Summary
Este método de trasplante de islotes cubiertos de grasa es adecuado para la detección de islotes injertados en la cavidad intraperitoneal. En particular, no requiere el uso de agentes bioaglutinantes o suturas.
Abstract
El trasplante de islotes es una terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus grave. La cavidad intraperitoneal suele ser el sitio de trasplante para este procedimiento. Sin embargo, el trasplante de islotes intraperitoneales tiene algunas limitaciones, incluida la eficacia deficiente del trasplante, la capacidad de detección difícil del injerto y la falta de capacidad de injertectomía para el análisis posterior al trasplante. En este documento, el "trasplante de islotes cubiertos de grasa", un método de trasplante de islotes intraperitoneales que utiliza tejido adiposo blanco epididimario, se utiliza para evaluar los efectos terapéuticos de los islotes de bioingeniería. La simplicidad del método radica en la siembra de islotes en el tejido adiposo blanco del epidídimo y el uso del tejido para cubrir los islotes. Si bien este método se puede clasificar como una técnica de trasplante de islotes intraperitoneal, comparte características con el trasplante de islotes de tejido intraadiposo. Sin embargo, el método de trasplante de islotes cubiertos de grasa demuestra efectos terapéuticos más sólidos que el trasplante de islotes de tejido intraadiposo, incluida la mejora de los niveles de glucosa en sangre e insulina plasmática y el potencial de extracción del injerto. Recomendamos la adopción de este método para evaluar los mecanismos de injerto de islotes en tejido adiposo blanco y los efectos terapéuticos de los islotes de bioingeniería.
Introduction
El trasplante de islotes es una terapia de reemplazo celular para pacientes con diabetes mellitus grave. Informes recientes han demostrado que las tasas de independencia de la insulina a los tres años después del trasplante mejoran hasta un 44%1 y que aproximadamente el 80% de los receptores que reciben más de 600.000 equivalentes totales de islotes logran la independencia de la insulina2. Además, en el informe más reciente del Registro Colaborativo de Trasplantes de Islotes, se reveló que los niveles de glucosa en sangre en ayunas se mantuvieron en 60-140 mg / dL durante un período de 5 años en más del 70% de los pacientes que se sometieron solo a un trasplante de islotes. El estudio también determinó que alrededor del 90% de los pacientes que recibieron trasplante de islotes solo o trasplante de islotes después del trasplante de riñón no desarrollaron ningún evento hipoglucémico grave durante más de 5 años3.
Aunque los resultados clínicos de este tratamiento han ido mejorando, aún deben abordarse algunas limitaciones, incluida la necesidad de establecer un sitio de trasplante óptimo. El hígado es un sitio de trasplante típico para el trasplante clínico de islotes porque es el órgano más grande que puede acomodar un gran volumen de islotes. Sin embargo, en algunos pacientes el hígado no está disponible (p. ej., debido a hipertensión portal, hepatitis y/o cirrosis4) y, por lo tanto, otros sitios, incluyendo el espacio subcapsular renal5,6, la bolsa omental 7,8,9,10, el mesenterio 11, el tracto gastrointestinal 12, el músculo esquelético 13, el tejido subcutáneo 13, la médula ósea 14 y el bazo 15 ,16,17, han sido considerados como sitios alternativos de trasplante.
Aunque el trasplante de islotes intraperitoneales se puede realizar fácilmente bajo anestesia local, lo que hace que la cavidad intraperitoneal sea un sitio atractivo para el trasplante clínico de islotes, después del trasplante, los islotes se dispersan por toda la cavidad intraperitoneal, lo que dificulta la detección del injerto de islotes y la confirmación exitosa del injerto. Por lo tanto, la cavidad intraperitoneal no es ampliamente reconocida como un sitio de trasplante clínico ideal. En cambio, se utiliza con frecuencia como modelo de control para estudios preclínicos para investigar la efectividad de los islotes encapsuladostrasplantados 18 y los islotes de bioingeniería19. Sin embargo, es difícil lograr una comparación exacta entre la bioingeniería y los islotes de control debido a los desafíos para realizar una evaluación precisa del injerto.
