Summary
Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş nazal epitel hücreleri ile doğuştan gelen hücre aktivasyonu arasındaki erken etkileşimlerin araştırılmasını detaylandırır. Bağışıklık hücrelerinin bireysel alt kümeleri, viral enfeksiyonlara yanıt olarak aktivasyonlarına göre ayırt edilebilir. Daha sonra erken antiviral yanıtlar üzerindeki etkilerini belirlemek için daha fazla araştırılabilirler.
Abstract
Viral enfeksiyonlar sırasında nazal epitel tabakası ile doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki erken etkileşimler henüz keşfedilmemiş bir alan olmaya devam etmektedir. Viral enfeksiyonlarda doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyonunun önemi, yüksek doğuştan gelen T hücresi aktivasyonu sergileyen solunum yolu enfeksiyonlu hastalar daha iyi bir hastalık sonucu gösterdiğinden önemli ölçüde artmıştır. Bu nedenle, bu erken doğuştan gelen bağışıklık etkileşimlerini parçalara ayırmak, onları yöneten süreçlerin aydınlatılmasına izin verir ve viral enfeksiyonların erken ilerlemesini azaltmak veya hatta önlemek için potansiyel terapötik hedeflerin ve stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş hava yolu epitel hücreleri tarafından salgılanan faktörlerden doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin erken çapraz etkileşimini, etkileşimlerini ve aktivasyonunu incelemek için kullanılabilecek çok yönlü bir modeli detaylandırır. Temsili virüs modeli olarak bir H3N2 influenza virüsü (A / Aichi / 2 / 1968) kullanılarak, viral enfeksiyona yanıt olarak epitelden salınan çözünür faktörler tarafından aktive edilen hücrelerin alt kümelerini araştırmak için ko-kültürlü periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) doğuştan gelen hücre aktivasyonu analiz edilmiştir. Sonuçlar, hücrelerin alt kümelerini ayırt etmek için geçit stratejisini göstermektedir ve PBMC'lerin aktive olmuş popülasyonları ile kontrol ve enfekte epitel ile çapraz etkileşimleri arasındaki açık farklılıkları ortaya koymaktadır. Aktive edilen alt kümeler daha sonra fonksiyonlarını ve hücrelere özgü moleküler değişiklikleri belirlemek için daha fazla analiz edilebilir. Böyle bir çapraz konuşma araştırmasından elde edilen bulgular, viral enfeksiyonun ilerlemesini kontrol etmede ve bastırmada yararlı olan hayati doğuştan gelen hücre popülasyonlarının aktivasyonu için önemli olan faktörleri ortaya çıkarabilir. Dahası, bu faktörler evrensel olarak farklı viral hastalıklara, özellikle de yeni ortaya çıkan virüslere, bu tür virüslerin naif insan popülasyonlarında ilk dolaşıma girdiklerinde etkilerini azaltmak için uygulanabilir.
Introduction
Solunum yolu virüsleri belki de ciddi sağlık ve ekonomik yüke neden olan en yaygın patojenler arasındadır. Ortaya çıkan salgın suşların (örneğin, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) periyodik küresel salgınlarından, her yıl mevsimsel grip suşlarına kadar, virüsler halk sağlığı için sürekli bir tehdittir. Her ne kadar aşılar bu küresel halk sağlığı sorunlarına verilen yanıtın ana kütlesini oluştursa da, bu karşı önlemlerin sadece 1,2'ye yanıt verdiğini belirtmek ayıltıcıdır. Ayrıca, yeni bir bulaşıcı suşun ortaya çıkması ile aşısının başarılı bir şekilde geliştirilmesi arasındaki gecikme kaçınılmazdır3 ve virüsün yayılmasını engellemek için mevcut önlemlerin oldukça sınırlı olduğu bir döneme yol açmaktadır.
