Summary
We presenteren een high-throughput, in vitro methode voor het kwantificeren van regionale longdepositie op kwabniveau met behulp van CT-scan-afgeleide, 3D-geprinte longmodellen met afstembare luchtstroomprofielen.
Abstract
De ontwikkeling van gerichte therapieën voor longziekten wordt beperkt door de beschikbaarheid van preklinische testmethoden met het vermogen om regionale aerosollevering te voorspellen. Met 3D-printen om patiëntspecifieke longmodellen te genereren, schetsen we het ontwerp van een in vitro experimentele opstelling met hoge doorvoer voor het kwantificeren van lobulaire longdepositie. Dit systeem is gemaakt met een combinatie van in de handel verkrijgbare en 3D-geprinte componenten en maakt het mogelijk om het debiet door elke longkwab onafhankelijk te regelen. Levering van fluorescerende aerosolen aan elke kwab wordt gemeten met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit protocol heeft het potentieel om de groei van gepersonaliseerde geneeskunde voor luchtwegaandoeningen te bevorderen door zijn vermogen om een breed scala aan demografische en ziektetoestanden van patiënten te modelleren. Zowel de geometrie van het 3D-geprinte longmodel als de instelling van het luchtstroomprofiel kunnen eenvoudig worden gemoduleerd om klinische gegevens weer te geven voor patiënten met verschillende leeftijd, ras en geslacht. Klinisch relevante hulpmiddelen voor de toediening van geneesmiddelen, zoals de hier getoonde endotracheale buis, kunnen in de testopstelling worden opgenomen om nauwkeuriger te voorspellen of een apparaat in staat is om therapeutische toediening aan een ziek gebied van de long te richten. De veelzijdigheid van deze experimentele opstelling maakt het mogelijk om het aan te passen aan een veelheid aan inhalatieomstandigheden, waardoor de strengheid van preklinische therapeutische tests wordt verbeterd.
Introduction
Veel longziekten zoals longkanker en chronische obstructieve longziekte (COPD) vertonen regionale verschillen in ziektekenmerken; er zijn echter een gebrek aan therapeutische technieken beschikbaar om de levering van geneesmiddelen aan alleen zieke gebieden van de longen te richten1. Meerdere computationele vloeistofdynamische (CFD)-modellen hebben aangetoond dat het mogelijk is om de depositieprofielen van geneesmiddelen te moduleren door specifieke stroomlijnen in delongen teidentificeren 2,3. De ontwikkeling van zowel inhalatoren als endotracheale (ET) buisadapters met regionale targetingmogelijkheden is in ons lab aan de gang om de aerosoldistributie naar zieke longregio's te beheersen. De uitbreiding van deze beginselen tot klinisch gebruik wordt beperkt door de huidige preklinische testcapaciteit. De precieze locatie waar een geneesmiddel zich in de long afzettingen, is bekend als de beste voorspeller van werkzaamheid; de huidige farmaceutische beoordelingen van inhaleerbare therapieën worden echter meestal voorspeld met behulp van in vitro-in vivo correlaties van deeltjesgrootte om depositie slechts bij benadering te benaderen4. Deze techniek maakt geen ruimtelijke analyse mogelijk om de effecten van verschillende luchtweggeometrieën op de regionale verdeling door de verschillende longlobben te bepalen. Bovendien mist deze test anatomisch nauwkeurige longgeometrieën, waarvan onderzoekers hebben aangetoond dat ze een aanzienlijke impact kunnen hebben op depositieprofielen5. Er zijn enkele inspanningen geleverd om patiëntspecifieke longgeometrieën op te nemen in testprotocollen door toevoeging van de bovenste luchtwegen; de meeste van deze benaderingen bemonsteren echter de levering van aerosolen aan verschillende generaties van de long in plaats van elke longkwab6,7,8. Het volgende protocol presenteert een methode met hoge doorvoer om patiëntspecifieke longmodellen te genereren met de capaciteit om relatieve deeltjesdepositie in elk van de vijf kwabben van de long te kwantificeren9.
Anatomisch nauwkeurige modellongen worden gegenereerd door ct-scans (3D printing patient computed tomography). Bij gebruik in combinatie met een eenvoudig te monteren debietsysteem kunnen de relatieve debieten door elk van de longlobben van het model onafhankelijk worden gecontroleerd en aangepast om die van verschillende demografische en/of ziektetoestanden van de patiënt na te bootsen. Met deze methode kunnen onderzoekers de werkzaamheid van potentiële therapeutische methoden in een relevante longgeometrie testen en de prestaties van elke methode correleren met de progressie van zieke morfologie. Hier worden twee apparaatontwerpen die in ons lab zijn ontwikkeld, getest op hun vermogen om de afzetting in een gewenste longkwab te verhogen door de locatie van aerosolafgifte in de mond of luchtpijp te regelen. Dit protocol heeft ook het potentieel om de ontwikkeling van gepersonaliseerde procedures voor patiënten aanzienlijk te beïnvloeden door de snelle voorspelling van de werkzaamheid van de behandeling in een modellong te vergemakkelijken die specifiek is voor de CT-scangegevens van die patiënt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van 3D-geprinte experimentele componenten
OPMERKING: Alle software die in het protocol wordt gebruikt, wordt aangegeven in de tabel met materialen. Bovendien is de gebruikte snijsoftware specifiek voor de 3D-printer die wordt vermeld in de tabel met materialen; Dit protocol kan echter worden uitgebreid tot een breed scala aan stereolithografie (SLA) 3D-printers.
- Converteer CT-scans van patiënten naar 3D-objecten (.stl-bestanden).
OPMERKING: Voor een meer gedetailleerde bespreking van de geometrische kenmerken van het specifieke longmodel dat in deze studies wordt gebruikt, raadpleegt u Feng et al.5.- Render CT-scans in een 3D-object met behulp van CT-scansoftware (zie Tabel met materialen). Open de CT-scan en maak een masker op het luchtruim met behulp van het gereedschap Drempel met een instelling tussen -800 en -1000. Bekijk met het gereedschap 3D-voorbeeld de 3D-rendering en exporteer het object (File | Exporteren)als een .stl-bestand.
