Summary
この脂肪で覆われた膵島移植法は、腹腔内に生着した膵島の検出に適しています。特に、それは生体結合剤の使用または縫合を必要としない。
Abstract
膵島移植は、重度の糖尿病の細胞補充療法です。腹腔内腔は、典型的には、この手順の移植部位である。しかし、腹腔内膵島移植には、移植効果が低い、移植片の検出能力が難しい、移植後分析のための移植片切除能力の欠如など、いくつかの制限があります。本論文では、精巣上体の白色脂肪組織を利用した腹腔内膵島移植法「脂肪で覆われた膵島移植」を用いて、バイオエンジニアリングされた膵島の治療効果を評価します。この方法の単純さは、精巣上体の白色脂肪組織に膵島を播種し、その組織を使用して膵島を覆うことにあります。この方法は腹腔内膵島移植技術に分類できるが、脂肪内組織膵島移植と特徴がある。脂肪で覆われた膵島移植法は、脂肪内組織膵島移植よりも強力な治療効果を示しますが、血糖値と血漿インスリン値の改善、移植片除去の可能性などが含まれます。白色脂肪組織への膵島生着のメカニズムとバイオエンジニアリングされた膵島の治療効果を評価するために、この方法の採用をお勧めします。
Introduction
膵島移植は、重度の糖尿病患者に対する細胞補充療法です。最近の報告によると、移植後3年後のインスリン非依存性の割合は最大44%1に改善し、 合計60万を超える膵島を投与されたレシピエントの約80%がインスリン非依存性を達成しています2。さらに、最新の共同膵島移植レジストリレポートでは、膵島移植のみを受けた患者の70%以上で、空腹時血糖値が5年間にわたって60〜140 mg / dLに維持されていることが明らかになりました。この研究では、膵島移植単独または腎臓移植後に膵島移植を受けた患者の約90%が、5年以上にわたって重度の低血糖イベントを発症しなかったことも判明しました3。
この治療の臨床成績は改善していますが、最適な移植部位を確立する必要性など、いくつかの制限に対処する必要があります。肝臓は、大量の膵島を収容できる最大の臓器であるため、臨床膵島移植の典型的な移植部位です。ただし、一部の患者では、肝臓が利用できないため(例:.、門脈圧亢進症、肝炎、および/または肝硬変4)、したがって、腎嚢下腔5,6、大網袋7,8,9,10、腸間膜11、胃腸管12、骨格筋13、皮下組織13、骨髄14、および脾臓15を含む他の部位,16,17は、代替移植部位として考えられている。
局所麻酔下で腹腔内移植が容易に行えるため、腹腔内腔は臨床膵島移植の魅力部位であるが、移植時には膵島が腹腔全体に分散するため、膵島生着の検出や生着確認の成功が困難である。したがって、腹腔内腔は理想的な臨床移植部位として広く認識されていません。代わりに、移植されたカプセル化された18 およびバイオエンジニアリングされた膵島19の有効性を調査するための前臨床試験の対照モデルとして頻繁に利用される。しかし、バイオエンジニアリングされた膵島と対照膵島の正確な比較は、正確な生着評価を行う上での課題のために達成することは困難です。
対照的に、大網ポーチ8、腸間膜、およびその他の肝外位置における腹腔内白色脂肪組織の使用は十分に報告されており10、20、21、22、23、および白色脂肪組織を使用して移植されたバイオエンジニアリングされた膵島の機能を調査する多くの研究は、有望な治療結果を報告することができました20、24、25、26.精巣上体脂肪組織を用いることで移植膵島の検出が容易になるため、腹腔内移植の限界を克服するために精巣上体脂肪組織を利用した「脂肪被覆膵島移植法」が開発されました。本稿では、精巣上体脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植について述べる。
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Protocol
次の手順は、3 つの手順で実行されます。第1段階は、レシピエントマウスにおける糖尿病の誘導およびドナー膵島の単離を含む。第二段階は移植前の膵島の準備を含みます。第3工程では、精巣上体脂肪組織への膵島移植と、脂肪組織を用いた膵島の被覆を行う。その後、治療効果を評価した。本研究で実施したマウスの取り扱いおよび実験手順は、「実験動物管理の原則」(実験動物の管理と使用に関するガイド、国立衛生研究所発行第8版、2011年)に準拠しており、実験プロトコルは福岡大学動物管理使用委員会によって承認されました(承認番号: 186018).