Bu gecikmeler, ekonomik ve sosyal olarak topluma uygulanan maliyetlerle daha da vurgulanmaktadır. Sadece mevsimsel grip, dolaylı maliyetlerde yaklaşık 8 milyar dolardan, tıbbi maliyetlerde 3,2 milyar dolardan ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 36,3 bin ölümden sorumludur4. Bu, aşı geliştirmeyi finanse etmek için gerekli olan araştırma maliyetlerini dikkate almadan öncedir. Epidemik salgınlar, şiddetli akut solunum sendromu koronovirüs 2'nin (SARS-CoV-2) ortaya çıkması ve hızla yayılmasının neden olduğu küresel bozulmaların kanıtladığı gibi, her yıl artan küreselleşme hızıyla birleştiğinde, toplum üzerinde daha da ciddi etkilere sahiptir5,6,7.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, daha fazla aktive olmuş doğuştan gelen T hücresi popülasyonuna sahip enfekte hastaların daha iyi bir hastalık sonucuna sahip olma eğiliminde olduğunu göstermiştir 8,9,10. Ayrıca, doğuştan gelen T hücresi popülasyonu birden fazla alt gruba ayrılır: mukozal ilişkili değişmez T (MAIT) hücreleri, Vδ1 γδ T hücreleri, Vδ2 γδ T hücreleri ve doğal öldürücü T (NKT) hücreleri. Doğuştan gelen T hücrelerinin bu alt grupları da popülasyonlarında heterojenlik sergiler ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde yer alan hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığını arttırır11. Bu nedenle, bu doğuştan gelen T hücrelerini aktive eden mekanizma ve doğuştan gelen T hücrelerinin spesifik alt gruplarının bilgisi, özellikle aşı geliştirme döneminde, bu virüslerin insan konakçısı üzerindeki bulaşıcı etkilerini azaltmak için farklı bir araştırma yolu sağlayabilir.
İnfluenza ile enfekte olmuş epitel hücreleri, doğuştan gelen T hücrelerini hızla aktive eden faktörler üretir12,13,14. Bu bulguya dayanarak, bu temassız Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) ortak kültür modeli, erken enfeksiyon sırasında enfekte burun epitel tabakası ile PBMC'ler arasındaki erken kimyasal etkileşimleri (enfekte epitel tabakası tarafından salınan çözünür faktörlerin aracılık ettiği) taklit etmeyi amaçlamaktadır. Nazal epitel tabakası (membran eklerinde kültürlenmiş) ve PBMC'ler (altındaki odada) arasındaki fiziksel ayrım ve epitel bütünlüğü, PBMC'lerin virüs tarafından doğrudan enfeksiyonunu önler ve epitel kaynaklı çözünür faktörlerin PBMC'ler üzerindeki etkilerinin ayrıntılı bir şekilde incelenmesini sağlar. Bu nedenle, tanımlanan faktörler, influenza enfeksiyonuna karşı koruyabilecek uygun doğuştan gelen T hücresi popülasyonunu indüklemede terapötik potansiyelleri açısından daha fazla araştırılabilir. Bu nedenle bu yazıda, epitel kaynaklı çözünür faktörlerden doğuştan gelen T-hücresi aktivasyonunun incelenmesi için bir ko-kültür oluşturma yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan ortam tarifleri için Tablo 1'e bakın.
NOT: 12 kuyucuklu transwell'de yetiştirilen hNECS'in, Influenza virüsü ile enfekte olduğunda çözünür faktörlerin bazal odaya kolayca ulaşması için daha optimal kalınlığa dönüştüğü bulunmuştur. Bu nedenle, ko-kültür için 12 iyi boyutlu transwell kullanılması önerilir.
1. 3T3 besleyici katmanının kurulması
- Dondurulmuş stoklardan kuruluş
- Dondurulmuş stoklardan bir kriyov / 3T3 fibroblastı çözün. Kriyovalin içeriğini 2 mL'lik tam Dulbecco'nun Minimal Esansiyel Ortamına (DMEM) ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın.
- 300 × g ve oda sıcaklığı/basıncında (rtp) 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri tam DMEM'de yeniden askıya alın.
- Tripan mavisi boyama kullanarak hücreleri sayın. Yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunun 10 μL'sine 10 μL tripan mavisi ekleyin. İyice karıştırın ve hücreleri saymak için süspansiyonun 10 μL'sini bir hemositometreye ekleyin.
- 1 × 104 hücre/cm2 yoğunluktaki tohum hücreleri, uygun bir kültür kabında (örneğin, T75 şişesi). Elde edilen kültür şişesini% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de 3 gün boyuncainkübe edin.
- Mitomisin C tedavisi
- 3 günde, akıcılığın% 60 -% 80 olduğundan emin olun, ortamı çıkarın ve hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
NOT: 3T3 besleyici katmanının tam akıcılığa ulaşmaması önemlidir; aksi takdirde, mitomisin C tedavisi etkili olmayacaktır. - Mitomisin C takviyeli tam DMEM'i şişeye ekleyin ve% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 3.5 saat boyunca inkübe edin. Mitomisin C içeren ortamı çıkarın ve hücreleri 2x 1x PBS ile yıkayın.
- 3 günde, akıcılığın% 60 -% 80 olduğundan emin olun, ortamı çıkarın ve hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- 3T3 hücrelerinin 6 delikli plakalara ekilmesi
- Hücreleri ayırmak için şişeye 3-5 dakika boyunca 3 mL 1x tripsin-EDTA ekleyin. İlişkisiz hücreleri taze bir 15 mL tüpte toplayın. 15 mL tüpü 300 × g, rtp'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın; süpernatantı atın. Hücreleri tam DMEM'de yeniden askıya alın.