- Het importeren van de bestanden in mesh editing software (zie Tabel van materialen),verwijder eventuele gekartelde functies met behulp van de Select tool(Sculpt | Borstels: "Shrink/Smooth" | Eigenschappen: Sterkte (50), Grootte (10), Diepte(0)). Het oppervlak gladmaken (Ctrl+A | | vervormen Glad | Vloeiend maken (0,2), Afvlakte schaal (1)).
- In meshbewerkingssoftware verlengt u de wand van deze objecten met 2 mm(Ctrl+A | Bewerken | Offset), en laat het binnenste object hol blijven zodat alleen de muur overblijft. Segment het object (Selecteer | Bewerken | Plane Cut) aan de luchtpijp om een inlaat te vormen en bij generaties 2 of 3 waar het object naar elke kwab vertakt om uitlaten te creëren (Figuur 1A).
OPMERKING: De dikte van 2 mm is gekozen op basis van de aanvaardbare functiegrootten die zijn opgegeven door de fabrikant van de 3D-printer die is vermeld in de tabel met materialen. Deze dikte kan worden aangepast op basis van de specificaties van de beschikbare 3D-printer als de binnengeometrie van het model behouden blijft.
- Wijzig de uitlaatgeometrieën van het patiëntlongmodel om compatibel te zijn met eerder ontworpen onderdelen van de lobbenuitlaatdop (figuur 1B,C) die in de tabel met materialenworden vermeld .
- Importeer het 3D-object, dat de CT-scan aan de binnenkant repliceert, een wanddikte van 2 mm heeft en open is bij de in- en uitgangen, in 3D-modelleringssoftware (zie tabel met materialen)als een solid body(Open | Mesh-bestanden | Opties | Solide lichaam).
- Een vlak maken op basis van een vlak op elk van de uitgangen (Invoegen | Referentiegeometrie | Vlak). Traceer met behulp van het splicing-gereedschap de binnenwand en buitenwand van de uitlaat in een schets op het vlak (Schets | Spline).
- Loft een cilinder (OD 18,5 mm, ID 12,5 mm, H 15,15 mm) om aan te sluiten op de binnen- en buitenwand van het model, waardoor de uitlaat uniform wordt bij elke kwab(Kenmerken | Verheven Baas/Basis). Voeg een inkeping toe rond de rand van de uitlaat die overeenkomt met de dop (Functies | Geëxtrudeerd gesneden | Verschuiving).
OPMERKING: De dop (figuur 1D) is een holle cilinder die overeenkomt met de afmetingen van de uitgangen en een plank heeft die aansluit op de inkeping van de modeluitlaat. Het ene uiteinde van de dop is zodanig geblokkeerd dat de ID kleiner is dan de rest van het onderdeel, dit zorgt voor een strakke pasvorm rond de prikkeldraadaansluiting (figuur 1E). De prikkeldraadslangverbinding is een kegelvormige t prikkeldraadvorm, zodat de prikkeldraad door de opening van de dop past, maar de rest van het deel niet, waardoor de slangverbinding stevig in de dop past. Zo past de dop strak rond zowel de prikkeldraadverbinding als het longmodel(figuur 1F,G). - Wijzig de inlaat van het longmodel afhankelijk van de gewenste experimentele omstandigheden. De keel- en vlekgebieden kunnen worden opgenomen om een patiënt na te bootsen die zelfstandig kan ademen (Figuur 1B). Gebieden boven de luchtpijp kunnen worden verwijderd met behulp van een geëxtrudeerde snede om een geïntubeerde patiënt na te bootsen op beademingsondersteuning(Kenmerken | Geëxtrudeerde snede) (figuur 1C).
- Oriënteer en ondersteun experimentele componenten in snijsoftware van de fabrikant van de 3D-printer.
- Importeer 3D-onderdeelbestanden in 3D-printerlicentiesoftware en kies de juiste hars. Gebruik een harde hars om de longmodellen en prikkeldraadslangverbindingen af te drukken en een zachte hars om de doppen af te drukken.
OPMERKING: De hars die wordt gebruikt voor het afdrukken van de doppen moet elastische eigenschappen hebben om deze over de lobbenuitlaat te kunnen strekken en een luchtdichte afdichting te creëren. - Stel de oriëntatie van het onderdeel zo in dat alle "eilanden" en niet-geventileerde volumes worden geminimaliseerd. De beste oriëntatie voor de longmodellen is met de lobbenuitlaten weg van het printplatform. Zorg ervoor dat zowel de prikkeldraadaansluitingen als de doppen de bredere delen naar het afdrukplatform hebben gericht.
OPMERKING: Afzonderlijke segmenten kunnen worden bekeken om te controleren op het uiterlijk van "eilanden", secties van het onderdeel die voor het eerst in een segment verschijnen zonder te zijn verbonden met de hoofdtekst van het onderdeel. De beoordelingsfunctie kan worden gebruikt om te controleren op plakjes met niet-geventileerde volumes, gebieden waar niet-uitgeharde hars tijdens het afdrukken in het onderdeel kan vast komen te zitten. Zowel "eilanden" als niet-geventileerde volumes verminderen de afdrukkwaliteit en kunnen leiden tot afdrukfouten. - Als u elk segment afzonderlijk bekijkt, voegt u ondersteuning toe aan alle resterende "eilanden" in het onderdeel en aan gebieden met aanzienlijke uitsteeksels. Exporteer en bekijk de segmenten voor de afdruk om te controleren of alle gebieden goed worden ondersteund.
- Importeer 3D-onderdeelbestanden in 3D-printerlicentiesoftware en kies de juiste hars. Gebruik een harde hars om de longmodellen en prikkeldraadslangverbindingen af te drukken en een zachte hars om de doppen af te drukken.
- Print experimentele componenten en volledige nabewerking volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Alle hieronder beschreven nabewerkingsstappen zijn specifiek voor de 3D-printer die wordt vermeld in de tabel met materialen. Wanneer u alternatieve printers of materialen gebruikt, past u deze stappen aan om de instructies van de fabrikant weer te geven.- Voor onderdelen bedrukt in zachte hars, wassen met ≥99% zuiverheid isopropylalcohol (IPA) om overtollige niet-uitgeharde hars en thermische uitharding te verwijderen in een heteluchtoven gedurende 8 uur volgens de specificaties van de fabrikant.
