trinnene i denne protokollen som involverte bruk av laboratoriedyr, inkludert håndtering og prosedyrer, ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved West Virginia University i Morgantown, West Virginia (Protokollnummer: 1604001894).
1. Bestemmelse av doseutgang
- Bruk denne protokollen, basert på protokollen "In-phantom Method" fra American Association of Physicists in Medicine Task Group (AAPM TG) 6110 og ligner på igangsettingsprotokollen satt av Xstrahl, for å bestemme stråleutgang av den lille dyrebestråleren med hensyn til bestemt geometri under følgende oppsettsforhold.
- Sett irradiatoren til å levere stråling ved 220 kVp og 13 mA, med et åpent felt (17 cm x 17 cm) plassert i isocenter, eller 35 cm fra kilden. I tillegg filtrerer du strålen med et 0,15 mm Cu-filter med bredt fokus. Noen cellulære irradiatorer inneholder bare en radioaktiv kilde, denne protokollen kan bare brukes til røntgenirradiatorer.
- Juster fantomene med fast vann i følgende rekkefølge: 1 cm skive, 2 cm skive med ioniseringskammerspor, 2 cm skive, 1 cm skive. Stabling av fastvannsfantomene i denne rekkefølgen plasserer ioniseringskammeret på en dybde på 2 cm, slik at 4 cm også for backscatter. Se Figur 1 for en grafisk fremstilling av dosimetryoppsettet.
MERK: For å imøtekomme den store, ganske tunge bunken med fast vann, anbefaler forfatterne oppkjøpet av en tilpasset 3D-trykt sofa med variabel støtte for å sikre at fantomstakken er jevn og i riktig avstand fra kilden over overflaten av materialet, ikke bare i midten.
- Bruk måleutstyret (det vil si ADCL kalibrert ioniseringskammer, elektrometer) og en forklaring på korreksjonsfaktorer som brukes i henholdsvis Materials- og tabell 1.
MERK: At ADCL gir verdier på Nk på et par punkter for forskjellige halvverdilag (HVL, mål på strålekvalitet). Verdien av Nk som skal brukes i protokollen bør baseres på en interpolering av ADCL-verdiene for enhetens målte HVL. Produsenten målte HVL av vår enhet, og vi brukte det i vår dosehastighet utgang bestemmelse. - Sett opp fantomstakken, og sett inn ioniseringskammeret i fantomet som angitt i trinn 1.1.2.
- Juster fantomstakken slik at kilden til overflateavstand (SSD), eller avstanden fra strålingskilden til den første overflaten, er 33 cm når den er riktig jevnet ut.
MERK: Forfatterne foreslår å lage en tilpasset, 3D-trykt sofa, stor nok til å støtte dimensjonene på de faste vannplatene. I tillegg har den som brukes i denne protokollen en justerbar komponent for utjevling av fantomstakken.
- Juster fantomstakken slik at kilden til overflateavstand (SSD), eller avstanden fra strålingskilden til den første overflaten, er 33 cm når den er riktig jevnet ut.
- Ta gjennomsnittet av tre separate røntgeneksponeringer, ett minutts avlesninger med elektrometerbiasspenningen satt til 300 V. Resultatet vil bli beterminert M+.
MERK: Bestråling utføres med instrumentet satt til å levere stråling ved 220 kVp og 13 mA. Dette er det samme for de neste to trinnene (trinn 1,5-1,6). For brukersikkerhet må du sørge for at dørene forblir lukket under behandlinger. - Utfør et annet sett med tre separate røntgeneksponeringer, 1 min avlesninger med elektrometerbiasspenningen satt til -150 V. Resultatet vil bli beterminert ML.
- Utfør et annet sett med tre separate røntgeneksponeringer, 1 min avlesninger med elektrometerbiasspenningen satt til -300 V. Resultatet vil bli beterminert MH, eller også M-.
- Beregnhenholdsvis P pol og Pion ved hjelp av henholdsvis Formel 1 og Ligning 2 som beskrevet nedenfor:
(Ligning 1)
(Ligning 2) - Mål temperaturen, i Celsius, og trykket, i kPa, inne i irradiatoren ved hjelp av et kalibrert digitalt termometer og barometer. Deretter beregner du PTP som angitt nedenfor i Formel 3.
MERK: Denne beregningen forutsetter at ADCL brukte standard temperatur- og trykkverdier på 22 °C og 101,33 kPa når de oppgir verdien for luft kermakalibreringsfaktoren.
(Ligning 3) - Beregn korrigert kammerlesing, M, ved å multiplisere råkammeravlesningen, MH, av Pelec, Ppol, Pionog PTP. Denne ligningen finner du nedenfor i Formel 4.
MERK: Denne beregningen forutsetter at ADCL utførte kalibreringen med bias-spenningen satt til -300V, som er en ganske vanlig praksis.
(Ligning 4). - Multipliser den korrigerte kammeravlesningen ved Nk, [(μno/p)wluft]vann,PQ, chamog P-hylse . P-hylse er kun nødvendig for målinger oppnådd i vann. Derfor, for denne protokollenP-hylsen er bare 1.