- Tripan mavisi boyama kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri 7.5 × 10 5-2.5 × 10 6 hücre / kuyuda 6 delikli birplakaya tohumlayın. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO 2 atmosferindeinkübe edin.
NOT: 3T3 besleyici katmanı, hücreler sağlıklıysa hazır olarak kabul edilir. Bu noktada, insan burun epitel kök / progenitör hücrelerini (hNESPC'ler) genişleme için besleyici tabakaya tohumlayın. - Şişeye Tam DMEM ekleyin ve mitomisin C tedavisinden iyileşmek için 3T3 hücreleri için gece boyunca% 5 CO2 olan 37 ° C'de inkübe edin.
2. İnsan nazal epitel hücresi (hNEC) kültürünün oluşturulması
NOT: Üst solunum yolu enfeksiyonu semptomları olmayan hastalardan klinik örnekler alınmalıdır.
- Burun dokusunun tek hücreli süspansiyona işlenmesi
- Burun dokusunu, 100 μL / mL antibiyotik-antimikotik karışım içeren 1x Dulbecco PBS (dPBS) (Mg 2+ ve Ca2 + olmadan PBS) içinde yıkayın. Dokuyu küçük parçalar halinde kesin ve numuneyi 4 ° C'de gece boyunca sallayarak 10 mg / mL'lik nötr bir proteaz içinde tedavi edin.
- 200 × g'da 5 dakika santrifüj yapın ve santrifüjlemeden sonra süpernatantı çıkarın. Peleti 1-2 mL 1x tripsin-EDTA (37 ° C, 15 dakika) içinde inkübe edin ve tüpteki hacmin% 10'una eşit bir fetal sığır serumu hacmi ekleyerek söndürün.
- Sindirilen dokuyu pipetleme yoluyla mekanik olarak tek hücreli agregalara ayırın ve ardından elde edilen süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri tam DMEM'de yeniden askıya alın.
NOT: Bu adımdan sonra, hücre süspansiyonu, insan burun epitel kök / progenitör hücreleri (hNESPC'ler) olarak adlandırılan terminal olarak farklılaşmış hücrelerin ve kök hücrelerin bir karışımıdır. Sonraki adımların amacı, farklı hücre popülasyonlarının karışımından hNESPC popülasyonunu seçmek ve zenginleştirmektir.
- hNESPC'lerin seçimi için 3T3 besleyici katmanına tek hücreli bir süspansiyonun tohumlanması
- Hücre süspansiyonunu adım 2.1.3'ten (300 × g, 5 dakika, rtp) santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri 3-5 mL'lik orta 3'te yeniden askıya alın.
NOT: Orta 3, hNESPC'lerin seçici büyümesini teşvik etmek için formüle edilmiştir. - Tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın. 6 kuyucuklu plakadaki ortamı çıkardıktan sonra hazırlanmış 3T3 besleyici tabakayı içeren 6 delikli plaka üzerine kuyucuk başına 2mL'lik orta3 hücrede 1 x 10 6 hücreyi tohumlayın. Elde edilen ko-kültürü %5 CO 2 atmosferinde 37 °C'deinkübe edin.
NOT: Tohumlamadan sonra, hNESPC'lerin bağlanmasını etkileyeceğinden plakayı çalkalamamaya dikkat edin. - Eski ortamı tamamen çıkarıp taze ortam 3 ile değiştirerek her 2-4 günde bir ortam 3'ü (2 mL) değiştirin.
NOT: Besin maddelerini yenilemek ve aşırı asidik koşulların hNESPC'lerin büyümesini olumsuz yönde etkilemesini önlemek için ortam değiştirilir. Her ortam değişimi arasındaki aralık, ortamın ne kadar asidik (sarı) hale geldiğine bağlıdır. Ortam hızlı bir şekilde asidik hale gelirse aralıklar kısaltılmalıdır. - 7-10 gün sonra, hNESPC'lerin membran eklerine aktarılması için uygun bir akıcılıkta olduğunu gözlemleyin. hNESPC'lerin 3 farklı zaman noktasında (2 gün, 5 gün ve 10 gün) temsili morfolojisi için Şekil 1'e bakın.
- Hücre süspansiyonunu adım 2.1.3'ten (300 × g, 5 dakika, rtp) santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri 3-5 mL'lik orta 3'te yeniden askıya alın.