OPMERKING: Onderdelen die in zachte hars worden afgedrukt, kunnen direct na het afdrukken zeer delicaat zijn, dus wees extra voorzichtig tijdens het reinigen. Blootstelling aan IPA moet onder de grenswaarde voor blootstelling aan oplosmiddelen van het materiaal worden gehouden om gedeeltelijke afbraak te voorkomen. - Voor onderdelen die in harde hars zijn bedrukt, wast u met IPA om overtollige niet-uitgeharde hars te verwijderen en hardt u uit in een UV-oven (365 nm licht bij 5-10 mW/cm2)gedurende 1 min per zijde.
OPMERKING: Om de nauwkeurigheid van de 3D-geprinte replica te evalueren, wordt aanbevolen om μCT-scanning van het afgedrukte onderdeel en CT-scansoftware te gebruiken om kwantitatief variaties tussen de oorspronkelijke 3D-rendering en de 3D-geprinte replica te vergelijken.
- Voor onderdelen bedrukt in zachte hars, wassen met ≥99% zuiverheid isopropylalcohol (IPA) om overtollige niet-uitgeharde hars en thermische uitharding te verwijderen in een heteluchtoven gedurende 8 uur volgens de specificaties van de fabrikant.
2. Montage van het buizenstelsel voor debietregeling
- Schroef 1/4" prikkeldraadfittingen in de zijkant van het spruitstuk met 6 poorten(afbeelding 2A-6)en een 3/8" prikkelbuis die in de resterende poort past.
- Snijd de 1/4" slang op de gewenste lengte en steek deze in elk uiteinde van de push-to-connect kleppen (Afbeelding 2A-5). Bevestig elke klep aan een van de 1/4" fittingen die in het spruitstuk zijn geplaatst.
- Sluit een debietmeter (afbeelding 2A-4) aan op het andere uiteinde van elke klep.
- Plaats het slangsysteem op de houten plank zodanig dat de enkele 3/8"-fitting van het spruitstuk zich langs de rand van het bord uitstrekt. Om op zijn plaats te bevestigen, voegt u twee schroeven toe aan de zijkant van de houten plank en bevestigt u het spruitstuk met draad aan de schroeven.
- Voeg vier schroeven toe die rond elk van de kleppen en stromingsmeters zijn geplaatst en gebruik draad om elk van hen aan de houten plank te bevestigen(afbeelding 2E).
- Sluit het spruitstuk met ongeveer 6" 3/8" ID-buizen aan op een in-line 0,1 μm poriegrootte vacuümfilter. Sluit het andere uiteinde van het filter aan op de flowcontroller met een andere 6" 3/8" ID-slang
OPMERKING: Het slangsysteem hoeft slechts één keer te worden gemonteerd.
3. Assemblage van lobbenuitlaatkappen met geduldig longmodel
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol moet vóór elke experimentele uitvoering worden voltooid.
- Steek prikkeldraadslangverbinding in de dop met mondstuk dat door de opening in de dopbasis steekt. Steek eerst een uiteinde van de ovale prikkeldraadverbindingsbasis in de dop. Rek vervolgens de flexibele dop voorzichtig over het andere uiteinde van de ovale basis, waarbij u er speciaal voor zorgt dat de dunne basis niet wordt gekraakt.
OPMERKING: Nieuw bedrukte doppen kunnen stijver zijn dan gewenst en kunnen worden uitgerekt door met twee vingers langs de binnenkant van de dop te lopen. - Snijd 10 μm filterpapier zodanig dat het iets groter is dan het uitlaatgebied. Vouw het filterpapier over de lobbenuitlaat en houd het met één hand op zijn plaats.
- Gebruik met de andere hand een pincet om de dop met prikkeldraadslangverbinding over de uitlaat te strekken. Druk de dop naar beneden totdat de inkeping van de dop overeenkomt met de overeenkomstige inkeping op de lobbenuitlaat (figuur 2C).
OPMERKING: Het rippen van het filterpapier in deze stap kan de resultaten ongeldig maken, dus wees voorzichtig om overmatige kracht te voorkomen bij het indrukken van de dop op de uitlaat. - Herhaal dit voor alle resterende lobbenuitlaten (figuur 2D).
4. Genereren van klinisch relevant luchtstroomprofiel
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol moet vóór elke experimentele uitvoering worden voltooid.
- Sluit elk longmodel lobbenuitlaat aan op de slang van de bijbehorende debietmeter en klep, waarbij u ervoor zorgt dat er niet te veel zijdelingse druk op de prikkeldraadaansluiting wordt uitgeoefend. Bevestig de elektronische debietmeter aan de mondinlaat van het longmodel om het totale luchtdebiet met het longmodel te meten.
- Schakel de debietregelaar (figuur 2A-7) en de vacuümpomp in (afbeelding 2A-8). Selecteer de instelling "testinstelling" op de debietregelaar en verhoog langzaam het debiet totdat de elektronische debietmeter het gewenste totale debiet weergeeft.
- Stel met behulp van de kleppen(afbeelding 2E-5)het debiet in door elk van de vijf longlobben: Rechts Boven (RU), Rechts Midden (RM), Rechts Onder (RL), Links Boven (LU) en Links Onder (LL). Zodra de lobdebieten op de debietmeters (figuur 2E-4) stabiel zijn op de gewenste waarde, controleert u het totale debiet opnieuw op de elektronische debietmeter om te controleren of er geen lekken in het systeem zijn.
- Als er een discrepantie is in het totale debiet, verlaagt u het debiet met de debietregelaar, stelt u alle kleppen in op de volledig geopende configuratie en herhaalt u stap 4.2 en 4.3.
OPMERKING: De hier gepresenteerde resultaten werden verkregen met behulp van luchtstroomprofielen op basis van gegevens gerapporteerd door Sul et al.10 Deze lobar flowfracties werden berekend met behulp van dun gesneden computertomografiebeelden van de longen van patiënten bij volledige inspiratie en expiratie, waarbij de relatieve veranderingen in het volume van elke longkwab werden vergeleken. De resultaten worden gepresenteerd voor twee verschillende stroomomstandigheden, beide bij een totaal inlaatdebiet van 1 L/min. Het gezonde longkwab-uitlaatstroomprofiel wordt naar elke uitlaat verdeeld door het volgende percentage van de inlaatstroom: LL-23,7%, LU-23,7%, RL-18,7%, RM-14,0%, RU-20,3%. Het COPD-lobbenuitlaatstroomprofiel wordt over elke uitlaat verdeeld door het volgende percentage van de inlaatstroom: LL-10,0%, LU-29,0%, RL-13,0%, RM-5,0%, RU-43,0%9,10.