MERK: Ved hjelp av betingelsene i denne protokollen gir de tre sistnevnte elementene en verdi på 1,0731. Denne verdien avhenger av strålekvaliteten, så HVL må være kjent for å bestemme den. Verdien på 1,0731 er spesifikk for vår enhet og er gitt som et eksempel. Hvis du vil bestemme verdiene for PQ,cham og [(μen/p)wluft]vann som er spesifikke for enheten, bruker du den målte HVL og interpolate fra tabell VIIog tabell VIII, og riktig for referansefeltstørrelsen i henhold til figur 3 og figur 4 fra AAPM TG61-protokollen10. I vårt tilfelle, multiplisere Nk med 1.0731 gir dosen til vann, Dw, i Gy for en nominell tid på 1 min, forutsatt at ADCL Nk verdien er gitt i Gy / Coulumbs. - Bestem slutteffekten av irradiatoren som brukes. Når røntgenstrålene først genereres, stiger utgangen til sin fulle verdi over noen begrenset tid. På samme måte, når røntgenkilden er slått av, reduseres utgangen til null over noen begrenset tid.
- Redegjør for tiden for denne overgangen, eller slutteffekten. Dette kan gjøres ved å ta gjennomsnittet av tre avlesninger med elektrometer bias spenning satt på -300 V, for en rekke tidsinnstillinger. Gjør dette i 6, 12, 18, 24, 30 og 60 sekunder.
- Plott elektrometeravlesningene mot tiden og finn den beste rette linjen. Den totale tiden, t, for en 1 minutt behandling kan beregnes ved ligning 5:
(Ligning 5).
- Beregn dosehastigheten for en gitt irradiator ved ligning 6:
(Ligning 6)
(Ligning 1)
(Ligning 2)
(Ligning 3)
(Ligning 4).
(Ligning 5).
(Ligning 6)2. Opprette en radiokrom filmkalibreringskurve
- Hvis du vil ha en liste over nødvendige materialer, kan du se Materials tabell.
- Bruk et nesten identisk oppsett som forrige protokoll, plasser filmen på en 2 cm dybde i fantomstakken med fast vann. Rekkefølgen på fantomer med fast vann er ubetydelig så lenge det er 2 cm fast vann over og 4 cm fast vann under for oppbygging og ryggsedlereffekter.
- Ved hjelp av den bestemte dosen som er bestilt i protokoll 1, må du bestemme behandlingstidene for dosene som er oppført i tabell 2 ved hjelp av ligningen 7:
(Ligning 7) - Forbered flere filmstykker som sikrer at hver film er av samme størrelse og forblir i samme retning fra behandling gjennom skanningoppkjøp. Dette kan gjøres ved å plassere en liten diagonal kutt i nedre venstre hjørne. Hver film fra dette punktet fremover må være fra samme filmparti.
MERK: Klargjør 3 separate repliker for hvert dosepunkt som skal vurderes. - Skann de kuttede bitene ved hjelp av en 48-biters fargefotoskanner med alle korrigeringer slått av. Kontroller at hver film er plassert i nøyaktig midten av skannesengen. Verdiene som er oppnådd er forhåndseksponeringsskanninger som brukes til å bestemme den ueksponerte optisketettheten 11,12. Lagre alle bildene i . Tiff filformat for å unngå komprimering av viktige data.
MERK: Forfatterne anbefaler å skanne filmene tre ganger og bruke det oppnådde gjennomsnittet som enkeltverdi for en gitt film. - Begynn bestrålingen av filmene ved å plassere et stykke film på toppen av 4 cm fast vann og plassert de resterende 2 cm med fast vann over, som beskrevet tidligere i denne delen.
- Juster fantomsettet slik at filmen er den samme avstanden fra kilden som ioniseringskammeret var når du bestemmer doseproduksjonen. Dette er det isosentriske punktet til irradiatoren.
- Programmer behandlingstiden beregnet i trinn 2.3 ovenfor for en foreskrevet dose.
- Gjenta behandlingen for hver av dosene som er oppført i tabell 2.
- La filmer hvile i 24 timer beskyttet mot lys.
- Få ettereksponeringsfilmskanninger på samme måte som ovenfor.
- Importer bilder til ImageJ analyseprogramvare og utfør alle målinger på den røde kanalen.
- Dra bildet i . Tiff filformat i ImageJ.
- Klikk på bilde rullegardinmenyen. Velg Farge fra bilde rullegardinmenyen. Velg delt kanal fra Farge-alternativet.
- Bruk bare den røde bildekanalen til å tegne et interesseområde ved hjelp av rektangelverktøyet. Trykk CTRL+M. Transkribere gjennomsnittsverdi fra resultatvinduet.
- Gjenta trinn 2.12.1-2.12.4 for alle skannede filmer.
- Få pikselverdien i en sentralt plassert 1 cm med 1 cm firkant for både de ueksponerte og eksponerte filmene. Disse verdiene vil bli betegnet som henholdsvis PVU(D) og PV(D) og kan brukes til å beregne den optiske netttettheten som beskrevet i Formel 8.
(Ligning 8) 13.10.
- Gjenta trinn 2.13 for hvert par filmbilder, både foreksponering og etter eksponering.
