Summary
Vi presenterer en in vitro-metode med høy gjennomstrømning for kvantifisering av regional lungeavsetning på lobenivå ved hjelp av CT-skanneavledede, 3D-trykte lungemodeller med justerbare luftstrømprofiler.
Abstract
Utvikling av målrettede terapier for lungesykdommer er begrenset av tilgjengeligheten av prekliniske testmetoder med evnen til å forutsi regional aerosollevering. Ved å utnytte 3D-utskrift for å generere pasientspesifikke lungemodeller, skisserer vi utformingen av et eksperimentelt oppsett med høy gjennomstrømning og in vitro for kvantifisering av lobulær lungeavsetning. Dette systemet er laget med en kombinasjon av kommersielt tilgjengelige og 3D-trykte komponenter og gjør at strømningshastigheten gjennom hver lobe i lungen kan kontrolleres uavhengig. Levering av fluorescerende aerosoler til hver lobe måles ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Denne protokollen har potensial til å fremme veksten av personlig medisin for luftveissykdommer gjennom sin evne til å modellere et bredt spekter av pasientdemografi og sykdomstilstander. Både geometrien til den 3D-trykte lungemodellen og luftstrømprofilinnstillingen kan enkelt moduleres for å gjenspeile kliniske data for pasienter med varierende alder, rase og kjønn. Klinisk relevante legemiddelleveringsenheter, for eksempel endotrakealrøret som vises her, kan innlemmes i testoppsettet for mer nøyaktig å forutsi enhetens evne til å målrette terapeutisk levering til en syk region i lungen. Allsidigheten til dette eksperimentelle oppsettet gjør at det kan tilpasses for å gjenspeile en rekke innåndingsforhold, noe som forbedrer strengheten til preklinisk terapeutisk testing.
Introduction
Mange lungesykdommer som lungekreft og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) viser regionale forskjeller i sykdomskarakteristikker; Det er imidlertid mangel på terapeutiske teknikker tilgjengelig for å målrette legemiddellevering til bare syke områder av lungen1. Flere beregningsvæske dynamiske (CFD) modeller har vist at det er mulig å modulere narkotikaavsetningsprofiler ved å identifisere spesifikke strømlinjeformede i lunge2,3. Utvikling av både inhalatorer og endotrakeale (ET) røradaptere med regionale målrettingsevner pågår i laboratoriet vårt for å kontrollere aerosolfordelingen til syke lungeregioner. Utvidelse av disse prinsippene til klinisk bruk er begrenset av gjeldende preklinisk testkapasitet. Den nøyaktige plasseringen av et stoffforekomster i lungen er kjent for å være den beste prediktoren for effekt; Imidlertid er nåværende farmasøytiske vurderinger av inhalerbare terapeutiske behandlinger oftest spådd ved hjelp av in vitro-in vivo-korrelasjoner av partikkelstørrelse til bare omtrentlig avsetning4. Denne teknikken tillater ikke noen romlig analyse for å bestemme effekten av forskjellige luftveisgeometrier på regional distribusjon gjennom de forskjellige lobes av lungen. I tillegg mangler denne testingen anatomisk nøyaktige lungegeometrier, som forskere har vist kan ha en betydelig innvirkning på avsetningsprofiler5. Det er gjort en del anstrengelser for å innlemme pasientspesifikke lungegeometrier i testprotokoller gjennom tilsetning av de øvre luftveiene; Imidlertid prøver de fleste av disse aerosollevering til ulike generasjoner av lungen i stedet for hver lungeloben6,7,8. Følgende protokoll presenterer en høy gjennomstrømningsmetode for å generere pasientspesifikke lungemodeller med kapasitet til å kvantifisere relativ partikkelavsetning i hver av de fem lobene i lungen9.
Anatomisk nøyaktige modell lunger genereres av 3D-printing pasient beregnet tomografi (CT) skanninger. Når de brukes sammen med et lett montert strømningssystem, kan de relative strømningshastighetene gjennom hver av modellens lunger kontrolleres uavhengig og skreddersys for å etterligne de av forskjellige pasientdemografi og / eller sykdomstilstander. Med denne metoden kan forskere teste effekten av potensielle terapeutiske metoder i en relevant lungegeometri og korrelere hver metodes ytelse med progresjonen av syk morfologi. Her er to enhetsdesign utviklet i laboratoriet vårt testet for deres evne til å øke avsetningen i en ønsket lungelobe ved å kontrollere plasseringen av aerosolutløsning i munnen eller luftrøret. Denne protokollen har også potensial til å påvirke utviklingen av personlige prosedyrer for pasienter betydelig ved å legge til rette for rask prediksjon av behandlingseffekten i en modell lunge som er spesifikk for pasientens CT-skanningsdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av 3D-trykte eksperimentelle komponenter
MERK: All programvare som brukes i protokollen, er angitt i materiallisten. I tillegg er skjæreprogramvaren som brukes, spesifikk for 3D-skriveren som er oppført i materialtabellen. Denne protokollen kan imidlertid utvides til et bredt spekter av 3D-skrivere (stereolithography).
- Konverter pasientens CT-skanninger til 3D-objekter (STL-filer).
MERK: For en mer detaljert drøfting av de geometriske egenskapene til den spesifikke lungemodellen som brukes i disse studiene, se Feng et al.5.- Gjengi CT-skanninger i et 3D-objekt ved hjelp av CT-skanneprogramvare (se Tabell over materialer). Åpne CT-skanningen og opprett en maske på luftrommet ved hjelp av terskelverktøyet med en innstilling mellom -800 og -1 000. Bruk verktøyet for 3D-forhåndsvisning til å vise 3D-gjengivelsen og eksportere objektet (Fil | Eksporter) som en STL-fil.