- Als er een discrepantie is in het totale debiet, verlaagt u het debiet met de debietregelaar, stelt u alle kleppen in op de volledig geopende configuratie en herhaalt u stap 4.2 en 4.3.
- Verlaat de "testopstelling" functie van de flow controller maar laat de vacuümpomp aan.
OPMERKING: Het uitschakelen van de vacuümpomp tussen het instellen van de debieten en het uitvoeren van het depositie-experiment kan leiden tot onnauwkeurigheden in het gegenereerde stroomprofiel. Het wordt aanbevolen om de vacuümpomp aan te laten zodra de gewenste debieten zijn ingesteld om de aerosoldepositietest te voltooien.
5. Levering van aerosol aan het longmodel
OPMERKING: Experimenten moeten worden uitgevoerd in een zuurkast met de vleugel gesloten om de blootstelling aan aërosolen die door de vernevelaar worden gegenereerd, te minimaliseren.
- Vul de vernevelaar met oplossing van de gewenste fluorescerende deeltjes (figuur 2A-1) en sluit aan op de inlaat van het longmodel (figuur 2B).
OPMERKING: De hier gepresenteerde resultaten werden verkregen met behulp van 30 ml van een verdunning van 1:100 van 1 μm fluorescerende polystyreendeeltjes in methanol.- Om de experimentele opstelling te valideren, sluit u de vernevelaar rechtstreeks aan op de inlaat van het longmodel zonder targetingapparaat.
- Om de werkzaamheid van een richtapparaat te meten, sluit u de vernevelaar aan op het apparaat en plaatst u het apparaat in het longmodel.
- Sluit de persluchtleiding aan op de vernevelaar en sluit de vleugel van de zuurkast zoveel mogelijk.
- Stel de stroomregelaar in op één proef van 10 s. Voordat u op start drukt, opent u de persluchtklep iets om te beginnen met het genereren van een aerosol in de vernevelaar.
- Druk op start op de flow controller en open onmiddellijk de persluchtklep volledig. Zodra de stromingsregelaar ongeveer 9 s bereikt, begint u de persluchtklep te sluiten.
- Zodra de persluchtklep volledig is gesloten, koppelt u de vernevelaar los van de persluchtleiding, sluit u de vleugel van de zuurkast volledig, sluit u de vacuümpomp af en laat u eventuele aerosolen ongeveer 10 minuten uit de zuurkast wissen.
OPMERKING: Het is belangrijk om de vacuümpomp uit te schakelen na het voltooien van een run om te voorkomen dat er zich een vacuüm oploopt in het slangsysteem. - Na voldoende tijd te hebben gewacht, koppelt u het longmodel los van het slangsysteem en zorgt u er speciaal voor dat de prikkeldraadslangverbindingen niet worden gekraakt.
- Verwijder de lobbenuitlaatdoppen door een pincet onder de rand van de dop te laten lopen en het voorzichtig van het longmodel te tillen.
- Verwijder het filterpapier van de dop en plaats het in een 24-putplaat met de zijkant waarop deeltjes zich op de bodem bevinden die naar de put van de plaat zijn gericht. Herhaal dit voor de resterende uitlaten en label de put die overeenkomt met elke kwab.
OPMERKING: Om te voorkomen dat restdepositie van deeltjes van invloed is op latere experimenten, is het belangrijk om zowel het longmodel als de dopcomponenten tussen de runs door te spoelen met IPA of geschikt oplosmiddel. Dit kan naar wens worden verzameld en opgenomen in de analyse. Bovendien wordt een logboek bijgehouden om ervoor te zorgen dat alle gebruikte replica's minimaal zijn blootgesteld aan IPA om de integriteit van onderdelen te behouden, en inspectie van visuele onderdelen wordt aanbevolen voorafgaand aan gebruik.
6. Uitlaatfilter papier beeldvorming
- Plaats de putplaat in de digitale fluorescentiemicroscoop en zet de microscoop op 4x vergroting en het juiste fluorescentiekanaal.
- Identificeer visueel welke kwab het filterpapier de hoogste hoeveelheid deeltjesdepositie heeft en gebruik de functie "Auto Expose". Let op de resulterende belichtings- en integratietijdwaarden.
- Pas deze belichting toe op alle filters voor de uitvoering en beoordeel of de instelling een bevredigend beeld oplevert voor alle gebieden met hoge depositie van de filters.
OPMERKING: Focusinstellingen kunnen worden gewijzigd van filter naar filter; alle filters voor een bepaalde uitvoering moeten echter worden geanalyseerd met dezelfde belichtingsinstellingen. Het is slechts mogelijk om één scherpstelkader tegelijk te hebben, dus bochten of scheuren in het filterpapier kunnen voorkomen dat alle afgezette deeltjes in het zicht scherp zijn. Dit kan worden voorkomen door ervoor te zorgen dat het filterpapier plat tegen de bodem van de putplaat ligt. - Maak ten minste drie afbeeldingen van het filterpapier van elke kwab op willekeurige locaties en sla op als .tiff bestanden.
7. Kwantificering van deeltjesdepositie
- Importeer alle filterpapierafbeeldingen voor een bepaalde uitvoering in een ImageJ-sessie.
- Wijzig het type van elke afbeelding in 8-bits door Afbeelding | te selecteren Type | 8-bits.
- Open de afbeelding met de hoogste fluorescentie en selecteer Afbeelding | | aanpassen Drempel om een drempel venster te openen. Pas de drempelwaarden aan om het achtergrondsignaal van het filterpapier te minimaliseren en definieer duidelijk de randen van deeltjes. Zie figuur 3 voor afbeeldingen van drempels van goede en slechte kwaliteit.
