Summary
Bu yağ kaplı adacık nakli yöntemi, intraperitoneal boşlukta engrafe adacıkların tespiti için uygundur. Özellikle, biyobağlayıcı ajanların kullanılmasını veya dikiş atılmasını gerektirmez.
Abstract
Adacık transplantasyonu, şiddetli diabetes mellitus için hücresel bir replasman tedavisidir. İntraperitoneal boşluk tipik olarak bu prosedür için nakil bölgesidir. Bununla birlikte, intraperitoneal adacık transplantasyonunun, zayıf transplantasyon etkinliği, zor greft tespit yeteneği ve nakil sonrası analiz için greftektomi yeteneğinin eksikliği gibi bazı sınırlamaları vardır. Bu yazıda, biyomühendislik adacıklarının terapötik etkilerini değerlendirmek için epididim beyaz yağ dokusunu kullanan bir intraperitoneal adacık transplantasyonu yöntemi olan "yağ kaplı adacık transplantasyonu" kullanılmıştır. Yöntemin basitliği, adacıkların epididim beyaz yağ dokusuna tohumlanması ve dokuların adacıkları örtmek için kullanılmasında yatmaktadır. Bu yöntem intraperitoneal adacık transplantasyonu tekniği olarak sınıflandırılabilirken, intra-yağ dokusu adacık transplantasyonu ile ortak özellikler taşımaktadır. Bununla birlikte, yağ kaplı adacık transplantasyonu yöntemi, kan şekeri ve plazma insülin seviyelerinin iyileştirilmesi ve greft çıkarılması potansiyeli de dahil olmak üzere, yağ içi doku adacık transplantasyonundan daha sağlam terapötik etkiler göstermektedir. Beyaz yağ dokusuna adacık engraftmanının mekanizmalarını ve biyomühendislik adacıklarının terapötik etkilerini değerlendirmek için bu yöntemin benimsenmesini öneriyoruz.
Introduction
Adacık transplantasyonu, şiddetli diabetes mellituslu hastalar için hücresel bir replasman tedavisidir. Son raporlar, transplantasyondan sonraki üç yıl içinde insülin bağımsızlığı oranlarının %44'e kadar iyileştiğini1 ve 600.000'den fazla toplam adacık eşdeğeri alan alıcıların yaklaşık %80'inin insülin bağımsızlığına ulaştığını göstermiştir2. Ayrıca, en son İşbirlikçi Adacık Nakli Kayıt raporunda, açlık kan şekeri seviyelerinin, tek başına adacık nakli yapılan hastaların% 70'inden fazlasında 5 yıllık bir süre boyunca 60-140 mg / dL'de tutulduğu ortaya konmuştur. Çalışma ayrıca, tek başına adacık nakli veya böbrek nakli sonrası adacık nakli yapılan hastaların yaklaşık% 90'ının 5 yıldan fazla bir süredir ciddi hipoglisemik olaylar geliştirmediğini belirlemiştir3.
Bu tedavinin klinik sonuçları iyileşiyor olsa da, optimal bir nakil bölgesi oluşturma gerekliliği de dahil olmak üzere bazı sınırlamalar hala ele alınmalıdır. Karaciğer, klinik adacık nakli için tipik bir nakil bölgesidir, çünkü yüksek hacimli adacıkları barındırabilen en büyük organdır. Bununla birlikte, bazı hastalarda karaciğer kullanılamaz (örneğin, portal hipertansiyon, hepatit ve / veya siroz4 nedeniyle) ve bu nedenle renal subkapsüler boşluk5,6, omental kese 7,8,9,10, mezenter 11, gastrointestinal sistem 12, iskelet kası 13, deri altı doku 13, kemik iliği 14 ve dalak 15 dahil olmak üzere diğer bölgeler ,16,17, alternatif nakil bölgeleri olarak kabul edilmiştir.
İntraperitoneal adacık transplantasyonu lokal anestezi altında kolaylıkla yapılabilmesine rağmen, intraperitoneal boşluğu klinik adacık nakli için cazip bir bölge haline getirse de, nakil sırasında adacıklar tüm intraperitoneal boşluğa dağılarak adacık engraftmanının saptanmasını ve başarılı engraftman doğrulamasını zorlaştırır. Bu nedenle, intraperitoneal boşluk ideal bir klinik nakil bölgesi olarak yaygın olarak tanınmamaktadır. Bunun yerine, nakledilen kapsüllenmiş18 ve biyomühendislik adacıkları19'un etkinliğini araştırmak için klinik öncesi çalışmalar için sıklıkla bir kontrol modeli olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, biyomühendislik ve kontrol adacıkları arasında kesin bir karşılaştırma yapmak, doğru bir engraftman değerlendirmesi gerçekleştirmedeki zorluklar nedeniyle zordur.
