Summary
Stralingsdosimetrie biedt een techniek om de nauwkeurigheid van preklinische experimenten te verbeteren en ervoor te zorgen dat de geleverde stralingsdoses nauw verwant zijn aan klinische parameters. Dit protocol beschrijft de stappen die in elke fase moeten worden genomen tijdens preklinische stralingsexperimenten om een goed experimenteel ontwerp te garanderen.
Abstract
Stralingsdosimetrie is van cruciaal belang voor de nauwkeurige levering en reproduceerbaarheid van stralingsschema's in preklinische modellen voor een hoge translationele relevantie. Alvorens in vitro of in vivo experimenten uit te voeren, moeten de specifieke dosisoutput voor de bestralingsmachine en individuele experimentele ontwerpen worden beoordeeld. Met behulp van een ionisatiekamer, elektrometer en vaste wateropstelling kan de dosisuitvoer van brede velden in isocenter worden bepaald. Met behulp van een vergelijkbare opstelling met radiochrome films in de plaats van de ionisatiekamer kunnen ook dosissnelheden voor kleinere velden op verschillende diepten worden bepaald. In vitro clonogene overlevingstests van kankercellen als reactie op bestraling zijn goedkope experimenten die een maat bieden voor inherente radiogevoeligheid van cellijnen door deze gegevens te passen bij het traditionele lineair-kwadratische model. Modelparameters geschat op basis van deze tests, gecombineerd met de principes van biologische effectieve doses, stelt iemand in staat om verschillende fractioneringsschema's te ontwikkelen voor bestraling die gelijkwaardige effectieve doses bieden in tumordragende dierproeven. Dit is een belangrijke factor om te overwegen en te corrigeren voor bij het vergelijken van in vivo bestralingstherapieschema's om mogelijke verwarring van de resultaten als gevolg van variantie in de geleverde effectieve doses te elimineren. Samen biedt dit artikel een algemene methode voor dosisuitvoerverificatie preklinische bestralingsapparaten voor dieren en kasten, in vitro beoordeling van radiogevoeligheid en verificatie van stralingsafgifte in kleine levende organismen.
Introduction
Kankers vertegenwoordigen gezamenlijk de op een na belangrijkste doodsoorzaak in de VS en in veel landen over de hele wereld1. Bestralingstherapie is een hoeksteen van de behandeling voor veel tumorsubtypen en wordt toegediend aan ongeveer de helft van alle kankerpatiënten2,3. De resultaten van patiënten voor bijna alle kankers zijn in de loop van de tijd verbeterd, aangezien de apparatuur die wordt gebruikt om stralingsdoses te leveren gestaag is gevorderd en sommige effectieve multimodale therapiebenaderingen zijn ontwikkeld4,5,6 , maar de recidief - ensterftecijfersvoor patiënten met bepaalde soorten tumoren blijven hoog7,8,9. Radiotherapie voor kanker blijft dus een actief gebied van fundamenteel en klinisch onderzoek. Veel preklinische radiotherapiestudies maken gebruik van kleinschalige bestralings om stralingsdoses te leveren aan in vitro of dierlijke modellen van kanker. Met een veelheid aan potentiële experimenten om mechanistische radiobiologiedetails of nieuwe behandelingen te onderzoeken, kunnen veelvoorkomende valkuilen worden ondervonden die leiden tot onjuiste conclusies, slechte reproduceerbaarheid en verspilde middelen. Deze valkuilen vallen binnen drie belangrijke gebieden: bestralingsdosimetrie, in vitro karakterisering van modelcellijnen en in vivo bestralingsschema en -opstelling. Nauwkeurige en reproduceerbare resultaten van meer geavanceerde experimenten zijn moeilijk te bereiken zonder voorafgaande aandacht voor deze fundamentele aspecten van radiotherapieonderzoek.
Het hierin beschreven protocol beschrijft een gegeneraliseerde strategie om deze problemen te voorkomen of te beperken en maakt gebruik van verschillende eerder ontwikkelde methodologieën die bedoeld zijn voor onafhankelijk gebruik. Deze verschillende methoden zijn samengevoegd zodat een onderzoeker die geïnteresseerd is in het starten of verbeteren van preklinische radiotherapie-experimenten dit kan gebruiken als een robuuste experimentele lay-out. Het voorgestelde kader omvat methodologie voor de inbedrijfstelling van kleinschalige dierlijke bestralingsinstallaties, voor het bepalen van de basis radiobioologische eigenschappen van modelkankercellijnen en voor het op de juiste manier ontwerpen en toedienen van een doseer- en fractioneringsschema voor in vivo tumormodellen.
Protocol
Alle stappen van dit protocol met betrekking tot het gebruik van proefdieren, inclusief behandeling en procedures, werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de West Virginia University in Morgantown, West Virginia (protocolnummer: 1604001894).
1. Bepaling van de dosisoutput
- Gebruik dit protocol, gebaseerd op het "In-phantom Method"-protocol van de American Association of Physicists in Medicine Task Group (AAPM TG) 6110 en vergelijkbaar met het inbedrijfstellingsprotocol van Xstrahl, om de straalopbrengst van de bestralingsmachine voor kleine dieren te bepalen met betrekking tot bepaalde geometrie onder de volgende installatieomstandigheden.
- Stel de bestralingsmachine in op 220 kVp en 13 mA, met een open veld (17 cm bij 17 cm) in het ISOCENTER, of 35 cm van de bron. Filter bovendien de balk met een 0,15 mm Cu-filter met een brede focus. Sommige cellulaire bestratoren bevatten alleen een radioactieve bron, dit protocol kan alleen worden gebruikt voor röntgenstraling.
- Lijn de vaste water fantomen in de volgende volgorde uit: 1 cm plaat, 2 cm plaat met ionisatiekamersleuf, 2 cm plaat, 1 cm plaat. Door de vaste waterfantomen in deze volgorde te stapelen, wordt de ionisatiekamer op een diepte van 2 cm geplaatst, waardoor ook 4 cm voor backscatter mogelijk is. Zie figuur 1 voor een grafische weergave van de dosimetrie-instelling.