- Importere filene til mesh-redigeringsprogramvare (se Innholdsfortegnelser), fjerne eventuelle ujevne funksjoner ved hjelp av markeringsverktøyet (Sculpt | Pensler: "Krympe/jevne" | Egenskaper: Styrke (50), Størrelse (10), Dybde(0)). Jevn ut overflaten (Ctrl+A | Deformer | Jevn | Utjevning (0,2), Utjevningsskala (1)).
- I mesh-redigeringsprogramvare utvider du veggen til disse objektene med 2 mm (Ctrl + A | Redigere | Forskyvning), og la det indre objektet forbli hult slik at bare veggen forblir. Del opp objektet (Merk | Redigere | Plankutt) ved luftrøret for å danne et innløp og i generasjoner 2 eller 3 der objektet forgrener seg til hver lobe for å opprette uttak (figur 1A).
MERK: Tykkelsen på 2 mm ble valgt basert på de akseptable funksjonsstørrelsene som er angitt av produsenten av 3D-skriveren som er oppført i Materialtabellen. Denne tykkelsen kan justeres basert på spesifikasjonene til 3D-skriveren som er tilgjengelig hvis modellens indre geometri opprettholdes.
- Modifiser pasientens lungemodellutløpsgeometri for å være kompatibel med tidligere utformede lobe outlet cap-komponenter (Figur 1B,C) som er oppført i materialtabellen.
- Importer 3D-objektet, som replikerer CT-skanningen på innsiden, har en veggtykkelse på 2 mm, og er åpen ved innløpet og uttakene, til 3D-modelleringsprogramvare (se Tabell over materialer) som en solid kropp ( Åpen| Mesh-filer | Alternativer | Heltrukket brødtekst).
- Lag et plan basert på et ansikt ved hvert av uttakene (Sett inn | | for referansegeometri Plan). Bruk skjøteverktøyet til å spore den indre veggen og ytterveggen på utløpet i en skisse på flyet (Skisse | Spline).
- Hems en sylinder (OD 18,5 mm, ID 12,5 mm, H 15,15 mm) for å koble til den indre og ytre veggen av modellen, og dermed forlenge utløpet slik at det blir ensartet ved hver lobe (Funksjoner | Opphøyd sjef/base). Legg til et hakk rundt kanten av uttaket for å matche med hetten (Funksjoner | Ekstrudert kutt | Forskyvning).
MERK: Hetten (figur 1D) er en hul sylinder som samsvarer med dimensjonene på uttakene og har en hylle som er sammenkoblet med hakket på modelluttaket. Den ene enden av hetten er blokkert slik at IDen er mindre enn resten av delen, dette sikrer en tett passform rundt piggrørtilkoblingen (Figur 1E). Piggrørforbindelsen er en piggformet kjegleform slik at grillingen passer gjennom åpningen av hetten, men resten av delen gjør det ikke, slik at slangetilkoblingen passer godt i hetten. Dermed passer hetten tett rundt både piggrørtilkoblingen og lungemodellen (Figur 1F,G). - Endre innløpet til lungemodellen avhengig av de ønskede eksperimentelle forholdene. Halsen og glottale områder kan inkluderes for å etterligne en pasient som kan puste på egen hånd (Figur 1B). Områder over luftrøret kan fjernes ved hjelp av et ekstrudert kutt for å etterligne en intubert pasient på respiratorstøtte (Funksjoner | Ekstrudert kutt) (Figur 1C).
- Orientere og støtte eksperimentelle komponenter i skjæreprogramvare levert av produsenten av 3D-skriveren.
- Importer 3D-delefiler til 3D-skriverslicing-programvare og velg riktig harpiks. Bruk en hard harpiks til å skrive ut lungemodeller og piggrørforbindelser, og en myk harpiks for å skrive ut hettene.
MERK: Harpiksen som brukes til å skrive ut hettene må ha elastiske egenskaper for at den skal kunne strekke seg over lobeuttaket og skape en lufttett forsegling. - Sett delretningen slik at eventuelle "øyer" og uoppventede volumer minimeres. Den beste orienteringen for lungemodellene er med lobeuttakene vendt bort fra utskriftsplattformen. Kontroller at både piggrørtilkoblingene og hettene har de bredere delene vendt mot utskriftsplattformen.
MERK: Individuelle skiver kan sees for å se etter utseendet på "øyer", deler av delen som først vises i et stykke uten å være koblet til hoveddelen av delen. Gjennomgangsfunksjonen kan brukes til å se etter skiver med uoppventede volumer, områder der usikret harpiks kan bli fanget inne i delen under utskrift. Både "øyer" og uventede volumer reduserer utskriftskvaliteten og kan føre til utskriftsfeil. - Se hver skive individuelt, legg til støtter til eventuelle gjenværende "øyer" i delen, så vel som eventuelle områder med betydelige overheng. Eksporter og vis sektorene for utskriften for å kontrollere at alle områder støttes riktig.
- Importer 3D-delefiler til 3D-skriverslicing-programvare og velg riktig harpiks. Bruk en hard harpiks til å skrive ut lungemodeller og piggrørforbindelser, og en myk harpiks for å skrive ut hettene.
- Skriv ut eksperimentelle komponenter og fullfør etterbehandling i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Alle etterbehandlingstrinn som er beskrevet nedenfor, er spesifikke for 3D-skriveren som er oppført i Materialfortegnelsen. Når du bruker alternative skrivere eller materialer, justerer du disse trinnene for å gjenspeile produsentens instruksjoner.- For deler som er trykt i myk harpiks, vask med ≥99% renhet isopropylalkohol (IPA) for å fjerne overflødig usikret harpiks og termisk kur i en konveksjonsovn i 8 timer i henhold til produsentens spesifikasjoner.