- hNESPC'lerin membran kesici uçlara aktarılması
NOT: Mitomisin C işlemi nedeniyle, 3T3 besleyici tabakası hNESPC genişleme periyodu boyunca yavaşça bozulacaktır. Bu, kuyunun yüzeyine zayıf bir yapışma ile sonuçlanacak ve bir pipetle kızararak yerinden çıkmalarına izin verecek ve sadece sağlıklı hNESPC'leri geride bırakacaktır.- Ortamı çıkarın ve her bir kuyucuğa 500 μL 1x dPBS ekleyin. 3T3 hücrelerini yerinden çıkarmak için hücreleri 3 kat mikropipetle yıkayın ve 1x dPBS'yi atın. Mikroskop altında, iğ şeklindeki 3T3 besleyici tabakası yerinden çıkarken yuvarlak hNESPC'lerin kaldığını gözlemleyin.
- Kuyu başına 500 μL hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de % 5 CO2 atmosferinde 5-10 dakika boyunca veya hNESPC'ler kuyu yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin.
- hNESPC süspansiyonunu, santrifüjü (300 × g, 5 dakika, rtp) toplayın ve süpernatanı çıkarın.
- Peleti orta 3'te yeniden askıya alın. Tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın. Tohum 3×, membran eki başına 150 μL orta 3 (24 delikli plaka) içinde 10 4 hücre veya membran eki başına 300 μL orta 3 (12 delikli plaka) içinde 1 × 105 hücre (Şekil 2). Hücreleri% 5'lik bir CO 2 atmosferinde 37 ° C'deinkübe edin.
- Her 2 günde bir apikal ve bazal odaların ortamını (orta 3) değiştirin. Bazal hazneye erişmek için membran ucunun destek kolları arasında bir pipet ucunda gezinin, eski ortamı çıkarın ve ardından aynı yöntemle taze ortamı yeniden takın. Apikal odaya kolayca erişilebilmesine rağmen, büyüyen hNESPC tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin.
NOT: Hücrelerin membrana yapışması için zamana ihtiyaç duyduğundan, tohumlamadan sonra apikal odadaki ortamı en az 2 gün boyunca rahatsız etmeyin.
- hNESPC'lerin hNEC'lere farklılaşması
- hNESPC'ler %100 akıcılığa ulaştığında (membran ekinde tohumlamadan yaklaşık 3-7 gün sonra), ALI kültürünü başlatın. Bazal ortamı farklılaşma ortamına değiştirin ve ortamı apikal odadan çıkarın. Ortam her 2-3 günde bir değiştirirken, Şekil 3 ve adım 2.3.5'te belirtildiği gibi, apikal odaya eklemeden sadece bazal odaya orta ekleyin.
NOT: Ortam, hNESPC'lerin ALI'deki hNEC'lere farklılaşmasını teşvik etmek için farklılaştırma ortamına dönüştürülür. hNESPC'lerin ALI'de hNEC olmak için tam olgunluğa ulaşması yaklaşık 3-4 hafta sürer, bu noktada hücreler her katmanda farklı hücre popülasyonları ile çok katmanlı bir şekilde büyümüş olur. Kirpikler ayrıca 400x'lik bir büyütmede de gözlenmelidir (kirpikler, mikroskop alanının titreşiyormuş gibi görünmesine neden olan dayak hareketleriyle tanımlanabilir). Bu noktada, hücreler ko-kültür deneyleri için kullanılmaya hazırdır. Tamamen farklılaştırılmış bir hNEC katmanının kesiti için Şekil 4'e bakın. - Olgun hNEC'ler elde ettikten sonra, ko-kültür deneyinden önce 1 hafta boyunca 2-3 günlük aralıklarla apikal oda 3x'teki hücreleri 1x dPBS ile yıkayın. Yıkama adımını bazal ortam değişiklikleri ile sinerjik hale getirin ve yıkamaları aşağıdaki gibi yapın.
- Membran ekinin apikal odasına 50 μL (24 kuyulu)/150 μL (12 kuyulu) 1x dPBS ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Farklılaşma sırasında biriken mukus ve ölü hücreleri çıkarmak için 10 dakikalık inkübasyondan sonra dPBS'yi çıkarın.
NOT: Deneyin niteliğine bağlı olarak, mukus tabakasını tamamen yıkamak için sodyum bikarbonat çözeltisi kullanılabilir. Bununla birlikte, ko-kültür deneylerinde viral enfeksiyon için, mukus tabakası korunur ve dPBS yıkama ile sadece fazla mukus çıkarılır. Bu retansiyon, gelen viral enfeksiyonla etkileşime girecek olan nazal epitelde bulunan fizyolojik mukus tabakasını taklit etmektir.
- Membran ekinin apikal odasına 50 μL (24 kuyulu)/150 μL (12 kuyulu) 1x dPBS ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Farklılaşma sırasında biriken mukus ve ölü hücreleri çıkarmak için 10 dakikalık inkübasyondan sonra dPBS'yi çıkarın.