1.手術の準備
- 糖尿病の誘発:0.1Mクエン酸緩衝液(180 mg / kg体重)に調製した18 mg / mLストレプトトシン溶液を静脈内注射することにより、体重20〜25 g、8〜12週齢のレシピエントオスマウスに糖尿病を誘発します。.血糖値が400 mg / dLを超えるマウスは糖尿病と見なされます。糖尿病誘発後1週間以内に膵島を覆うために精巣上体白色脂肪組織の過度の萎縮の前に糖尿病マウスを使用する。
- 膵島分離:後藤の膵島分離法27 に従って、移植の1日前にマウス膵島分離を行います。
- 簡単に説明すると、コラゲナーゼ溶液を用いて膵臓組織を消化する。適切な細胞分離溶液を用いた密度勾配遠心分離により膵島を単離する。その後、22°Cおよび5%CO2のインキュベーター内で膵島を一晩培養した(<37°Cでの培養は膵島死を予防することが報告されている28、29、30、31)。
注意: 精製された膵島培養物は安全キャビネットで取り扱ってください。膵島の分離と培養に使用するすべての溶液を0.22 μmのフィルターを使用してフィルター滅菌します。
2.移植用膵島の準備
- 図1Aに示すように、適切な機器と材料を収集します。
- アミラーゼやリパーゼなどの消化酵素は、単離および移植された膵島に損傷を与える可能性があり、培養皿内の汚染された線維組織に閉じ込められることで膵島が失われる可能性があるため、移植前に、鉗子を使用して、腺房組織や線維組織を含む膵臓から余分な膵島成分を手で摘み取ります(図1B)。 解剖顕微鏡下。ピッキング後、セルストレーナーを使用して単一の腺房細胞をろ過します。
- ろ過した膵島を、プラスチックへの膵島付着を防ぐためにウシ血清またはアルブミンを添加した適切な培地または緩衝液(低グルコースを含むDMEM、RPMI1640、CMRL1066、またはHBSSなど)を含む新しい培養皿に移し、皿を旋回させて膵島を皿の中央に配置します(図1C)。P200マイクロピペットと顕微鏡を使用して、個々の膵島を適切な収集チューブにピックします(図1D)。
- 新しい40 μmのセルストレーナーを50 mLプラスチックチューブの上に置き(図1E左と中央)、フィルターを新しい培地で洗浄します(図1E右)。
- 1000 μLのピペットを使用して膵島をストレーナーに加え、膵島と単一の腺房細胞を分離します(図1 F1および図1F2)。
注:セルストレーナーの精製された膵島は、約100%純粋です。 - 鉗子を使用して、培養培地またはウシ血清またはアルブミンを添加した適切な緩衝液を含む新しい60mmまたは100mmサイズの未処理培養皿でストレーナーを反転させます(図1 F3および図1F4)。新鮮な培地/バッファーを使用して、膵島を新しい培養皿に洗い流します。次に、約20 mLの総容量に達するのに十分な培地/バッファーを培養皿に追加します。
- 顕微鏡下で膵島を数え、ドナー動物の数に応じて、個々の1.5 mLプラスチック遠心チューブ間で膵島の数を均等に分割します(図1G)。例えば、2匹のマウスからの200個の100〜200μmの膵島当量(IEQ)が2本のチューブのそれぞれに追加されます。
- 膵島を室温で1分以内に2,100 x gで遠心分離し、上清を廃棄します。通常、約20〜30μLの残留溶液がチューブ内に残ります(図1H)。
3.精巣上体脂肪組織への膵島移植と精巣上体白色脂肪組織による被覆
- 手術の前に、小動物用の麻酔器、実体顕微鏡、光源、200 μLのマイクロピペットチップを備えた50-200 μLのマイクロピペット、綿棒、4-0縫合セット、および消毒された手術器具を収集します(図2A)。クーパーはさみ、眼科用はさみ、ピーン鉗子、ピンセット、および針ホルダーをオートクレーブします。オートクレーブ処理後、装置を1%ポビドンヨード溶液に浸します(図2A)。精巣上体の白色脂肪組織の動員および出血の場合の止血のために綿棒を使用してください。膵島移植には、50〜200μLのチップが付いたマイクロピペットを使用してください。
- 吸入麻酔薬(酸素中の2%イソフルラン)を使用して糖尿病レシピエントマウスに麻酔を送達する。眼科用潤滑剤を両眼に塗布し、乾燥を防ぎます。次に、マウスを仰臥位に置き(図2B左)、バリカンや脱毛クリームを使用して感染を防ぐために腹部から毛を取り除きます。少なくとも3ラウンドのポビドンヨード溶液とそれに続く70%エタノールを交互に使用して、腹部と鼠径部を消毒します(図2B右)。手術の前に、つま先のピンチ反射がないことで麻酔の深さを確認します。加熱パッドを使用して術中の熱サポートを提供し、外科用ドレープを使用して無菌手術領域を固定します。
