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Immunology and Infection

श्वसन वायरस संक्रमण के दौरान जन्मजात प्रतिरक्षा सेल सक्रियण के अध्ययन के लिए संपर्क-मुक्त सह-संस्कृति मॉडल

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62115
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1,4, 1,4, 5, 2,6, 1,2,6, 1,6
1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल वायरल रूप से संक्रमित नाक उपकला कोशिकाओं और जन्मजात सेल सक्रियण के बीच शुरुआती बातचीत की जांच का विवरण देता है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के व्यक्तिगत सबसेट को वायरल संक्रमण के जवाब में उनके सक्रियण के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है। फिर उन्हें शुरुआती एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं पर उनके प्रभावों को निर्धारित करने के लिए आगे की जांच की जा सकती है।

Abstract

वायरल संक्रमण के दौरान नाक की उपकला परत और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच प्रारंभिक बातचीत एक अंडर-एक्सप्लोर्ड क्षेत्र बनी हुई है। वायरल संक्रमण में जन्मजात प्रतिरक्षा सिग्नलिंग का महत्व काफी बढ़ गया है क्योंकि श्वसन संक्रमण वाले रोगी जो उच्च जन्मजात टी सेल सक्रियण प्रदर्शित करते हैं, एक बेहतर बीमारी परिणाम दिखाते हैं। इसलिए, इन शुरुआती जन्मजात प्रतिरक्षा इंटरैक्शन को विच्छेदन करने से उन प्रक्रियाओं की व्याख्या की अनुमति मिलती है जो उन्हें नियंत्रित करते हैं और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों और रणनीतियों के विकास को कम करने या यहां तक कि वायरल संक्रमण की शुरुआती प्रगति को रोकने के लिए सुविधाजनक बना सकते हैं। यह प्रोटोकॉल एक बहुमुखी मॉडल का विवरण देता है जिसका उपयोग वायरल रूप से संक्रमित वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं द्वारा स्रावित कारकों से जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के शुरुआती क्रॉसस्टॉक, इंटरैक्शन और सक्रियण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। प्रतिनिधि वायरस मॉडल के रूप में एक H3N2 इन्फ्लूएंजा वायरस (A/Aichi/2/1968) का उपयोग करते हुए, सह-सुसंस्कृत परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) के जन्मजात सेल सक्रियण का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके किया गया है ताकि कोशिकाओं के सबसेट की जांच की जा सके जो वायरल संक्रमण के जवाब में उपकला से जारी घुलनशील कारकों द्वारा सक्रिय होते हैं। परिणाम कोशिकाओं के सबसेट को अलग करने के लिए गेटिंग रणनीति का प्रदर्शन करते हैं और पीबीएमसी की सक्रिय आबादी और नियंत्रण और संक्रमित उपकला के साथ उनके क्रॉसस्टॉक के बीच स्पष्ट अंतर को प्रकट करते हैं। सक्रिय सबसेट को तब उनके कार्यों के साथ-साथ कोशिकाओं के लिए विशिष्ट आणविक परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए आगे विश्लेषण किया जा सकता है। इस तरह के एक crosstalk जांच से निष्कर्ष उन कारकों को उजागर कर सकते हैं जो महत्वपूर्ण जन्मजात सेल आबादी के सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो वायरल संक्रमण की प्रगति को नियंत्रित करने और दबाने में फायदेमंद हैं। इसके अलावा, इन कारकों को सार्वभौमिक रूप से विभिन्न वायरल बीमारियों पर लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से नए उभरते वायरस के लिए, ऐसे वायरस के प्रभाव को कम करने के लिए जब वे पहली बार भोले मानव आबादी में प्रसारित होते हैं।

Introduction

श्वसन वायरस शायद सबसे व्यापक रोगजनकों में से एक हैं जो गंभीर स्वास्थ्य देखभाल और आर्थिक बोझ का कारण बनते हैं। उभरते हुए महामारी उपभेदों (जैसे, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) के आवधिक वैश्विक प्रकोपों से लेकर हर साल इन्फ्लूएंजा के मौसमी उपभेदों तक, वायरस सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक निरंतर खतरा हैं। यद्यपि टीके इन वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य चुनौतियों की प्रतिक्रिया का मुख्य थोक बनाते हैं, यह ध्यान रखना गंभीर है कि ये countermeasures केवल उत्तरदायी 1,2 हैं। इसके अलावा, एक नए संक्रामक तनाव के उद्भव और इसके टीके के सफल विकास के बीचदेरी अपरिहार्य है, जिससे एक ऐसी अवधि होती है जब वायरस के प्रसार को रोकने के लिए उपलब्ध उपाय अत्यधिक सीमित होते हैं।

इन देरी को आगे उन लागतों द्वारा जोर दिया जाता है जो समाज-आर्थिक और सामाजिक रूप से लगाए जाते हैं। अकेले मौसमी फ्लू अप्रत्यक्ष लागत में लगभग $ 8 बिलियन, चिकित्सा लागत में $ 3.2 बिलियन, और संयुक्त राज्य अमेरिका में सालाना 36.3 हजार मौतों के लिए जिम्मेदारहै। यह अनुसंधान लागतों पर विचार करने से पहले है जो वैक्सीन के विकास को निधि देने के लिए आवश्यक हैं। महामारी के प्रकोप का समाज पर और भी गंभीर प्रभाव पड़ता है, जो हर साल वैश्वीकरण की बढ़ती दर से जटिल होता है, जैसा कि गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम के उद्भव और तेजी से प्रसार के कारण वैश्विक व्यवधानों से स्पष्ट है कोरोनोवायरस 2 (सार्स-कोव -2) 5,6,7।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सक्रिय जन्मजात टी कोशिकाओं की अधिक आबादी वाले संक्रमित रोगियों में बेहतर बीमारी का परिणाम 8,9,10 होता है। इसके अलावा, जन्मजात टी सेल जनसंख्या को कई उपसमूहों में वर्गीकृत किया गया है: म्यूकोसल-संबद्ध अपरिवर्तनीय टी (एमएआईटी) कोशिकाएं, Vπ1π t कोशिकाएं, Vπ2π t कोशिकाएं, और प्राकृतिक हत्यारा T (NKT) कोशिकाएं। जन्मजात टी कोशिकाओं के ये उपसमूह भी अपनी आबादी के भीतर विषमता प्रदर्शित करते हैं, जिससे जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल सेल आबादी के बीच बातचीत की जटिलताबढ़ जाती है। इसलिए, तंत्र जो इन जन्मजात टी कोशिकाओं को सक्रिय करता है और जन्मजात टी कोशिकाओं के विशिष्ट उपसमूहों का ज्ञान मानव मेजबान पर इन वायरसों के संक्रामक प्रभावों को कम करने के लिए अनुसंधान का एक अलग एवेन्यू प्रदान कर सकता है, खासकर वैक्सीन विकास की अवधि के दौरान।

इन्फ्लूएंजा से संक्रमित उपकला कोशिकाएं उन कारकों का उत्पादन करती हैं जो जन्मजात टी कोशिकाओं को तेजी सेसक्रिय करती हैं 12,13,14। उस खोज पर निर्माण, इस संपर्क-मुक्त एयर-लिक्विड इंटरफेस (एएलआई) सह-संस्कृति मॉडल का उद्देश्य प्रारंभिक संक्रमण के दौरान संक्रमित नाक उपकला परत और पीबीएमसी के बीच प्रारंभिक रासायनिक इंटरैक्शन (संक्रमित उपकला परत द्वारा जारी घुलनशील कारकों द्वारा मध्यस्थता) की नकल करना है। नाक उपकला परत (झिल्ली आवेषण पर सुसंस्कृत) और PBMCs (नीचे कक्ष में) और उपकला अखंडता के बीच शारीरिक अलगाव वायरस द्वारा PBMCs के प्रत्यक्ष संक्रमण को रोकता है, जिससे PBMCs पर उपकला-व्युत्पन्न घुलनशील कारकों के प्रभावों का एक विस्तृत अध्ययन किया जा सकता है। इसलिए पहचाने गए कारकों को उचित जन्मजात टी सेल आबादी को प्रेरित करने में उनकी चिकित्सीय क्षमता के लिए आगे की जांच की जा सकती है जो इन्फ्लूएंजा संक्रमण से रक्षा कर सकते हैं। इसलिए इस पेपर ने उपकला-व्युत्पन्न घुलनशील कारकों से जन्मजात टी-सेल सक्रियण के अध्ययन के लिए एक सह-संस्कृति स्थापित करने के तरीकों को विस्तृत किया है।