- hNESPC'ler %100 akıcılığa ulaştığında (membran ekinde tohumlamadan yaklaşık 3-7 gün sonra), ALI kültürünü başlatın. Bazal ortamı farklılaşma ortamına değiştirin ve ortamı apikal odadan çıkarın. Ortam her 2-3 günde bir değiştirirken, Şekil 3 ve adım 2.3.5'te belirtildiği gibi, apikal odaya eklemeden sadece bazal odaya orta ekleyin.
3. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü
NOT: Epitel bütünlüğünün doğrulanması, sağlam ve sağlıklı bir epitel tabakasının elde edilmesini sağlamak için önemlidir. Sağlam bir epitel tabakası, bir voltohmmetre kullanılarak 4 rastgele kuyu üzerinde gerçekleştirilen TEER ölçümü ile belirlenir.
- Elektrotu% 70 etanol ile durulayın ve steriliteyi sağlamak için kullanmadan önce 15 dakika boyunca ultraviyole ışıkla sterilize edin. Sterilizasyondan sonra 1x dPBS ile durulayın.
- Membran ekinin apikal odasına 100 μL (24 kuyucuk için) veya 300 μL (12 delikli için) 1x dPBS ekleyin. Plakayı 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin; ardından dPBS'yi kaldırın.
- Ölçülecek her kuyu için, önceden ısıtılmış (37 ° C'ye kadar) farklılaşma ortamının 1 mL (24 kuyucuk için) veya 3 mL (12 kuyucuk için) ile kullanılmayan bir kuyu hazırlayın. Membran ekini hazırlanan kuyuya yerleştirin ve apikal odaya 200 μL (24 kuyucuk için) veya 600 μL (12 kuyucuk için) önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı ekleyin. 15 dakika boyunca 37 ° C'de denge (eklenen virüs türünün kuluçka sıcaklığına bağlı olarak, örneğin, İnfluenza için 35 ° C).
NOT: TEER'in hesaplanması için aynı şekilde boş (boş membran girişi) hazırlayın. - Önceden ısıtılmış farklılaşma ortamının 15 mL'lik bir tüpünü de aynı sıcaklıkta 15 dakika boyunca dengeleyin. Elektrotları 15 mL tüpe yerleştirin ve voltohmmetreyi açın.
NOT: Bu noktada, elektrotlar aynı ortamda olduğu için okuma 0 direnç olmalıdır. Başka bir okuma elde edilirse, okuma 0 olana kadar 15 mL tüpteki elektrodu dengeleyin. - Boşluktan başlayarak, elektrotları her bir kuyucuğa, bir elektrot apikal oda ortamına, diğeri bazal oda ortamına batırılacak şekilde konumlandırın. Okumayı yalnızca en az 5 dakikalık bir süre boyunca sürekli bir okuma elde edildiğinde kaydedin.
- Her ölçümden sonra, bir sonraki ölçümden önce elektrodu PBS ile yıkayın. İyi test edilen her bir numune için, membranın farklı konumlarında üç numune için ölçümler yapın. Her numunenin net TEER'sini hesaplamak için, boş membran eki tarafından verilen arka plan direncini her ölçümden çıkarın.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak bir kuyu için toplam TEER okumasını hesaplayın:
Epitel Bütünlüğü (Ωcm2) = Net TEER (ohm) × Membran Alanı (cm2)
NOT: Viral enfeksiyon deneyleri için hNEC'lerin TEER değerleri >1000 Ωcm213,15,16 olmalıdır.
4. Periferik kan monositlerinin ve NK hücrelerinin izolasyonu
NOT: Kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden alınmalı ve izolasyonun aynı gününde kullanılmalıdır.
- 10 mL kan alma tüplerinde her donörden 30-40 mL tam kan toplayın.
- PBMC'leri yoğunluk gradyanı santrifüjleme kullanarak izole edin ve aşağıdaki adımlardan sonra PBMC'leri buffy kattan elde edin (ayrıca Malzeme Tablosu'na bakın).
- Eşit hacimli dengeli tuz çözeltisi (PBS) ile seyreltmeden önce kan toplama tüpünden ~ 10 mL kanı bir vakumlayıcıda iyice karıştırın.
- 50 mL'lik bir tüpün tabanına 15 mL yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin.
NOT: Yoğunluk gradyanı ortamının seyreltilmiş kana oranı 2:3-3.5 olmalıdır. - Tüpü 45° eğerek ve seyreltilmiş kanın tüpün iç duvarına damla damla düşmesine izin vererek bir pipet tabancası ile yoğunluk gradyanı ortamında (dağıtım ayarı mümkün olan en düşük seviyeye ayarlanmış) 35 mL seyreltilmiş kan tabakası, böylece yoğunluk gradyan ortamının tabakası bozulmaz.