OPMERKING: Om de grote, vrij zware stapel vast water te huisvesten, raden de auteurs de aanschaf aan van een aangepaste 3D-geprinte bank met variabele ondersteuning om ervoor te zorgen dat de fantoomstapel waterpas en op de juiste afstand van de bron over het oppervlak van het materiaal is, niet alleen in het midden.
- Gebruik de meetapparatuur (d.w.z. adcl gekalibreerde ionisatiekamer, elektrometer) en een uitleg van de gebruikte correctiefactoren vindt u respectievelijk in Tabel met materialen en tabel 1.
OPMERKING: Dat de ADCL waarden van Nk op een paar punten biedt voor verschillende halvewaardelagen (HVL, maat voor de straalkwaliteit). De waarde van Nk die in het protocol moet worden gebruikt, moet worden gebaseerd op een interpolatie van de ADCL-waarden voor de gemeten HVL van de eenheid. De fabrikant heeft de HVL van onze unit gemeten en dat hebben we gebruikt bij de bepaling van onze dosissnelheidsoutput. - Stel de fantoomstapel in en plaats de ionisatiekamer in het fantoom zoals gespecificeerd in stap 1.1.2.
- Stel de fantoomstapel zo in dat de bron tot oppervlakteafstand (SSD), of de afstand van de stralingsbron tot het eerste oppervlak, 33 cm is wanneer deze op de juiste manier wordt geëgaliseerd.
OPMERKING: De auteurs stellen voor om een aangepaste, 3D-geprinte bank te maken, groot genoeg om de afmetingen van de vaste waterplaten te ondersteunen. Bovendien heeft degene die in dit protocol wordt gebruikt een instelbare component voor het nivelleren van de fantoomstack.
- Stel de fantoomstapel zo in dat de bron tot oppervlakteafstand (SSD), of de afstand van de stralingsbron tot het eerste oppervlak, 33 cm is wanneer deze op de juiste manier wordt geëgaliseerd.
- Neem het gemiddelde van drie afzonderlijke röntgenbelichtingen, metingen van één minuut met de elektrometer biasspanning ingesteld op 300 V. Het resultaat wordt M+ .
OPMERKING: Bestraling wordt uitgevoerd met het instrument dat is ingesteld om straling te leveren op 220 kVp en 13 mA. Dit geldt ook voor de volgende twee stappen (stappen 1.5-1.6). Voor de veiligheid van de gebruiker, zorg ervoor dat de deuren gesloten blijven tijdens behandelingen. - Voer nog een set van drie afzonderlijke röntgenbelichtingen uit, met een afmeting van 1 minuut met de elektrometer biasspanning ingesteld op -150 V. Het resultaat wordt ML.
- Voer nog een set van drie afzonderlijke röntgenbelichtingen uit, met een afmeting van 1 minuut met de elektrometer biasspanning ingesteld op -300 V. Het resultaat wordt MH, of ook M- .
- Bereken Ppol en Pion met respectievelijk vergelijking 1 en vergelijking 2 zoals hieronder beschreven:
(Vergelijking 1)
(Vergelijking 2) - Meet de temperatuur, in Celsius, en de druk, in kPa, in de bestralingsmachine met behulp van een gekalibreerde digitale thermometer en barometer. Bereken vervolgens PTP zoals hieronder aangegeven in vergelijking 3.
OPMERKING: Bij deze berekening wordt ervan uitgegaan dat de ADCL standaardtemperatuur- en drukwaarden van 22 °C en 101,33 kPa heeft gebruikt bij het vermelden van hun waarde voor de luchtkermakalibratiefactor.
(Vergelijking 3) - Bereken de gecorrigeerde kamerlezing, M, door de ruwe kamerlezing, MH, te vermenigvuldigen met Pelec, Ppol, Pionen PTP. Deze vergelijking is hieronder te vinden in vergelijking 4.
OPMERKING: Deze berekening gaat ervan uit dat de ADCL hun kalibratie heeft uitgevoerd met de biasspanning ingesteld op -300V, wat vrij gebruikelijk is.
(Vergelijking 4). - Vermenigvuldig de gecorrigeerde kamerlezing verder met Nk, [(μen/p)wlucht]water, PQ, chamen Pschede. P-huls is alleen nodig voor metingen in water. Daarom is voor dit protocol Pschede slechts 1.
OPMERKING: Met behulp van de voorwaarden in dit protocol geven de laatste drie items een waarde van 1,0731. Deze waarde is afhankelijk van de straalkwaliteit, dus de HVL moet bekend zijn om deze te bepalen. De waarde van 1.0731 is specifiek voor onze eenheid en wordt als voorbeeld gegeven. Om de waarden van PQ, cham en [(μen/p)wlucht]water specifiek voor uw eenheid te bepalen, gebruikt u de gemeten HVL en interpoleert u uit tabel VIIen tabel VIII, en corrigeert u voor de grootte van het referentieveld volgens figuur 3 en figuur 4 van het AAPM TG61-protocol10. In ons geval levert het vermenigvuldigen van Nk met 1,0731 de dosis aan water, Dw, in Gy gedurende een nominale tijd van 1 min, ervan uitgaande dat de ADCL Nk-waarde wordt gegeven in Gy/Coulumbs. - Bepaal het eindresultaat van de gebruikte bestralingsmachine. Wanneer de röntgenstralen voor het eerst worden gegenereerd, stijgt de output tot zijn volledige waarde gedurende enige eindige tijd. Op dezelfde manier, wanneer de röntgenbron is uitgeschakeld, neemt de uitvoer af tot nul gedurende een bepaalde eindige tijd.
- Houd rekening met de tijd voor deze overgang of het eindeffect. Dit kan worden gedaan door het gemiddelde van drie metingen te nemen met de elektrometer biasspanning ingesteld op -300 V, voor verschillende tijdinstellingen. Doe dit gedurende 6, 12, 18, 24, 30 en 60 seconden.
- Plot de elektrometermetingen tegen de tijd en vind de beste rechte lijn. De totale tijd, t, voor een behandeling van 1 minuut kan worden berekend aan de hand van vergelijking 5:
(Vergelijking 5).