- Plott en graf av dosen versus netto optisk tetthet og monter kurven til et kubikkpolynomi i formatet y = ax3 + bx2 + cx + d. Du finner et eksempel i figur 2B.
(Ligning 7)
(Ligning 8) 13.10.
3. Fastsettelse α/β verdi for spesifikke kreftcellelinjer via klogen analyse
MERK: Følgende protokoll er en modifisert versjon av metodene beskrevet av Franken et al14 og kan ses i figur 3.
- Grow celler til ~ 80% samløpet. Unngå å bruke over-confluent kilder til celler for dette eksperimentet, da det er nødvendig at cellene er i loggfasen av cellevekst. For de representative klogeniske analyseresultatene som vises i figur 3C,ble hjernetropiske MDA-MB-231 brystkreftceller dyrket i Dulbeccos Modifiserte Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% fosterbovinserum og penicillin /streptomycin og ble inkubert ved 37 °C og 5 % karbondioksid i en fuktig inkubator.
- Seed cellene ved ønsket tetthet for kolonianalysen. Nøyaktige fortynninger under såingen er avgjørende for å bestemme analysens platingeffektivitet. Pass på å plate flere repliker.
- Fortsett med dette trinnet hvis strålebehandling vil gå foran celleplating (figur 3A). Alternativt kan du gå videre til trinn 3.4 hvis celleplating vil gå forut for strålebehandling.
- Utfør ønsket strålebehandling på kulturflasker. Eventuelle tilleggsbehandlinger (f.eks. medikamentbehandlinger) kan utføres når som helst før eller etter dette. For de representative resultatene i figur 3Coppstod strålebehandling etter platingceller, beskrevet i trinn 3.4.
- Trekk ut cellene ved hjelp av foretrukket trypsiniseringsmetode og opprett en enkelt cellesuspensjon. Fjern kulturmedier og tilsett rekombinantenzym (f.eks. TrypLE Express) for å løsne celler fra kolben. Inkuber celler med enzymet i ca. 3 minutter til cellene ble løsrevet som oppdaget ved hjelp av et lett mikroskop. Nøytraliser enzymet ved hjelp av et likt volum av cellekulturmedier. Sentrifugeceller ved 300 x g i 10 min og resuspend til ønsket konsentrasjon i kulturmedium.
- Plate cellene på ønskede tettheter i flere replikerer.
- Skift ut med friskt medium etter de første 24 timer.
- Fortsett å erstatte medier hver 2-3 dager.
- Fortsett å kultere celler til kontrollkolonier overstiger 50 celler per koloni, ~ 9-14 dager. Kontrollkolonier er de behandlingsgruppene som ikke får strålingsdoser. For eksperimenter som bruker narkotikabehandlinger også, vil en annen kontrollgruppe med narkotikadosering, men ingen strålebehandling også være nødvendig.
- Fortsett med dette trinnet når såing celler før strålebehandling (Figur 3B).
- Trekk ut celler ved hjelp av foretrukket trypsiniseringsmetode og opprett en enkelt cellesuspensjon.
- Plasser celler på ønskede tettheter i flere repliker.
- La cellene holde seg til platen over natten.
- Utfør ønskede strålingsdoser. Ytterligere behandlinger, som dosing av legemidler, kan utføres når som helst før eller etter dette trinnet, så lenge cellene har festet seg til sine behandlingsplater. For de representative resultatene i figur 3Cble 1250 hjernetropiske MDA-MB-231-celler belagt før behandling (trinn 3.4). Deretter ble celler behandlet med 15 nM doksorubicin 3 timer før bestråling med 3 Gy røntgenstråler.
- Sett på plass utskriftsmaterialet etter de første 24 timer.
- Skift ut medier hver 2-3.
- Kultur de behandlede cellene til kontrollgruppekolonier overstiger 50 celler, ~ 9-14 dager. Kontrollkolonier er de behandlingsgruppene som ikke får strålingsdoser. For eksperimenter som bruker narkotikabehandlinger også, vil en annen kontrollgruppe med narkotikadosering, men ingen strålebehandling også være nødvendig.
- Fjern kulturmedier fra brønner eller retter, og vask med PBS.
- Fest celler i 15 minutter i en 1:7 (v:v) løsning av is eddiksyre og metanol.
- Fjern fikseringsløsningen.
- Etter fiksering, flekkceller i 30 minutter, eller 2 timer hvis tiden er tilgjengelig, ved romtemperatur med en 2,5-5,0 mg / ml løsning av krystallfiolett i en 4:1 (v: v) løsning av destillert vann og metanol.
- Fjern fargingsløsning og vask celler i et stort vannbad med romtemperatur.
MERK: Ikke vask under rennende vann. - Tell det resulterende antall kolonier i hver behandlingsgruppe og beregn overlevelsesfraksjonen av hver plate.
- Plott overlevelsesfraksjonen mot den tilsvarende dosen som leveres, og monter kurven med en eksponentiell passform.