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Protocol

नोट:: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मीडिया के व्यंजनों के लिए तालिका 1 देखें।
नोट: 12-अच्छी तरह से ट्रांसवेल पर उगाए गए एचएनईसीएस को इन्फ्लूएंजा वायरस से संक्रमित होने पर बेसल चैंबर तक पहुंचने के लिए घुलनशील कारकों के लिए अधिक इष्टतम मोटाई में बढ़ने के लिए पाया गया है। इसलिए सह-संस्कृति के लिए 12-अच्छी तरह से आकार के ट्रांसवेल के उपयोग की सिफारिश की जाती है।

1. 3T3 फीडर परत की स्थापना

  1. जमे हुए स्टॉक से स्थापना
    1. जमे हुए स्टॉक से एनआईएच / 3 टी 3 फाइब्रोब्लास्ट के एक क्रायोविल को पिघलाएं। Cryovial की सामग्री को पूरा Dulbecco के न्यूनतम आवश्यक मीडिया (DMEM) के 2 mL में जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    2. 300 × जी और कमरे के तापमान / दबाव (आरटीपी) पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, और supernatant को हटा दें। पूर्ण DMEM में कक्षों को पुन: निलंबित करें.
    3. ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। पुन: निलंबित सेल निलंबन के 10 μL करने के लिए trypan नीले रंग के 10 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं, और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर में निलंबन के 10 μL जोड़ें।
    4. एक उपयुक्त संस्कृति पकवान (जैसे, T75 फ्लास्क) में 1 × 104 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर बीज कोशिकाएं। एक 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए परिणामी संस्कृति फ्लास्क इनक्यूबेट करें।
  2. मिटोमाइसिन सी उपचार
    1. 3 दिनों में, सुनिश्चित करें कि confluency 60% -80% है, माध्यम को हटा दें, और 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोएं।
      नोट:: यह महत्वपूर्ण है कि 3T3 फीडर परत पूर्ण confluency तक नहीं पहुँचता है; अन्यथा, मिटोमाइसिन सी उपचार प्रभावी नहीं होगा।
    2. फ्लास्क में मिटोमाइसिन सी-पूरक पूर्ण डीएमईएम जोड़ें, और 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3.5 घंटेके लिए इनक्यूबेट करें। मिटोमाइसिन सी युक्त माध्यम को हटा दें, और कोशिकाओं को 1x PBS के साथ 2x धोलें।
  3. 6-अच्छी तरह से प्लेटों में 3T3 कोशिकाओं को सीडिंग
    1. कोशिकाओं को अलग करने के लिए 3-5 मिनट के लिए फ्लास्क में 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 3 एमएल जोड़ें। एक ताजा 15 एमएल ट्यूब में असंबद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करें। 300 × जी, आरटीपी पर 5 मिनट के लिए 15 एमएल ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें; supernatant त्याग. पूर्ण DMEM में कक्षों को पुन: निलंबित करें.
    2. ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। 7.5 ×10 5-2.5 × 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से पर एक6-अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं को बीज दें। एक 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेट इनक्यूबेट करें।
      नोट:: 3T3 फीडर परत तैयार माना जाता है यदि कक्ष स्वस्थ हैं। इस बिंदु पर, विस्तार के लिए फीडर परत पर मानव नाक उपकला स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं (hNESPCs) को बीज दें।
    3. फ्लास्क में पूर्ण DMEM जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 5% सीओ2 3T3 कोशिकाओं के लिए रात भर में मिटोमाइसिन सी उपचार से ठीक होने के लिए।

2. मानव नाक उपकला कोशिका (hNEC) संस्कृति की स्थापना

नोट: नैदानिक नमूने उन रोगियों से प्राप्त किए जाने चाहिए जो ऊपरी श्वसन पथ के संक्रमण के लक्षणों से मुक्त हैं।