- Bereken de dosissnelheid voor een bepaalde bestralingsmachine aan de andere zijde van vergelijking 6:
(Vergelijking 6)
(Vergelijking 1)
(Vergelijking 2)
(Vergelijking 3)
(Vergelijking 4).
(Vergelijking 5).
(Vergelijking 6)2. Het maken van een radiochrome filmkalibratiecurve
- Zie Tabel met materialen voor een lijst met benodigde materialen.
- Plaats de film met behulp van een bijna identieke opstelling als het vorige protocol op een diepte van 2 cm in de fantoomstapel met vast water. De volgorde van vaste water fantomen is onbeduidend zolang er 2 cm vast water boven en 4 cm vast water hieronder voor opbouw en backscatter effecten.
- Bepaal met behulp van de in protocol 1 in opdracht gegeven bepaalde dosis de behandelingstijden voor de in tabel 2 vermelde doses met behulp van vergelijking 7:
(Vergelijking 7) - Bereid verschillende stukken film voor die ervoor zorgen dat elke film van dezelfde grootte is en in dezelfde richting blijft van behandeling tot scanverwerving. Dit kan door een kleine diagonale snede in de linkerbenedenhoek te plaatsen. Elke film vanaf dit punt moet van dezelfde partij film zijn.
OPMERKING: Bereid 3 afzonderlijke repliceringen voor elk te beoordelen dosispunt. - Scan de gesneden stukken met een 48-bits kleurenfotoscanner terwijl alle correcties zijn uitgeschakeld. Zorg ervoor dat elke film in het exacte midden van het scanbed wordt geplaatst. De verkregen waarden zijn de scans vóór blootstelling die worden gebruikt voor het bepalen van de niet-belichte optischedichtheid 11,12. Sla alle afbeeldingen op in de . Tiff bestandsformaat om compressie van belangrijke gegevens te voorkomen.
OPMERKING: De auteurs raden aan om de films drie keer te scannen en het verkregen gemiddelde te gebruiken als de enige waarde voor een bepaalde film. - Begin met de bestraling van de films door een stuk film bovenop 4 cm vast water te plaatsen en plaats de resterende 2 cm vast water hierboven, zoals eerder beschreven in deze sectie.
- Stel de fantoomset zo in dat de film zich op dezelfde afstand van de bron bevindt als de ionisatiekamer bij het bepalen van de dosisuitgang. Dit is het isocentrische punt van de bestralingsoven.
- Programmeer de behandelingstijd berekend in stap 2.3 hierboven voor één voorgeschreven dosis.
- Herhaal de behandeling voor elk van de in tabel 2vermelde doses .
- Laat films 24 uur rusten, beschermd tegen licht.
- Verkrijg de filmscans na blootstelling op dezelfde manier als hierboven.
- Importeer afbeeldingen naar ImageJ-analysesoftware en voer alle metingen uit op het rode kanaal.
- Sleep de afbeelding naar . Tiff-bestandsindeling in ImageJ.
- Klik op het vervolgkeuzemenu Afbeelding. Selecteer Kleur in het vervolgkeuzemenu Afbeelding. Selecteer gesplitste kanalen in de optie Kleur.
- Teken met alleen het rode afbeeldingskanaal een interessant gebied met behulp van het gereedschap rechthoek. Druk op Ctrl+M. De gemiddelde waarde transcriberen uit het resultatenvenster.
- Herhaal stap 2.12.1-2.12.4 voor alle gescande films.
- Verkrijg de pixelwaarde in een centraal gelegen vierkant van 1 cm bij 1 cm voor zowel de onbelichte als de blootgestelde films. Deze waarden worden respectievelijk aangeduid als PVU(D) en PV(D) en kunnen worden gebruikt om de netto optische dichtheid te berekenen zoals beschreven in vergelijking 8.
(Vergelijking 8) 13 jaar
- Herhaal stap 2.13 voor elk paar filmbeelden, zowel voorbelichting als nabelichting.
- Maak een grafiek van de dosis versus de netto optische dichtheid en pas de curve aan op een kubieke veelterm in het formaat y = ax3 + bx2 + cx + d. Een voorbeeld is te vinden in figuur 2B.
(Vergelijking 7)
(Vergelijking 8) 13 jaar
3. Bepaling van α/β waarde voor specifieke kankercellijnen via clonogene test
OPMERKING: Het volgende protocol is een gewijzigde versie van de methoden beschreven door Franken et al14 en is te zien in figuur 3.
- Laat cellen groeien tot ~80% samenvloeiing. Vermijd het gebruik van te samenvloeiende bronnen van cellen voor dit experiment, omdat het noodzakelijk is dat de cellen zich in de logfase van celgroei bevinden. Voor de representatieve clonogene testresultaten weergegeven in figuur 3C,werden hersen-tropen MDA-MB-231 borstkankercellen gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en penicilline/streptomycine en geïncubeerd bij 37 °C en 5% kooldioxide in een bevochtigde incubator.
- Zaai de cellen op de gewenste dichtheid voor de kolonietest. Nauwkeurige verdunningen tijdens het zaaien zijn cruciaal voor het bepalen van de beplatingsefficiëntie van de test. Zorg ervoor dat u meerdere replica's plaat.
- Ga verder met deze stap als de bestraling voorafgaat aan celbeplating (figuur 3A). U ook doorgaan met stap 3.4 als celbeplating voorafgaat aan de bestraling.
- Voer de gewenste bestralingsbehandeling uit op kweekkolven. Eventuele aanvullende behandelingen (d.w.z. medicamenteuze behandelingen) kunnen op elk moment voor of na dit worden uitgevoerd. Voor de representatieve resultaten in figuur 3Cvond bestraling plaats na het plateren van cellen, beschreven in stap 3.4.
- Extraheer de cellen met behulp van de gewenste trypsinisatiemethode en maak een suspensie met één cel. Verwijder kweekmedia en voeg recombinant enzym (bijv. TrypLE Express) toe om cellen uit de kolf te verwijderen. Incubeer cellen met het enzym gedurende ongeveer 3 minuten totdat cellen werden losgemaakt zoals gedetecteerd met behulp van een lichtmicroscoop. Neutraliseer het enzym met een gelijk volume celcultuurmedia. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten en resuspend tot de gewenste concentratie in kweekmedium.