OPMERKING: Voor filters met een hoog depositieniveau kan een "corona" van fluorescentie, veroorzaakt door de diffractie van licht door de papiervezels van het filter, worden waargenomen rond grote groepen deeltjes. Bij het drempelen van deze afbeeldingen worden in een te groot bereik kleine stippen of "veerachtige" vormen rond deze gegroepeerde groepen weergegeven, zoals wordt waargenomen in de "slechte" drempelafbeeldingen in figuur 3. Dit kan worden verbeterd door de ondergrens van de drempel geleidelijk te verhogen totdat het signaal van de papiervezels van het filter wordt geminimaliseerd zonder het signaal van de deeltjes zelf te verduisteren. - De drempelwaarde-instellingen voor de hoogste fluorescentieafbeelding doorgeven aan alle andere afbeeldingen.
- Kwantificeer het aantal deeltjes en het totale fluorescerende gebied door Analyse | Analyseer deeltjes.
OPMERKING: Datasets worden vergeleken met sidak's multiple comparisons test en een tweerichtings ANOVA. Bovendien wordt depositie in alleen de kwab van belang vergeleken met behulp van een Student T-test uitgaande van gelijke variantie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deeltjes in dit groottebereik (1-5 μm) en stroomomstandigheden (1-10 L/min) volgen de vloeistofstroomlijnen op basis van zowel hun theoretische Stokes-getal als in vivo gegevens; bij gebrek aan een doelafgifteapparaat wordt daarom verwacht dat deeltjes die in het longmodel vrijkomen, zich zullen afzetten volgens het percentage van de totale luchtstroom dat naar elke kwab wordt omgeleid. De relatieve hoeveelheden deeltjesafgifte aan elke kwab kunnen vervolgens worden vergeleken met klinische lobbendebietgegevens die worden verkregen door het analyseren van patiëntspecifieke hoge resolutie computertomografie (HRCT) scans10. Een gevalideerde experimentele opstelling zal een niet-gericht deeltjesdepositieprofiel opleveren dat geen statistisch significant verschil heeft met het klinische luchtstroomprofiel. Validatiegegevens worden gepresenteerd voor twee verschillende stroomomstandigheden: 1 L/min in een gezonde long (figuur 4A) en 1 L/min in een long die is aangetast door COPD (figuur 4B). Onder beide omstandigheden verschilde het experimenteel bepaalde depositieprofiel niet statistisch van de klinische gegevens, wat aantoont dat de opstelling de verdeling van de luchtstroom naar elk van de longlobben nauwkeurig nabootst. Deze basislijndepositieprofielen dienden als de controle waartegen gerichte deeltjesdepositieprofielen worden vergeleken.
Om het vermogen van dit protocol om veranderingen in regionale longdepositie te kwantificeren te illustreren, werden gegevens opgenomen voor het testen van twee verschillende richtinrichtingen: een gemodificeerde endotracheale (ET) buis (figuur 5B) en een concentrische cilinderinrichting (figuur 5E). Beide apparaten hadden een 2 mm ID-uitgang met afstembare locatie voor gerichte deeltjesafgifte. De gemodificeerde ET-buis werd beoordeeld met het geïntubeerde longmodel op zijn vermogen om deeltjesdepositie te richten op zowel de linker onder (LL) kwab als de rechter onder (RL) kwab. In vergelijking met het niet-gerichte deeltjesdepositieprofiel genereerde dit apparaat een bijna viervoudige toename van de ll-kwabafgifte (T-test p=0,004, n=3) naast het omleiden van meer dan 96% van de geleverde deeltjes naar de linkerlong (T-test p=0,0001, n=3) (figuur 5A). Door de instelling van de ontgrendelingslocatie te wijzigen om de RL-kwab te richten, genereerde dit apparaat meer dan de deeltjestoevoer naar de RL-kwab (T-test p=0,02, n=3) en leidde 94% van de geleverde deeltjes om naar de rechterlong (T-test p=0,0005, n=3) (figuur 5C). Dit geeft aan dat het apparaat zeer succesvol is in het produceren van de beoogde depositieprofielmodulatie. Het concentrische cilinderapparaat werd getest in het volledige longmodel met een beoogd doel van de Linker Bovenkwab (LU). In vergelijking met het niet-gerichte deeltjesdepositieprofiel veroorzaakte dit apparaat een bijna verdrievoudiging van de lukwabafgifte (T-test p=0,0003, n=3) naast het omleiden van meer dan 87% van de geleverde deeltjes naar de linkerlong (T-test p=0,002, n=3) (figuur 5D). Targetingefficiëntie kan ook kwalitatief worden waargenomen door de afbeeldingen van het doelkwabfilter te vergelijken met de andere uitlaatfilters. Zoals afgebeeld in figuur 3, zal de meest effectieve richtmethode een hoge deeltjesdepositie opleveren bij de beoogde kwab van belang en een lage depositie bij de resterende lobbenuitlaten. Voor verdere demonstraties van de mogelijkheden van dit protocol, zie de experimenten uitgevoerd door Kolewe et al9.