  1. एकल सेल निलंबन में नाक के ऊतकों को संसाधित करना
    1. 1x Dulbecco के PBS (dPBS) (Mg2+ और Ca 2+ के बिना PBS) में नाक केऊतकों को धोएं, जिसमें एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक मिश्रण के 100 μL / mL होते हैं। ऊतक को छोटे टुकड़ों में काटें, और एक तटस्थ प्रोटीज के 10 मिलीग्राम / एमएल में नमूने का इलाज करें, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए।
    2. 200 × जी पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, और centrifugation के बाद supernatant को हटाने। 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए (37 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) के 1-2 मिलीलीटर में गोली को इनक्यूबेट करें, और ट्यूब में मात्रा के 10% के बराबर भ्रूण गोजातीय सीरम की मात्रा जोड़कर बुझाएं।
    3. यंत्रवत् पचे हुए ऊतक को पिपेटिंग द्वारा एकल-सेल समुच्चय में अलग करें, और फिर 70 μm सेल छलनी के माध्यम से परिणामी निलंबन को पारित करें। पूर्ण DMEM में कक्षों को पुन: निलंबित करें.
      नोट: इस चरण के बाद, सेल निलंबन टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं और स्टेम कोशिकाओं का मिश्रण है जिन्हें मानव नाक उपकला स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं (एचएनईएसपीसी) के रूप में संदर्भित किया जाता है। बाद के चरणों का उद्देश्य विभिन्न सेल आबादी के मिश्रण से एचएनईएसपीसी आबादी का चयन करना और समृद्ध करना है।
  2. HNESPCs के चयन के लिए 3T3 फीडर परत पर एक एकल-सेल निलंबन सीडिंग
    1. चरण 2.1.3 (300 × जी, 5 मिनट, आरटीपी) से सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और supernatant को हटा दें। मध्यम 3 के 3-5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: मध्यम 3 hNESPCs के चयनात्मक विकास को बढ़ावा देने के लिए तैयार किया गया है।
    2. Trypan नीले दाग के माध्यम से कोशिकाओं की गणना. बीज 1 x 10 6 कोशिकाओं मध्यम 3 प्रति अच्छी तरह से6-अच्छी तरह से प्लेट पर 6-अच्छी तरह से प्लेट के 2mL में 6 अच्छी तरह से प्लेट में मीडिया को हटाने के बाद तैयार 3T3 फीडर परत युक्त. परिणामस्वरूप सह-संस्कृति को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: सीडिंग के बाद, ध्यान रखें कि प्लेट को उत्तेजित न करें क्योंकि यह hNESPCs के अनुलग्नक को प्रभावित करेगा।
    3. पुराने माध्यम को पूरी तरह से हटाकर और इसे ताजा माध्यम 3 के साथ बदलकर हर 2-4 दिनों में मध्यम 3 (2 एमएल) बदलें।
      नोट: मध्यम पोषक तत्वों को फिर से भरने के लिए और hNESPCs के विकास को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने से अत्यधिक अम्लीय स्थितियों को रोकने के लिए बदल दिया जाता है। प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के बीच का अंतराल इस बात पर निर्भर करता है कि माध्यम कितना अम्लीय (पीला) हो जाता है। अंतराल को छोटा किया जाना चाहिए यदि माध्यम जल्दी से अम्लीय हो जाता है।
    4. 7-10 दिनों के बाद, ध्यान दें कि hNESPCs झिल्ली आवेषण पर उन्हें स्थानांतरित करने के लिए उपयुक्त confluency पर हैं। 3 अलग-अलग टाइमपॉइंट्स (2 दिन, 5 दिन और 10 दिन) पर hNESPCs के प्रतिनिधि आकृति विज्ञान के लिए चित्रा 1 देखें।
  3. झिल्ली आवेषण पर hNESPCs स्थानांतरित करना
    नोट: मिटोमाइसिन सी उपचार के कारण, 3T3 फीडर परत धीरे-धीरे hNESPC विस्तार अवधि में अवक्रमित हो जाएगी। इसके परिणामस्वरूप अच्छी तरह से सतह पर एक कमजोर आसंजन होगा, जिससे पिपेट के साथ फ्लशिंग करके उनके विघटन की अनुमति मिलती है, केवल स्वस्थ एचएनईएसपीसी को पीछे छोड़ दिया जाता है।
    1. माध्यम निकालें, और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1x dPBS के 500 μL जोड़ें। 3T3 कोशिकाओं को विस्थापित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट के साथ कोशिकाओं 3x को फ्लश करें, और 1x dPBS को छोड़ दें। माइक्रोस्कोप के नीचे देखें कि गोल hNESPCs बने रहते हैं जबकि स्पिंडल के आकार की 3T3 फीडर परत को हटा दिया जाता है।
    2. प्रति अच्छी तरह से एक सेल असंबद्ध अभिकर्मक के 500 μL जोड़ें, और 5-10 मिनट के लिए 5% CO2 वातावरण में 37 °C पर इनक्यूबेट करें, या जब तक hNESPCs अच्छी तरह से सतह से अलग नहीं हो जाते।
    3. HNESPC निलंबन, सेंट्रीफ्यूज (300 × जी, 5 मिनट, rtp) ले लीजिए, और supernatant को हटाने.
    4. मध्यम 3 में गोली को फिर से निलंबित करें। Trypan नीले दाग के माध्यम से कोशिकाओं की गणना. बीज 3 × 10 4 कोशिकाओं में मध्यम 3 प्रति झिल्ली डालने (24-अच्छी तरह से प्लेट) या 1 × 10 5 कोशिकाओं के 300 μL में मध्यम 3 प्रति झिल्ली डालने (12-अच्छी तरह से प्लेट) (चित्रा 2) के 300 μL में कोशिकाओं के150 μL. एक 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    5. हर 2 दिनों में एपिकल और बेसल कक्षों के माध्यम (मध्यम 3) को बदलें। बेसल चैंबर तक पहुंचने के लिए झिल्ली डालने की सहायक बाहों के बीच एक पिपेट टिप नेविगेट करें, पुराने माध्यम को हटा दें, और फिर उसी विधि से ताजा माध्यम को फिर से पेश करें। यद्यपि एपिकल चैंबर आसानी से सुलभ है, ध्यान रखें कि बढ़ती hNESPC परत को परेशान न करें।
      नोट: सीडिंग के बाद कम से कम 2 दिनों के लिए एपिकल चैंबर में माध्यम को परेशान न करें क्योंकि कोशिकाओं को झिल्ली से जुड़ने के लिए समय की आवश्यकता होती है।
  4. HNESPCs का hNECs में विभेदन
    1. जब hNESPCs 100% confluency (झिल्ली डालने पर सीडिंग से लगभग 3-7 दिन) तक पहुंचते हैं, तो ALI संस्कृति शुरू करें। बेसल माध्यम को विभेदन माध्यम में बदलें, और एपिकल कक्ष से माध्यम को हटा दें। हर 2-3 दिनों में माध्यम को बदलते समय एपिकल चैंबर में इसे जोड़े बिना बेसल चैंबर में माध्यम जोड़ें, जैसा कि चित्र 3 और चरण 2.3.5 में दर्शाया गया है।
      नोट: माध्यम को भेदभाव माध्यम में बदल दिया गया है ताकि ALI में hNECs में hNESPCs के विभेदन को बढ़ावा दिया जा सके। एचएनईएसपीसी को ALI में hNECs बनने के लिए पूर्ण परिपक्वता तक पहुंचने में लगभग 3-4 सप्ताह लगते हैं, जिस बिंदु पर कोशिकाएं प्रत्येक परत में कोशिकाओं की विभिन्न आबादी के साथ एक बहुपरत में विकसित होती हैं। सिलिया को 400x के आवर्धन पर भी देखा जाना चाहिए (सिलिया को उनके पिटाई आंदोलन से पहचाना जा सकता है, जो माइक्रोस्कोप क्षेत्र को दिखाई देने का कारण बनता है जैसे यह हिल रहा है)। इस बिंदु पर, कोशिकाएं सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने के लिए तैयार हैं। पूरी तरह से विभेदित hNEC परत के क्रॉस-सेक्शन के लिए चित्रा 4 को देखें।
    2. परिपक्व hNECs प्राप्त करने के बाद, सह-संस्कृति प्रयोग से पहले 1 सप्ताह के लिए 2-3-दिन के अंतराल पर 1x dPBS के साथ एपिकल चैंबर 3x में कोशिकाओं को धोएं। बेसल माध्यम परिवर्तनों के साथ धोने के चरण को सहक्रियात्मक करें, और निम्नानुसार वॉश करें।
      1. झिल्ली डालने के एपिकल कक्ष में 1x dPBS के 50 μL (24-well)/150 μL (12-well) जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 37 °C पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। विभेदन के दौरान संचित बलगम और मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद dPBS को हटा दें।
        नोट: प्रयोग की प्रकृति के आधार पर, सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान का उपयोग बलगम परत को पूरी तरह से धोने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, सह-संस्कृति प्रयोगों में वायरल संक्रमण के लिए, बलगम परत को बनाए रखा जाता है, और केवल अतिरिक्त बलगम को डीपीबीएस धोने के साथ हटा दिया जाता है। यह प्रतिधारण नाक एपिथेलिया पर मौजूद शारीरिक बलगम परत की नकल करना है जो आने वाले वायरल संक्रमण के साथ बातचीत करेगा।

3. Transepithelial विद्युत प्रतिरोध (TEER) माप

नोट: उपकला अखंडता की पुष्टि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि एक बरकरार और स्वस्थ उपकला परत प्राप्त की जाती है। एक अक्षुण्ण उपकला परत एक voltohmmeter का उपयोग कर 4 यादृच्छिक कुओं पर किए गए TEER माप के माध्यम से निर्धारित किया जाता है।

  1. 70% इथेनॉल के साथ इलेक्ट्रोड को कुल्ला करें, और बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए उपयोग से पहले 15 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के साथ इसे निष्फल करें। नसबंदी के बाद 1x dPBS के साथ कुल्ला।
  2. झिल्ली डालने के एपिकल कक्ष में 1x dPBS के 100 μL (24-अच्छी तरह से) या 300 μL (12-अच्छी तरह से) जोड़ें। प्लेट को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें; फिर, dPBS निकालें।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से मापा जा करने के लिए, 1 एमएल (24-अच्छी तरह से) या 3 एमएल (12-अच्छी तरह से) के साथ एक अप्रयुक्त अच्छी तरह से तैयार करें prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस तक) भेदभाव माध्यम। तैयार अच्छी तरह से झिल्ली डालने जगह है, और 200 μL (24-अच्छी तरह से के लिए) या 600 μL (12-अच्छी तरह से) एपिकल कक्ष के लिए prewarmed भेदभाव माध्यम के जोड़ें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (वायरस के प्रकार के इनक्यूबेशन तापमान के अधीन, उदाहरण के लिए, इन्फ्लूएंजा के लिए 35 डिग्री सेल्सियस) पर संतुलित करें।
    नोट:: TEER की गणना के लिए एक ही तरह से एक रिक्त (रिक्त झिल्ली सम्मिलित करें) तैयार करें।
  4. 15 मिनट के लिए एक ही तापमान पर prewarmed विभेदन माध्यम की एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को संतुलित करें। इलेक्ट्रोड को 15 एमएल ट्यूब में रखें, और वोल्टोहममीटर पर स्विच करें।
    नोट: इस बिंदु पर, रीडिंग 0 प्रतिरोध होना चाहिए, क्योंकि इलेक्ट्रोड एक ही माध्यम में हैं। यदि कोई अन्य रीडिंग प्राप्त की जाती है, तो 15 एमएल ट्यूब में इलेक्ट्रोड को संतुलित करें जब तक कि रीडिंग 0 न हो।
  5. रिक्त स्थान से शुरू करते हुए, इलेक्ट्रोड को प्रत्येक कुएं में इस तरह से रखें कि एक इलेक्ट्रोड एपिकल चैंबर माध्यम में डूबा हुआ है और दूसरा बेसल चैंबर माध्यम में। रीडिंग को केवल तभी रिकॉर्ड करें जब कम से कम 5 मिनट की अवधि के लिए एक निरंतर रीडिंग प्राप्त की जाती है।
  6. प्रत्येक माप के बाद, अगले माप से पहले पीबीएस के साथ इलेक्ट्रोड को धो लें। प्रत्येक अच्छी तरह से परीक्षण के लिए, झिल्ली के विभिन्न पदों पर तीन नमूनों के लिए माप लें। प्रत्येक नमूने के शुद्ध टीईईआर की गणना करने के लिए, प्रत्येक माप से रिक्त झिल्ली सम्मिलित द्वारा दिए गए पृष्ठभूमि प्रतिरोध को घटाएं।
  7. निम्न समीकरण का उपयोग कर एक अच्छी तरह से के लिए कुल TEER पठन की गणना करें:
    उपकला अखंडता (Ωcm2) = शुद्ध TEER (ओम) × झिल्ली का क्षेत्रफल (सेमी2)
    नोट: वायरल संक्रमण प्रयोगों के लिए hNECs के TEER मान >1000 Ωcm2 13,15,16 होना चाहिए। 