- Plaat de cellen op gewenste dichtheden in meerdere replica's.
- Vervang door verse media na de eerste 24 uur.
- Blijf media elke 2-3 dagen vervangen.
- Blijf cellen cultiveren totdat de controlekolonies meer dan 50 cellen per kolonie overschrijden, ~ 9-14 dagen. Controlekolonies zijn die behandelingsgroepen die geen stralingsdoses ontvangen. Voor experimenten met medicamenteuze behandelingen is ook een andere controlegroep met medicijndosering, maar geen bestraling nodig.
- Ga verder met deze stap bij het zaaien van cellen vóór de bestraling (figuur 3B).
- Extraheer cellen met behulp van de gewenste trypsinisatiemethode en maak een suspensie met één cel.
- Plaats cellen op gewenste dichtheden in meerdere replica's.
- Laat cellen zich 's nachts aan de plaat hechten.
- Voer de gewenste stralingsdoses uit. Aanvullende behandelingen, zoals het doseren van geneesmiddelen, kunnen op elk moment voor of na deze stap worden uitgevoerd, zolang cellen zich aan hun behandelingsplaten hebben bevestigd. Voor de representatieve resultaten in figuur 3Cwerden vóór de behandeling 1250 hersen-tropen MDA-MB-231 cellen geplateerd (stap 3.4). Vervolgens werden cellen behandeld met 15 nM doxorubicine 3 uur voor bestraling met 3 Gy van röntgenfoto's.
- Vervang het medium na de eerste 24 uur.
- Vervang media elke 2-3 dagen.
- Kweek de behandelde cellen tot controlegroepkolonies meer dan 50 cellen, ~9-14 dagen. Controlekolonies zijn die behandelingsgroepen die geen stralingsdoses ontvangen. Voor experimenten met medicamenteuze behandelingen is ook een andere controlegroep met medicijndosering, maar geen bestraling nodig.
- Verwijder kweekmedia uit putten of borden en was met PBS.
- Fixeer cellen gedurende 15 minuten in een 1:7 (v:v) oplossing van glaciaal azijnzuur en methanol.
- Verwijder de fixatieoplossing.
- Na fixatie, vlekkencellen gedurende 30 minuten, of 2 uur als de tijd beschikbaar is, bij kamertemperatuur met een 2,5-5,0 mg/ml oplossing van kristalviool in een 4:1 (v:v) oplossing van gedestilleerd water en methanol.
- Verwijder de kleuringsoplossing en was de cellen in een groot waterbad op kamertemperatuur.
OPMERKING: Niet wassen onder stromend water. - Tel het resulterende aantal kolonies in elke behandelingsgroep en bereken de overlevingsfractie van elke plaat.
- Plot de overlevingsfractie ten opzichte van de overeenkomstige toegediende dosis en pas de curve aan met een exponentiële pasvorm.
- Als u de α/β waarde wilt schatten, gebruikt u een exponentiële pasvorm van de bovenstaande plot om de waarden voor elk van de instelbare parameters in de lineair-kwadratische vergelijking hieronder te schatten:
(Vergelijking 9)
OPMERKING: Bestraling van cellen kan meestal worden gedaan in isocenter zonder enige collimatie, op voorwaarde dat de veldgrootte groot genoeg is voor goed bordjes of petrischaaltjes. Mogelijke valkuilen in dit protocol kunnen opbrengsten zijn zoals geen kolonievorming, significante celmigratie met duidelijke celgroei, maar geen echte kolonies, of besmetting als gevolg van behandeling in een niet-steriele bestralingskamer.
4. Bepaling van de specifieke dosisoutput voor variabele experimentele ontwerpen
- Bepaal de gewenste veldgrootte en afstand tot de bron.
OPMERKING: Collimatie verandert de dosissnelheid, ongeacht de grootte of afstand van de collimator tot de röntgenbron. - Gebruik vaste waterfantomen om opbouw en backscatter te bieden, plaats een stuk film in de juiste richting die het experimentele ontwerp het beste weergeeft.
OPMERKING: Voor elke experimentele opstelling biedt vast water mogelijk niet de meest nauwkeurige weergave van een bepaald ontwerp. In plaats daarvan raden we aan om de vaten van het eigenlijke experiment te gebruiken (d.w.z. Petri-schotel, putplaten, kleine dierlijke fantomen, enz.). - Bestraal films gedurende 1 (N=3) en 2 (N=3) minuten.
- Laat films 24 uur rusten, beschermd tegen licht.
- Bepaal de netto optische dichtheid van elk van de films volgens de procedures van punt 2. Gebruik de filmkalibratiecurve om de dosis te bepalen op de netto optische dichtheid.
- Bepaal de dosis op 1 minuut, D1, als de outputdosissnelheid, Ḋ, voor deze experimentele opstelling gedefinieerd door vergelijking 10 als volgt:
(Vergelijking 10) - Evenzo calucleren de dosis op 2 minuten door vergelijking 11 als volgt:
(Vergelijking 11) - Vanwege het eindresultaat kan de dosissnelheid voor de bovenstaande berekeningen enigszins verschillen. Gebruik om deze reden omD-exp te berekenen voor het gewenste experimentele ontwerp een gemiddelde van de afzonderlijkeD-exp zoals aangegeven in vergelijking 12:
(Vergelijking 12) - Definieer met behulp van dit gemiddelde de tijd voor de behandeling van elke gewenste dosis voor deze specifieke instelling in vergelijking 13:
(Vergelijking 13)
(Vergelijking 10)
(Vergelijking 11)
(Vergelijking 12)
(Vergelijking 13)5. Behandeling van muizen met tumoren op een anatomische locatie van belang
- Verdoof de muis met veilige en humane anesthesietechnieken die zijn goedgekeurd door het IACUC van de instelling.
- Plaats verdoofd dier in terughoudendheid zoals aangegeven in het gewenste experimentele ontwerp.
- Deze stap is optioneel, indien niet beschikbaar ga verder met stap 5.6. Verkrijg een radiogram, met behulp van een ingebouwde portaalcamera, van de muis zonder collimatie met behulp van een aluminiumfilter.