Buna karşılık, omental poşet8, mezenter ve diğer ekstrahepatik lokalizasyonlarda intraperitoneal beyaz yağ dokusunun kullanımı iyi bildirilmiştir 10,20,21,22,23 ve beyaz yağ dokusu kullanılarak nakledilen biyomühendislik adacıklarının işlevini araştıran çalışmaların çoğu, umut verici terapötik sonuçlar bildirebilmiştir 20,24,25, 26. Epididim yağ dokusu kullanımı nakledilen adacıkların saptanmasını kolaylaştırdığından, intraperitoneal adacık transplantasyonunun sınırlamalarını aşmak için epididim yağ dokusunu kullanan "yağ kaplı adacık transplantasyonu yöntemi" geliştirilmiştir. Bu yazıda epididim yağ dokusu kullanılarak yağ kaplı adacık transplantasyonu anlatılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki yordam üç adımda gerçekleştirilir. İlk adım, alıcı farelerde diyabetin indüksiyonunu ve donör adacıklarının izolasyonunu içerir. İkinci adım, transplantasyondan önce adacıkların hazırlanmasını içerir. Üçüncü adımda epididim yağ dokusuna adacık nakli ve yağ dokusu kullanılarak adacıkların örtülmesi gerçekleştirilir. Bundan sonra, terapötik etkiler değerlendirildi. Farelerin kullanımı ve bu çalışmada gerçekleştirilen deneysel prosedürler "Laboratuvar Hayvanları Bakımı İlkeleri" ne (Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı İçin Kılavuz, Ulusal Sağlık Enstitüleri yayını 8. baskı, 2011) uygundur ve deneysel protokol Fukuoka Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: 186018).
1. Cerrahi hazırlık
- Diyabetin indüksiyonu: 0.1M sitrat tamponunda (180 mg / kg vücut ağırlığı) hazırlanan 18 mg / mL streptozotosin çözeltisinin intravenöz enjeksiyonu yoluyla 20-25 g vücut ağırlığında, 8-12 haftalık alıcı erkek farelerde diyabeti indükleyin. Kan şekeri seviyeleri 400 mg / dL'yi aşan fareler diyabetik olarak kabul edilir. Adacıkları örtmek için epididim beyaz yağ dokusunun aşırı atrofisinden önce diyabetik indüksiyondan sonraki 1 hafta içinde diyabetik fareler kullanın.
- Adacık izolasyonu: Adacık izolasyonu için Gotoh'un yöntem27'sini izleyerek transplantasyondan bir gün önce murin adacık izolasyonu yapın.
- Kısacası, kollajenaz çözeltisi kullanarak pankreas dokusunu sindirin. Uygun bir hücre ayırma çözeltisi kullanarak adacıkları yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile izole edin. Daha sonra kültür adacıkları gece boyunca 22 ° C'de bir inkübatörde ve% 5 CO2'de (<37 ° C'de kültürün adacık ölümünü önlediği bildirilmiştir 28,29,30,31).
NOT: Saflaştırılmış adacık kültürlerini bir güvenlik kabininde tutun. Adacık izolasyonu ve kültürü için kullanılan tüm çözeltileri 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyerek sterilize edin.
2. Transplantasyon için adacıkların hazırlanması
- Şekil 1A'da belirtildiği gibi uygun alet ve malzemeleri toplayın.
- Amilaz ve lipaz gibi sindirim enzimleri, izole edilmiş ve nakledilen adacıkların yaralanmasına neden olabileceğinden ve kültür kabı içindeki kirletici fibröz dokularda sıkışıp kalmaktan dolayı adacık kaybı meydana gelebileceğinden, transplantasyondan önce, asinar ve fibröz dokular da dahil olmak üzere pankreastan herhangi bir adacık dışı bileşeni elle seçmek için forseps kullanın (Şekil 1B), diseksiyon mikroskobu altında. Seçtikten sonra, tek asinar hücreleri filtrelemek için bir hücre süzgeci kullanın.