4. परिधीय रक्त monocytes और एनके कोशिकाओं के अलगाव

नोट: रक्त के नमूने स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त किए जाने चाहिए और अलगाव के एक ही दिन में उपयोग किए जाने चाहिए।

  1. 10 मिलीलीटर रक्त संग्रह ट्यूबों में प्रत्येक दाता से पूरे रक्त के 30-40 मिलीलीटर एकत्र करें।
  2. घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके PBMCs को अलग करें, और निम्नलिखित चरणों के बाद बफी कोट से PBMCs प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका भी देखें)।
    1. संतुलित नमक समाधान (पीबीएस) की एक समान मात्रा के साथ पतला करने से पहले एक vacutainer में रक्त संग्रह ट्यूब से रक्त के ~ 10 मिलीलीटर अच्छी तरह से मिश्रण।
    2. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के आधार पर घनत्व ढाल माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: पतला रक्त के लिए घनत्व ढाल माध्यम का अनुपात 2: 3-3.5 होना चाहिए।
    3. एक पिपेट बंदूक के साथ घनत्व ढाल माध्यम पर पतला रक्त की परत 35 मिलीलीटर (डिस्पेंस सेटिंग के साथ सबसे कम संभव पर सेट किया गया है) ट्यूब को 45 डिग्री तक झुकाकर और पतला रक्त को ट्यूब की आंतरिक दीवार पर ड्रॉपवाइज गिरने की अनुमति देता है ताकि घनत्व ढाल माध्यम की परत परेशान न हो।
    4. सेंट्रीफ्यूज 500 × जी पर lysate, 30 मिनट के लिए 18-20 डिग्री सेल्सियस (ब्रेक: बंद)। निचली परत को परेशान किए बिना ऊपरी प्लाज्मा परत को सावधानीपूर्वक हटा दें और छोड़ दें।
    5. लाल रक्त कोशिका परत, ढाल घनत्व मध्यम परत, या बफी कोट के मिश्रण के बिना एक नई ट्यूब के लिए बफी कोट स्थानांतरित करें। एक बार जब बफी कोट को एक नई 50 एमएल ट्यूब में एकत्र किया गया है, तो 1x पीबीएस के साथ वॉल्यूम को 50 एमएल तक ऊपर उठाएं।
    6. सेंट्रीफ्यूज lysate 800 × g, 18-20 °C, 8 मिनट (ब्रेक: बंद) पर, और एक पिपेट बंदूक के साथ supernatant को हटा दें। 1x PBS के 50 mL के साथ सेल गोली resuspend, और 120 × g, 18-20 °C, प्लेटलेट्स को हटाने के लिए 10 मिनट पर सेंट्रीफ्यूज।
    7. सेल गोली परेशान किए बिना, pipetting द्वारा supernatant त्याग.
      नोट: के रूप में सेल गोली ढीला हो सकता है, यह डालने से supernatant त्याग करने के लिए अनुचित है।
    8. पूर्ण RPMI (Roswell पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट) माध्यम के साथ सेल गोली resuspend. 3% एसिटिक एसिड के 10 μL को मेथिलीन नीले रंग के साथ 10 μL को पुन: निलंबित सेल निलंबन के 10 μL जोड़कर एक सेल गिनती करें। अच्छी तरह से मिलाएं, और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर में मिश्रण के 10 μL जोड़ें।
  3. पूर्ण RPMI माध्यम के साथ PBMCs को 2 × 106 / mL (24-अच्छी तरह से) या 4 × 106 / mL (12-अच्छी तरह से) के घनत्व के लिए पतला करें।

5. hNEC वायरल संक्रमण और hNEC के लिए संक्रमण: PBMC सह संस्कृति

नोट: H3N2 (A/Aichi/2/1968) का उपयोग इस प्रोटोकॉल में संक्रमण के प्रतिनिधि तनाव के रूप में किया जाता है। 0.1 के संक्रमण की बहुलता (MOI) का उपयोग इस प्रोटोकॉल में प्रतिनिधि MOI के रूप में किया जाता है।

  1. दिन 0 (HNECs का संक्रमण)
    नोट: एक ही दाता से उगाए गए hNECs से एक अच्छी तरह से प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग किए जाने वाले के लिए एक प्रतिनिधि सेल गिनती प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है।
    1. प्रतिनिधि में अच्छी तरह से, झिल्ली डालने के एपिकल कक्ष में 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 150 μL और बेसल कक्ष में 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 350 μL जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, या जब तक कोशिकाएं झिल्ली से अलग न हो जाएं।
    2. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा झिल्ली पर कोशिकाओं फ्लश, और एक 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निलंबन इकट्ठा. ट्रिप्सिन गतिविधि को बुझाने के लिए पूर्ण DMEM के 200 μL जोड़ें। ट्राइपैन नीले दाग के माध्यम से कोशिकाओं की गिनती प्रति अच्छी तरह से सेल गिनती प्राप्त करने के लिए।
    3. अच्छी तरह से सेल गिनती के आधार पर वायरस के आवश्यक MOI की गणना करें, और तदनुसार बर्फ पर पूर्ण RPMI के साथ वायरस स्टॉक को पतला करें।
      नोट: MOI 0.1 of 1.26 × 106 hNECs प्रति अच्छी तरह से = 1.26 × 10 5 H3N2 वायरल कणप्रति अच्छी तरह से 30 μL में (24-well के लिए)/100 μL (12-अच्छी तरह से)
    4. संक्रमण प्रयोग के लिए शेष कुओं के लिए, झिल्ली आवेषण के एपिकल कक्षों में 1x dPBS के 50 μL (24-well के लिए)/150 μL (12-well के लिए) जोड़ें, 10 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें, और 1x dPBS को हटा दें।
    5. झिल्ली आवेषण में बेसल माध्यम को बदलें RPMI को एक नई प्लेट में स्थानांतरित करके RPMI माध्यम को पूरा करने के लिए पूर्ण RPMI कुओं में जोड़ा गया (350 μL (24-well के लिए)/700 μL (12-अच्छी तरह से))।
      नोट: जब hNESPCs पूरी तरह से hNECs के लिए विभेदित है, वे सहिष्णु / 72 h तक के लिए विभिन्न मीडिया के लिए अनुमेय हैं, आकारिकी या संगठन के लिए कोई परिवर्तन के साथ जब माध्यम RPMI12 करने के लिए स्विच किया जाता है। RPMI का उपयोग PBMC आबादी के विकास और रखरखाव का समर्थन करने के लिए किया जाता है।
    6. झिल्ली डालने के एपिकल कक्ष में वायरस इनोकुलम के तैयार 30 μL (24-अच्छी तरह से)/ 100 μL (12-अच्छी तरह से) जोड़ें, 1 घंटे के लिए 5% CO2 वातावरण में 35 °C पर इनक्यूबेट करें, और एपिकल चैंबर से वायरल इनोकुलम को हटा दें।
    7. झिल्ली डालने के बेसल माध्यम को ताजा पूर्ण RPMI माध्यम में बदलें और24 घंटे के लिए 5% CO 2 वातावरण में 35 °C पर इनक्यूबेट करें।
  2. दिन 1 (hNECs + PBMCs सह-संस्कृति की स्थापना)
    1. 150 μL (24-well के लिए)/300 μL (12-well के लिए) में PBMCs की आवश्यक संख्या को पूरा RPMI माध्यम के लिए सीधे दिन 0 से असंक्रमित या संक्रमित hNECs के प्रत्येक कुएं के बेसल कक्ष में PBMC निलंबन जोड़कर (1.5 × 106 24-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए और 3 × 106 12-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए)। 24/48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: सह-संस्कृति की स्थापना के बाद बेसल चैंबर में अंतिम मात्रा 500 μL (24-well के लिए)/1000 μL (12-well के लिए) है।
  3. दिन 2-3 (पीबीएमसी की कटाई 48/72 ज पोस्ट-वायरल संक्रमण)
    1. एपिकल supernatants का संग्रह (48/72 ज पोस्ट वायरल संक्रमण)
      1. प्रत्येक एपिकल चैंबर में 1x dPBS के 50 μL (24-well के लिए)/150 μL (12-well के लिए) जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें। 1.5 mL ट्यूबों में 1x dPBS ले लीजिए. एलीकोट 25 μL (24-अच्छी तरह से के लिए)/50 μL (12-अच्छी तरह से) एक नए 1.5 mL ट्यूब में पट्टिका परख के लिए supernatant के, और तुरंत दोनों स्टॉक और एलीकोट -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज.
    2. एचएनईसी से सेलुलर आरएनए का संग्रह (48/72 ज पोस्ट-वायरल संक्रमण)
      1. झिल्ली डालने को एक साफ अच्छी तरह से स्थानांतरित करें, एपिकल चैंबर में आरएनए लाइसिस बफर के 300 μL (24-अच्छी तरह से)/ 600 μL (12-अच्छी तरह से) जोड़ें, और 5 मिनट के लिए rtp पर इनक्यूबेट करें। एक 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में supernatant ले लीजिए, और आणविक विश्लेषण के लिए आरएनए निष्कर्षण तक इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. PBMCs की कटाई (48/72 ज पोस्ट-वायरल संक्रमण)
      1. एक बाँझ पिपेट टिप के व्यापक आधार के साथ, धीरे से सक्रिय PBMCs है कि अच्छी तरह से सतह के लिए अनुयायी हो सकता है dislodge करने के लिए अच्छी तरह से सतह की सतह को खरोंच. एक 2 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में PBMCs युक्त बेसल माध्यम ले लीजिए.
      2. 1x dPBS के 300 μL के साथ कुओं 2x फ्लश, और एक ही 2 mL ट्यूब में धोने इकट्ठा. 2 एमएल ट्यूब (500 × जी, 5 मिनट, आरटीपी) को सेंट्रीफ्यूज करें, और सेल पैलेट को परेशान किए बिना एक ताजा 2 एमएल ट्यूब में supernatant इकट्ठा करें। साइटोकाइन और केमोकाइन विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर supernatant स्टोर; 1x dPBS के 200 μL में सेल गोली resuspend.