En contraste, el uso de tejido adiposo blanco intraperitoneal en la bolsa omental8, mesenterio y otras localizaciones extrahepáticas ha sido bien reportado 10,20,21,22,23 y muchos de los estudios que investigaron la función de los islotes de bioingeniería trasplantados usando tejido adiposo blanco pudieron reportar resultados terapéuticos prometedores 20,24,25, 26. Como el uso de tejido adiposo epididimario facilita la detección de islotes trasplantados, se desarrolló el "método de trasplante de islotes cubiertos de grasa", que utiliza tejido adiposo epididimario, para superar las limitaciones del trasplante de islotes intraperitoneales. En este trabajo, se describe el trasplante de islotes cubiertos de grasa utilizando tejido adiposo epididimario.
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Protocol
El siguiente procedimiento se realiza en tres pasos. El primer paso incluye la inducción de diabetes en los ratones receptores y el aislamiento de los islotes donantes. El segundo paso implica la preparación de los islotes antes del trasplante. En el tercer paso, se realiza el trasplante de islotes en el tejido adiposo epididimario y el recubrimiento de los islotes utilizando el tejido adiposo. Después de eso, se evaluaron los efectos terapéuticos. El manejo de los ratones y los procedimientos experimentales realizados en este estudio cumplen con los "Principios de cuidado de animales de laboratorio" (Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, publicación de los Institutos Nacionales de Salud8ª edición, 2011), y el protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fukuoka (número de aprobación: 186018).
1. Preparación quirúrgica
- Inducción de diabetes: Inducir diabetes en ratones machos receptores de 20-25 g de peso corporal, de 8-12 semanas de edad, mediante inyección intravenosa de solución de estreptozotocina de 18 mg / ml preparada en tampón de citrato 0.1M (180 mg / kg de peso corporal). Los ratones con niveles de glucosa en sangre superiores a 400 mg / dL se consideran diabéticos. Use ratones diabéticos dentro de 1 semana después de la inducción de diabetes antes de la atrofia excesiva del tejido adiposo blanco epididimario para cubrir los islotes.
- Aislamiento de islotes: Realizar aislamiento de islotes murinos un día antes del trasplante siguiendo el método27 de Gotoh para el aislamiento de islotes.
- En resumen, digiera el tejido pancreático usando solución de colagenasa. Aislar los islotes mediante centrifugación por gradiente de densidad utilizando una solución de separación celular adecuada. Luego, cultive islotes durante la noche en una incubadora a 22 °C y 5% deCO2 (se ha informado que el cultivo a <37 °C previene la muerte de los islotes 28,29,30,31).
NOTA: Manipule los cultivos de islotes purificados en un armario de seguridad. Filtrar-esterilizar todas las soluciones utilizadas para el aislamiento y cultivo de islotes utilizando un filtro de 0,22 μm.
2. Preparación de islotes para trasplante
- Reúna los instrumentos y materiales apropiados como se indica en la Figura 1A.
- Como las enzimas digestivas como la amilasa y la lipasa pueden provocar lesiones en los islotes aislados y trasplantados y puede producirse una pérdida de islotes al quedar atrapados en tejidos fibrosos contaminantes dentro de la placa de cultivo, antes del trasplante, use fórceps para seleccionar a mano cualquier componente adicional de los islotes del páncreas, incluidos los tejidos acinares y fibrosos (Figura 1B), bajo un microscopio de disección. Después de la recolección, use un colador de celdas para filtrar las células acinares individuales.
- Transfiera los islotes filtrados a una nueva placa de cultivo que contenga cualquier medio de cultivo o solución tampón apropiada (por ejemplo, DMEM con bajo nivel de glucosa, RPMI1640, CMRL1066 o HBSS) suplementada con suero bovino o albúmina para evitar la fijación de islotes al plástico y agite el plato para colocar los islotes en el centro del plato (Figura 1C). Usando una micropipeta P200 y el microscopio, escoja los islotes individuales en un tubo de recolección apropiado (Figura 1D).
- Coloque un filtro celular nuevo de 40 μm encima de un tubo de plástico de 50 ml (Figura 1E izquierda y centro) y lave el filtro con medio nuevo (Figura 1E derecha).
- Utilice una pipeta de 1000 μL para añadir los islotes al colador para separar los islotes y las células acinares individuales (Figura 1 F1 y Figura 1F2).
NOTA: Los islotes purificados en el filtro celular serán aproximadamente 100% puros. - Utilice fórceps para invertir el colador en una nueva placa de cultivo no tratada de 60 o 100 mm de tamaño que contenga medio de cultivo o una solución tampón adecuada complementada con suero bovino o albúmina (Figura 1 F3 y Figura 1F4). Use medio fresco / tampón para enjuagar los islotes en un nuevo plato de cultivo. Luego agregue suficiente medio/tampón a la placa de cultivo para alcanzar un volumen total de aproximadamente 20 ml.