- 中央下部の皮膚を切開します(図2C左)。長さ約2cmの皮膚切開をお勧めします。Pean鉗子(非外傷性鉗子または開創器も使用できます)で左腹壁をクランプし、組織をマウスの左側に引っ張って手術野を固定します(図2C右)。開腹後、麻酔維持のためにイソフルランの割合を1.0〜1.5%に減らす。
- 綿棒を使用して、小腸と大腸をマウスの右側(つまり、オペレーターの左側)に動員します。腹腔内の左精巣上体白色脂肪組織は左鼠径部に位置する。精巣上体の白色脂肪組織と左精巣を腹部の外側に動員し(図2D左)、組織を伸ばします(2D右)。
- 200 μLのピペットチップを備えたP200マイクロピペットを使用して、採取時にチューブ内に膵島が残らないように注意しながら、穏やかなピペットで1.5 mLチューブから膵島の全容量を採取します(図2E左)。採取した膵島を重力によってピペットの先端に沈降させます(図2E右)。
- マイクロピペットチップを膨張した脂肪組織に軽く置きます。先端の培地/バッファーが過度に洗い流されないように注意しながら、膵島を組織に慎重に播種します(図2F左)。播種後、解剖顕微鏡で膵島の正しい配置を確認します(図2F右)。
- 精巣上体の白色脂肪組織で膵島を覆います(図2G)。縫合糸または生体結合剤の使用は必要ありません。
- 左精巣を精巣上体の白色脂肪組織の下に置き、組織を腹腔に戻します(図2H)。4-0縫合糸を使用して、皮膚を2層(腹膜、次に筋肉、皮膚)で閉じます(ナイロンや吸収性縫合糸などの任意の縫合糸を使用できます)(図2I)。アセチルサリチル酸を注射します(300 mg / kg;SQ)術後鎮痛のための創傷の近く。次に、マウスをヒートランプの下に置き、完全に回復するまで監視します。
4. 膵島移植後のモニタリング(概要)
- 血糖値、耐糖能試験、および術後(POD)の組織学的評価を監視することにより、膵島移植の治療効果を評価します28。
- 血糖値をモニターし、耐糖能試験での血糖値の測定を含めて、小型のグルコースメーターを使用する。
- 尾静脈から血液サンプル(数マイクロリットル)を収集します。組織学的評価では、免疫組織化学により回収した精巣上体脂肪組織の移植膵島からマウスインスリン(生着膵島検出用)とフォンビルブランド因子(血管検出用、膵島生着の証拠)を検出した。
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Representative Results
脂肪で覆われた膵島移植と腹腔内膵島移植後の移植効果を比較するために、対照レシピエント糖尿病動物の左傍結腸腔の腹膜に同数の膵島を移植した。脂肪で覆われた膵島移植マウスの血糖値は、腹腔内膵島移植マウスと比較して徐々に有意に低下することが観察されました(p = 0.0023; 図3A)。移植後1ヶ月で、脂肪で覆われた膵島移植マウスの血糖値は、腹腔内ブドウ糖負荷試験によって評価された腹腔内膵島移植マウスで観察されたものよりも低いレベルに維持されました(p = 0.0046; 図3B)。さらに、以前に報告したように、脂肪で覆われた膵島移植後に血漿インスリンレベルも改善したことを報告しました。血糖値の再上昇も確認された。これらのデータは、200個のIEQを使用した腹腔内脂肪で覆われた膵島移植がレシピエントマウスの糖尿病状態を大幅に改善できることを示しています。
精巣上体白色脂肪組織への膵島生着を評価するために組織学的検査も行った。脂肪で覆われた膵島移植レシピエント動物では、ヘマトキシリン-エオジン染色により、精巣上体の白色脂肪組織内の膵島の存在が明らかになります(図3C、上の画像)。さらに、インスリン陽性膵島の蛍光標識抗体染色は、すべてのレシピエントマウスの精巣上体白色脂肪組織内のフォンビルブランド因子陽性微小血管の検出を容易にしました(n = 6; 図3C)。対照的に、腹腔内膵島移植マウスでは、精巣上体白色脂肪組織または腹壁のいずれにおいても生着した膵島は観察されなかった(データ示さず)。