6. प्रवाह cytometry

नोट:: प्रोटोकॉल का यह अनुभाग सीधे पिछले अनुभाग से PBMC सेल निलंबन चरण 5.3.3.2 से का उपयोग कर जारी रखा गया है। इस अनुभाग में निम्न चरणों के दौरान न्यूनतम प्रकाश जोखिम सुनिश्चित करें। सतह धुंधला मार्करों का एक नमूना पैनल तालिका 2 में पाया जा सकता है।

  1. सतह धुंधला
    1. एक 96-V नीचे अच्छी तरह से प्लेट में resuspended PBMC सेल गोली स्थानांतरण. सेंट्रीफ्यूज 3 मिनट के लिए 800 × जी पर lysate, और supernatant को हटाने.
    2. RTP पर 15 मिनट के लिए एक व्यवहार्यता दाग के 100 μL के साथ सभी PBMCs ("unstained" को छोड़कर) इनक्यूबेट करें। चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (MACS) बफर के 150 μL के साथ 200 μL तक ऊपर। सेंट्रीफ्यूज 3 मिनट के लिए 800 × जी पर lysate, और supernatant त्याग.
    3. उचित कमजोर पड़ने के अनुपात और प्रति प्रतिक्रिया 50 μL की अंतिम मात्रा (अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए MACS बफर के साथ टॉप-अप) के साथ ब्याज की सतह धुंधला एंटीबॉडी का एक पैनल तैयार करें। एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं के लिए तैयार एंटीबॉडी मिश्रण के 50 μL जोड़कर सतह धुंधला प्रदर्शन. अंधेरे में 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. MACS बफर के 150 μL जोड़कर धोएं। सेंट्रीफ्यूज 3 मिनट के लिए 800 × जी पर lysate, और supernatant त्याग. यदि इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग की आवश्यकता नहीं है, तो चरण 6.3 में 15 मिनट इनक्यूबेशन पर सीधे आगे बढ़ें।
  2. इंट्रासेल्युलर धुंधला (यदि आवश्यक हो)
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से एक निर्धारण और permeabilization समाधान के 100 μL जोड़ें। अंधेरे में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 1x MACS बफर के 100 μL के साथ कुओं को ऊपर रखें।
    2. सेंट्रीफ्यूज (800 × जी, 3 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस), और supernatant को हटा दें। 1x Permeabilization धोने बफर के 200 μL जोड़कर धोने को दोहराएँ। सेंट्रीफ्यूज (500 × जी, 3 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस), और supernatant को हटाने।
    3. 1x Permeabilization धोने बफर का उपयोग कर 50 μL की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए ब्याज के एंटीबॉडी पैनल के लिए dilutions तैयार करें। अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 1x Permeabilization धोने बफर के 200 μL जोड़ें.
    4. कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें (800 × जी, 3 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस), और supernatant को हटा दें। प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग बफर के 100 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  3. पिपेट प्रत्येक कुएं में एक लाइसिंग समाधान का 200 μL. RTP पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूज 3 मिनट के लिए 800 × जी पर lysate और supernatant त्याग.
  4. MACS बफर के 200 μL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित कर दिया। पहले13 उल्लिखित सेटिंग्स के अनुसार प्रवाह साइटोमेट्री करें, या अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. साइटोकाइन और केमोकाइन के स्तर का निर्धारण

  1. प्रक्रिया बेसल चैंबर supernatant के 25 μL निर्माता के प्रोटोकॉल18 के अनुसार एक immunology मल्टीप्लेक्स परख का उपयोग कर.
  2. मानक वक्र के लिए एक वक्र-फिटिंग एल्गोरिथ्म (5 पैरामीटर) का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स प्रबंधक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक विश्लेषक की एकाग्रता की गणना करें।

8. वायरल संदूषण का आकलन

  1. समाधान के 4 सेटों पर एक निष्कर्षण किट का उपयोग करके वायरल आरएनए निकालें: स्टॉक H3N2 समाधान, संक्रमण के लिए MOI 0.1 कमजोर पड़ने, MOI 0.1 के 10x सीरियल dilutions, और नमूनों से बेसल माध्यम (दोनों 48 और 72 ज पोस्ट-वायरल संक्रमण)12।
  2. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए लक्ष्य के रूप में गैर-संरचनात्मक जीन (एनएस 1) और मैट्रिक्स (एम 1) का चयन करें (प्रतिनिधि प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  3. वायरल उपस्थिति के लिए प्रॉक्सी के रूप में एनएस 1 और एम 1 स्तरों को मापने के लिए मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) करने से पहले वायरल आरएनए को सीडीएनए में परिवर्तित करने के लिए रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन-पीसीआर (आरटी-पीसीआर) (42 डिग्री सेल्सियस, 60 मिनट) करें, और एमओआई 0.1 एलीकोट के 10x सीरियल कमजोर पड़ने पर किए गए आरटी-क्यूपीसीआर से प्राप्त मानक वक्र के स्तर को सहसंबंधित करें। प्रतिक्रिया मिश्रणों की संरचना के लिए तालिका 3 का संदर्भ लें, और निम्नलिखित शर्तों का उपयोग करें: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रीइनक्यूबेशन, इसके बाद 40 चक्रों के लिए 3-चरण प्रवर्धन: 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; पिघलने वक्र: 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 60 सेकंड के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, और 1 सेकंड के लिए 97 डिग्री सेल्सियस।