- Santrifüj lizatı 500 × g, 18-20 °C'de 30 dakika boyunca (fren: kapalı). Alt tabakayı rahatsız etmeden üst plazma tabakasını dikkatlice çıkarın ve atın.
- Buffy ceketi, kırmızı kan hücresi tabakasını, gradyan yoğunluğu orta tabakasını veya buffy ceketini karıştırmadan yeni bir tüpe aktarın. Buffy ceket yeni bir 50 mL tüpte toplandıktan sonra, hacmi 1x PBS ile 50 mL'ye yükseltin.
- Santrifüj, 800 × g, 18-20 °C, 8 dakika (fren: kapalı) hızında lizat yapın ve süpernatantı bir pipet tabancasıyla çıkarın. Hücre peletini 50 mL 1x PBS ile yeniden askıya alın ve trombositleri çıkarmak için 120 × g, 18-20 ° C, 10 dakika santrifüj yapın.
- Süpernatantı pipetleyerek, hücre peletini rahatsız etmeden atın.
NOT: Hücre peleti gevşek olabileceğinden, süpernatantın dökülerek atılması tavsiye edilmez. - Hücre peletini tam RPMI (Roswell Park Memorial Institute) ortamı ile yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücre süspansiyonunun 10 μL'sine metilen mavisi ile% 3 asetik asitten 10 μL ekleyerek bir hücre sayımı yapın. İyice karıştırın ve hücreleri saymak için karışımın 10 μL'sini bir hemositometreye ekleyin.
- Tam RPMI ortamına sahip PBMC'leri 2 × 10 6/mL (24 kuyucuk için) veya 4 × 106/mL (12 kuyucuk için) yoğunluğa kadar seyreltin.
5. hNEC Viral enfeksiyon ve hNEC'ye geçiş: PBMC ko-kültürü
NOT: H3N2 (A/Aichi/2/1968) bu protokolde enfeksiyonun temsili suşu olarak kullanılmıştır. Bu protokolde temsili MOI olarak 0.1 enfeksiyon çokluğu (MOI) kullanılmıştır.
- 0. Gün (hNEC'lerin enfeksiyonu)
NOT: Aynı donörden yetiştirilen hNEC'lerden bir kuyu, deneyde kullanılan her kuyu için temsili bir hücre sayısı elde etmek için kullanılır.- Temsili kuyuda, membran ekinin apikal odasına 150 μL 1x tripsin-EDTA ve bazal odaya 350 μL 1x tripsin-EDTA ekleyin ve 10 dakika boyunca veya hücreler zardan ayrılana kadar 37 ° C'de inkübe edin.
- Membran üzerindeki hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın ve süspansiyonu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Tripsin aktivitesini söndürmek için 200 μL tam DMEM ekleyin. Kuyucuk başına hücre sayısını elde etmek için tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın.
- Kuyucuk başına hücre sayısına göre virüsün gerekli MOI'sini hesaplayın ve virüs stokunu buz üzerinde tam RPMI ile buna göre seyreltin.
NOT: MOI 0.1 × 10 kuyu başına6 hNEC = 1.26 × 30 μL'de kuyu başına 105 H3N2 viral partikül (24 kuyucuk için)/100 μL (12 kuyucuk için) - Enfeksiyon deneyi için kalan kuyucuklar için, membran eklerinin apikal odalarına 50 μL (24 kuyucuk için) / 150 μL (12 kuyucuk için) 1x dPBS ekleyin, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve 1x dPBS'yi çıkarın.
- Membran uçlarındaki bazal ortamı, uçları kuyucuklara tam RPMI eklenmiş yeni bir plakaya aktararak RPMI ortamını tamamlamak için değiştirin (350 μL (24 delikli için)/700 μL (12 delikli için)).
NOT: hNESPC'ler hNEC'lere tamamen farklılaştığında, ortam RPMI 12'ye geçirildiğinde morfolojide veya organizasyonda herhangi bir değişiklik olmadan,72 saate kadar farklı ortamlara toleranslıdır / izin verir. RPMI, PBMC popülasyonunun büyümesini ve bakımını desteklemek için kullanılır. - Virüs inokulunun hazırlanan 30 μL (24 kuyucuklu) / 100 μL (12 kuyucuklu için) membran ekinin apikal odasına ekleyin, 35 ° C'de% 5 CO2 atmosferinde 1 saat boyunca inkübe edin ve viral inokulu apikal odadan çıkarın.
- Membran kesici ucun bazal ortamını taze tam RPMI ortamına değiştirin ve 24 saat boyunca %5 CO 2 atmosferinde 35 °C'de inkübe edin.