MERK: Deler som trykkes i myk harpiks kan være svært delikate umiddelbart etter utskrift, så det bør utvises spesiell forsiktighet under rengjøringstrinnene. Eksponering for IPA bør holdes under materialets eksponeringsgrense for løsningsmiddel for å forhindre delvis nedbrytning. - For deler som er trykt i hard harpiks, vask med IPA for å fjerne overflødig usikret harpiks og herd i en UV-ovn (365 nm lys ved 5-10 mW/cm2) i 1 min per side.
MERK: For å evaluere nøyaktigheten til den 3D-trykte replikaen, anbefales det å bruke μCT-skanning av den trykte delen og CT-skanneprogramvaren for å sammenligne, kvantitativt, variasjoner mellom den opprinnelige 3D-gjengivelsen og den 3D-trykte replikaen.
- For deler som er trykt i myk harpiks, vask med ≥99% renhet isopropylalkohol (IPA) for å fjerne overflødig usikret harpiks og termisk kur i en konveksjonsovn i 8 timer i henhold til produsentens spesifikasjoner.
2. Montering av rørsystem for strømningshastighetskontroll
- Skru 1/4" piggrørbeslag inn i siden av manifolden med 6 porter (Figur 2A-6) og et 3/8" piggrør som passer inn i den gjenværende porten.
- Kapp 1/4" slangen til ønsket lengde og sett den inn i hver ende av push-to-connect-ventilene (Figur 2A-5). Fest hver ventil til en av de 1/4" beslagene som er satt inn i manifolden.
- Koble en strømningsmåler (figur 2A-4) til den andre enden av hver ventil.
- Plasser rørsystemet på toppen av treplaten slik at manifoldens enkle 3/8" montering strekker seg forbi kanten av brettet. For å feste på plass, legg til to skruer på siden av treplaten og fest manifolden til skruene ved hjelp av ledning.
- Tilsett fire skruer plassert rundt hver av ventilene og strømningsmålerne, og bruk ledningen til å feste hver av dem til treplaten (figur 2E).
- Med ca. 6" 3/8" ID-slange kobler du manifolden til et in-line 0,1 μm pore størrelse vakuumkvalitetsfilter. Koble den andre enden av filteret til strømningsregulatoren ved hjelp av en annen 6" 3/8" ID-slange
MERK: Rørsystemet trenger bare å monteres én gang.
3. Montering av lobe utløpshetter med pasient lungemodell
MERK: Denne delen av protokollen må fullføres før hver eksperimentelle kjøring.
- Sett piggrørtilkoblingen inn i hetten med dysen som stikker ut gjennom åpningen i hettebunnen. Sett først den ene enden av den ovale piggrørskoblingsbasen inn i hetten. Strekk deretter forsiktig den fleksible hetten over den andre enden av den ovale basen, og vær spesielt forsiktig så du ikke knekker den tynne basen.
MERK: Nytrykte hetter kan være stivere enn ønsket og kan strekkes ut ved å kjøre to fingre langs hetten innvendig. - Klipp 10 μm filterpapir slik at det er litt større enn utløpsområdet. Brett filterpapiret over lobeuttaket og hold det på plass med én hånd.
- Med den annen side, bruk pinsett for å strekke hetten med piggrørforbindelse over utløpet. Trykk hetten ned til hakket stemmer overens med det tilsvarende hakket på lobeuttaket (Figur 2C).
MERK: Hvis du ripper filterpapiret i dette trinnet, kan du gjøre resultatene ugyldige, så det må utvises spesiell forsiktighet for å unngå overdreven kraft når du trykker hetten på uttaket. - Gjenta dette for alle gjenværende lobeuttak (Figur 2D).
4. Generering av klinisk relevant luftstrømprofil
MERK: Denne delen av protokollen må fullføres før hver eksperimentelle kjøring.
- Koble hver lungemodell lobeuttak til slangen til den tilsvarende strømningsmåleren og ventilen, pass på at du ikke bruker for mye sidetrykk på piggrørtilkoblingen. Fest den elektroniske strømningsmåleren til munninntaket for lungemodellen for å måle den totale luftmengden til lungemodellen.
- Slå på strømningsregulatoren (figur 2A-7) og vakuumpumpen (Figur 2A-8). Velg innstillingentestoppsettpå strømningskontrolleren, og øk strømningshastigheten langsomt til den elektroniske strømningsmåleren viser ønsket total strømningshastighet.
- Bruk ventilene (Figur 2E-5), juster strømningshastigheten gjennom hver av de fem lungelobene: Høyre øvre (RU), Høyre midt (RM), Høyre nedre (RL), Venstre øvre (LU) og Venstre nedre (LL). Når lobestrømningshastighetene som vises på strømningsmålerne (Figur 2E-4) er stabile til ønsket verdi, må du kontrollere den totale strømningshastigheten igjen på den elektroniske strømningsmåleren for å kontrollere at det ikke er noen lekkasjer i systemet.
- Hvis det er et avvik i den totale strømningshastigheten, senker du strømningshastigheten med strømningsregulatoren, setter alle ventiler til den helt åpne konfigurasjonen og gjentar trinn 4.2 og 4.3.
MERK: Resultatene som presenteres her ble innhentet ved hjelp av luftstrømsprofiler basert på data rapportert av Sul et al.10 Disse lobarstrømningsfraksjonene ble beregnet ved hjelp av tynnskiveberegnede tomografibilder av pasient lunger med full inspirasjon og utløp, og sammenlignet de relative endringene i volumet av hver lungelobe. Resultatene presenteres for to distinkte strømningsforhold, begge med en samlet innløpsstrømningshastighet på 1 L/min. Den sunne lungelobeutløpsflytprofilen fordeles til hvert uttak med følgende prosentandel av innløpsstrømmen: LL-23,7%, LU-23,7%, RL-18,7%, RM-14,0%, RU-20,3%. Kols lobe utløpsflytprofilen fordeles mellom hvert uttak med følgende prosentandel av innløpsflyten: LL-10,0%, LU-29,0%, RL-13,0%, RM-5,0%, RU-43,0%9,10.