- Filtrelenmiş adacıkları, adacıkların plastiğe yapışmasını önlemek için sığır serumu veya albümin ile desteklenmiş herhangi bir uygun kültür ortamı veya tampon çözeltisi (örneğin, düşük glikozlu DMEM, RPMI1640, CMRL1066 veya HBSS) içeren yeni bir kültür kabına aktarın ve adacıkları çanağın ortasına yerleştirmek için çanağı döndürün (Şekil 1C). Bir P200 mikropipeti ve mikroskop kullanarak, tek tek adacıkları uygun bir toplama tüpüne seçin (Şekil 1D).
- 50 mL'lik plastik tüpün üzerine yeni, 40 μm hücre süzgeci yerleştirin (Şekil 1E sol ve orta) ve filtreyi taze ortamla yıkayın (Şekil 1E sağda).
- Adacıkları ve tek asinar hücreleri ayırmak üzere süzgeclere adacıkları eklemek için 1000 μL'lik bir pipet kullanın (Şekil 1 F1 ve Şekil 1F2).
NOT: Hücre süzgeci üzerindeki saflaştırılmış adacıklar yaklaşık% 100 saf olacaktır. - Süzgeci, kültür ortamı veya sığır serumu veya albümin ile desteklenmiş uygun bir tampon çözeltisi içeren yeni bir 60 veya 100 mm boyutunda işlenmemiş kültür kabı üzerinde ters çevirmek için forseps kullanın (Şekil 1 F3 ve Şekil 1F4). Adacıkları yeni bir kültür kabına yıkamak için taze orta / tampon kullanın. Ardından, yaklaşık 20 mL'lik toplam hacme ulaşmak için kültür kabına yeterli miktarda orta/tampon ekleyin.
- Adacıkları mikroskop altında sayın ve adacık sayısını, donör hayvanların sayısına göre bireysel 1,5 mL plastik santrifüj tüpleri arasında eşit olarak bölün (Şekil 1G). Örneğin, iki tüpün her birine iki fareden iki yüz, 100-200 μm adacık eşdeğeri (IEQ) eklenecektir.
- Adacıkları oda sıcaklığında 1 dakika içinde 2.100 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Yaklaşık 20-30 μL artık çözelti tipik olarak tüpte kalacaktır (Şekil 1H).
3. Epididim yağ dokusuna adacık nakli ve epididim beyaz yağ dokusu ile örtülmesi
- Ameliyattan önce küçük hayvanlar için anestezi makinesi, stereo mikroskop, ışık kaynağı, 200 μL mikropipet uçlu 50-200 μL mikropipet, pamuklu çubuklar, 4-0 dikiş seti ve dezenfekte edilmiş cerrahi aletler toplayın (Şekil 2A). Cooper makaslarını, oftalmik makasları, bezelye forsepslerini, cımbızlarını ve iğne tutucularını otoklav. Otoklavlamadan sonra, ekipmanı %1'lik bir povidon-iyot çözeltisine batırın (Şekil 2A). Epididim beyaz yağ dokusunun mobilizasyonu ve kanama durumlarında hemostaz için pamuklu çubuklar kullanın. Adacık nakli için 50-200 μL uçlu bir mikropipet kullanın.
- Diyabetik alıcı fareye, solunan anestezik bir ajan (oksijende% 2 izofluran) kullanarak anestezi verin. Kurumayı önlemek için her iki göze de oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın. Ardından fareyi sırtüstü pozisyona getirin (Şekil 2B solda) ve saç kesme makineleri ve / veya tüy dökücü krem kullanarak enfeksiyonu önlemek için saçları karından çıkarın. Karın ve kasık bölgesini, bir povidon-iyot çözeltisinin en az üç alternatif turunu ve ardından% 70 etanol kullanarak dezenfekte edin (Şekil 2B sağda). Ameliyattan önce, ayak parmağı sıkışma refleksinin yokluğunda anestezi derinliğini onaylayın. Bir ısıtma yastığı kullanarak intraoperatif termal destek sağlayın ve steril cerrahi alanı sabitlemek için cerrahi bir örtü kullanın.