- Verkrijg een tweede radiogram met collimatie op zijn plaats.
- Overlay radiogrammen in ImageJ om de positie van de straal aan te tonen.
- Bepaal aan de hand van de vooraf bepaalde α/β waarde het dosisschema dat de meest redelijke benadering biedt om een onderzoeksvraag te beantwoorden (d.w.z. als u de effecten van een dosis van 30Gy wilt modelleren die in 10 fracties van 3 Gy wordt geleverd, maar slechts vier fracties wilt geven). Met behulp van vergelijking 14, met een veronderstelde α/β waarde van 10 (deze waarde kan worden bepaald voor individuele kankercellijnen in protocol 3) en een BED vergelijkbaar met dat van 30 Gy/10 F, behandelen met 24 Gy in 4 fracties van 6 Gy.
- Behandel het dier gedurende de voorgeschreven tijd die voor de gewenste dosis wordt gegeven.
6. Histologische bevestiging van dosisdepositie in vivo
- Volgens protocol 5, verzamel weefsel van belang binnen 1 uur na behandeling15,16. Ga na weefseloogst verder met het voorkeursprotocol voor immunohistochemie. Hieronder volgt een voorbeeld.
- Perfuse dier met ijskoud 4% paraformaldehyde (PFA).
- Na-fix in PFA bij 4 °C.
- Na fixatie fixeert u weefsel achtereenvolgens in 10%, 20% en 30% sacharose gedurende 24 uur elk bij kamertemperatuur.
- Embed weefsel in gelatine en opeenvolgend fixeren in 4% PFA en opnieuw in 10-30% sucrose gedurende 24 uur elk bij kamertemperatuur.
- Trim blok en plaats op -80 °C gedurende 30 minuten.
- Snijd weefsel in secties van 20-30 μm.
- Immunostain glijdt als vrije drijvende secties in een zes goed-plaat17,18.
- Was drie keer en permeabiliseer gedurende 30 minuten op een shaker met 1,83% lysine in 1% Triton en 4% warmte-geïnactiveerd geitenserum.
- Incubatiesecties met anti-γH2AX antilichaam gedurende 24 uur, gevolgd door een incubatie van 2 uur met gewenst secundair antilichaam.
- Coverslip schuift met glazen afdeklippen met behulp van voorkeursmontagemedia.
- Beeld op een fluorescentiemicroscoop.
Representative Results
Volgens protocol 1 zal een dosissnelheid in Gy/min worden verstrekt, die specifiek is voor de bestralingsmachine die wordt gebruikt. Ongeacht het type bestralingsmachine kan echter met een bekende dosissnelheid een kalibratiecurve worden gegenereerd met behulp van protocol 2 dat vergelijkbare films oplevert en een vergelijkbare kalibratiecurve als die in figuur 2A-B. Een succesvolle test uit protocol 3 levert verschillende, goed afgebakende kolonies cellen op die homogeen violet beitsen. De schatting van α/β kan worden vergeleken met literatuurwaarden of andere behandelingsgroepen om de radiogevoeligheid van de opgegeven cellijn te interpreteren. Met behulp van de kalibratiecurve die is ontwikkeld volgens protocol 2 en weergegeven in figuur 2B,levert protocol 4 twee filmmonsters op die lijken op figuur 2A en die kunnen worden gebruikt om de vereiste experimentele bestralingstijden te schatten. Als er een ingebouwde portaalbeeldcamera beschikbaar is voor de bestralingsmachine die wordt gebruikt, kunnen radiogrammen van kleine dieren worden verkregen met en zonder collimatie. Het overlappen van deze beelden toont de exacte positionering van de gebotste stralingsstraal ten opzichte van het kleine dier dat wordt behandeld zoals afgebeeld in figuur 4A. Succesvolle dosisdepositie in protocol 5 kan worden bevestigd volgens protocol 6. Een indicatie dat straling wordt afgezet in een in vivo of in vitro systeem is door de detectie van dubbelstrengs DNA-breuken. Geïllustreerd in figuur 4B, dezelfde muis die alleen door de rechterhersenhelft wordt behandeld in figuur 4A, toont positieve γH2AX-vlekken alleen in de behandelde hemisfeer. In deze figuur zijn de kernen bevlekt met DAPI om twee dingen te laten zien; 1) het geheel is van de hersenen waarop het anti-γH2AX-antilichaam werd toegepast tijdens histologische analyse, en 2) de onbehandelde hersenhelft blijft onbevlekt.
Figuur 1: Ruwe opstelling van ionisatiekamer en water fantoom ingesteld voor bepaling van de dosisuitvoer. Het pictogram illustreert een basisopstelling met behulp van de verschillende componenten die nodig zijn voor dosimetrie met behulp van een ionisatiekamer en vaste waterfantomen in de kast van de bestralingsoven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Generatie van een kalibratiecurve met behulp van radiochrome film. (A) Representatieve kleurverandering van radiochrome film met toenemende dosis. Linksboven (0 cGy); rechtsonder (2000 cGy). (B) Potentiële radiochrome filmkalibratiecurve waarbij de netto optische dichtheid en dosis worden vergeleken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Clonogene test van kankercellen. Bestraling van cellen kan worden gedaan voorafgaand aan het plateren in zes putplaten / petrischaaltjes(A),of na (B). In paneel (C) wordt een representatieve afbeelding weergegeven van een succesvolle clonogene test met MDA-MB-231 borstkankercellen na het volgen van Protocol Sectie 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gebruik van dubbele overlappende radiogrammen voor positionering (indien beschikbaar) en positieve γH2AX immunohistochemische kleuring ter bevestiging van dosisdepositie. (A) Representatieve bedekte radiogrammen die de plaatsing van stralingsstralen weergeven. (B) Representatieve resultaten die wijzen op dosisdepositie naar de rechterhersenhelft, zoals aangetoond door verhoogde γH2AX-intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Correctiefactor | Uitleg | |
| Nκ | Lucht kerma kalibratiefactor | |
| [(μen/ρ)Wlucht] water (water) | Rantsoen van massa-energieabsorptiecoëfficiënten van water naar lucht; ongeveer 1,05 | |
| Pq, Cham | Correctieboekhouding voor kamerstam die de perterbatie van fotonfluence per kamer beïnvloedt; ongeveer 1.022 | |
| Pschede | Correctieboekhouding voor schedebeschermende ionisatiekamer; waarde van 1, omdat kamer waterdicht is | |
| Ppol | Correctiefactor die rekening houdt met polariteit; bepaald in Protocol 1 | |
| Pion | Correctiefactor voor ionenrecombinatie; bepaald in Protocol 1 | |
| PTp | Correctiefactor acocunting voor temerpatuur en druk op de dag van het experiment; bepaald in Protocol 1 | |
Tabel 1: Correctiefactoren die nodig zijn voor de bepaling van de dosissnelheid in Protocol nr.