9. पट्टिका परख

  1. दिन 0: 24-अच्छी तरह से प्लेटों में MDCK (मैडिन डार्बी कैनाइन किडनी) सीडिंग
    1. confluent MDCK कोशिकाओं के एक T75 फ्लास्क से माध्यम निकालें। सीरम के सभी निशान को हटाने के लिए 1x PBS के साथ 2x धोएं। ट्रिप्सिन के 10 मिलीलीटर को जोड़कर और कोशिकाओं के अलग होने तक 20-30 मिनट के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके एमडीसीके कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें।
      नोट: फ्लास्क को टैप न करें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप clumping हो सकता है।
    2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन पिपेट पूर्ण ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (EMEM) के 2 एमएल युक्त है। सेंट्रीफ्यूज (300 × जी, 5 मिनट, आरटीपी), और supernatant निकालें।
    3. पूर्ण EMEM के 6 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग द्वारा कोशिकाओं की गणना करें।
    4. MDCK सेल निलंबन को 1 × 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए पतला करें, और एक बाँझ 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला निलंबन के बीज 1 एमएल। प्रत्येक कुएं में MDCK कोशिकाओं के एक confluent monolayer प्राप्त करने के लिए24 ज के लिए एक 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubate।
  2. दिन 1: MDCK कोशिकाओं का संक्रमण
    1. संक्रमण माध्यम तैयार करें। 24-अच्छी तरह से प्लेट में MDCK मोनोलेयर से माध्यम को हटा दें, और 1x dPBS के साथ 2x धो लें। दूसरे धोने के लिए, वायरस के सीरियल dilutions तैयार करते समय कुओं में PBS छोड़ दें।
    2. बर्फ पर वायरस के नमूनों को पिघलाएं, और 10-1 से 10-6 तक सीरियल dilutions प्राप्त करने के लिए उन्हें 24-अच्छी तरह से प्लेट में क्रमिक रूप से पतला करें।
      नोट: एक उदाहरण के रूप में, संक्रमण माध्यम के 270 μL के साथ एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से भरें।
    3. पंक्ति में पहले कुएं के लिए वायरस के नमूने के 30 μL जोड़ें। एक नए पिपेट टिप के साथ, अच्छी तरह से मिलाएं और 10x द्वारा नमूने को पतला करने के लिए पंक्ति में अगले कुएं में स्थानांतरित करें। जब तक 10-6 कमजोर पड़ने का लक्ष्य प्राप्त नहीं हो जाता तब तक आगे बढ़ें; सभी वायरस नमूनों के लिए चरण 9.2.1-9.2.3 निष्पादित करें।
    4. MDCK प्लेट से PBS निकालें, और तैयार वायरल dilutions के 100 μL के साथ डुप्लिकेट में संक्रमित। नियंत्रण कुओं के लिए, संक्रमण माध्यम के 100 μL जोड़ें (वायरल नमूने के बिना)। 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 35 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, हर 15 मिनट में सूखे धब्बों को खत्म करने के लिए प्लेट को हिलाते हुए।
    5. वायरल इनोकुलम को हटा दें, और प्रत्येक अच्छी तरह से तरल ओवरले के 1 एमएल जोड़ें। 72 घंटे के लिए 5% सीओ2 वातावरण में 35 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. दिन 4 (72 ज पोस्ट संक्रमण): पट्टिका विज़ुअलाइज़ेशन
    1. तरल ओवरले को हटा दें, और 1 घंटे के लिए 1x PBS में 4% फॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। फॉर्मेल्डिहाइड समाधान निकालें, और 1x PBS या आसुत पानी के साथ एक बार धोलें।
    2. 15 मिनट के लिए 1% क्रिस्टल वायलेट समाधान जोड़कर निश्चित कोशिकाओं को दाग दें। क्रिस्टल वायलेट डाई निकालें, और बहते पानी के साथ कोशिकाओं को धोलें। आरटीपी पर प्लेट को सुखाएं।
    3. एक बार सूखने के बाद, सजीले टुकड़े की गिनती करें, और निम्नलिखित सूत्र के अनुसार वायरल टिटर की गणना करें:
      तनुकरण कारक × सजीले टुकड़े की संख्या = पट्टिका की संख्या - 100 μL में इकाइयों का निर्माण

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Representative Results

यद्यपि पारंपरिक टी कोशिकाएं वायरल निकासी की सुविधा के लिए वायरल संक्रमण के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मुख्य प्रदर्शनों की सूची बनाती हैं, जन्मजात टी सेल आबादी बाद के चरण में प्रभावी निकासी के लिए वायरल लोड को दबाने के लिए एक व्यापक स्पेक्ट्रम में काम करती है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से जन्मजात टी कोशिकाओं, उनके सक्रियण, और इन्फ्लूएंजा संक्रमण के बाद उनकी कार्यात्मक आबादी का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत स्थिति बनाता है, एक ही दाता से उपकला और प्रतिरक्षा कोशिका नमूनों की आवश्यकता के बिना। इस प्रोटोकॉल को अन्य वायरसों पर भी लागू किया जा सकता है, हालांकि यह एपिकल रिलीज वाले वायरस तक सीमित हो सकता है, यानी, किसी भी वायरस को पीबीएमसी डिब्बे के संपर्क में आने के लिए बेसल परत में प्रवेश नहीं करना चाहिए।

चित्रा 1 में प्रतिनिधि परिणामों के आधार पर, यह प्रोटोकॉल 3T3 फीडर परत में प्राथमिक सेल निलंबन से उगाई गई hNESPC आबादी प्राप्त करने में मदद कर सकता है। चित्रा 1 hNESPCs की अपेक्षित प्रगति का एक नमूना प्रदान करता है क्योंकि वे 3T3 फीडर परत पर बढ़ते हैं। इन कोशिकाओं का उपयोग ALI संस्कृति में विभेदन के लिए किया जाएगा ताकि बहुस्तरीय hNECs प्राप्त किया जा सके, जो कार्यात्मक सिलिटेड और गोब्लेट कोशिकाओं (चित्रा 4) के साथ पूरा हो। एचएनईसी का उपयोग करके, प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके जन्मजात टी-सेल सक्रियण की जांच की जा सकती है। चित्रा 5 में दिखाए गए परिणाम MAIT सेल, ππ-T सेल और एनके सेल आबादी का पता लगाने को दर्शाते हैं, जो इन्फ्लूएंजा वायरस से संक्रमित एचएनईसी को शामिल करने वाले सह-संस्कृति में काफी वृद्धि हुई थी। इस सेटअप को तब इन्फ्लूएंजा वायरस के अन्य उपभेदों पर लागू किया जा सकता है ताकि उपभेदों में सार्वभौमिक आबादी को चिढ़ाया जा सके, साथ ही साथ अन्य वायरस और जन्मजात टी सेल आबादी को सक्रिय करने की उनकी क्षमता। इसके अलावा, संक्रमित उपकला कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति स्थितियों के तहत अपने संबंधित सक्रियण का निरीक्षण करने के लिए ब्याज की जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के अनुसार भी डिटेक्शन पैनल को अनुकूलित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: hNESPCs एक 3T3 फीडर परत पर उगाया 2/5/10 दिन सीडिंग से दिन. दिन 2: ध्यान दें hNESPCs के आइलेट्स (एक उदाहरण एक सफेद तीर के साथ सीमांकित है) जो 3T3 फीडर परत पर सीडिंग के 2 दिन बाद मनाया जाना चाहिए। दिन 5: दिन 2 पर मनाया आइलेट्स अब बड़ा होना चाहिए (एचएनईएसपीसी के द्वीपों के उदाहरणों को हरे घेरे द्वारा सीमांकित किया जाता है), और 3T3 परत को विघटित होने के लिए मनाया जाना चाहिए। दिन 10: hNECPS को पूरी प्लेट पर कम या कोई 3T3 कोशिकाओं के साथ हावी होना चाहिए। दिन 2 और दिन 5 के लिए स्केल बार = 200x के आवर्धन के आधार पर 50 μm, दिन 10 के लिए स्केल बार = 100x के आवर्धन के आधार पर 100 μm। संक्षिप्त नाम: hNESPCs = मानव नाक उपकला स्टेम / पूर्वज कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 24-अच्छी तरह से और 12-अच्छी तरह से प्लेटों में झिल्ली आवेषण के लिए अच्छी तरह से आरेख। प्रत्येक डिब्बे के लिए उपयोग किए जाने वाले मध्यम वॉल्यूम को नोट करें। hNESPCs झिल्ली आवेषण के एपिकल कक्षों में seeded हैं। संक्षिप्त नाम: hNESPCs = मानव नाक उपकला स्टेम / पूर्वज कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ALI सह-संस्कृति स्थापना के लिए 24-अच्छी तरह से और 12-अच्छी तरह से प्लेटों में झिल्ली आवेषण के लिए अच्छी तरह से आरेख। प्रत्येक डिब्बे के लिए उपयोग किए जाने वाले मध्यम वॉल्यूम को नोट करें। मध्यम परिवर्तनों के बीच विभिन्न अंतरालों (2 दिन/3 दिन) के लिए उपयोग किए जाने वाले मध्यम आयतन में अंतर पर ध्यान दें। संक्षिप्त नाम: ALI = वायु-तरल इंटरफ़ेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एक hNEC परत के सह-दाग π4-ट्यूबुलिन और MUC5AC. π4-ट्यूबुलिन हरे रंग में दाग है, जबकि MUC5AC लाल रंग में सना हुआ है। नाभिक DAPI के साथ नीले रंग में दाग रहे हैं. MUC5AC बलगम-उत्पादक गोब्लेट कोशिकाओं की उपस्थिति को इंगित करता है, जबकि π4-ट्यूबुलिन सिलिटेड कोशिकाओं पर सिलिया की उपस्थिति को इंगित करता है। स्केल बार = 20 μm 600x आवर्धन के आधार पर। संक्षेप: hNEC = मानव नाक उपकला कोशिका; MUC5AC = mucin 5AC; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 24 घंटे के लिए नाक उपकला या इन्फ्लूएंजा-संक्रमित उपकला के साथ या बिना इनक्यूबेट किए गए पीबीएमसी के प्रतिनिधि परिणाम। MAIT, Vπ1 T कोशिकाओं, Vπ2 T कोशिकाओं और NK कोशिकाओं का सक्रियण Vα 7.2 TCR, Vπ1 TCR, Vπ2 TCR, CD56, और CD69 धुंधला सहित सेल-प्रकार-विशिष्ट मार्करों द्वारा निर्धारित किया गया था। गेट्स के ऊपर के मान CD69-धनात्मक कक्षों के प्रतिशत को इंगित करते हैं. संक्षेप: PBMCs = परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं; एपिथ = नाक उपकला; फ्लू-एपिथ = इन्फ्लूएंजा-संक्रमित उपकला; MAIT = mucosal-संबद्ध अपरिवर्तनीय टी कोशिकाएं; NK = प्राकृतिक हत्यारा; TCR = T-सेल रिसेप्टर; CD = विभेदन का समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मध्यम नुस्खा संयोजन टिप्पणियाँ
मध्यम 3 DMEM/ पोषक तत्व मिश्रण F-12 500 mL
मानव उपकला विकास कारक 5 ng/mL
इन्सुलिन 2.5 μg/mL
हैजा विष 0.1 nM
हाइड्रोकार्टिसोन 0.5 μg/mL
3,3',5-triiodo-l-thyronine 2 nM
N-2 पूरक 5 mL 10 μL/mL
एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक 5 mL
विभेदन मीडिया न्यूमाकुल्ट-अली बेसल मध्यम 441 मिलीलीटर
न्यूमाकुल्ट-अली 10x पूरक 50 mL
Hydrocortisone समाधान (200x) 2.5 mL
0.2% (2 मिलीग्राम / एमएल; 1000 आईयू / एमएल) हेपरिन सोडियम नमक फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा में 1 मिलीलीटर
एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (100x) 5 mL
PneumaCult-ALI रखरखाव पूरक (100x) 500 μL उपयोग करने से पहले केवल सही जोड़ने के लिए
पूरा Dulbecco न्यूनतम आवश्यक माध्यम (DMEM) DMEM/ उच्च ग्लूकोज 450 mL
गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम 50 mL
एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (100x) 5 mL
Roswell पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) मध्यम पूरा RPMI 1640 (w L-Glutamine) 445 mL
गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम 50 mL
एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (100x) 5 mL
ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (EMEM) को पूरा करें EMEM (w L-Glutamine) 450 mL
गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम 50 mL
संक्रमण मध्यम EMEM (w L-Glutamine) 4 मिलीलीटर
TPCK ट्रिप्सिन (500 μg/ 8 μL अंतिम TPCK ट्रिप्सिन 1 μg/mL की सांद्रता
चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग बफ़र 1x PBS 498 mL
0.5 M EDTA 2 मिलीलीटर
बीएसए (ऊतक संस्कृति ग्रेड) 2.5 ग्राम
Mitomycin सी-पूरक पूर्ण DMEM पूरा DMEM 10 mL
मिटोमाइसिन C 500 μL मिटोमाइसिन सी (10 μg/