- Alt medyan bölgedeki cildi kesin (Şekil 2C solda). Yaklaşık 2 cm uzunluğunda bir cilt kesisi önerilir. Sol karın duvarını Pean forseps ile kelepçeleyin (atravmatik forseps veya retraktör de kullanılabilir) ve cerrahi alanı sabitlemek için dokuyu farenin sol tarafına çekin (Şekil 2C sağda). Laparotomiden sonra, anestezi bakımı için izofluran yüzdesini% 1.0-1.5'e düşürün.
- İnce ve kalın bağırsağı farenin sağ tarafına (yani operatörün sol tarafına) harekete geçirmek için pamuklu çubuk kullanın. Karın boşluğundaki sol epididim beyaz yağ dokusu sol kasık bölgesinde bulunur. Epididim beyaz yağ dokusunu ve sol testisi karın dışına doğru mobilize edin (Şekil 2D solda) ve dokuyu uzatın (2D sağda).
- 200 μL pipet ucu ile donatılmış bir P200 mikropipet kullanarak 1,5 mL'lik bir tüpten adacıkların tüm hacmini nazik pipetleme ile toplayın (Şekil 2E solda), toplandıktan sonra tüpte adacık kalmamasına dikkat edin. Toplanan adacıkların yerçekimi ile pipetin ucuna yerleşmesine izin verin (Şekil 2E sağda).
- Mikropipet ucunu şişmiş yağ dokusunun üzerine hafifçe yerleştirin. Uçtaki ortamın / tamponun aşırı yıkanmasını önlemeye özen göstererek, adacıkları dikkatlice dokuya tohumlayın (Şekil 2F solda). Tohumlamadan sonra, adacıkların diseksiyon mikroskobu altında doğru bir şekilde yerleştirildiğini onaylayın (Şekil 2F sağda).
- Adacıkları epididim beyaz yağ dokusu ile örtün (Şekil 2G). Dikişlerin veya biyobağlayıcı ajanların kullanımına gerek yoktur.
- Sol testisi epididim beyaz yağ dokusunun altına yerleştirin ve dokuları intraperitoneal boşluğa geri döndürün (Şekil 2H). 4-0 dikiş kullanarak cildi iki kat halinde (periton, daha sonra kas ve cilt) kapatın (naylon veya emilebilir sütürler gibi herhangi bir dikiş kullanılabilir) (Şekil 2I). Asetilsalisilik asit enjekte edin (300 mg/kg; SQ) postoperatif analjezi için yaranın yakınında. Ardından fareyi bir ısı lambasının altına yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar izleyin.
4. Adacık nakli sonrası izleme (Özet)
- Postoperatif günde kan şekeri, glukoz tolerans testi ve histolojik değerlendirmeyi izleyerek adacık transplantasyonunun terapötik etkilerini değerlendirin (POD) 28.
- Küçük bir glikoz ölçüm cihazı kullanarak glikoz tolerans testinde kan şekeri ölçümleri de dahil olmak üzere kan şekerini izleyin.
- Kuyruk damarından kan örneklerini (biraz mikrolitre) toplayın. Histolojik değerlendirme ile ilgili olarak, immünohistokimya ile geri kazanılan epididim yağ dokusunda nakledilen adacıklarda murin insülin (engraftasyonlu adacıkların saptanması için) ve von Willebrand faktörü (adacık engraftmanının bir kanıtı olan damarların tespiti için) saptandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yağ kaplı adacık transplantasyonunun transplantasyon etkinliğini, intraperitoneal adacık transplantasyonundan sonrakiyle karşılaştırmak için, kontrol alıcısı diyabetik hayvanların sol parakolik boşluğundaki periton üzerine aynı sayıda adacık implante edildi. Yağ kaplı adacık nakli yapılan farelerin kan şekeri düzeylerinin, intraperitoneal adacık nakli yapılan farelere göre kademeli ve anlamlı olarak azaldığı gözlenmiştir (p = 0.0023; Şekil 3A). Transplantasyondan bir ay sonra, yağ kaplı adacık transplantasyonu olan farelerde kan şekeri, intraperitoneal glukoz tolerans testi ile değerlendirildiği gibi, intraperitoneal adacık nakli yapılan farelerde gözlenenden daha düşük seviyelerde tutulmuştur (p = 0.0046; Şekil 3B). Ayrıca, daha önce de belirttiğimiz gibi, plazma insülin seviyelerinin de yağ kaplı adacık transplantasyonundan sonra iyileştiğini bildirmiştir. Kan şekeri seviyelerinin yeniden yükselmesi de doğrulandı. Bu veriler, 200 IEQ kullanılarak intraperitoneal yağ kaplı adacık transplantasyonunun, alıcı farelerin diyabetik koşullarını önemli ölçüde iyileştirebileceğini göstermektedir.