- Contar los islotes bajo un microscopio y dividir el número de islotes por igual entre tubos centrífugos de plástico individuales de 1,5 ml de acuerdo con el número de animales donantes (Figura 1G). Por ejemplo, doscientos equivalentes de islotes (IEQ) de 100-200 μm de dos ratones se agregarían a cada uno de los dos tubos.
- Centrifugar los islotes a 2.100 x g en 1 minuto a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Alrededor de 20-30 μL de solución residual normalmente permanecerán en el tubo (Figura 1H).
3. Trasplante de islotes sobre tejido adiposo epididimario y recubrimiento con tejido adiposo blanco epididimario
- Antes de la cirugía, recoja una máquina de anestesia para animales pequeños, microscopio estéreo, fuente de luz, micropipeta de 50-200 μL con puntas de micropipeta de 200 μL, hisopos de algodón, un juego de sutura 4-0 e instrumentos quirúrgicos desinfectados (Figura 2A). Autoclave las tijeras de cobre, tijeras oftálmicas, pinzas de Pean, pinzas y portaagujas. Después del autoclave, sumerja el equipo en una solución de povidona yodada al 1% (Figura 2A). Use hisopos de algodón para la movilización del tejido adiposo blanco del epidídimo y para la hemostasia en casos de sangrado. Utilice una micropipeta con puntas de 50-200 μL para el trasplante de islotes.
- Administrar anestesia al ratón receptor diabético utilizando un agente anestésico inhalado (2% de isoflurano en oxígeno). Aplique lubricante oftálmico en ambos ojos para evitar que se seque. Luego coloque el ratón en posición supina (Figura 2B izquierda) y retire el vello del abdomen para prevenir la infección usando cortapelos y/o crema depilatoria. Desinfecte el abdomen y la región inguinal utilizando al menos tres rondas alternas de una solución de povidona yodada seguida de etanol al 70% (Figura 2B derecha). Antes de la cirugía, confirme la profundidad de la anestesia a través de la ausencia de un reflejo de pellizco del dedo del pie. Proporcione soporte térmico intraoperatorio usando una almohadilla térmica y use una cortina quirúrgica para asegurar el área quirúrgica estéril.
- Incise la piel en el área mediana inferior (Figura 2C izquierda). Se recomienda una incisión en la piel de aproximadamente 2 cm de longitud. Sujete la pared abdominal izquierda con los fórceps de Pean (también se pueden usar fórceps atraumáticos o retractor) y tire del tejido hacia el lado izquierdo del ratón para asegurar el campo quirúrgico (Figura 2C derecha). Después de la laparotomía, disminuya el porcentaje de isoflurano a 1.0-1.5% para el mantenimiento de la anestesia.
- Use un hisopo de algodón para movilizar el intestino delgado y grueso hacia el lado derecho del ratón (es decir, el lado izquierdo del operador). El tejido adiposo blanco del epidídimo izquierdo en la cavidad abdominal se encuentra en el área inguinal izquierda. Movilizar el tejido adiposo blanco del epidídimo y el testículo izquierdo hacia el exterior del abdomen (Figura 2D izquierda) y estirar el tejido (2D derecha).
- Utilice una micropipeta P200 equipada con una punta de pipeta de 200 μL para recoger todo el volumen de islotes de un tubo de 1,5 ml con pipeteo suave (figura 2E izquierda), teniendo cuidado de que no queden islotes en el tubo en el momento de la recolección. Permitir que los islotes recogidos se asienten en la punta de la pipeta por gravedad (Figura 2e derecha).
- Coloque la punta de la micropipeta ligeramente sobre el tejido adiposo distendido. Teniendo cuidado de evitar el lavado excesivo del medio/tampón en la punta, siembre cuidadosamente los islotes en el tejido (Figura 2F izquierda). Después de la siembra, confirme una colocación correcta de los islotes bajo un microscopio de disección (Figura 2F derecha).
- Cubrir los islotes con el tejido adiposo blanco del epidídimo (Figura 2G). No es necesario el uso de suturas o agentes bioaglutinantes.