- Hvis det er et avvik i den totale strømningshastigheten, senker du strømningshastigheten med strømningsregulatoren, setter alle ventiler til den helt åpne konfigurasjonen og gjentar trinn 4.2 og 4.3.
- Avslutt" testoppsett" -funksjonen til strømningsregulatoren, men la vakuumpumpen være på.
MERK: Hvis du slår av vakuumpumpen mellom å stille inn strømningshastighetene og utføre avsetningseksperimentet, kan det føre til unøyaktigheter i strømningsprofilen som genereres. Det anbefales å la vakuumpumpen stå på når ønsket strømningshastighet er satt til å fullføre aerosolavsetningstestingen.
5. Levering av aerosol til lungemodellen
MERK: Eksperimenter må utføres i en avtrekkshette med rammen lukket for å minimere eksponeringen for aerosoler som genereres av forstøveren.
- Fyll forstøveren med oppløsning av ønskede fluorescerende partikler (Figur 2A-1) og koble til lungemodellinntaket (Figur 2B).
MERK: Resultatene som presenteres her ble oppnådd ved hjelp av 30 ml av en 1:100 fortynning av 1 μm fluorescerende polystyrenpartikler i metanol.- For å validere det eksperimentelle oppsettet, koble forstøveren direkte til lungemodellinntaket uten målrettingsanordning.
- For å måle effekten av en målrettingsenhet, koble forstøveren til enheten og sett enheten inn i lungemodellen.
- Koble trykkluftledningen til forstøveren og lukk avtrekkshetten så mye som mulig.
- Angi at flytkontrolleren skal kjøre i en prøveversjon på 10 s. Før du trykker på start, åpner du trykkluftventilen litt for å begynne å generere en aerosol i forstøveren.
- Trykk start på strømningsregulatoren og åpne trykkluftventilen helt. Når strømningsregulatoren når ca. 9 s, begynner du å lukke trykkluftventilen.
- Når trykkluftventilen er helt lukket, kobler du forstøveren fra trykkluftledningen, lukker avtrekkshetten helt, slår av vakuumpumpen og lar eventuelle aerosoler slippe ut av avtrekkshetten i ca. 10 minutter.
MERK: Det er viktig å slå av vakuumpumpen etter at du har fullført et løp for å forhindre at et vakuum bygger seg opp i rørsystemet. - Etter å ha ventet i tilstrekkelig tid, koble lungemodellen fra rørsystemet, og vær spesielt forsiktig så du ikke knekker piggrørforbindelsene.
- Fjern lobe utløpshettene ved å kjøre et par pinsett under kanten av hetten og løft den forsiktig av lungemodellen.
- Fjern filterpapiret fra hetten og legg det i en 24 brønnplate med siden som partikler avsatte på bunnen som vender mot platens brønn. Gjenta for de resterende uttakene og merk brønnen som tilsvarer hver lobe.
MERK: For å forhindre at gjenværende partikkelavsetning påvirker påfølgende eksperimenter, er det viktig å skylle både lungemodellen og hettekomponentene med IPA eller passende løsningsmiddel mellom løpene. Dette kan samles inn og inkluderes i analysen etter ønske. I tillegg beholdes en logg for å sikre at alle replikaer som brukes, har blitt minimalt eksponert for IPA for å opprettholde delintegritet, og visuell delinspeksjon anbefales før bruk.
6. Bilde av utløpsfilterpapir
- Plasser brønnplaten i det digitale fluorescensmikroskopet og sett mikroskopet til 4x forstørrelse og riktig fluorescenskanal.
- Identifiser visuelt hvilken lobes filterpapir som har den høyeste mengden partikkelavsetning, og bruk funksjonen"Auto Expose". Legg merke til de resulterende verdiene for eksponering og integrasjonstid.
- Bruk denne eksponeringen på alle filtrene for kjøringen, og vurder om innstillingen gir et tilfredsstillende bilde for alle områder med høy avsetning av filtrene.
MERK: Fokusinnstillinger kan endres fra filter til filter; Alle filtrene for en gitt kjøring må imidlertid analyseres med samme eksponeringsinnstillinger. Det er bare mulig å ha én fokusramme om gangen, så bøyninger eller rifter i filterpapiret kan forhindre at alle avsatte partikler i visningen er i fokus. Dette kan unngås ved å sikre at filterpapiret er flatt mot bunnen av brønnplaten. - Ta minst tre bilder av hver lobes filterpapir på tilfeldige steder og lagre som .tiff filer.
7. Kvantifisering av partikkelavsetning
- Importer alle filterpapirbildene for et gitt løp til en ImageJ-økt.
- Endre typen for hvert bilde til 8-biters ved å velge Bilde | Skriv inn | 8-biters.
- Åpne bildet med høyest fluorescens, og velg Bilde | Juster | Terskelverdi for å åpne et terskelvindu. Juster terskelverdiene for å minimere bakgrunnssignalet fra filterpapiret og tydelig definere kantene på partikler. Se figur 3 for skildringer av terskler av god kvalitet og dårlig kvalitet.
MERK: For filtre med høye avsetningsnivåer kan det observeres en "korona" av fluorescens, forårsaket av diffraksjon av lys av filterpapirfibrene, rundt store grupperinger av partikler. Når du terkler disse bildene, viser et område som er for stort, små prikker eller "uttoningslignende" figurer rundt disse grupperingene, som observert i de "dårlige" terskelbildene i figur 3. Dette kan forbedres ved å gradvis øke den nedre grensen for terskelen til signalet fra filterpapirfibrene minimeres uten å skjule signalet fra partiklene selv. - Forplant terskelinnstillingene for det høyeste fluorescensbildet til alle andre bilder.