図 1-ABC。精巣上体脂肪組織に移植するための膵島の調製および精巣上体白色脂肪組織で被覆する。 (A)器具の準備:a.ピペットエイド、b.10 mLピペットチップ、c.50 mLプラスチックチューブ、d.15 mLプラスチックチューブ、e.50-200 μL(左)および200-1000 μL(右)マイクロピペット、f.1.5 mLプラスチック遠心チューブ、g.200および1000 μLマイクロピペットチップ、h.アルブミンまたはウシ胎児血清を含む培地またはバッファー(すなわち、10%ウシ胎児血清および100 U/mLペニシリン+ 100 U/mLストレプトマイシン溶液を含む低グルコースを含むDMEM)、 i. 40 μmの細胞ストレーナー。(B)腺房(左:矢印で示す)および線維組織(右)を有する単離された膵島。スケールバー = 200 μm。 (C)プラスチックチューブに膵島を採取。左、培養皿に分散した膵島。中心は、膵島が渦巻くことにより培養皿の中央に集められる。右、皿の中央に集められた小島。スケールバー= 200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 1-DEF.精巣上体脂肪組織に移植するための膵島の調製および精巣上体白色脂肪組織で被覆する。(D)採取した膵島(左)を15mLプラスチックチューブ(右)に移します。(E)40 μmのセルストレーナーを50 mLプラスチックチューブ(左と中央)の上にセットします。調製した培地/バッファーを他の50 mLプラスチックチューブに加え、細胞ストレーナー上の膵島を新しい培養皿に流します(右)。(F) 1.膵島は200〜1000μLのマイクロピペットを用いて回収した。2.膵島をセルストレーナーに注ぎます。3と4。膵島をストレーナーに流して新しい培養皿に入れるために使用される培地/バッファー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 1-GH精巣上体脂肪組織に移植するための膵島の調製および精巣上体白色脂肪組織で被覆する。(g)レシピエントマウスの数に応じて1.5 mLのプラスチック製遠心チューブに分割された膵島。ここでは、200個の100〜200μmの膵島当量(IEQ)を各チューブに均等に分割した。(h)遠心分離前に1.5 mLチューブに均等に分割された膵島(左)。膵島はチューブ底部(中央)に回収して遠心分離した。20〜30μLの上清は、余分な溶液を廃棄した後もチューブに残ります(右)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2-ABC精巣上体脂肪組織への膵島移植の手順と、精巣上体白色脂肪組織を用いた被覆。 (A)器具の準備:a.小動物用麻酔器、b.実体顕微鏡、c.光源、d.消毒された手術器具、e.1.5 mLプラスチックチューブに分割された膵島、f.50-200 μLマイクロピペット、g.200 μLマイクロピペットチップ、およびh.4-0縫合糸。(B)2%イソフルランの全身麻酔下で仰臥位で糖尿病レシピエントマウス(左)。腹部と鼠径部は70%エタノールを使用して消毒され、紙の実験室ワイプで覆われます(右)。(C)皮膚は中央値下部で切開されています(左)。左腹壁をピーン鉗子で固定し、マウスの左側に引っ張って術野を確保します(右)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2-DEF.精巣上体脂肪組織への膵島移植の手順と、精巣上体白色脂肪組織を用いた被覆。(D)左精巣上体白色脂肪組織と左精巣は腹部の外側(左)に動員され、膨張している(右)。スケールバー= 1 cm。 (E)1.5 mLプラスチックチューブ内の膵島は、200 μLピペットチップを備えたマイクロピペットを使用して完全に回収されます(左)。採取した膵島(矢印で示す)を重力によりピペットチップ(右)に完全に沈めた。(F)マイクロピペットチップを膨張した脂肪組織上に軽く置く(左)。組織上への膵島播種(点線の円)を解剖顕微鏡で確認した(右)。スケールバー= 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2-GHI.精巣上体脂肪組織への膵島移植の手順と、精巣上体白色脂肪組織を用いた被覆。(g)膵島は精巣上体の白色脂肪組織で覆われている。(h)左精巣および精巣上体白色脂肪組織が腹腔内に戻された。(I)腹部閉鎖後の画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.脂肪で覆われた膵島移植の治療効果。 (A)血糖値。青い線:脂肪で覆われた膵島移植(n = 6);オレンジライン:腹腔内膵島移植(n=6) 統計解析は反復測定分散分析を用いて行い、有意差はp<0.05と定義した。(B)移植後1ヶ月の耐糖能試験の血糖値。青い線:脂肪で覆われた膵島移植(n = 6);オレンジ色の線:腹腔内膵島移植(n=6)。統計分析は反復測定分散分析を用いて行い、有意差はp < 0.05と定義した。(C)移植後1ヶ月の生着膵島の組織像。上の画像:ヘマトキシリン-エオジン染色;下画像:マウスインスリン(緑)とフォンビルブランド因子(vWF:赤、白矢印で示す)の免疫組織染色。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