Figuur 1: 3D geprinte experimentele componenten. (A) Ct-scan van de patiënt omgezet in 3D-deelbestand met behulp van CT-scan en mesh-bewerkingssoftware. (B) Longmodel met lobbenuitlaataanpassingen gemaakt in mesh editing en 3D modellering software. (C) Longmodel met inlaat aangepast in 3D-modelleringssoftware om een geïntubeerde patiënt weer te geven. (D) Prikkeldraadslangaansluiting en (E) dop ontworpen in 3D-modelleringssoftware. (F) Dwarsdoorsnede van het 3D-model dat het in elkaar grijpende karakter van de longmodeluitlaten met de dop en de prikkeldraadaansluiting weergeeft. (G) Geëxplodeerde weergave van longmodel uitlaatdopassemblage. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Montage van experimentele opstelling. (A) Schematisch van experimentele opstelling inclusief (1) vernevelaar, (2) longmodel, (3) uitlaatdoppen, (4) debietmeters, (5) kleppen, (6) spruitstuk, (7) stroomregelaar en (8) een vacuümpomp. (B) Volledig geassembleerde opstelling. (C) Close-up van lobbenuitlaat met geassembleerde dop. (D) Longmodel met alle doppen toegevoegd. (E) Close-up van buizennetwerk voor het instellen van lobbenuitlaatdebieten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Filter papier beeldverwerking. De gepresenteerde ruwe beelden werden verzameld tijdens een experiment om de linkerlong te targeten met behulp van 1 μm fluorescerende polystyreendeeltjes op 1 L/min onder een gezond ademhalingsprofiel. De "hoge" en "lage" depositiebeelden tonen respectievelijk de LL- en RU Lobe-filters. De "goede" drempel, toegepast met een bereik van 43 tot 255, handhaaft gedefinieerde randen tussen individuele deeltjes en vermijdt detectie van filterpapiervezels. De "slechte" drempel, toegepast met een bereik van 17 tot 255, verduistert individuele deeltjesranden en overschat het fluorescerende gebied van het filter. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Experimentele installatievalidatie. (A) Validatieresultaten voor gezonde patiënten en (B) een COPD-patiënt op 1 L/min. Alle gepresenteerde gegevens zijn gemiddelde ± SD met drie duplo's (met uitzondering van klinische COPD-gegevens, waarbij slechts één patiënt werd gemeld). Klinische referentiegegevens voor gezonde en COPD-patiënten werden verkregen van Sul, et al10. Datasets werden vergeleken met sidak's multiple comparisons test, en alle verschillen zijn niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeldgegevens voor targetingexperimenten. (A) Linker onderste kwab en (C) rechter onderste kwab targeting bereikt met behulp van (B) een gemodificeerd ET buis leveringssysteem. (D) Linker bovenste kwab targeting bereikt met behulp van (E) een concentrische buis levering systeem. Voor alle drie de gegevenssets vertegenwoordigt de binnenste ring het niet-gerichte depositieprofiel dat is verkregen tijdens de validatie van de installatie, en de buitenste ring vertegenwoordigt het depositieprofiel dat is geproduceerd met de toevoeging van het aangegeven targetingapparaat. Er worden drie replica's voor elke installatie weergegeven. Datasets werden vergeleken met sidak's multiple comparisons test en een student T-test uitgaande van gelijke variantie. Alle drie de opstellingen zorgden voor een aanzienlijke toename van de levering aan de kwab van belang: LL Lobe (T-test p=0.004, n=3), RL Lobe (T-test p=0.02, n=3) en LU Lobe (T-test p=0.0003, n=3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige state-of-the-art apparaat voor long farmaceutisch testen van een volledige inhalatiedosis is het Next Generator Impactor (NGI), dat de aerodynamische diameter van een aerosolmeet 4. Deze dimensioneringsgegevens worden vervolgens gebruikt om de longgeneratie te voorspellen waarbij de aerosol zich zal afzetten op basis van een correlatie die is ontwikkeld voor een gezonde volwassen man11. Helaas is deze methode beperkt in zijn vermogen om verschillen in regionale longdepositie te beoordelen, de effecten van ziekteomstandigheden op de farmaceutische levering te bepalen en depositieprofielen te voorspellen voor verschillende leeftijdsgroepen, rassen en geslachten12,13,14. Het hier geschetste protocol heeft de capaciteit om aan deze testbehoeften te voldoen door onderzoekers in staat te stellen afstembare, anatomisch nauwkeurige longmodellen te genereren met de mogelijkheid om relatieve depositie op kwabniveau te kwantificeren, op basis van vloeistofstroomgedrag dat eerder werd aangetoond in computationele modellen3,5,15. Met behulp van deze methode kunnen farmaceutische dosering en toediening beter worden beoordeeld op pediatrische en zieke longgeometrieën voordat ze aan klinische proeven beginnen.
Zoals blijkt uit de figuren 4 en figuur 5, kan de afzetting op lobbenniveau nauwkeurig en snel worden gemeten voor zowel gerichte als niet-gerichte inhalatieaërosolen. Bij afwezigheid van een richtinrichting volgen deeltjes in dit groottebereik (1-5 μm) en stroomomstandigheden (1-10 L/min) de vloeistof stroomlijnen en het totale luchtstroomprofiel dat naar elke kwab wordt omgeleid (figuur 4). Met name kunnen verschillende inhalatorapparaten en ET-buisbevestigingen worden ontwikkeld om ingeademde geneesmiddelen te concentreren op gecontroleerde kwablocaties. Zoals beschreven in ons recente werk en dat van anderen, dragen veel kenmerken van het inhalatorapparaat, het stromingsprofiel en de luchtweggeometrie bij aan gericht depositiegedrag2,3,9,16. Over het algemeen vereist efficiënte regionale targeting, zoals aangetoond door onze unieke in vitro modellen, een smalle aerosolgrootteverdeling en lage inhalatiedebieten om turbulentie van de luchtwegen te voorkomen die specifiek in de luchtpijp wordt aangetroffen. Opname van de volledige bovenste luchtwegen in ons in vitro model maakt een nauwkeurige recreatie mogelijk van deze luchtstroompatronen waarvan bekend is dat ze de stroomafwaartse verdeling op kwabniveau beïnvloeden9. Vanwege deze complexe stromen heeft recent werk aangetoond dat de targeting van onder de glottis9is toegenomen . Onze resultaten in figuur 5 benadrukken specifiek het voordeel van het gebruik van een ET-buisadapter om individuele lobben regionaal te targeten vanaf de afgifte onder de glottis, waarbij efficiënte kwabspecifieke targeting wordt getoond voor lobben van zowel de rechter- als linkerlong bij efficiënties variërend tussen 62-74% van de totale dosis. Dit betekent een toename ten opzichte van eerder experimenteel gerapporteerde regionale efficiëntieverbeteringen voor mondafgifte en is een belangrijke weg voor klinische implementatie van deze aanpak9. Belangrijk is dat het protocol experimentele kwabverdelingsmetingen van een volledige farmaceutische dosering mogelijk maakt van een breed scala aan potentiële regionale targetingapparaten die verder gaan dan hier gedemonstreerd.