| Dosis | N |
| 0.5 | 3 |
| 1 | 3 |
| 2 | 3 |
| 3 | 3 |
| 4 | 3 |
| 6 | 3 |
| 8 | 3 |
| 10 | 3 |
| 12* | 3 |
| 15* | 3 |
| 20* | 3 |
| * Alleen nodig voor doses van meer dan 10 voor individuele experimenten. | |
Tabel 2: Doses die moeten worden gebruikt bij het genereren van radiochrome filmkalibratiecurve.
Discussion
Het bovenstaande protocol beschrijft een gebruiksvriendelijke aanpak voor stralingsdosimetrie, bepaling van α/β waarden in kankercellijnen, en een kort voorbeeld van een aanpak voor bestraling in een preklinisch model van hersenmetastasen van borstkanker. Deze methoden kunnen worden gebruikt om elk model van kanker te bestuderen en zijn niet alleen beperkt tot hersenmetastasen van borstkanker. In deze sectie bespreken we de relevante fijne kneepjes die ten grondslag liggen aan preklinische radiotherapie-experimenten.
Dosimetrie bestaat uit twee delen: 1) kalibreer de uitgang met een boerenkamer, zodat de dosissnelheid van de röntgeneenheid wordt vastgesteld, en 2) bereid een praktisch dosimetriemeetsysteem voor met behulp van radiochrome film. Wat de uitgangskalibratie betreft, biedt TG-61 een reproduceerbare methode in water. Het protocol hier maakt gebruik van Gammex RMI 457 vast water, zoals aanbevolen door XStrahl, de fabrikant van de bestralingsmachine. Hoewel relatieve dosimetrie (profielen of dieptedosiscurves genormaliseerd tot maximale dosis) analyse met vast water, akkoord gaat met beter dan 1% met die van water, is er een verschil van ongeveer 3 tot 4% in absolute dosis als gevolg van een hogere massa-energieabsorptiecoëfficiënt voor vast water in vergelijking met water. Aangezien alle installaties van het XStrahl-systeem echter het vastewaterprotocol gebruiken voor uitvoerkalibratie, hebben we deze verschillen niet gecorrigeerd. Door de output te kennen, kan de blootstellingstijd worden berekend die nodig is om een gewenste dosis te leveren. Door film in dezelfde opstelling te plaatsen als de boerenkamer kunnen we bekende doses aan de film leveren. Het scannen van de film levert vervolgens optische dichtheden op. De dosis van de film kan vervolgens worden gegrafeerd tegen de overeenkomstige netto optische dichtheid (verschil in optische dichtheid na en vóór blootstelling). Dit produceert een filmkalibratiecurve. Wanneer we experimentele opstellingen wijzigen, kan de dosissnelheid in die situatie veranderen, omdat de dosissnelheid afhankelijk is van de veldgrootte, diepte en het materiaal dat wordt bestraald. Het blootstellen van film met de experimentele opstelling biedt ons een netto optische dichtheid, en met behulp van de filmkalibratiecurve kunnen we vervolgens de bijbehorende dosis bepalen. Als we deze dosis delen tegen de tijd dat de film werd bestraald, krijgen we de dosissnelheid. Deze dosissnelheid kan vervolgens worden gebruikt om de blootstellingstijd te berekenen om een gewenste dosis te leveren voor de gegeven experimentele opstelling. Het hierboven beschreven protocol behandelt verschillende nuances die verband houden met filmdosimetrie. Na blootstelling heeft de film bijvoorbeeld ongeveer 24 uur nodig om de chemische reacties in de actieve laag van de film vrijwel compleet te laten zijn. Niet wachten op deze hoeveelheid tijd zal leiden tot een lagere optische dichtheid.
Voor elke studie om reproduceerbare dosimetrie te hebben, is het belangrijk om verschillende van de belangrijkste elementen van een bepaalde bestralingsmachine te kennen en te begrijpen. In het bijzonder het is van cruciaal belang om andere onderzoekers het merk en het model van de gebruikte bestralingsoven, het brontype (röntgen, radioactief, enz.), energie, halve waarde laag, veldgrootte, bron tot oppervlakte en bron tot isocenter afstanden, grootte van het bestraalde materiaal, demping voor en terug te weten na het bestraalde materiaal, experimentspecifieke dosissnelheid, fractioneringsschema, gebruikte exacte dosimetrieapparatuur en het gebruikte dosimetrieprotocol. Al deze informatiepunten beschrijven op samenhangende wijze de straalkwaliteit van een bepaalde bestralingsoven voordat een dosis aan een dier of cel wordt toegediend19. Een ander relevant punt van informatie uit dit protocol en andere is dat de dosissnelheid die in Protocol 1 wordt bereikt, gewoon de output is van de bestralingsmachine die wordt gebruikt. Voor een bepaald experiment is het belangrijk om de dosissnelheid voor die specifieke opstelling te bepalen (Protocol 4) in vergelijking met een gegenereerde radiochrome filmkalibratiecurve (Protocol 2).