- Hvis du vil α/β-verdien, bruker du en eksponentiell tilpasning av plottet ovenfor til å estimere verdiene for hver av de justerbare parameterne i den lineære kvadratiske ligningen som du finner nedenfor:
(Ligning 9)
MERK: Bestråling av celler kan vanligvis gjøres i isocenter uten kollidering forutsatt at feltstørrelsen er stor nok til å romme godt plater eller petriskåler. Potensielle fallgruver i denne protokollen kan omfatte utbytter som ingen kolonidannelse, betydelig cellemigrasjon med klar cellevekst, men ingen sanne kolonier, eller forurensning på grunn av behandling i et ikke-sterilt irradiatorkammer.
4. Fastsettelse av den spesifikke doseutgangen for variabel eksperimentell design
- Bestem deg for ønsket feltstørrelse og avstand fra kilden.
MERK: Collimation vil endre dosehastigheten uansett størrelsen eller avstanden til kollmatoren fra røntgenkilden. - Bruk av fantomer med fast vann for å gi oppbygging og bakgrunnsscatter, plasser et stykke film i riktig retning som best skildrer eksperimentell design.
MERK: For ethvert eksperimentelt oppsett kan fast vann ikke gi den mest nøyaktige representasjonen av et gitt design. I stedet anbefaler vi å bruke selve eksperimentets fartøy (det vil vil vil at petriskål, brønnplater, små dyrefantomer osv.). - Bestråle filmer i 1 (N = 3) og 2 (N = 3) minutter.
- La filmer hvile i 24 timer beskyttet mot lys.
- Bestem den optiske netttettheten til hver av filmene etter prosedyrene fra avsnitt 2. Bruk filmkalibreringskurven til å bestemme dosen fra den optiske netttettheten.
- Bestem dosen ved 1 minutt, D1, som utgangsdosehastighet, Ḋ, for dette eksperimentelle oppsettet definert av Formel 10 som følger:
(Ligning 10) - På samme måte kan du caluclate dosen ved 2 minutter med ligning 11 som følger:
(Ligning 11) - På grunn av slutteffekten kan dosehastigheten for beregningene ovenfor være litt annerledes. Av denne grunn til å beregne Dexp for ønsket eksperimentell design, bruk et gjennomsnitt av den enkelte Dexp som angitt i Formel 12:
(Ligning 12) - Ved hjelp av dette gjennomsnittet, definere tiden for behandling til ønsket dose for dette oppsettet i Formel 13:
(Ligning 13)
(Ligning 10)
(Ligning 11)
(Ligning 12)
(Ligning 13)5. Behandling av mus som bærer svulster i anatomisk sted av interesse
- Bedøve mus med trygge og humane anestesi teknikker godkjent av institusjonens IACUC.
- Plasser bedøvet dyr i tilbakeholdenhet som angitt i ønsket eksperimentell design.
- Dette trinnet er valgfritt, hvis ikke tilgjengelig gå videre til trinn 5.6. Få et radiogram, ved hjelp av et innebygd portalkamera, av musen uten collimation ved hjelp av et aluminiumsfilter.
- Få et nytt radiogram med kollidering på plass.
- Overlegg radiogrammer i ImageJ for å demonstrere stråleposisjonering.
- Ved hjelp av den forhåndsbestemte α/β-verdien bestemmer du doseordningen som gir den mest fornuftige tilnærmingen til å svare på et forskningsspørsmål (det vil si hvis du ønsker å modellere effekten av en dose på 30Gy levert i 10 brøkdeler av 3 Gy, men bare ønsker å gi fire fraksjoner). Ved hjelp av ligning 14, med en antatt α/ β verdi på 10 (denne verdien kan bestemmes for individuelle kreftcellelinjer i protokoll 3)og en SENG som ligner på 30 Gy / 10 F, behandle med 24 Gy i 4 brøkdeler av 6 Gy.
- Behandle dyr for foreskrevet tid gitt for ønsket dose.
6. Histologisk bekreftelse på dosedeponering in vivo
- Etter protokoll 5, samle vev av interesse innen 1 time etter behandling15,16. Etter vevshøsting fortsetter du med foretrukket immunohistochemistry-protokoll. Et eksempel er gitt nedenfor.
- Perfuse dyr med iskald 4% paraformaldehyd (PFA).
- Post-fix i PFA ved 4 °C.
- Etter fiksering, fikse vev sekvensielt i 10%, 20%, og 30% sukrose i 24 timer hver ved romtemperatur.
- Bygg inn vev i gelatin og sekvensielt fikse i 4% PFA og igjen i 10-30% sukrose i 24 timer hver ved romtemperatur.
- Trim blokk og plasser ved -80 °C i 30 minutter.
- Skjær vevet i 20-30 μm seksjoner.
- Immunstain glir som frie flytende seksjoner i en seks brønnplate17,18.
- Vask tre ganger og permeabiliser i 30 minutter på en shaker med 1,83% lysin i 1% Triton, og 4% varmeinaktivert geiteserum.
- Inkuber seksjoner med anti-γH2AX antistoff i 24 timer, etterfulgt av en 2 timers inkubasjon med ønsket sekundært antistoff.
- Dekslerslips glir med glassdeksler med foretrukne monteringsmedier.
- Bilde på et fluorescerende mikroskop.