- 1. Gün (hNEC'lerin + PBMC'lerin ortak kültürünün kurulması)
- PBMC süspansiyonunu 0. Gün'den itibaren enfekte olmamış veya enfekte olmuş hNEC'lerin her bir kuyucuğunun bazal odasına doğrudan ekleyerek (24 kuyucuklu plakalar için 150 μL (24 kuyucuklu) / 300 μL (12 kuyucuklu için) tam RPMI ortamının 150 μL'sinde (24 kuyucuklu plakalar için 10 6 ve 12 delikli plakalar için 3 ×× 106) gerekli PBMC sayısını tohumlayın. 24/48 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
NOT: Ko-kültürün kurulmasından sonra bazal odadaki son hacim 500 μL (24 kuyu için)/1000 μL'dir (12 kuyucuk için).
- PBMC süspansiyonunu 0. Gün'den itibaren enfekte olmamış veya enfekte olmuş hNEC'lerin her bir kuyucuğunun bazal odasına doğrudan ekleyerek (24 kuyucuklu plakalar için 150 μL (24 kuyucuklu) / 300 μL (12 kuyucuklu için) tam RPMI ortamının 150 μL'sinde (24 kuyucuklu plakalar için 10 6 ve 12 delikli plakalar için 3 ×× 106) gerekli PBMC sayısını tohumlayın. 24/48 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- 2-3. Gün (PBMC'lerin 48/72 saat viral enfeksiyon sonrası toplanması)
- Apikal süpernatantların toplanması (48/72 saat post-viral enfeksiyon)
- Her apikal odaya 50 μL (24 kuyucuk için)/150 μL (12 kuyucuk için) 1x dPBS ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. 1x dPBS'yi 1,5 mL tüplerde toplayın. Yeni bir 1.5 mL tüpte plak testi için süpernatantın Aliquot 25 μL (24 kuyucuk için) / 50 μL (12 kuyucuk için) ve hemen hem stoğu hem de alikotları -80 ° C'de dondurun.
- hNEC'lerden hücresel RNA toplanması (48/72 h post-viral enfeksiyon)
- Membran ekini temiz bir kuyucuğa aktarın, apikal odaya 300 μL (24 kuyucuk için)/600 μL (12 kuyucuk için) RNA lizis tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca rtp'de inkübe edin. Süpernatantı 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve moleküler analiz için RNA ekstraksiyonuna kadar -80 ° C'de saklayın.
- PBMC'lerin toplanması (48/72 saat post-viral enfeksiyon)
- Steril pipet ucunun geniş tabanıyla, kuyu yüzeyine yapışmış olabilecek aktif PBMC'leri yerinden çıkarmak için kuyunun yüzeyini yavaşça kazıyın. PBMC'leri içeren bazal ortamı 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
- Kuyucukları 300 μL 1x dPBS ile 2 kat yıkayın ve yıkamayı aynı 2 mL tüpte toplayın. 2 mL tüpü (500 × g, 5 dakika, rtp) santrifüj edin ve süpernatantı hücre peletini rahatsız etmeden taze bir 2 mL tüpte toplayın. Sitokin ve kemokin analizi için süpernatantı -80 ° C'de saklayın; hücre peletini 200 μL 1x dPBS'de yeniden askıya alın.
- Apikal süpernatantların toplanması (48/72 saat post-viral enfeksiyon)
6. Akış sitometrisi
NOT: Protokolün bu bölümü, adım 5.3.3.2'deki PBMC hücre askıya alma işlemi kullanılarak doğrudan önceki bölümden devam ettirilir. Bu bölümdeki aşağıdaki adımlarda ışığa en az düzeyde maruz kaldığınızdan emin olun. Yüzey boyama işaretleyicilerinden oluşan örnek bir panel Tablo 2'de bulunabilir.
- Yüzey boyama
- Yeniden askıya alınmış PBMC hücre peletini 96 V'luk bir alt kuyu plakasına aktarın. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat yapın ve süpernatanı çıkarın.
- Tüm PBMC'leri ("lekesiz" hariç) rtp'de 15 dakika boyunca 100 μL canlılık lekesi ile inkübe edin. 150 μL Manyetik-Aktif Hücre Sıralama (MACS) tamponu ile 200 μL'ye kadar doldurun. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat yapar ve süpernatanı atın.
- Uygun seyreltme oranlarına ve reaksiyon başına 50 μL'lik bir son hacme sahip ilgili yüzey boyama antikorlarından oluşan bir panel hazırlayın (son hacmi elde etmek için MACS tamponu ile doldurun). Çok kanallı pipet kullanarak hazırlanan antikor karışımının 50 μL'sini hücrelere ekleyerek yüzey boyama işlemini gerçekleştirin. Karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 150 μL MACS tamponu ekleyerek yıkayın. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat yapın ve süpernatanı atın. Hücre içi boyama gerekli değilse, adım 6.3'te doğrudan 15 dakikalık inkübasyona geçin.