In vitro experimenten geven belangrijke details over het radiobiologisch gedrag van kankercellijnen. In vitro clonogene celoverlevingstests schatten en kwantificeren nauwkeurig de inherente radiogevoeligheid van een cellijn20, wat helpt bij het ontwerpen van fractioneringsschema 's in latere cellulaire of kleine dierproeven21. In het bijzonder benaderen deze tests de geschatte waarden voor de parameters α en β die in het lineair-kwadratische model worden gebruikt om celdood te voorspellen als reactie op radiotherapie volgens de vergelijking:
(Vergelijking 9)
waarbij SF de overlevende fractie van clonogenisch levensvatbare cellen is, D stralingsdosis in Gy is en α en β zijn aangebracht parameters22. De verhouding α/β biedt een inherente maat voor cellulaire radiogevoeligheid, waarbij hogere waarden correleren met verhoogde gevoeligheid van een cellijn22. Omdat deze functionele relatie niet-lineair is met betrekking tot de dosis, zijn de biologische effecten van een radiotherapiefractieschema niet alleen gerelateerd aan de totale geleverde dosis, maar ook aan het aantal en de grootte van fracties23. De biologische effectieve dosis (BED) is een maat voor de werkelijke biologische dosis die aan een weefsel wordt geleverd en maakt een directe vergelijking van verschillende fractioneringsschema 'smogelijk 24,25. De BED-vergelijking vereist alleen een schatting van α/β en wordt hieronder weergegeven:
(Vergelijking 14)
waarbij n het aantal fracties van dosis D is. Clonogene celoverlevingstests schatten α/β en vergemakkelijken de directe vergelijking van radiotherapiefractieschema's via de BED-vergelijking. Er kunnen onjuiste conclusies worden getrokken met betrekking tot een weefsel- of orgaanrespons op radiotherapie (of combinaties van radiotherapie met andere modaliteiten) als het BED in de behandelingsgroepen niet billijk is binnen of tussen experimenten. Bijvoorbeeld, 2 fracties van 10 Gy in vergelijking met 4 fracties van 5 Gy leveren niet hetzelfde BED op, en dus kunnen deze doseerschema's niet rechtstreeks worden vergeleken in termen van biologische respons. Hoewel de BED-vergelijking onvolmaakt is als gevolg van inherente beperkingen in het lineair-kwadratische model , schat de BED-vergelijking op betrouwbare wijze billijke effecten in voor een breed scala aan experimentele behandelingsomstandigheden24,25.
Clonogene celoverlevingstests spelen duidelijk een belangrijke rol bij het bestuderen van radiotherapie-effecten in kankermodellen, maar in vitro experimenten bieden een aantal extra opties om mechanistische details van radiobiologie van kankercellen verder te onderzoeken. Eenvoudige wijzigingen van de clonogene celoverlevingstest werden gebruikt om de werkingsmodi te bepalen voor sommige radiosensibiliserende chemotherapieën, zoals paclitaxel of etoposide26,27. Verdere in vitro experimentele opties omvatten immunocytochemiestudies om specifieke cellulaire reparatieroutes te onderzoeken, zoals γ-H2AX foci en/of 53BP1-kleuring voor dubbelstrengs DNA-breukherstel28. Deze experimenten kunnen van bijzonder belang zijn bij het vergelijken van radiotherapie als een enkele modaliteit met combinatietherapieën, vooral bij het onderzoeken van mechanistische details voor een bepaalde cellijn. Andere experimentele opties omvatten cytokinemetingen om de aangeboren rol van de ontstekingsreactie van een cel op bestraling te onderzoeken of analyses van de wijze van celdood (d.w.z. apoptose, necrose, mitotische catastrofe, enz.) onder verschillende therapeutische omstandigheden29,30,31. Dit type experimenten kan dierproeven aanvullen of vervangen en een vollediger begrip van de radiobiologie van een kankercellijn bieden. Ongeacht de keuze van aanvullende experimenten om uit te voeren, is een standaard clonogene celoverlevingstest zoals beschreven in protocol 3 een belangrijke initiële radiobioologische beoordeling van een cellijn.
Clonogene tests en stralingsdosimetrie bieden de onderzoeker een middel om experimenten nauwkeuriger te plannen om directer op klinische scenario's te lijken. Met de toevoeging van preklinische kankermodellen voor kleine knaagdieren, is het mogelijk om de reactie op straling alleen of in de context van een behandelplan in vivo te bestuderen. Alvorens dieren te gebruiken, is het belangrijk om de relatieve dosisoutput van de specifieke opstelling te bepalen als deze afwijkt van de opstelling die wordt gebruikt voor de bepaling van de dosisoutput32,33. Als het gaat om het bepalen van een dosissnelheid voor veldgroottes van <10 mm, wordt het gebruik van een ionisatiekamer minder nauwkeurig als gevolg van uitlijning binnen een klein veld en gedeeltelijke volumemiddelingseffecten33. Het gebruik van radiochrome film om de output te bepalen in combinatie met in vivo immunohistochemische experimenten is gebruikt om de output en dosisdepositie te bepalen in de afgelopen16,34,35,36,37,38.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen te doen.
Acknowledgments
De auteurs willen de Microscope and Animal Models Imaging Facilites van WVU bedanken voor het gebruik van hun apparatuur ondersteund door subsidienummer P20GM103434. Bovendien werd dit werk ondersteund door subsidienummer P20GM121322 van de National Institue of General Medical Sciences, door het National Cancer Institute subsidienummer F99CA25376801 en het Mylan Chair Endowment Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | This or comparable glacial acetic acid products are acceptable. |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | This or comparable crystal violet products are acceptable. |
| Digital Baraometer | Fisher Scientific | 14-650-118 | For pressure and temperature measurements. |
| Electrometer | Standard Imaging | CDX 2000B | Calibrated by an ADCL; Need correction factor, Pelec |
| Film | Gafchromic | EBT3 Film | Comes in sheets of 25; calibration films and experimental films must come from same set |
| Ionization Chamber | Farmer | PTW TN30013 | Calibrated by an ADCL @ two calibration points |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | This or comparable methanol products are acceptable. |
| Photo Scanner | Epson | Perfection V700 | Equivalent scanners are V800, V10000, V11000, V12000 |
| XenX | Xstrahl | NA | Irradiator used. |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Allen, C., Her, S., Jaffray, D. A. Radiotherapy for Cancer: Present and Future. Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 1-2 (2017).