Representative Results
Etter protokoll 1 vil gi en dosehastighet i Gy/min, som er spesifikk for irradiatoren som brukes. Men uavhengig av type irradiator, med en kjent dosehastighet, kan en kalibreringskurve genereres ved hjelp av protokoll 2 som gir lignende filmer og en lignende kalibreringskurve som i figur 2A-B. En vellykket analyse fra protokoll 3 vil gi distinkte, godt avgrensede kolonier av celler som flekker homogent fiolett. Anslaget α/β sammenlignes med litteraturverdier eller andre behandlingsgrupper for å tolke radiofølsomheten til den gitte cellelinjen. Ved hjelp av kalibreringskurven som er utviklet etter protokoll 2 og vises i figur 2B,vil protokoll 4 gi to filmprøver som ligner figur 2A som kan brukes til å estimere nødvendige eksperimentelle bestrålingstider. Hvis et bildekamera om bord er tilgjengelig for irradiatoren som brukes, kan radiogrammer av små dyr oppnås med og uten kollidering. Overlegg av disse bildene vil demonstrere nøyaktig posisjonering av den kolleinerte strålingsstrålen i forhold til det lille dyret som behandles som avbildet i figur 4A. Vellykket dosedeponering i protokoll 5 kan bekreftes etter protokoll 6. En indikasjon på at stråling blir deponert i en in vivo eller in vitro systemer er gjennom påvisning av dobbelt strandet DNA pauser. Illustrert i figur 4B, den samme musen behandlet utelukkende gjennom høyre halvkule i figur 4A, viser positiv γH2AX farging bare på den behandlede halvkule. I dette tallet er kjernene farget med DAPI for å vise to ting; 1) hele er av hjernen som anti γH2AX antistoff ble brukt på under histologisk analyse, og 2) den ubehandlede halvkule av hjernen forblir uopphetet.
Figur 1: Grovt oppsett av ioniseringskammer og vann fantom satt opp for bestemmelse av doseproduksjon. Piktogrammet illustrerer et grunnleggende oppsett ved hjelp av de ulike komponentene som kreves for dosimetry ved hjelp av et ioniseringskammer og fantomer for fast vann i kabinettet til irradiatoren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generering av en kalibreringskurve ved hjelp av radiokrom film. (A)Representativ fargeendring av radiokrom film med økende dose. Øverst til venstre (0 cGy); nederst til høyre (2000 cGy). (B)Potensiell radiokrom filmkalibreringskurve som sammenligner netto optisk tetthet og dose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Clonogenic Analyse av kreftceller. Strålebehandling av celler kan gjøres før plating i seks brønnplater / petriretter (A), eller etter (B). I panelet (C)vises et representativt bilde av en vellykket klogen analyse med MDA-MB-231 brystkreftceller etter å ha fulgt protokollseksjon 3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bruk av doble overlagsradiogrammer for posisjonering (hvis tilgjengelig) og positiv γH2AX immunohistokjemisk farging for bekreftelse av dosedeponering. (A)Representative overlags radiogrammer som viser plassering av strålingsstråle. (B) Representative resultater som indikerer dosedeponering til høyre halvkule som vist ved økt γH2AX intensitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Korreksjonsfaktor | Forklaring | |
| Nκ | Luft kerma kalibrering faktor | |
| [(μno/ρ)Wluft] vann | Rasjon av masseenergiabsorpsjonskoeffisienter av vann til luft; ca. 1,05 | |
| Pq,Cham Leilighet | Korreksjon regnskap for kammerstammen påvirker foton flyt perterbasjon av kammer; ca. 1.022 | |
| Pkappe | Korreksjon regnskap for hylse beskytte ionisering kammer; verdien av 1, som kammeret er vanntett | |
| Ppol | Korreksjonsfaktor som tar høyde for polaritet; bestemmes i protokoll 1 | |
| Pion (andre | Korreksjonsfaktor som tar høyde for ionrekombinasjon; bestemmes i protokoll 1 | |
| PTp | Korreksjonsfaktor acocunting for temerpature og press på dagen for eksperimentet; bestemmes i protokoll 1 | |
Tabell 1: Korreksjonsfaktorer som er nødvendige for fastsettelse av dosehastighet i protokoll 1.
| Dose | N |
| 0.5 | 3 |
| 1 | 3 |
| 2 | 3 |
| 3 | 3 |
| 4 | 3 |
| 6 | 3 |
| 8 | 3 |
| 10 | 3 |
| 12* | 3 |
| 15* | 3 |
| 20* | 3 |
| * Bare nødvendig for doser som overstiger 10 for individuelle eksperimenter. | |
Tabell 2: Doser som skal brukes i generering av radiokrom filmkalibreringskurve.
Discussion
Ovennevnte protokoll beskriver en brukervennlig tilnærming for stråling dosimetry, fastsettelse av α/β verdier i kreftcellelinjer, og et kort eksempel på en tilnærming for bestråling i en preklinisk modell av brystkreft hjernemetastase. Disse metodene kan brukes til å studere enhver modell av kreft og er ikke bare begrenset til hjernemetastase av brystkreft. I denne delen vil vi diskutere relevante vanskeligheter underliggende prekliniske strålebehandlingseksperimenter.