तालिका 1: उपयोग किए जाने वाले मीडिया के लिए नुस्खा।

सेल सतह मार्कर फ्लोरोफोर
Vπ1 T-cell receptor (TCR) फ्लोरोसीन आइसोथियोसाइनेट (FITC)
Vπ2 TCR पेरिडिनिन-कोलोरफिल-प्रोटीन (PerCP)
CD3 V500
CD8 Allophycocyanin-Cyanine 7 डाई (APC-Cy7)
CD14 Phycoerythrin (पीई)-CF594
CD56 Phycoerythrin (पीई)-साइनिन 7 (Cy7)
CD69 शानदार वायलेट 421 (BV421)
CD83 एलोफिकोसायनिन (एपीसी)
CD161 शानदार वायलेट 605 (BV605)
Vα 7.2 Phycoerythrin (पीई)
CD38 शानदार पराबैंगनी 395 (BUV395)

तालिका 2: नमूना सतह धुंधला मार्करों.

qPCR अभिक्रिया मिश्रण qPCR मास्टर मिक्स 5 μL
न्यूक्लिएज-मुक्त जल 3 μL
फॉरवर्ड प्राइमर (1 mM) 0.5 μL
रिवर्स प्राइमर (1 mM) 0.5 μL
cDNA (12.5 ng/μL) 1 μL
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 10 μL
आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण आरटी-पीसीआर 5x बफर 2.5 μL
यादृच्छिक प्राइमर (500 ng / μL) 0.2 μL
RNase अवरोधक 0.625 μL
dNTP मिश्रण 2.5 μL
रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज 0.5 μL
आरएनए (200 ng/μL) 1 μL
न्यूक्लिएज मुक्त जल 12.675 μL
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 20 μL

तालिका 3: रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) और मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) के प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए नुस्खा।

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Discussion

वायरस के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं एंटीवायरल प्रबंधन में अध्ययन का एक अंडर-जांच क्षेत्र हैं। वायुमार्ग उपकला कोशिकाएं और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं एक संक्रमण के दौरान वायरल प्रतिकृति को दबाने के लिए कॉन्सर्ट में काम करती हैं, इसके अलावा अतिसक्रिय अनुकूली प्रतिक्रिया के निर्धारक के रूप में सेवा करने के अलावा यदि वायरल लोडको जांच में नहीं रखा जाता है 12,13,17। हालांकि, एक उपयुक्त एंटीवायरल प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियण की जांच करने के लिए उपकला-जन्मजात प्रतिरक्षा क्रॉसस्टॉक के अध्ययन के लिए एक प्रासंगिक मानव मॉडल का विकास एक चुनौती बनी हुई है। इसलिए, यह ALI सह-संस्कृति मॉडल एक बहुमुखी तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है जिसका उपयोग नाक उपकला परत और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत के एक पूरे मेजबान का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। जैसा कि यह मॉडल इन-विट्रो-विभेदित एचएनईसी, प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से पीबीएमसी सक्रियण विश्लेषण, और वायरल संक्रमण को जोड़ता है, इसलिए इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण चरणों को स्पष्ट रूप से सीमांकित किया गया है। इसके अलावा, वायुमार्ग के उस हिस्से में भी आगे संशोधन किया जा सकता है जिसमें शामिल है जहां ऊपरी और निचले वायुमार्ग दोनों से इन-विट्रो-विभेदित कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है, प्रोटोकॉल में बहुमुखी प्रतिभा की एक और परत जोड़ते हुए।

हालांकि, वायरल संक्रमण में उपकला-प्रतिरक्षा कोशिका क्रॉसस्टॉक के साथ काम करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि वायरस एचएनईसी द्वारा जारी प्रारंभिक स्थानीय उपकला-व्युत्पन्न घुलनशील कारकों की पहचान करने के लिए पीबीएमसी के साथ सीधे बातचीत न करें। इसलिए, यह मॉडल ध्रुवीकृत वायरल रिलीज के साथ वायरस की जांच करने के लिए अधिक उपयुक्त है, जिसमें वायरस केवल एपिकल सतह से एपिकल चैंबर में बाहर निकलते हैं, उदाहरण के लिए, इन्फ्लूएंजा वायरस12 और सार्स-कोव -2 वायरस19। इसके अलावा, प्रयोग से समझौता करने वाले बेसल चैंबर में एपिकल-रिलीज वायरस के रिसाव को रोकने के लिए, पर्याप्त मोटाई की एक बरकरार उपकला परत महत्वपूर्ण है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि टीईईआर माप और वायरल आरएनए परिमाणीकरण यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाए कि परिणाम बेसल चैंबर 13,16,20 में वायरल रिसाव से मुक्त हैं। >1000 के एक टीईईआर पढ़ने का तात्पर्य ध्रुवीकृत रिलीज के साथ वायरस के लिए उपयुक्त कोशिकाओं की एक बरकरार बहुपरत है; बेसल मीडिया को किसी भी वायरल आरएनए संदूषण13,15,16 से मुक्त होना चाहिए। हालांकि, द्विदिश रिलीज वायरस के लिए मॉडल की उपयोगिता, जैसे कि राइनोवायरस, का पता लगाया जाना बाकीहै। इस तरह के वायरस ध्रुवीकृत तरीके से अपनी संतानों को जारी करने तक सीमित नहीं हैं और एपिथेलियम के एपिकल और बेसल दोनों क्षेत्रों में द्विदिश रूप से नए वायरस जारी कर सकते हैं। इस मॉडल को गैर-ध्रुवीकृत रिलीज वाले वायरस पर लागू करने से पहले आगे के अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