脂肪で覆われた膵島移植法は、腹腔内膵島移植と脂肪内組織膵島移植の2つの異なる移植技術の技術を取り入れています。精巣上体白色脂肪組織の表面膜は腹膜で覆われ、精巣上体に付着している白色脂肪組織であると考えられることから、脂肪で覆われた膵島移植法は腹腔内膵島移植の一種として解剖学的に分類することができる。しかしながら、膵島がレシピエント動物に送達される技術は、脂肪内組織膵島移植において利用されるものとより類似している。我々のデータは、脂肪で覆われた膵島移植法の治療効果が腹腔内膵島移植の治療効果よりも優れていることを示しています。また、本手法の移植効果は、移植効果が最も高い膵島移植法である腎嚢下膵島移植とほぼ同等であることが示された23。この方法の有用性は、白色脂肪組織およびアディポサイトカイン内に存在し、膵島生着に寄与すると考えられている接着分子に起因する可能性があると推測されています10,23。
精巣上体白色脂肪組織の大きさは、大量の膵島を収容することを可能にする。対照的に、げっ歯類の大網は小さすぎて、多くの島を簡単に収容してアクセスすることはできません。潜在的な実験的膵島移植部位としての精巣上体白色脂肪組織の唯一の物理的制限は、インスリン10の門脈循環を提供しないことである。
この方法は、膵島が組織に直接注入されるのではなく、脂肪組織で覆われているため、独特です。脂肪内組織移植膵島は、糖尿病動物におけるインスリン機能障害が過剰な遊離脂肪酸をもたらし得るので、脂肪毒性の影響に苦しむ可能性がある32。この方法はまた、移植された膵島の損失を防ぐために生体結合剤または縫合を必要としない。 図3Cで観察されるように、膵島は移植後1ヶ月まで脂肪組織内に正常に生着したままであり、移植片切除術後も血糖値維持が確認された23。この現象は、脂肪組織が膵島をトラップする能力が原因である可能性があります。
この方法の利点は、技術的に実行が容易であり、膵島の治療効果の代謝的および組織学的評価を可能にし、移植片切除後の膵島遺伝子および/またはタンパク質発現の評価を容易にすることである。以前の研究と比較して、この方法の有効性は、精巣上体白色脂肪組織への膵島移植の有効性に劣らない10、33、34、35、36。膵島を失うことなく精巣上体の白色脂肪組織に膵島を正確に播種することは、生着を成功させるために必要であることに注意することが重要です。成功を確実にするには、粗くて迅速なピペッティングにより、プラスチックチューブの壁に膵島が付着し、分注が困難になる可能性があるため、膵島の全容量を1.5 mLプラスチックチューブからマイクロピペットチップに穏やかに吸引する必要があります。膵島の付着は、不十分な膵島の播種の主な理由です。膵島をマイクロピペットチップの先端に定着させた後、膵島を紅潮させずに精巣上体脂肪組織に移植する必要があります。脂肪組織の過剰な培地/バッファーフラッシングを防ぐために、膵島を吸引および分注する際のプランジャーボタンの押し下げを最小限に抑えることが重要です。したがって、マイクロピペットチップの先端で膵島が完全に凝集するまで待ってから、移植用のマイクロピペットのプランジャーボタンを押すことが不可欠です。先端を脂肪組織上に軽く置き、光学顕微鏡で組織への膵島の播種を確認すれば十分です。
結論として、この方法は、成功のためにいくつかの重要なステップを必要とするにもかかわらず、非常に単純です。この方法の普及により、白色脂肪組織への膵島生着の促進と、バイオエンジニアリングされた膵島の治療効果のさらなる評価に役立つことを期待しています。
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Disclosures
利益相反はありません。
Acknowledgments
本研究は、文部科学省科学研究費補助金基盤研究(C)(19K09839, NS)の助成を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
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