Dosimetry innebærer to deler: 1) kalibrere produksjonen med et bondekammer, slik at dosehastigheten til røntgenenheten er etablert, og 2) forberede et praktisk dosimetry målesystem ved hjelp av radiochromic film. Når det gjelder utgangskalibrering, gir TG-61 en reproduserbar metode i vann. Protokollen her bruker Gammex RMI 457 fast vann, som anbefalt av XStrahl, produsenten av irradiatoren. Selv om relativ dosimetry (profiler eller dybdedosekurver normalisert til maksimal dose) analyse med fast vann, godtar bedre enn 1% med vann, er det en forskjell på ca 3 til 4% i absolutt dose på grunn av en høyere masseenergiabsorpsjonskoeffisient for fast vann sammenlignet med vann. Men siden alle installasjoner av XStrahl-systemet bruker fastvannsprotokollen for utdatakalibrering, korrigerte vi ikke for disse forskjellene. Å vite utgangen tillater beregning av eksponeringstiden som kreves for å levere en ønsket dose. Å plassere film i samme oppsett som bondekammeret tillater oss å levere kjente doser til filmen. Skanning av filmen gir deretter optiske tettheter. Dosen til filmen kan deretter graferes mot tilsvarende netto optisk tetthet (forskjell i optisk tetthet etter og før eksponering). Dette gir en filmkalibreringskurve. Når vi endrer eksperimentelle oppsett, kan dosehastigheten i den situasjonen endres, siden dosehastigheten avhenger av feltstørrelse, dybde og materialet som bestråles. Å utsette film med det eksperimentelle oppsettet gir oss en netto optisk tetthet, og ved hjelp av filmkalibreringskurven kan vi deretter bestemme den tilsvarende dosen. Dele denne dosen da filmen ble bestrålt, får vi dosehastigheten. Denne dosehastigheten kan deretter brukes til å beregne eksponeringstiden for å levere en ønsket dose for det gitte eksperimentelle oppsettet. Protokollen beskrevet ovenfor håndterer flere nyanser knyttet til film dosimetry. For eksempel, etter eksponering, krever filmen ca 24 timer for de kjemiske reaksjonene i filmens aktive lag for å være nesten komplett. Hvis du ikke venter på denne tiden, vil det føre til en lavere optisk tetthet.
For at enhver studie skal ha reproduserbar dosimetry er det viktig å kjenne og forstå flere av de viktigste elementene i en gitt irradiator. Spesielt er det avgjørende å vite og detaljere til andre forskere om å lage og modellere irradiatoren som brukes, kildetypen (røntgen, radioaktivt, etc.), energi, halvverdilag, feltstørrelse, kilde til overflate og kilde til isocenteravstander, størrelse på materiale bestrålt, demping før og backscatter etter bestrålt materiale, eksperimentspesifikk dosehastighet, fraksjoneringsskjema, eksakt dosimetryutstyr som benyttes, og dosimetryprotokollen som brukes. Alle disse informasjonspunktene er det som beskriver strålekvaliteten til en gitt irradiator før du leverer en dose til et dyr eller celle19. Et annet relevant informasjonspunkt fra denne protokollen og andre er at dosehastigheten oppnådd i protokoll 1 bare er utgangen av irradiatoren som brukes. For et gitt eksperiment er det viktig å definere dosehastigheten for det bestemte oppsettet (Protokoll 4) sammenlignet med en generert radiokrom filmkalibreringskurve (Protokoll 2).
In vitro eksperimentering gir viktige detaljer om radiobiologisk oppførsel av kreftcellelinjer. In vitro klonogene celleoverlevelsesanalyser nøyaktig estimerer og kvantifiserer den iboende radiofølsomheten til encellelinje 20, som hjelper til med utformingen av fraksjoneringsplaner i påfølgende cellulære eller små dyreforsøk21. Spesielt sier disse omtrentlige verdiene for parametrene α og β som brukes i den lineære kvadratiske modellen for å forutsi celledød som svar på strålebehandling i henhold til ligningen:
(Ligning 9)
hvor SF er den overlevende fraksjonen av clonogenically levedyktige celler, D er strålingsdose i Gy, og α og β er montert parametere22. Forholdet mellom α/β gir et iboende mål på mobilradiofølsomhet, med høyere verdier som korrelerer med økt følsomhet for en cellelinje22. Fordi dette funksjonelle forholdet ikke er lineært med hensyn til dose, er de biologiske effektene av en strålebehandlingsfraksjonsordning ikke bare relatert til den totale leverte dosen, men også antall og størrelse påbrøker 23. Den biologiske effektive dosen (BED) er et mål på den sanne biologiske dosen som leveres til et vev og tillater direkte sammenligning av forskjelligefraksjoneringsordninger 24,25. BED-ligningen krever bare et estimat på α/β, og vises nedenfor:
(Ligning 14)
hvor n er antall fraksjoner av dose D. Clonogenic celle overlevelse analyser estimere α/ β og lette direkte sammenligning av strålebehandling fraksjonering ordninger via BED ligningen. Feil konklusjoner kan trekkes vedrørende en vevs- eller organrespons på strålebehandling (eller kombinasjoner av strålebehandling med andre modaliteter) hvis SENGEN i behandlingsgruppene ikke er rettferdig innenfor eller mellom eksperimenter. For eksempel gir 2 brøkdeler av 10 Gy sammenlignet med 4 brøkdeler av 5 Gy ikke samme seng, og disse dosingordningene kan derfor ikke sammenlignes direkte når det gjelder biologisk respons. BED-ligningen, mens den er ufullkommen på grunn av iboende begrensninger i den lineære quadratic-modellen, anslår pålitelig rettferdige effekter for et bredt spekter av eksperimentellebehandlingsforhold 24,25.