चूंकि इस प्रोटोकॉल में विभिन्न व्यक्तियों से मानव नमूनों के साथ काम करना शामिल है, इसलिए एचएनईसी के कोई भी दो नमूने एक ही गुण और प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित नहीं करेंगे। उदाहरण के लिए, टर्मिनली विभेदित एचएनईसी परत द्वारा उत्पादित बलगम की चिपचिपाहट बहुत भिन्न हो सकती है। सिलिया विकास की गति भी अलग हो सकती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में निर्धारित दिशानिर्देशों का पालन करते समय लचीलेपन के कुछ स्तर का प्रयोग करना महत्वपूर्ण है। हालांकि उपकला सेल लाइनों का उपयोग करना निश्चित रूप से संभव है, यह उपकला परत के विभिन्न सेल प्रकारों के बीच बातचीत की जटिलता (बलगम, विभिन्न सेल प्रकारों के बीच बातचीत) को हटा देगा, जो इस बात की जांच के लिए आदर्श होगा कि उपकला क्रॉसस्टॉक पीबीएमसी की प्रतिक्रियाओं को कैसे प्रभावित करता है। नाक के ऊतकों के शरीर विज्ञान की नकल करने के लिए एक प्राथमिक सेल लाइन आवश्यक है, जहां कोशिकाएं बहुस्तरीय होती हैं, और विभिन्न सेल प्रकारों को अपने स्वयं के व्यक्तिगत आला में स्थानीयकृत किया जाता है, हालांकि परिवर्तनशीलता एक मुद्दा हो सकता है। इस संबंध में परिवर्तनशीलता को कोशिकाओं की विषम आबादी को अलग करने और अलग करने के लिए एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करके दूर किया जा सकता है।

जिन प्रकार के इंटरैक्शन का मूल्यांकन किया जा सकता है, वे वास्तव में पीबीएमसी और एचएनईसी की उत्पत्ति से सीमित हैं। जब PBMCs और hNECs विभिन्न दाताओं से प्राप्त किए जाते हैं, तो उपकला अखंडता और अलगाव सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। जब पीबीएमसी एचएनईसी के संपर्क में आते हैं, तो एलोजेनिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। इसलिए, केवल इंटरैक्शन जो प्रासंगिक हैं, घुलनशील कारकों द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत हैं जो झिल्ली आवेषण से गुजर सकते हैं, जैसा कि ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में वर्णित है। हालांकि, जब कोशिकाओं की दोनों आबादी एक ही व्यक्ति से उत्पन्न होती है, तो इस मॉडल में उपयोगिता की एक अतिरिक्त परत होती है क्योंकि एचएनईसी और पीबीएमसी आबादी के बीच पारंपरिक प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया जा सकता है, जिसमें टी-सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी और एंटीबॉडी-मध्यस्थता प्रतिक्रियाएं शामिल हैं। इसके अलावा, एपिजेनेटिक अध्ययन यह जांचने के लिए भी किया जा सकता है कि जीनोम में संशोधन साइटोकाइन जीन / प्रोटीन अभिव्यक्ति / स्राव को कैसे प्रभावित कर सकते हैं।

इसके अलावा, एक विशिष्ट आबादी की जांच करने के लिए बेसल चैंबर में विभिन्न सेल आबादी को जोड़ा जा सकता है। यह ब्याज की कोशिका आबादी (टी कोशिकाओं, एनके कोशिकाओं, मोनोसाइट्स) को अलग करके और उन्हें पीबीएमसी के बजाय बेसल चैंबर में पेश करके किया जा सकता है। हालांकि, इस मॉडल का उपयोग सेलुलर इंटरैक्शन की जांच करने के लिए नहीं किया जा सकता है, जिसके लिए झिल्ली द्वारा दो सेल आबादी के अलगाव के कारण सीधे संपर्क की आवश्यकता होती है। जैसे, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की जांच इस विवरण से सीमित हो सकती है। अंत में, यह ALI सह-संस्कृति मॉडल नाक के ऊतकों और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच crosstalk की इन विट्रो जांच के लिए एक बहुमुखी प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल एक दिशानिर्देश प्रदान करने का प्रयास करता है जो आबादी / स्थितियों को बदलने के बावजूद सहायक होगा।

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Disclosures

सभी लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम एनयूएस डिपार्टमेंट ऑफ ओटोलरींगोलॉजी और माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग में अनुसंधान कर्मचारियों को एचएनईसी संस्कृति और वायरल-संस्कृति से संबंधित काम के साथ उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम नेशनल यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, ओटोलरींगोलॉजी विभाग में सर्जनों और सर्जिकल टीम को भी धन्यवाद देना चाहते हैं, जो अध्ययन के लिए आवश्यक कोशिका और रक्त के नमूने प्रदान करने में उनकी सहायता के लिए हैं।
इस अध्ययन को राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद, सिंगापुर सं 2009 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एनएमआरसी / सीआईआरजी / 1458 / 2016 (डी यून वांग के लिए) और एमओएच-ओएफआईआरजी 19 मई -0007 (काई सेन टैन के लिए)। काई सेन टैन यूरोपीय एलर्जी और नैदानिक इम्यूनोलॉजी (EAACI) रिसर्च फैलोशिप 2019 से फैलोशिप समर्थन का एक प्राप्तकर्ता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free Thermofisher AM9260G 0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120086 1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes BD 366643 10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS Gibco 14200-075
10x PBS Vivantis PC0711
12-well Plate Corning  3513
12-well Transwell Insert Corning  3460 membrane insert
1x FACS Lysing Solution BD 349202
2.0 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120094 2 mL centrifuge tube
24-well Plate Corning  3524
24-well Transwell Insert Corning  3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue STEMCELL Technologies 07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine Sigma T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O Sigma 533998
5810R Centrifuge Eppendorf 5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes) BD 352058
70 µm Cell Strainer Corning  431751
A-4-62 Rotor Eppendorf 5810709008
Accutase Gibco A1110501 Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Avicel CL-611 FMC Biopolymer NA Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software Bio-Rad Laboratories, Inc 171STND01 Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G BD 367287
Cholera Toxin Sigma C8052
Crystal Violet  Merck C6158
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II Sigma D4693 Neutral Protease
DMEM/High Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12 Gibco-Invitrogen 11320033
dNTP Mix Promega U1515 dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine) ATCC 30-2003
EVOM voltohmmeter device WPI, Sarasota, FL, USA 300523
FACS Lysing Solution BD 349202 1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL CellStar 188271 15 mL tube
Falcon tube 50 mL CellStar 227261 50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master Roche 6402682001 qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium Research Instruments 17544203 Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)  ATCC VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Gibco 10500-064
hNESPCs Human Donors NA
Human Epithelial Growth Factor Gibco-Invitrogen PHG0314
Hydrocortisone STEMCELL Techonologies 7925 Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin Sigma I3536
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation Thermofisher L23105 Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex Merck Pte Ltd HCP2MAG-62K-PX23 Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C Sigma M4287
M-MLV 5x Buffer Promega M1705 RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase Promega M1706 Reverse Transcriptase
N-2 supplement Gibco-Invitrogen 17502-048
NIH/3T3 ATCC CRL1658
Perm/Wash Buffer BD 554723 Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Basal Medium STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) STEMCELL Techonologies 5001
Random Primers Promega C1181 Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor Promega N2511 RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer Qiagen Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine) ATCC 30-2001
STX2 electrodes WPI, Sarasota, FL, USA STX2 Electrode
T25 Flask Corning 430639
T75 Flask Corning 430641U
TPCK Trypsin Sigma T1426
Trypan Blue Hyclone SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit Qiagen 52904 Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate Corning 3894

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References

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