- Kvantifisere antall partikler og det totale fluorescerende området ved å velge Analyser | Analyser partikler.
MERK: Datasett sammenlignes med Sidaks multisammenligningstest og en toveis ANOVA. I tillegg sammenlignes avsetning i bare lobe av interesse ved hjelp av en Student T-test forutsatt lik varians.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Partikler i dette størrelsesområdet (1-5 μm) og strømningsforhold (1-10 L/min) følger væskestrømlinjene basert på både deres teoretiske Stokes-nummer og in vivo-data; Derfor, i fravær av en målrettet leveringsenhet, forventes partikler som slippes ut i lungemodellen å avsettes i henhold til prosentandelen av total luftstrøm som ledes til hver lobe. De relative mengdene partikkellevering til hver lobe kan deretter sammenlignes med kliniske lobestrømningsdata innhentet ved å analysere pasientspesifikke hrct-skanninger (high-resolution computed tomography)10. Et validert eksperimentelt oppsett vil gi en ikke-målrettet partikkelavsetningsprofil som ikke har noen statistisk signifikant forskjell fra den kliniske luftstrømsprofilen. Valideringsdata presenteres for to distinkte strømningsforhold: 1 L/min i en sunn lunge (figur 4A) og 1 l/min i en lunge som påvirkes av kols (figur 4B). Under begge disse forholdene var den eksperimentelt bestemte avsetningsprofilen ikke statistisk forskjellig fra de kliniske dataene, noe som viser at oppsettet nøyaktig etterligner fordelingen av luftstrøm til hver av lungelobene. Disse baseline avsetningsprofilene fungerte som kontrollen som målrettede partikkelavsetningsprofiler sammenlignes med.
For å illustrere denne protokollens evne til å kvantifisere endringer i regional lungeavsetning, ble data inkludert for testing av to forskjellige målrettingsenheter: et modifisert endotrakealrør (ET) (figur 5B) og en konsentrisk sylinderenhet (figur 5E). Begge disse enhetene hadde et 2 mm ID-uttak med justerbar plassering for målrettet partikkelutløsning. Det modifiserte ET-røret ble vurdert med den intubert lungemodellen for sin evne til å målrette partikkelavsetning til både venstre nedre (LL) Lobe og høyre nedre (RL) Lobe. Sammenlignet med den ikke-målrettede partikkelavsetningsprofilen genererte denne enheten en nesten fire ganger økning i LL Lobe-levering (T-test p = 0,004, n = 3) i tillegg til å diversifisere over 96% av leverte partikler til venstre lunge (T-test p = 0,0001, n = 3) (Figur 5A). Ved å endre innstillingen for utløserplassering for å målrette RL Lobe, genererte denne enheten mer enn dobler partikkelleveringen til RL Lobe (T-test p = 0,02, n = 3) og omdirigerte 94% av leverte partikler til høyre lunge (T-test p = 0,0005, n = 3) (Figur 5C). Dette indikerer at enheten har stor suksess med å produsere den tiltenkte avsetningsprofilmoduleringen. Den konsentriske sylinderenheten ble testet i hele lungemodellen med et tiltenkt mål for venstre øvre (LU) Lobe. Sammenlignet med den ikke-målrettede partikkelavsetningsprofilen forårsaket denne enheten en nesten tre ganger økning i LU Lobe-levering (T-test p = 0,0003, n = 3) i tillegg til å diversifisere over 87% av leverte partikler til venstre lunge (T-test p = 0,002, n = 3) (Figur 5D). Målrettingseffektivitet kan også observeres kvalitativt ved å sammenligne bildene av mållobefilteret med de andre utløpsfiltrene. Som avbildet i figur 3, vil den mest effektive målrettingsmetoden gi høy partikkelavsetning ved den tiltenkte lobe av interesse og lav avsetning ved de resterende lobeutsalgene. For ytterligere demonstrasjoner av egenskapene til denne protokollen, vennligst se forsøkene utført av Kolewe et al9.