- Coloque el testículo izquierdo debajo del tejido adiposo blanco del epidídimo y devuelva los tejidos a la cavidad intraperitoneal (Figura 2H). Cierre la piel en dos capas (peritoneo, luego músculo y piel) usando una sutura 4-0 (se pueden usar suturas como nylon o suturas absorbibles) (Figura 2I). Inyecte ácido acetilsalicílico (300 mg/kg; SQ) cerca de la herida para analgesia postoperatoria. Luego coloque el mouse debajo de una lámpara de calor y monitoree hasta que se recupere por completo.
4. Monitorización después del trasplante de islotes (Resumen)
- Evaluar los efectos terapéuticos del trasplante de islotes mediante monitorización de la glucemia, prueba de tolerancia a la glucosa y evaluación histológica en el día postoperatorio (POD) 28.
- Controle la glucosa en sangre, incluidas las mediciones de glucosa en sangre en la prueba de tolerancia a la glucosa, utilizando un pequeño medidor de glucosa.
- Recoja las muestras de sangre (un poco de microlitros) de la vena de la cola. En cuanto a la evaluación histológica, se detectaron insulina murina (para detectar islotes injertados) y factor von Willebrand (para detección de vasos, que es evidencia para injerto de islotes) en islotes trasplantados en el tejido adiposo epididimario recuperado mediante inmunohistoquímica.
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Representative Results
Para comparar la eficacia del trasplante del trasplante de islotes cubiertos de grasa con la del trasplante intraperitoneal de islotes, se implantó el mismo número de islotes en el peritoneo en el espacio paracólico izquierdo de los animales diabéticos receptores de control. Se observó que los niveles de glucosa en sangre de ratones con trasplante de islotes cubiertos de grasa disminuyeron gradual y significativamente en comparación con los ratones trasplantados con islotes intraperitoneales (p = 0,0023; Figura 3A). Un mes después del trasplante, la glucemia en ratones con trasplante de islotes cubiertos de grasa se mantuvo en niveles más bajos que los observados en ratones trasplantados con islotes intraperitoneales según lo evaluado por la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (p = 0,0046; Figura 3B). Además, como hemos informado anteriormente, los niveles plasmáticos de insulina también mejoraron después del trasplante de islotes cubiertos de grasa. También se confirmó la reelevación de los niveles de glucosa en sangre. Estos datos demuestran que el trasplante intraperitoneal de islotes cubiertos de grasa utilizando 200 IEQ puede mejorar significativamente las condiciones diabéticas de los ratones receptores.
También se realizó un examen histológico para evaluar el injerto de islotes en el tejido adiposo blanco del epidídimo. En animales receptores de trasplante de islotes cubiertos de grasa, la tinción de hematoxilina-eosina revela la presencia de islotes dentro del tejido adiposo blanco epididimario (Figura 3C, imagen superior). Además, la tinción de anticuerpos conjugados con fluorescencia de islotes insulinopositivos facilitó la detección de microvasos positivos para el factor von Willebrand dentro del tejido adiposo blanco epididimario de todos los ratones receptores (n = 6; Figura 3C). En contraste, en ratones trasplantados con islotes intraperitoneales, no se observaron islotes injertados ni en el tejido adiposo blanco del epidídimo ni en la pared abdominal (datos no mostrados).