Epididim beyaz yağ dokusuna adacık engraftmanını değerlendirmek için histolojik inceleme de yapıldı. Yağ kaplı adacık nakli alıcısı hayvanlarda, hematoksilin-eozin boyaması, epididim beyaz yağ dokusu içinde adacıkların varlığını ortaya koymaktadır (Şekil 3C, üst görüntü). Ek olarak, insülin pozitif adacıkların floresan konjuge antikor boyaması, tüm alıcı farelerin epididim beyaz yağ dokusu içinde von Willebrand faktörü-pozitif mikrodamarların saptanmasını kolaylaştırmıştır (n = 6; Şekil 3C). Buna karşılık, intraperitoneal adacık nakli yapılan farelerde, epididim beyaz yağ dokusunda veya karın duvarında engrafe adacıklar gözlenmemiştir (veriler gösterilmemiştir).
Şekil 1-ABC. Epididim yağ dokusuna transplantasyon için adacıkların hazırlanması ve epididim beyaz yağ dokusu ile kaplanması. (A) Aletlerin hazırlanması: a. pipet yardımcısı, b. 10 mL pipet uçları, c. 50 mL plastik tüpler, d. 15 mL plastik tüpler, e. 50-200 μL (solda) ve 200-1000 μL (sağda) mikropipetler, f. 1,5 mL plastik santrifüj tüpleri, g. 200 ve 1000 μL mikropipet uçları, h. albümin veya fetal sığır serumu içeren orta veya tampon (yani,% 10 fetal sığır serumu ve 100 U/mL penisilin + 100 U/mL streptomisin çözeltisi içeren düşük glikozlu DMEM), ve i. 40 μm hücre süzgeci. (B) Acinar (solda: okla gösterilir) ve fibröz dokuları (sağda) olan izole adacıklar. Ölçek çubuğu = 200 μm. (C) Plastik tüp içinde toplanan adacıklar. Kültür çanağında sol, dağınık adacıklar. Merkez, adacıklar merkezde toplanarak kültür çanağı döner. Sağda, çanağın merkezinde toplanan adacıklar. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 1-DEF. Epididim yağ dokusuna transplantasyon için adacıkların hazırlanması ve epididim beyaz yağ dokusu ile kaplanması. (D) Toplanan adacıklar (solda) 15 mL plastik tüplere (sağda) aktarılır. (E) 40 μm hücre süzgeci, 50 mL plastik tüpün (sol ve orta) üzerine yerleştirilmiştir. Hücre süzgeci üzerindeki adacıkları yeni bir kültür kabına yıkamak için diğer 50 mL plastik tüpe ilave edilmiş ortam / tampon (sağda). (F) 1. 200-1000 μL mikropipet kullanılarak toplanan adacıklar. 2. Adacıklar hücre süzgecine döküldü. 3 ve 4. Orta/tampon, adacıkları süzgeç üzerine yeni kültür kabına yıkamak için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 1-GH. Epididim yağ dokusuna transplantasyon için adacıkların hazırlanması ve epididim beyaz yağ dokusu ile kaplanması. (G) Adacıklar, alıcı fare sayısına göre 1,5 mL plastik santrifüj tüpüne bölünmüştür. Burada, iki yüz 100-200 μm adacık eşdeğeri (IEQ) her tüpe eşit olarak bölünmüştür. (H) Santrifüjlemeden önce 1,5 mL tüplere eşit olarak bölünmüş adacıklar (solda). Tüp dibinde (ortada) toplanmak üzere santrifüjlenmiş adacıklar. 20-30 μL süpernatant, fazla çözelti atıldıktan sonra tüpte kalır (sağda). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2-ABC. Epididim beyaz yağ dokusu kullanılarak yapılan adacık nakli ve örtücül yağ dokusu üzerine enjeksiyon işlemi. (A) Aletlerin hazırlanması: a. küçük hayvanlar için anestezi makinesi, b. stereo mikroskop, c. ışık kaynağı, d. dezenfekte edilmiş cerrahi aletler, e. 1,5 mL plastik tüplerde bölünmüş adacıklar, f. 50-200 μL mikropipetler, g. 200 μL mikropipet uçları ve h. 4-0 dikişler. (B) Genel anestezi altında %2 izofluran sırtüstü pozisyonda diyabetik alıcı fare (solda). Karın ve kasık bölgesi% 70 etanol kullanılarak dezenfekte edilir ve bir kağıt laboratuar mendili ile kaplanır (sağda). (C) Cilt alt medyan pozisyonda kesilir (solda). Sol karın duvarı Pean forseps tarafından kelepçelenir ve cerrahi alanı güvence altına almak için farenin sol tarafına çekilir (sağda). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2-DEF. Epididim beyaz yağ dokusu kullanılarak yapılan adacık nakli ve örtücül yağ dokusu üzerine enjeksiyon işlemi. (D) Sol epididim beyaz yağ dokusu ve sol testis, karın dışında (solda) ve şişkin (sağda) mobilize edilir. Ölçek çubuğu = 1 cm. (E) 1,5 mL plastik tüplerdeki adacıklar, 200 μL pipet ucuna (solda) sahip bir mikropipet kullanılarak tamamen toplanır. Toplanan adacıklar (okla gösterilir), yerçekimi ile pipet ucuna (sağda) tamamen batmasına izin verilir. (F) Mikropipet ucu şişmiş yağ dokusuna hafifçe yerleştirilir (solda). Diseksiyon mikroskobu (sağda) ile doğrulanan doku üzerine adacık tohumlama (noktalı daire). Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2-GHI. Epididim beyaz yağ dokusu kullanılarak yapılan adacık nakli ve örtücül yağ dokusu üzerine enjeksiyon işlemi. (G) Adacıklar epididim beyaz yağ dokusu ile kaplıdır. (H) Sol testis ve epididim beyaz yağ dokusu intraperitoneal boşluğa geri döndü. (I) Karın kapandıktan sonraki görüntü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Yağ kaplı adacık transplantasyonunun terapötik etkisi. (A) Kan şekeri seviyesi. Mavi çizgi: yağ kaplı adacık nakli (n = 6); Turuncu çizgi: intraperitoneal adacık transplantasyonu (n= 6) İstatistiksel analiz tekrarlanan ölçümler kullanılarak varyans analizi yapıldı ve anlamlı fark p < 0.05 olarak tanımlandı. (B) Transplantasyondan bir ay sonra glikoz tolerans testinden kan şekeri seviyesi. Mavi çizgi: yağ kaplı adacık nakli (n = 6); Turuncu çizgi: intraperitoneal adacık transplantasyonu (n = 6). İstatistiksel analiz tekrarlanan ölçümler kullanılarak varyans analizi yapılmış ve anlamlı fark p < 0.05 olarak tanımlanmıştır. (C) Transplantasyondan bir ay sonra engrafe adacıkların histolojik görüntüsü. Üst görüntü: hematoksilin-eozin boyama; Alt resim: murin insülin (yeşil) ve von Willebrand faktörü (vWF: kırmızı, beyaz okla gösterilir) için immünohistostaining. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yağ kaplı adacık nakli yöntemi, iki farklı nakil tekniğinden teknikler içerir: intraperitoneal adacık transplantasyonu ve intra-yağ dokusu adacık transplantasyonu. Epididim beyaz yağ dokusunun yüzey zarı, periton ile kaplanan ve epididimise bağlanan beyaz yağ dokusu olarak kabul edildiğinden, yağ kaplı adacık nakli yöntemi anatomik olarak intraperitoneal adacık transplantasyonu türü olarak kategorize edilebilir. Bununla birlikte, adacıkların alıcı hayvana teslim edildiği teknik, yağ içi doku adacık transplantasyonunda kullanılanlara daha benzer. Verilerimiz yağ kaplı adacık transplantasyonu yönteminin tedavi edici etkisinin intraperitoneal adacık transplantasyonundan daha üstün olduğunu göstermektedir. Önceki çalışmamız ayrıca, bu yöntemin nakil etkinliğinin, yüksek nakil etkinliği olan bir adacık nakli yöntemi olan renal subkapsüler adacık transplantasyonuna neredeyse eşit olduğunu göstermiştir23. Bu yöntemin yararlılığının, beyaz yağ dokuları ve adipositokinler içinde bulunan ve adacık engraftmanına katkıda bulunduğu düşünülen adezyon moleküllerinden kaynaklanabileceği düşünülmektedir10,23.