Figur 1: 3D-trykte eksperimentelle komponenter. (A) Pasient CT-skanning konvertert til 3D-delfil ved hjelp av CT-skanning og mesh-redigeringsprogramvare. (B) Lungemodell med lobe outlet modifikasjoner gjort i mesh redigering og 3D modellering programvare. (C) Lungemodell med innløps modifisert i 3D-modelleringsprogramvare for å gjenspeile en intubert pasient. (D) Piggrørtilkobling og (E) hette designet i 3D-modelleringsprogramvare. (F) Tverrsnitt av 3D-modell som viser lungemodellens sammenlåsende natur med hetten og piggrørtilkoblingen. (G) Eksplodert visning av lungemodell utløpshetteenhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Montering av eksperimentelt oppsett. (A) Skjematisk for eksperimentelt oppsett, inkludert (1) forstøver, (2) lungemodell, (3) utløpshetter, (4) strømningsmålere, (5) ventiler, (6) manifold, (7) strømningsregulator og (8) en vakuumpumpe. (B) Fullstendig montert oppsett. (C) Nærbilde av lobeuttak med montert hette. (D) Lungemodell med store bokstaver tilsatt. (E) Nærbilde av rørnettverk for innstilling av lobe utløpsstrømningshastigheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Behandling av filterpapirbilder. De rå bildene som ble presentert ble samlet inn under et eksperiment for å målrette venstre lunge ved hjelp av 1 μm fluorescerende polystyrenpartikler ved 1 l / min under en sunn pusteprofil. De "høye" og "lave" avsetningsbildene viser henholdsvis LL- og RU Lobe-filtrene. Den "gode" terskelen, påført med et område på 43 til 255, opprettholder definerte kanter mellom individuelle partikler og unngår påvisning av filterpapirfibre. Den "dårlige" terskelen, påført med et område på 17 til 255, skjuler individuelle partikkelkanter og overvurderer det fluorescerende området av filteret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Validering av eksperimentelt oppsett. (A) Valideringsresultater for friske pasienter og (B) en KOLS-pasient ved 1 L/min. Alle data som presenteres er gjennomsnittlig ± SD med tre replikeringer (unntatt kliniske kolsdata, der bare én pasient ble rapportert). Kliniske referansedata for friske og kolspasienter ble innhentet fra Sul, etal. 10. Datasett ble sammenlignet med Sidaks multisammenligningstest, og alle forskjeller er ikke signifikante. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempeldata for målrettingseksperimenter. (A) Venstre nedre lobe og (C) Høyre nedre lobe målretting oppnådd ved hjelp av (B) et modifisert ET-rørleveringssystem. (D) Venstre øvre lobe målretting oppnådd ved hjelp av (E) et konsentrisk rørleveringssystem. For alle tre datasettene representerer den indre ringen den ikke-målrettede avsetningsprofilen som ble oppnådd under installasjonsvalideringen, og den ytre ringen representerer avsetningsprofilen som produseres med tillegg av den angitte målrettingsenheten. Midler på tre replikeringer for hvert oppsett vises. Datasett ble sammenlignet ved hjelp av Sidaks multisammenligningstest og en Student T-test med lik varians. Alle de tre oppsettene ga en betydelig økning i leveransen til lobe av interesse: LL Lobe (T-test p = 0,004, n = 3), RL Lobe (T-test p = 0,02, n = 3) og LU Lobe (T-test p = 0,0003, n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende toppmoderne enheten for lunge farmasøytisk testing av en komplett innåndingsdose er Next Generator Impactor (NGI), som måler den aerodynamiske diameteren til en aerosol4. Disse størrelsesdataene brukes deretter til å forutsi lungegenerasjonen der aerosolen vil deponere basert på en korrelasjon utviklet for en sunn voksen mann11. Dessverre er denne metoden begrenset i sin evne til å vurdere forskjeller i regional lungeavsetning, bestemme effekten av sykdomstilstander på farmasøytisk levering, og forutsi avsetningsprofiler for ulike aldersgrupper, raser og kjønn12,13,14. Protokollen som er skissert her har kapasitet til å oppfylle disse testbehovene ved å la forskere generere justerbare, anatomisk nøyaktige lungemodeller med evnen til å kvantifisere relativ avsetning på lobenivå, basert på væskestrømningsadferd tidligere demonstrert i beregningsmodeller3,5,15. Ved hjelp av denne metoden kan farmasøytisk dosering og levering vurderes bedre for pediatriske og syke lungegeometrier før de går inn i kliniske studier.
Som vist i figur 4 og figur 5,kan avsetning på lobenivå måles nøyaktig og raskt for både målrettede og ikke-målrettede innåndings aerosoler. I mangel av en målrettingsanordning følger partikler i dette størrelsesområdet (1-5 μm) og strømningsforhold (1-10 l/min) væsken strømlinjeformes og den totale luftstrømsprofilen viderekobles til hver lobe (figur 4). Spesielt kan ulike inhalatorinnretninger og ET-rørfester utvikles for å konsentrere inhalerte medisiner til kontrollerte lobesteder. Som beskrevet i vårt nylige arbeid og andres, bidrar mange funksjoner i inhalatorenheten, strømningsprofilen og luftveisgeometrien til målrettet avsetningsatferd2,3,9,16. Generelt krever effektiv regional målretting som demonstrert av våre unike in vitro-modeller en smal aerosolstørrelsesfordeling og lave innåndingsstrømningshastigheter for å unngå luftveisturbulens spesielt funnet i luftrøret. Inkludering av hele øvre luftvei i vår in vitro-modell gir nøyaktig rekreasjon av disse luftstrømmønstrene som er kjent for å påvirke nedstrøms lobenivåfordeling9. På grunn av disse komplekse strømmene har nyere arbeid vist økt målretting fra under glottis9. Våre resultater i figur 5 fremhever spesielt fordelen med å bruke en ET-røradapter for å regionalt målrette individuelle lober fra frigjøring under glottis, med effektiv lobe-spesifikk målretting vist for lober av både høyre og venstre lunge ved effektivitet som spenner mellom 62-74% av den totale dosen. Dette representerer en økning i tidligere eksperimentelt rapporterte regionale målrettingseffektiviteter for munnfrigjøring og er en viktig mulighet for klinisk implementering av denne tilnærmingen9. Viktigst, protokollen tillater eksperimentell lobe distribusjon målinger av en komplett farmasøytisk dosering fra et bredt spekter av potensielle regionale målretting enheter utover de som er demonstrert her.