Met alleen een CT-scan kan een patiëntspecifiek longmodel snel 3D-geprint worden om een mogelijke therapeutische toedieningsmethode te testen. Dit protocol biedt niet alleen een experimentele benadering op laboratoriumschaal ter ondersteuning van het ontwerp van nieuwe inhalatorapparaten, maar creëert ook mogelijkheden voor gepersonaliseerde inhalatieapparatuur op aanvraag in de klinische praktijk. De harde hars die in dit protocol wordt gebruikt, kost ~ $ 0,12 / ml; daarom kunnen ziekenhuizen met bestaande 3D-printinfrastructuur een longmodel printen voor slechts $ 15 in materialen17 en een gepersonaliseerde luchtweg in minder dan een dag monteren. Met name de druktijden en materiaalkosten in de additieve productie blijven snel dalen, waardoor de algehele haalbaarheid van deze aanpak toeneemt. Onze experimentele opstelling kan eenvoudig worden aangepast om een aantal luchtstroomomstandigheden weer te geven door gebruik te maken van een ander longmodel of luchtstroomverdelingsinstelling, na de experimentele validatie in figuur 4. Verschillen in longstroomprofielen en geometrieën als gevolg van kenmerken zoals leeftijd, ras en geslacht zijn goed gedocumenteerd in de literatuur en kunnen gemakkelijk worden opgenomen in onze modelleringsbenadering18,19,20. In het bijzonder kunnen geometrische variaties in het strottenhoofd, de keelholte en de luchtpijp van longmodellen een aanzienlijke invloed hebben op de luchtstroom en de daaropvolgende regionale depositiepatronen15,21,22, die dit protocol goed kan detecteren. De integratie van deze gepersonaliseerde modelleringsbenadering zal dus naar verwachting een aanzienlijke impact hebben op de ontwikkeling van aangepaste inhalatietherapieën.
Hier werden de lobbendebieten aangepast om die van een COPD-ziektetoestand weer te geven die wordt gekenmerkt door een verminderde luchtstroom naar de onderste kwabben(figuur 4B),maar COPD-patiënt-afgeleide CT-scans kunnen ook worden gebruikt om de zieke longarchitectuur en mogelijke obstructies nauwkeuriger na te bootsen23. Met een bibliotheek van patiëntlongmodellen en stromingsprofielen kunnen de effecten van ziekteprogressie op de leveringsefficiëntie worden onderzocht. Er is een breed scala aan open source scans beschikbaar van organisaties, zoals de National Institutes of Health (NIH) en het Cancer Imaging Archive (TCIA)24. Hoewel deze modellen momenteel alleen de patiëntgeometrie tot de tweede of derde generatie kunnen repliceren om de verdeling op kwabniveau adequaat te meten, wordt er gewerkt aan het ontwikkelen van modificaties die de onderste luchtwegen kunnen opnemen voor een meer gedetailleerde analyse. Dit protocol kan ook klinisch relevante hulpmiddelen voor de toediening van geneesmiddelen bevatten, zoals een ET-buis zoals afgebeeld in figuur 5B. Onderzoekers kunnen meerdere toedieningsapparaten evalueren om kenmerken te onthullen die de behandelingsefficiëntie kunnen verhogen of verlagen. De targetingeffectiviteit wordt bijvoorbeeld verminderd wanneer in het volledige longmodel wordt geprobeerd in tegenstelling tot het geïntubeerde longmodel (figuur 5). Dit verschil geeft aan dat het omzeilen van het glottal-gebied gebieden van turbulente vermenging vermijdt die het targetingvermogen verminderen.
Dit protocol wordt beperkt door het onvermogen om de biologische lucht-vloeistof interface nauwkeurig na te bootsen. Als gevolg hiervan kunnen aerosolen die zich normaal afzetten door traagheidsimpact in plaats daarvan van de stijve wanden van het longmodelstuiteren 25. Om dit te verbeteren, omvatten toekomstige richtingen het verkennen van oppervlaktemodificaties en coatings om de mucosale laag van het longepitheel na te bootsen. Coatings zoals siliciumolie en glycerine zijn onderzocht voor de preventie van deeltjeskaatsing in een NGI en kunnen gemakkelijk worden opgenomen in de 3D-geprinte longmodellen26. Andere technieken zoals bioprinting en cultivering cellen op 3D-geprinte modellen worden onderzocht op hun vermogen om een cellulaire reactie op te nemen in het protocol27. Bovendien maakt dit protocol gebruik van apparatuur die is geoptimaliseerd voor debieten van 1-15 L/min; in de toekomst kunnen hogere debieten van 30-60 L/min, het normale bereik van piek inspiratoire debieten, worden gebruikt door de regelkleppen en debietmeters uit te schakelen voor degenen die geschikt zijn voor het gewenste debietbereik28,29. Met het gebruikte flow controller model is het systeem alleen in staat om inspiratie te modelleren in plaats van een volledige cyclische ademhalingscyclus. Integratie van voorbijgaande ademhalingspatronen door het gebruik van een beademingsapparaat of een complexer stromingssysteem zou waarschijnlijk de nauwkeurigheid van experimentele resultaten met betrekking tot deeltjesdepositie-efficiëntie verbeteren30. Ten slotte zijn depositie-experimenten alleen uitgevoerd met monodisperse fluorescerende polystyreenbollen variërend in grootte van 1-5 μm. Depositiekwantificering is afhankelijk van fluorescentie van aerosolen, dus het gebruik van dit protocol met niet-fluorescerende aerosolen kan de opname van een fluorescerend label zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) vereisen voor analyse31. Er kunnen echter aanvullende analytische technieken worden toegepast om het filter te analyseren, afhankelijk van de aerosolsamenstelling, zoals hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en of massaspectrometrie.
Ons protocol demonstreert de eerste in vitro experimentele opstelling met het vermogen om lobulaire longdepositie in een patiëntspecifieke longgeometrie te kwantificeren. Het bereiken van een gecontroleerde verdeling op kwabniveau zal naar verwachting de therapeutische werkzaamheid van inhalatietherapieën verhogen, wat alleen zal worden bereikt door vooruitgang in in vitro metingen van de gehele dosis. Met de groeiende interesse in gepersonaliseerde geneeskunde, heeft dit protocol het potentieel om de ontwikkeling van nieuwe gerichte longtherapieën te stimuleren door nauwkeurigere voorspellingen van potentiële behandelingseffectiviteit mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs danken professor Yu Feng, dr. Jenna Briddell, Ian Woodward en Lucas Attia voor hun nuttige discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
References
- Goel, A., Baboota, S., Sahni, J. K., Ali, J. Exploring targeted pulmonary delivery for treatment of lung cancer. International Journal of Pharmaceutical Investigation. 3 (1), 8-14 (2013).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Li, Z., Roberts, W. L., Rojas, C. A new methodology for targeting drug-aerosols in the human respiratory system. International Journal of Heat and Mass Transfer. 51 (23), 5578-5589 (2008).