Clonogenic celle overlevelse analyser klart spille en viktig rolle i å studere strålebehandling effekter i kreftmodeller, men in vitro eksperimentering tilbyr en rekke ekstra alternativer for å utforske mekanistiske detaljer om kreftcelle radiobiologi. Enkle modifikasjoner av den klogene celleoverlevelsesanalysen ble brukt til å bestemme virkningsmåtene for noen radiosensibiliserende kjemoterapier, for eksempel paklitaksel eller etoposide26,27. Ytterligere in vitro eksperimentelle alternativer inkluderer immunocytochemistry studier for å undersøke spesifikke cellulære reparasjonsveier, for eksempel γ-H2AX foci og / eller 53BP1 farging for dobbelt strandet DNA break reparasjon28. Disse eksperimentene kan være av spesiell interesse når man sammenligner strålebehandling som en enkelt modalitet med kombinasjonsbehandlinger, spesielt når man undersøker mekanistiske detaljer for en gitt cellelinje. Andre eksperimentelle alternativer inkluderer cytokinmålinger for å undersøke den medfødte rollen til en celles inflammatoriske respons på bestråling eller analyser av modusen for celledød (det vil si apoptose, nekrose, mitotisk katastrofe, etc.) under forskjellige terapeutiskeforhold 29,30,31. Denne typen eksperimentering kan utfylle eller erstatte dyreeksperimentering og gi en mer fullstendig forståelse av en kreftcellelinjes radiobiologi. Uavhengig av valg av ytterligere eksperimenter å gjennomføre, er en standard klogen celleoverlevelsesanalyse som beskrevet i protokoll 3 en viktig første radiobiologisk vurdering av en cellelinje.
Clonogenic analyser og stråling dosimetry gi forskeren et middel til å nøyaktig planlegge eksperimenter for å ligne mer direkte kliniske scenarier. Med tillegg av preklinisk kreft små gnagermodeller, er det mulig å studere responsen på stråling alene eller i sammenheng med en behandlingsplan in vivo. Før du bruker dyr, er det viktig å bestemme den relative doseutgangen til det spesifikke oppsettet hvis det er forskjellig fra oppsettet som brukes til bestemmelse avdoseutgang 32,33. Når det gjelder å bestemme en dosehastighet for feltstørrelser på <10 mm, blir bruk av et ioniseringskammer mindre nøyaktig på grunn av justering i et lite felt og delvis volumsnitteffekter 33. Bruk av radiokrom film for å bestemme utgang i kombinasjon med in vivo immunohistokjemiske eksperimenter har blitt brukt til å bestemme utgang og dose deponering i de siste16,34,35,36,37,38.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer å gjøre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke mikroskopet og Animal Models Imaging Facilites ved WVU for bruk av utstyret deres støttet av tilskuddsnummer P20GM103434. I tillegg ble dette arbeidet støttet av tilskuddsnummer P20GM121322 fra National Institue of General Medical Sciences, av National Cancer Institute tilskuddsnummer F99CA25376801, og Mylan Chair Endowment Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | This or comparable glacial acetic acid products are acceptable. |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | This or comparable crystal violet products are acceptable. |
| Digital Baraometer | Fisher Scientific | 14-650-118 | For pressure and temperature measurements. |
| Electrometer | Standard Imaging | CDX 2000B | Calibrated by an ADCL; Need correction factor, Pelec |
| Film | Gafchromic | EBT3 Film | Comes in sheets of 25; calibration films and experimental films must come from same set |
| Ionization Chamber | Farmer | PTW TN30013 | Calibrated by an ADCL @ two calibration points |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | This or comparable methanol products are acceptable. |
| Photo Scanner | Epson | Perfection V700 | Equivalent scanners are V800, V10000, V11000, V12000 |
| XenX | Xstrahl | NA | Irradiator used. |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Allen, C., Her, S., Jaffray, D. A. Radiotherapy for Cancer: Present and Future. Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 1-2 (2017).
- Delaney, G., Jacob, S., Featherstone, C., Barton, M. The role of radiotherapy in cancer treatment: estimating optimal utilization from a review of evidence-based clinical guidelines. Cancer. 104 (6), 1129-1137 (2005).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Le, Q. T., Shirato, H., Giaccia, A. J., Koong, A. C. Emerging Treatment Paradigms in Radiation Oncology. Clinical Cancer Research. 21 (15), 3393-3401 (2015).
- Baumann, M., et al. Radiation oncology in the era of precision medicine. Nature Reviews Cancer. 16 (4), 234-249 (2016).
- Leeman, J. E., et al. Patterns of Treatment Failure and Postrecurrence Outcomes Among Patients With Locally Advanced Head and Neck Squamous Cell Carcinoma After Chemoradiotherapy Using Modern Radiation Techniques. JAMA Oncology. 3 (11), 1487-1494 (2017).