Med bare en CT-skanning kan en pasientspesifikk lungemodell raskt skrives ut for å teste en potensiell terapeutisk leveringsmetode. Denne protokollen vil ikke bare gi en eksperimentell lab-skala tilnærming for å støtte design av nye inhalatorenheter, men også skape mulighet for personlige innåndingsenheter på forespørsel i klinisk praksis. Den harde harpiksen som brukes i denne protokollen koster ~ $ 0.12 / ml; Derfor kan sykehus med eksisterende 3D-utskriftsinfrastruktur skrive ut en lungemodell for så lite som $ 15 i materialer17 og montere en personlig luftvei på under en dag. Spesielt fortsetter utskriftstidene og materialkostnadene i additiv tilvirkning å avta raskt, noe som øker den generelle gjennomførbarheten av denne tilnærmingen. Vårt eksperimentelle oppsett kan enkelt modifiseres for å gjenspeile en rekke luftstrømsforhold ved å bruke en annen lungemodell eller luftstrømsfordelingsinnstilling, etter den eksperimentelle valideringen vist i figur 4. Forskjeller i lungestrømprofiler og geometrier på grunn av egenskaper som alder, rase og kjønn er godt dokumentert i litteraturen og kan lett innlemmes i vår modelleringstilnærming18,19,20. Spesielt kan geometriske variasjoner i strupehodet, svelget og luftrøret av lungemodeller ha en betydelig innvirkning på luftstrømmen og påfølgende regionale avsetningsmønstre15,21,22, som denne protokollen er godt utstyrt for å oppdage. Dermed forventes inkorporering av denne personlige modelleringsmetoden å ha betydelig innvirkning på utviklingen av tilpassede inhalasjonsterapeutiske behandlinger.
Her ble lobestrømningshastighetene endret for å gjenspeile de av en KOLS-sykdomstilstand preget av redusert luftstrøm til de nedre lobene (figur 4B), men KOLS-pasientavledede CT-skanninger kan også brukes til mer nøyaktig å etterligne den syke lungearkitekturen og mulige hindringer23. Med et bibliotek med pasient lungemodeller og strømningsprofiler kan effekten av sykdomsprogresjon på leveringseffektivitet undersøkes. Det er et bredt spekter av open source-skanninger tilgjengelig fra organisasjoner, for eksempel National Institutes of Health (NIH) og Cancer Imaging Archive (TCIA)24. Selv om disse modellene for tiden bare kan gjenskape pasientgeometri opp til andre eller tredje generasjon for å måle lobenivåfordeling tilstrekkelig, pågår det arbeid med å utvikle modifikasjoner som kan innlemme de nedre luftveiene for mer detaljert analyse. Denne protokollen kan også inneholde klinisk relevante legemiddelleveringsenheter som et ET-rør som avbildet i figur 5B. Forskere kan evaluere flere leveringsenheter for å avdekke egenskaper som kan øke eller redusere behandlingseffektiviteten. For eksempel reduseres målrettingseffektiviteten når det forsøkes i hele lungemodellen i motsetning til den intubert lungemodellen (figur 5). Denne forskjellen indikerer at å omgå den glottale regionen unngår områder med turbulent blanding som reduserer målrettingsevnen.
Denne protokollen er begrenset av dens manglende evne til å etterligne det biologiske luftvæskegrensesnittet nøyaktig. Som et resultat kan aerosoler som normalt avsetter ved inertial påvirkning i stedet sprette av de stive veggene i lungemodellen25. For å forbedre dette inkluderer fremtidige retninger å utforske overflatemodifikasjoner og belegg for å etterligne slimhinnen i lungeepitelet. Belegg som silisiumolje og glyserin har blitt undersøkt for forebygging av partikkelavvisning i en NGI og kan lett innlemmes i 3D-trykte lungemodeller26. Andre teknikker som bioprinting og culturing celler på 3D trykte modeller blir undersøkt for deres evne til å innlemme en cellulær respons i protokollen27. I tillegg bruker denne protokollen utstyr som er optimalisert for strømningshastigheter på 1-15 l/min. I fremtiden kan høyere strømningshastigheter på 30-60 L/min, det normale området av toppinspiratoriske strømningshastigheter, brukes ved å bytte ut reguleringsventilene og strømningsmålerne for de som passer for ønsket strømningshastighetsområde28,29. Når strømningsregulatormodellen brukes, er systemet bare i stand til å modellere inspirasjon i stedet for en full syklisk pustesyklus. Inkorporering av forbigående pustemønstre ved bruk av en respirator eller mer komplekst strømningssystem vil sannsynligvis forbedre nøyaktigheten av eksperimentelle resultater med hensyn til partikkelavsetningseffektivitet30. Til slutt har avsetningsforsøk bare blitt utført med monodisperse fluorescerende polystyrenkuler som varierer i størrelse fra 1-5 μm. Kvantifisering av avsetning er avhengig av aerosolfluorescens, så bruken av denne protokollen med ikke-fluorescerende aerosoler kan kreve inkorporering av en fluorescerende etikett som fluoresceinisiocyanat (FITC) for analyse31. Imidlertid kan ytterligere analytiske teknikker brukes til å analysere filteret avhengig av aerosolsammensetningen, for eksempel høyytelses væskekromatografi (HPLC) og eller massespektrometri.
Vår protokoll demonstrerer det første in vitro eksperimentelle oppsettet med evnen til å kvantifisere lobulær lungeavsetning i en pasientspesifikk lungegeometri. Oppnå kontrollert lobe-nivå distribusjon forventes å øke terapeutisk effekt av inhalasjon terapeutiske, som bare vil bli oppnådd gjennom fremskritt i in vitro hele dose målinger. Med den økende interessen for personlig medisin har denne protokollen potensial til å anspore utviklingen av nye målrettede lungebehandlinger ved å muliggjøre mer nøyaktige spådommer om potensiell behandlingseffekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker professor Yu Feng, Dr. Jenna Briddell, Ian Woodward og Lucas Attia for deres nyttige diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
References
- Goel, A., Baboota, S., Sahni, J. K., Ali, J. Exploring targeted pulmonary delivery for treatment of lung cancer. International Journal of Pharmaceutical Investigation. 3 (1), 8-14 (2013).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Li, Z., Roberts, W. L., Rojas, C. A new methodology for targeting drug-aerosols in the human respiratory system. International Journal of Heat and Mass Transfer. 51 (23), 5578-5589 (2008).
- Feng, Y., Chen, X., Yang, M. An In Silico Investigation of a Lobe-Specific Targeted Pulmonary Drug Delivery Method. Design of Medical Devices Conference. , (2018).