Figura 1-ABC. Preparación de islotes para trasplante en tejido adiposo epididimario y recubrimiento con tejido adiposo blanco epididimario. A) Preparación de instrumentos: a. coadyuvante para pipetas, b. puntas de pipeta de 10 ml, tubos de plástico de aproximadamente 50 ml, d. tubos de plástico de 15 ml, e. micropipetas de 50-200 μL (izquierda) y 200-1000 μL (derecha), tubos de centrífuga de plástico de 1,5 ml, puntas de micropipetas de g. 200 y 1000 μL, h. medio o tampón que contenga albúmina o suero bovino fetal (es decir, DMEM con niveles bajos de glucosa que contengan 10% de suero bovino fetal y 100 U/ml de penicilina + 100 U/ml de solución de estreptomicina), e i. Filtro celular de 40 μm. (B) Islotes aislados con tejidos acinares (izquierda: indicados por flecha) y fibrosos (derecha). Barra de escala = 200 μm. (C) Islotes recogidos en el tubo de plástico. Islotes a la izquierda, dispersos en plato de cultivo. Centro, los islotes se recogen en el centro del plato de cultivo por remolino. Derecha, islotes recogidos en el centro del plato. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 1-DEF. Preparación de islotes para trasplante en tejido adiposo epididimario y recubrimiento con tejido adiposo blanco epididimario. (D) Los islotes recolectados (izquierda) se transfieren a tubos de plástico de 15 ml (derecha). (E) El filtro de células de 40 μm se coloca en la parte superior del tubo de plástico de 50 ml (izquierda y centro). Medio preparado/tampón añadido a otro tubo de plástico de 50 ml para enjuagar los islotes del colador celular en una nueva placa de cultivo (derecha). f) 1. Islotes recogidos con una micropipeta de 200-1000 μL. 2. Islotes vertidos en el colador de celdas. 3 y 4. Medio/tampón utilizado para enjuagar los islotes en el colador en un nuevo plato de cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 1-GH. Preparación de islotes para trasplante en tejido adiposo epididimario y recubrimiento con tejido adiposo blanco epididimario. (G) Islotes divididos en tubo centrífugo de plástico de 1,5 ml según el número de ratones receptores. Aquí, doscientos equivalentes de islotes de 100-200 μm (IEQ) se dividieron por igual en cada tubo. (H) Islotes divididos en partes iguales en tubos de 1,5 ml antes de la centrifugación (izquierda). Islotes centrifugados para recoger en el fondo del tubo (centro). 20-30 μL de sobrenadante permanecen en el tubo después de desechar el exceso de solución (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2-ABC. El procedimiento de trasplante de islotes en el tejido adiposo epididimario y el recubrimiento con tejido adiposo blanco epididimario. (A) Preparación de instrumentos: a. máquina de anestesia para animales pequeños, b. microscopio estereoscópico, c. fuente de luz, d. instrumentos quirúrgicos desinfectados, e. islotes divididos en tubos de plástico de 1,5 ml, micropipetas de 50-200 μl, puntas de micropipetas de g. 200 μl y suturas h. 4-0. (B) Ratón receptor diabético en posición supina bajo anestesia general de isoflurano al 2% (izquierda). El abdomen y la región inguinal se desinfectan con etanol al 70% y se cubren con una toallita de laboratorio de papel (derecha). (C) La piel está incisa en la posición mediana inferior (izquierda). La pared abdominal izquierda es sujetada por pinzas de Pean y tirada hacia el lado izquierdo del ratón para asegurar el campo quirúrgico (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2-DEF. El procedimiento de trasplante de islotes en el tejido adiposo epididimario y el recubrimiento con tejido adiposo blanco epididimario. (D) El tejido adiposo blanco del epidídimo izquierdo y el testículo izquierdo se movilizan fuera del abdomen (izquierda) y se distienden (derecha). Barra de escala = 1 cm. (E) Los islotes en tubos de plástico de 1,5 ml se recogen completamente utilizando una micropipeta con punta de pipeta de 200 μL (izquierda). Islotes recogidos (indicados por flecha) que se hunden completamente por gravedad a la punta de la pipeta (derecha). (F) Punta de micropipeta ligeramente colocada sobre el tejido adiposo distendido (izquierda). Siembra de islotes (círculo punteado) en el tejido confirmado por microscopio de disección (derecha). Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2-GHI. El procedimiento de trasplante de islotes en el tejido adiposo epididimario y el recubrimiento con tejido adiposo blanco epididimario. (G) Los islotes están cubiertos con tejido adiposo blanco epididimario. (H) Testículo izquierdo y tejido adiposo blanco epididimario devuelto a la cavidad intraperitoneal. (I) Imagen después del cierre del abdomen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. El efecto terapéutico del trasplante de islotes cubiertos de grasa. (A) Nivel de glucosa en sangre. Línea azul: trasplante de islotes cubiertos de grasa (n = 6); Línea naranja: trasplante intraperitoneal de islotes (n = 6) El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza de medidas repetidas y se definió una diferencia significativa como p < 0,05. (B) Nivel de glucosa en sangre de la prueba de tolerancia a la glucosa un mes después del trasplante. Línea azul: trasplante de islotes cubiertos de grasa (n = 6); Línea naranja: trasplante intraperitoneal de islotes (n = 6). El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza de medidas repetidas y se definió una diferencia significativa como p < 0,05. (C) Imagen histológica de islotes injertados un mes después del trasplante. Imagen superior: tinción de hematoxilina-eosina; Imagen inferior: inmunohistotinción para insulina murina (verde) y factor von Willebrand (vWF: rojo, indicado por flecha blanca). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método de trasplante de islotes cubiertos de grasa incorpora técnicas de dos técnicas de trasplante diferentes: trasplante de islotes intraperitoneales y trasplante de islotes de tejido intraadiposo. Como la membrana superficial del tejido adiposo blanco del epidídimo se considera el tejido adiposo blanco que está cubierto por el peritoneo y que está unido al epidídimo, el método de trasplante de islotes cubierto de grasa se puede clasificar anatómicamente como un tipo de trasplante de islotes intraperitoneales. Sin embargo, la técnica por la cual los islotes se entregan al animal receptor es más similar a las utilizadas en el trasplante de islotes de tejido intraadiposo. Nuestros datos muestran que el efecto terapéutico del método de trasplante de islotes cubiertos de grasa es superior al del trasplante de islotes intraperitoneales. Nuestro estudio previo también mostró que la eficacia del trasplante de este método es casi igual a la del trasplante de islotes subcapsulares renales, un método de trasplante de islotes con una eficacia de trasplante suprema23. Se especula que la utilidad de este método puede deberse a las moléculas de adhesión presentes en los tejidos adiposos blancos y adipocitoquinas y que se cree que contribuyen al injerto de islotes10,23.