- Coy, P., et al. Patterns of failure following loco-regional radiotherapy in the treatment of limited stage small cell lung cancer. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 28 (2), 355-362 (1994).
- Achrol, A. S., et al.
- Ma, C. M., et al. AAPM protocol for 40-300 kV x-ray beam dosimetry in radiotherapy and radiobiology. Medical Physics. 28 (6), 868-893 (2001).
- Wang, Y. F., Lin, S. C., Na, Y. H., Black, P. J., Wuu, C. S. Dosimetric verification and commissioning for a small animal image-guided irradiator. Physics in Medicine and Biology. 63 (14), 145001 (2018).
- Wack, L., et al. High throughput film dosimetry in homogeneous and heterogeneous media for a small animal irradiator. Physical Medicine. 30 (1), 36-46 (2014).
- Devic, S. Radiochromic film dosimetry: past, present, and future. Physical Medicine. 27 (3), 122-134 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiation Research. 175 (6), 774-783 (2011).
- Zarghami, N., et al. Half brain irradiation in a murine model of breast cancer brain metastasis: magnetic resonance imaging and histological assessments of dose-response. Radiation Oncology. 13 (1), 104 (2018).
- Nwafor, D. C., et al. Loss of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) enzyme activity in cerebral microvessels is coupled to persistent neuroinflammation and behavioral deficits in late sepsis. Brain, Behavior, and Immunity. , (2019).
- Amtul, Z., Hepburn, J. D. Protein markers of cerebrovascular disruption of neurovascular unit: immunohistochemical and imaging approaches. Reviews in Neuroscience. 25 (4), 481-507 (2014).
- Draeger, E., et al. A Dose of Reality: How 20 Years of Incomplete Physics and Dosimetry Reporting in Radiobiology Studies May Have Contributed to the Reproducibility Crisis. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 106 (2), 243-252 (2020).
- Dunne, A. L., et al. Relationship between clonogenic radiosensitivity, radiation-induced apoptosis and DNA damage/repair in human colon cancer cells. British Journal of Cancer. 89 (12), 2277-2283 (2003).
- Yang, Y., Xing, L. Optimization of radiotherapy dose-time fractionation with consideration of tumor specific biology. Medical Physics. 32 (12), 3666-3677 (2005).
- Hall, E. J., Giaccia, A. J. Radiobiology for the radiologist. Eighth edition. , Wolters Kluwer. (2019).
- van Leeuwen, C. M., et al. The alfa and beta of tumours: a review of parameters of the linear-quadratic model, derived from clinical radiotherapy studies. Radiation Oncology. 13 (1), 96 (2018).
- Fowler, J. F. 21 years of biologically effective dose. British Institute of Radiology. 83 (991), 554-568 (2010).
- Jones, B., Dale, R. G., Deehan, C., Hopkins, K. I., Morgan, D. A. The role of biologically effective dose (BED) in clinical oncology. Clinical Oncology journal | The Royal College of Radiologists. 13 (2), 71-81 (2001).
- Choy, H., Rodriguez, F. F., Koester, S., Hilsenbeck, S., Von Hoff, D. D. Investigation of taxol as a potential radiation sensitizer. Cancer. 71 (11), 3774-3778 (1993).
- Ng, C. E., Bussey, A. M., Raaphorst, G. P. Inhibition of potentially lethal and sublethal damage repair by camptothecin and etoposide in human melanoma cell lines. International Journal of Radiation Biology. 66 (1), 49-57 (1994).
- Kurashige, T., Shimamura, M., Nagayama, Y. Differences in quantification of DNA double-strand breaks assessed by 53BP1/gammaH2AX focus formation assays and the comet assay in mammalian cells treated with irradiation and N-acetyl-L-cysteine. Journal of Radiation Research. 57 (3), 312-317 (2016).
- Schaue, D., Kachikwu, E. L., McBride, W. H. Cytokines in radiobiological responses: a review. Radiation Research. 178 (6), 505-523 (2012).
- Mery, B., et al. In Vitro Cell Death Determination for Drug Discovery: A Landscape Review of Real Issues. Journal of Cell Death. 10, 1179670717691251 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
- Felix, M. C., et al. Collimator optimization for small animal radiation therapy at a micro-CT. Z Medical Physics. 27 (1), 56-64 (2017).
- Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical Physics. 38 (12), 6754-6762 (2011).
- Wong, J., et al. High-resolution, small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 71 (5), 1591-1599 (2008).
- Ghita, M., et al. Small field dosimetry for the small animal radiotherapy research platform (SARRP). Radiation Oncology. 12 (1), 204 (2017).
- Biglin, E. R., et al. Preclinical dosimetry: exploring the use of small animal phantoms. Radiation Oncology. 14 (1), 134 (2019).
- Munoz Arango, E. T., Peixoto, J. G., de Almeida, C. E. Small field dosimetry with a high-resolution 3D scanning water phantom system for the small animal radiation research platform SARRP: a geometrical and quantitative study. Physics in Medicine and Biology. , (2019).
- Murrell, D. H., et al. Evaluating Changes to Blood-Brain Barrier Integrity in Brain Metastasis over Time and after Radiation Treatment. Translational Oncology. 9 (3), 219-227 (2016).