Epididim beyaz yağ dokusunun boyutu, büyük miktarda adacığın barındırılmasına izin verir. Buna karşılık, kemirgen büyük omentum, birçok adacığı kolayca içermek ve bunlara erişmek için çok küçüktür. Epididim beyaz yağ dokusunun potansiyel deneysel adacık transplantasyonu bölgesi olarak tek fiziksel sınırlılığı, insülin10'un portal dolaşımını sağlamamasıdır.
Yöntem benzersizdir, çünkü adacıklar doğrudan dokuya enjekte edilmek yerine yağ dokuları ile kaplıdır. İntra-yağ dokusu nakli adacıkları lipotoksisitenin etkisinden muzdarip olabilir, çünkü diyabetik hayvanlarda bozulmuş insülin fonksiyonu aşırı serbest yağ asitlerine yol açabilir32. Bu yöntem aynı zamanda implante adacık kaybını önlemek için biyo-bağ ajanları veya dikiş gerektirmez. Şekil 3C'de görüldüğü gibi, adacıklar transplantasyondan 1 ay sonrasına kadar yağ dokusu içinde başarılı bir şekilde aşılanmış olarak kalır ve greftektomi23 sonrası kan şekeri seviyesinin idamesi doğrulanmıştır. Bu fenomen, yağ dokusunun soyulması zorlaşan adacıkları yakalama kabiliyetinden kaynaklanıyor olabilir.
Bu yöntemin avantajları, teknik olarak gerçekleştirilmesinin kolay olması, adacıkların terapötik etkilerinin metabolik ve histolojik olarak değerlendirilmesine izin vermesi ve graftektomi sonrası adacık geni ve/veya protein ekspresyonunun değerlendirilmesini kolaylaştırmasıdır. Önceki çalışmalarla karşılaştırıldığında, bu yöntemin etkinliği epididim beyaz yağ dokusuna adacık transplantasyonundan daha düşük değildir 10,33,34,35,36. Başarılı bir engraftment için adacıkların epididim beyaz yağ dokusuna adacık kaybı olmadan kesin bir şekilde tohumlanmasının gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidir. Başarıyı sağlamak için, adacıkların tüm hacmi 1,5 mL plastik tüpten mikropipet ucuna nazikçe aspire edilmelidir, çünkü kaba ve hızlı pipetleme adacığın plastik tüpün duvarlarına yapışmasına neden olabilir ve bu da dağıtımı zorlaştırır. Adacık yapışması, yetersiz adacık tohumlamasının önemli bir nedenidir. Adacıkların mikropipet ucunun ucuna yerleşmesine izin verdikten sonra, adacıklar kızarmadan epididim yağ dokusuna implante edilmelidir. Yağ dokusunun aşırı orta / tampon yıkanmasını önlemek için adacıkları aspire ederken ve dağıtırken piston düğmesinin çöküntüsünü en aza indirmek önemlidir. Bu nedenle, implantasyon için mikropipetin piston düğmesine basmadan önce adacıkların mikropipet ucunun ucunda tamamen birikmesini beklemek önemlidir. Ucu yağ dokusuna hafifçe yerleştirmek ve adacıkların doku üzerine tohumlanmasını ışık mikroskobu ile doğrulamak yeterlidir.
Sonuç olarak, bu yöntem başarısı için birkaç kritik adım gerektirmesine rağmen çok basittir. Bu yöntemin, beyaz yağ dokusuna adacık engraftasyonunun kolaylaştırılmasına ve biyomühendislik adacıklarının terapötik etkilerinin daha fazla değerlendirilmesine yardımcı olmak için geniş çapta benimsenmesini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışmamız yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Japonya Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan Bilimsel Araştırma için Yardım Fonu (C) (19K09839, NS) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
- Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
- Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
- Collaborative Islet Transplant Registry. Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
- Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
- Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
- Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
- Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
- Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
- Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
- Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
- Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
- Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
- Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
- White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
- Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
- Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
- Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
- Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
- Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
- Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
- Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
- Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
- Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
- Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
- Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
- Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
- Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
- Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
- Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
- Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
- Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).