El tamaño del tejido adiposo blanco epididimario permite acomodar un gran volumen de islotes. En contraste, el epiplón mayor del roedor es demasiado pequeño para contener y acceder fácilmente a muchos islotes. La única limitación física del tejido adiposo blanco epididimario como un potencial sitio experimental de trasplante de islotes es que no proporciona una circulación portal de insulina10.
El método es único porque los islotes están cubiertos con tejidos adiposos, en lugar de ser infundidos directamente en el tejido. Los islotes trasplantados de tejido intraadiposo pueden sufrir la influencia de la lipotoxicidad, ya que la función alterada de la insulina en animales diabéticos puede conducir a un exceso de ácidos grasos libres32. Este método tampoco requiere agentes de biounión o sutura para evitar la pérdida de islotes implantados. Como se observa en la Figura 3C, los islotes permanecen injertados con éxito dentro del tejido adiposo hasta 1 mes después del trasplante y se ha confirmado el mantenimiento del nivel de glucosa en sangre después de la graftectomía23. Este fenómeno puede deberse a la capacidad del tejido adiposo para atrapar los islotes, que se vuelven difíciles de despegar.
Las ventajas de este método son que es técnicamente fácil de realizar, permite una evaluación metabólica e histológica de los efectos terapéuticos de los islotes, y facilita la evaluación de la expresión génica y/o proteica de los islotes después de la injertectomía. En comparación con estudios previos, la eficacia de este método no es inferior a la del trasplante de islotes en tejido adiposo blanco epididimario 10,33,34,35,36. Es importante tener en cuenta que una siembra precisa de los islotes en el tejido adiposo blanco epididimario sin pérdida de islotes es necesaria para un injerto exitoso. Para garantizar el éxito, todo el volumen de los islotes debe aspirarse suavemente en la punta de la micropipeta desde el tubo de plástico de 1,5 ml, ya que el pipeteo áspero y rápido puede provocar la adhesión de los islotes a las paredes del tubo de plástico, lo que dificulta la dispensación. La adhesión de los islotes es una de las principales razones de la siembra inadecuada de los islotes. Después de permitir que los islotes se asienten en la punta de la micropipeta, los islotes deben implantarse en el tejido adiposo epididimario sin enrojecerse. Es importante minimizar la depresión del botón del émbolo al aspirar y dispensar los islotes para evitar el lavado excesivo del tejido adiposo medio/tampón. Por lo tanto, es esencial esperar hasta que los islotes se hayan agregado completamente en la punta de la punta de la micropipeta antes de presionar el botón del émbolo de la micropipeta para la implantación. Basta con colocar la punta ligeramente sobre el tejido adiposo y confirmar la siembra de islotes en el tejido mediante microscopía óptica.
En conclusión, este método es muy simple, a pesar de requerir varios pasos críticos para su éxito. Esperamos la amplia adopción de este método para ayudar aún más en la facilitación del injerto de islotes en el tejido adiposo blanco y para una mayor evaluación de los efectos terapéuticos de los islotes de bioingeniería.
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Disclosures
No tenemos ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado por una subvención para la investigación científica (C) (19K09839, NS) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
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