- Marple, V. A., et al. Next generation pharmaceutical impactor (a new impactor for pharmaceutical inhaler testing). Part I: Design. Journal of Aerosol Medicine. 16 (3), 283-299 (2003).
- Feng, Y., Zhao, J., Chen, X., Lin, J. An In Silico Subject-Variability Study of Upper Airway Morphological Influence on the Airflow Regime in a Tracheobronchial Tree. Bioengineering. 4 (4), 90 (2017).
- Huynh, B. K., et al. The Development and Validation of an In Vitro Airway Model to Assess Realistic Airway Deposition and Drug Permeation Behavior of Orally Inhaled Products Across Synthetic Membranes. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 31 (2), 103-108 (2018).
- Lizal, F., Elcner, J., Hopke, P. K., Jedelsky, J., Jicha, M. Development of a realistic human airway model. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 226 (3), 197-207 (2011).
- Wei, X., Hindle, M., Delvadia, R. R., Byron, P. R. In Vitro Tests for Aerosol Deposition. V: Using Realistic Testing to Estimate Variations in Aerosol Properties at the Trachea. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 30 (5), 339-348 (2017).
- Kolewe, E. L., Feng, Y., Fromen, C. A. Realizing Lobe-Specific Aerosol Targeting in a 3D-Printed In Vitro Lung Model. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. , (2020).
- Sul, B., et al. Assessing Airflow Sensitivity to Healthy and Diseased Lung Conditions in a Computational Fluid Dynamics Model Validated In Vitro. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
- Martonen, T. B., Katz, I. Deposition Patterns of Polydisperse Aerosols Within Human Lungs. Journal of Aerosol Medicine. 6 (4), 251-274 (1993).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Nichols, S. C., et al. A Multi-laboratory in Vitro Study to Compare Data from Abbreviated and Pharmacopeial Impactor Measurements for Orally Inhaled Products: a Report of the European Aerosol Group (EPAG). AAPS PharmSciTech. 17 (6), 1383-1392 (2016).
- Yoshida, H., Kuwana, A., Shibata, H., Izutsu, K. I., Goda, Y. Comparison of Aerodynamic Particle Size Distribution Between a Next Generation Impactor and a Cascade Impactor at a Range of Flow Rates. AAPS PharmSciTech. 18 (3), 646-653 (2017).
- Feng, Y., et al. An in silico inter-subject variability study of extra-thoracic morphology effects on inhaled particle transport and deposition. Journal of Aerosol Science. 123, 185-207 (2018).
- Kleinstreuer, C., Seelecke, S. Inhaler system for targeted maximum drug-aerosol delivery. United States patent. , (2005).
- Pietila, T. How Medical 3D Printing is Gaining Ground in Top Hospitals. , Available from: https://www.materialise.com/en/blog/3d-printing-hospitals (2019).
- Weber, P. W., Price, O. T., McClellan, G. E. Demographic Variability of Inhalation Mechanics: A Review. Defense Threat Reduction Agency. , (2016).
- Jiang, Y. Y., Xu, X., Su, H. L., Liu, D. X. Gender-related difference in the upper airway dimensions and hyoid bone position in Chinese Han children and adolescents aged 6-18 years using cone beam computed tomography. Acta Odontologica Scandinavica. 73 (5), 391-400 (2015).
- Martin, S. E., Mathur, R., Marshall, I., Douglas, N. J. The effect of age, sex, obesity and posture on upper airway size. European Respiratory Journal. 10 (9), 2087 (1997).
- Xi, J., Longest, P. W., Martonen, T. B. Effects of the laryngeal jet on nano- and microparticle transport and deposition in an approximate model of the upper tracheobronchial airways. Journal of Applied Physiology. 104 (6), 1761-1777 (2008).
- Zhao, J., Feng, Y., Fromen, C. A. Glottis motion effects on the particle transport and deposition in a subject-specific mouth-to-trachea model: A CFPD study. Computers in Biology and Medicine. 116, 103532 (2020).
- Kim, S. S., et al. Chronic obstructive pulmonary disease: lobe-based visual assessment of volumetric CT by Using standard images--comparison with quantitative CT and pulmonary function test in the COPDGene study. Radiology. 266 (2), 626-635 (2013).
- The Cancer Imaging Archive. , Available from: https://www.cancerimagingarchive.net/ (2020).
- Li, A., Ahmadi, G. Computer Simulation of Deposition of Aerosols in a Turbulent Channel Flow with Rough Walls. Aerosol Science and Technology. 18 (1), 11-24 (1993).
- Khalili, S. F., Ghanbarzadeh, S., Nokhodchi, A., Hamishehkar, H. The effect of different coating materials on the prevention of powder bounce in the next generation impactor. Research in Pharmaceutical Sciences. 13 (3), 283-287 (2018).
- Galliger, Z., Vogt, C. D., Panoskaltsis-Mortari, A. 3D bioprinting for lungs and hollow organs. Translational Research. 211, 19-34 (2019).
- Schwarz, K., Biller, H., Windt, H., Koch, W., Hohlfeld, J. M. Characterization of exhaled particles from the healthy human lung--a systematic analysis in relation to pulmonary function variables. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23 (6), 371-379 (2010).
- Patton, J. S., Byron, P. R. Inhaling medicines: delivering drugs to the body through the lungs. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (1), 67-74 (2007).
- Zhang, Z., Kleinstreuer, C., Kim, C. S. Cyclic micron-size particle inhalation and deposition in a triple bifurcation lung airway model. Journal of Aerosol Science. 33 (2), 257-281 (2002).
- Ju, Y., et al. Engineering of Nebulized Metal-Phenolic Capsules for Controlled Pulmonary Deposition. Advanced Science. 7 (6), 1902650 (2020).