- Feng, Y., Chen, X., Yang, M. An In Silico Investigation of a Lobe-Specific Targeted Pulmonary Drug Delivery Method. Design of Medical Devices Conference. , (2018).
- Marple, V. A., et al. Next generation pharmaceutical impactor (a new impactor for pharmaceutical inhaler testing). Part I: Design. Journal of Aerosol Medicine. 16 (3), 283-299 (2003).
- Feng, Y., Zhao, J., Chen, X., Lin, J. An In Silico Subject-Variability Study of Upper Airway Morphological Influence on the Airflow Regime in a Tracheobronchial Tree. Bioengineering. 4 (4), 90 (2017).
- Huynh, B. K., et al. The Development and Validation of an In Vitro Airway Model to Assess Realistic Airway Deposition and Drug Permeation Behavior of Orally Inhaled Products Across Synthetic Membranes. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 31 (2), 103-108 (2018).
- Lizal, F., Elcner, J., Hopke, P. K., Jedelsky, J., Jicha, M. Development of a realistic human airway model. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 226 (3), 197-207 (2011).
- Wei, X., Hindle, M., Delvadia, R. R., Byron, P. R. In Vitro Tests for Aerosol Deposition. V: Using Realistic Testing to Estimate Variations in Aerosol Properties at the Trachea. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 30 (5), 339-348 (2017).
- Kolewe, E. L., Feng, Y., Fromen, C. A. Realizing Lobe-Specific Aerosol Targeting in a 3D-Printed In Vitro Lung Model. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. , (2020).
- Sul, B., et al. Assessing Airflow Sensitivity to Healthy and Diseased Lung Conditions in a Computational Fluid Dynamics Model Validated In Vitro. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
- Martonen, T. B., Katz, I. Deposition Patterns of Polydisperse Aerosols Within Human Lungs. Journal of Aerosol Medicine. 6 (4), 251-274 (1993).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Nichols, S. C., et al. A Multi-laboratory in Vitro Study to Compare Data from Abbreviated and Pharmacopeial Impactor Measurements for Orally Inhaled Products: a Report of the European Aerosol Group (EPAG). AAPS PharmSciTech. 17 (6), 1383-1392 (2016).
- Yoshida, H., Kuwana, A., Shibata, H., Izutsu, K. I., Goda, Y. Comparison of Aerodynamic Particle Size Distribution Between a Next Generation Impactor and a Cascade Impactor at a Range of Flow Rates. AAPS PharmSciTech. 18 (3), 646-653 (2017).
- Feng, Y., et al. An in silico inter-subject variability study of extra-thoracic morphology effects on inhaled particle transport and deposition. Journal of Aerosol Science. 123, 185-207 (2018).
- Kleinstreuer, C., Seelecke, S. Inhaler system for targeted maximum drug-aerosol delivery. United States patent. , (2005).
- Pietila, T. How Medical 3D Printing is Gaining Ground in Top Hospitals. , Available from: https://www.materialise.com/en/blog/3d-printing-hospitals (2019).
- Weber, P. W., Price, O. T., McClellan, G. E. Demographic Variability of Inhalation Mechanics: A Review. Defense Threat Reduction Agency. , (2016).
- Jiang, Y. Y., Xu, X., Su, H. L., Liu, D. X. Gender-related difference in the upper airway dimensions and hyoid bone position in Chinese Han children and adolescents aged 6-18 years using cone beam computed tomography. Acta Odontologica Scandinavica. 73 (5), 391-400 (2015).
- Martin, S. E., Mathur, R., Marshall, I., Douglas, N. J. The effect of age, sex, obesity and posture on upper airway size. European Respiratory Journal. 10 (9), 2087 (1997).
- Xi, J., Longest, P. W., Martonen, T. B. Effects of the laryngeal jet on nano- and microparticle transport and deposition in an approximate model of the upper tracheobronchial airways. Journal of Applied Physiology. 104 (6), 1761-1777 (2008).
- Zhao, J., Feng, Y., Fromen, C. A. Glottis motion effects on the particle transport and deposition in a subject-specific mouth-to-trachea model: A CFPD study. Computers in Biology and Medicine. 116, 103532 (2020).
- Kim, S. S., et al. Chronic obstructive pulmonary disease: lobe-based visual assessment of volumetric CT by Using standard images--comparison with quantitative CT and pulmonary function test in the COPDGene study. Radiology. 266 (2), 626-635 (2013).
- The Cancer Imaging Archive. , Available from: https://www.cancerimagingarchive.net/ (2020).
- Li, A., Ahmadi, G. Computer Simulation of Deposition of Aerosols in a Turbulent Channel Flow with Rough Walls. Aerosol Science and Technology. 18 (1), 11-24 (1993).
- Khalili, S. F., Ghanbarzadeh, S., Nokhodchi, A., Hamishehkar, H. The effect of different coating materials on the prevention of powder bounce in the next generation impactor. Research in Pharmaceutical Sciences. 13 (3), 283-287 (2018).
- Galliger, Z., Vogt, C. D., Panoskaltsis-Mortari, A. 3D bioprinting for lungs and hollow organs. Translational Research. 211, 19-34 (2019).
- Schwarz, K., Biller, H., Windt, H., Koch, W., Hohlfeld, J. M. Characterization of exhaled particles from the healthy human lung--a systematic analysis in relation to pulmonary function variables. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23 (6), 371-379 (2010).
- Patton, J. S., Byron, P. R. Inhaling medicines: delivering drugs to the body through the lungs. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (1), 67-74 (2007).
- Zhang, Z., Kleinstreuer, C., Kim, C. S. Cyclic micron-size particle inhalation and deposition in a triple bifurcation lung airway model. Journal of Aerosol Science. 33 (2), 257-281 (2002).
- Ju, Y., et al. Engineering of Nebulized Metal-Phenolic Capsules for Controlled Pulmonary Deposition. Advanced Science. 7 (6), 1902650 (2020).