- Delaney, G., Jacob, S., Featherstone, C., Barton, M. The role of radiotherapy in cancer treatment: estimating optimal utilization from a review of evidence-based clinical guidelines. Cancer. 104 (6), 1129-1137 (2005).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Le, Q. T., Shirato, H., Giaccia, A. J., Koong, A. C. Emerging Treatment Paradigms in Radiation Oncology. Clinical Cancer Research. 21 (15), 3393-3401 (2015).
- Baumann, M., et al. Radiation oncology in the era of precision medicine. Nature Reviews Cancer. 16 (4), 234-249 (2016).
- Leeman, J. E., et al. Patterns of Treatment Failure and Postrecurrence Outcomes Among Patients With Locally Advanced Head and Neck Squamous Cell Carcinoma After Chemoradiotherapy Using Modern Radiation Techniques. JAMA Oncology. 3 (11), 1487-1494 (2017).
- Coy, P., et al. Patterns of failure following loco-regional radiotherapy in the treatment of limited stage small cell lung cancer. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 28 (2), 355-362 (1994).
- Achrol, A. S., et al.
- Ma, C. M., et al. AAPM protocol for 40-300 kV x-ray beam dosimetry in radiotherapy and radiobiology. Medical Physics. 28 (6), 868-893 (2001).
- Wang, Y. F., Lin, S. C., Na, Y. H., Black, P. J., Wuu, C. S. Dosimetric verification and commissioning for a small animal image-guided irradiator. Physics in Medicine and Biology. 63 (14), 145001 (2018).
- Wack, L., et al. High throughput film dosimetry in homogeneous and heterogeneous media for a small animal irradiator. Physical Medicine. 30 (1), 36-46 (2014).
- Devic, S. Radiochromic film dosimetry: past, present, and future. Physical Medicine. 27 (3), 122-134 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiation Research. 175 (6), 774-783 (2011).
- Zarghami, N., et al. Half brain irradiation in a murine model of breast cancer brain metastasis: magnetic resonance imaging and histological assessments of dose-response. Radiation Oncology. 13 (1), 104 (2018).
- Nwafor, D. C., et al. Loss of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) enzyme activity in cerebral microvessels is coupled to persistent neuroinflammation and behavioral deficits in late sepsis. Brain, Behavior, and Immunity. , (2019).
- Amtul, Z., Hepburn, J. D. Protein markers of cerebrovascular disruption of neurovascular unit: immunohistochemical and imaging approaches. Reviews in Neuroscience. 25 (4), 481-507 (2014).
- Draeger, E., et al. A Dose of Reality: How 20 Years of Incomplete Physics and Dosimetry Reporting in Radiobiology Studies May Have Contributed to the Reproducibility Crisis. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 106 (2), 243-252 (2020).
- Dunne, A. L., et al. Relationship between clonogenic radiosensitivity, radiation-induced apoptosis and DNA damage/repair in human colon cancer cells. British Journal of Cancer. 89 (12), 2277-2283 (2003).
- Yang, Y., Xing, L. Optimization of radiotherapy dose-time fractionation with consideration of tumor specific biology. Medical Physics. 32 (12), 3666-3677 (2005).
- Hall, E. J., Giaccia, A. J. Radiobiology for the radiologist. Eighth edition. , Wolters Kluwer. (2019).
- van Leeuwen, C. M., et al. The alfa and beta of tumours: a review of parameters of the linear-quadratic model, derived from clinical radiotherapy studies. Radiation Oncology. 13 (1), 96 (2018).
- Fowler, J. F. 21 years of biologically effective dose. British Institute of Radiology. 83 (991), 554-568 (2010).
- Jones, B., Dale, R. G., Deehan, C., Hopkins, K. I., Morgan, D. A. The role of biologically effective dose (BED) in clinical oncology. Clinical Oncology journal | The Royal College of Radiologists. 13 (2), 71-81 (2001).
- Choy, H., Rodriguez, F. F., Koester, S., Hilsenbeck, S., Von Hoff, D. D. Investigation of taxol as a potential radiation sensitizer. Cancer. 71 (11), 3774-3778 (1993).
- Ng, C. E., Bussey, A. M., Raaphorst, G. P. Inhibition of potentially lethal and sublethal damage repair by camptothecin and etoposide in human melanoma cell lines. International Journal of Radiation Biology. 66 (1), 49-57 (1994).
- Kurashige, T., Shimamura, M., Nagayama, Y. Differences in quantification of DNA double-strand breaks assessed by 53BP1/gammaH2AX focus formation assays and the comet assay in mammalian cells treated with irradiation and N-acetyl-L-cysteine. Journal of Radiation Research. 57 (3), 312-317 (2016).
- Schaue, D., Kachikwu, E. L., McBride, W. H. Cytokines in radiobiological responses: a review. Radiation Research. 178 (6), 505-523 (2012).
- Mery, B., et al. In Vitro Cell Death Determination for Drug Discovery: A Landscape Review of Real Issues. Journal of Cell Death. 10, 1179670717691251 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
- Felix, M. C., et al. Collimator optimization for small animal radiation therapy at a micro-CT. Z Medical Physics. 27 (1), 56-64 (2017).
- Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical Physics. 38 (12), 6754-6762 (2011).
- Wong, J., et al. High-resolution, small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. International Journal of Radiation Oncology - Biology - Physics. 71 (5), 1591-1599 (2008).
- Ghita, M., et al. Small field dosimetry for the small animal radiotherapy research platform (SARRP). Radiation Oncology. 12 (1), 204 (2017).
- Biglin, E. R., et al. Preclinical dosimetry: exploring the use of small animal phantoms. Radiation Oncology. 14 (1), 134 (2019).
- Munoz Arango, E. T., Peixoto, J. G., de Almeida, C. E. Small field dosimetry with a high-resolution 3D scanning water phantom system for the small animal radiation research platform SARRP: a geometrical and quantitative study. Physics in Medicine and Biology. , (2019).
- Murrell, D. H., et al. Evaluating Changes to Blood-Brain Barrier Integrity in Brain Metastasis over Time and after Radiation Treatment. Translational Oncology. 9 (3), 219-227 (2016).