- Hücre içi boyama (Gerekirse)
- Her bir oyuğa 100 μL sabitleme ve geçirgenlik çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Kuyucukları 100 μL 1x MACS tamponuyla doldurun.
- Santrifüj (800 × g, 3 dk, 25 °C) ve süpernatanı çıkarın. 200 μL 1x Permeabilizasyon Yıkama tamponu ekleyerek yıkamayı tekrarlayın. Santrifüj (500 × g, 3 dk, 25 °C) ve süpernatanı çıkarın.
- 1x Permeabilizasyon Yıkama tamponu kullanarak 50 μL'lik son bir hacim elde etmek için ilgili antikor panelinin seyreltmelerini hazırlayın. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. 200 μL 1x Geçirgenleştirme Yıkama tamponu ekleyin.
- Hücreleri santrifüj edin (800 × g, 3 dakika, 4 ° C) ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri 100 μL floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama tamponunda yeniden askıya alın.
- Pipet, her bir kuyucuğun içine 200 μL'lik bir lizör çözeltisi yerleştirin. RTP'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat eder ve süpernatanı atar.
- Hücre peletlerini 200 μL MACS tamponunda yeniden askıya alın. Daha önce13 olarak belirtilen ayarlara uygun olarak akış sitometrisi yapın veya karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
7. Sitokin ve kemokin düzeylerinin belirlenmesi
- Üreticinin protokolü18'e göre bir immünoloji multipleks testi kullanarak bazal oda süpernatanının 25 μL'sini işleyin.
- Standart eğri için eğriye uyan bir algoritma (5 parametre) kullanan multipleks yönetici yazılımını kullanarak her analitin konsantrasyonunu hesaplayın.
8. Viral kontaminasyonun değerlendirilmesi
- 4 set çözelti üzerinde bir ekstraksiyon kiti kullanarak viral RNA'yı ekstrakte edin: stok H3N2 çözeltisi, enfeksiyon için MOI 0.1 seyreltme, MOI 0.1'in 10x seri seyreltilmesi ve örneklerden bazal ortam (hem 48 hem de 72 saat viral enfeksiyon sonrası)12.
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için hedef olarak yapısal olmayan gen (NS1) ve matrisi (M1) seçin (temsili deneyde kullanılan primerler için Malzeme Tablosuna bakınız).
- NS1 ve M1 seviyelerini viral mevcudiyet için bir vekil olarak ölçmek üzere kantitatif PCR (qPCR) gerçekleştirmeden önce viral RNA'yı cDNA'ya dönüştürmek için ters transkripsiyon-PCR (RT-PCR) (42 ° C, 60 dakika) gerçekleştirin ve seviyeleri MOI 0.1 aliquot'un 10x seri seyreltilmesinde gerçekleştirilen RT-qPCR'den elde edilen standart eğri ile ilişkilendirin. Reaksiyon karışımlarının bileşimi için Tablo 3'e bakın ve aşağıdaki koşulları kullanın: 10 dakika boyunca 95 ° C'de ön inkübasyon, ardından 40 döngü için 3 adımlı bir amplifikasyon: 10 s için 95 ° C, 10 s için 60 ° C, 30 s için 72 ° C; erime eğrisi: 10 s için 95 °C, 60 s için 65 °C ve 1 s için 97 °C.
9. Plak tahlili
- 0. Gün: MDCK'nin (Madin Darby Canine Böbrek) 24 kuyucuklu plakalara ekilmesi
- Ortamı, birleşik MDCK hücrelerinin T75 Flask'ından çıkarın. Tüm serum izlerini gidermek için 2x'i 1x PBS ile yıkayın. MDCK hücrelerini, 10 mL tripsin ekleyerek ve hücreler ayrılana kadar 20-30 dakika boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe ederek tripsinize edin.
NOT: Şişeye dokunmayın, çünkü bu durum kümelenmeye neden olabilir. - Hücre süspansiyonunu, 2 mL'lik tam Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) içeren 15 mL'lik bir tüpe pipetleyin. Santrifüj (300 × g, 5 dakika, rtp) ve süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri 6 mL'lik tam EMEM'de yeniden askıya alın. Tripan mavisi boyama ile hücreleri sayın.
- MDCK hücre süspansiyonunu 1 × 105 hücre / mL konsantrasyona kadar seyreltin ve steril 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda seyreltilmiş süspansiyonun 1 mL'sini tohumlayın. Her bir kuyucukta birleştirilmiş bir tek katmanlı MDCK hücresi elde etmek için24 saat boyunca% 5'lik bir CO 2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin.
- Ortamı, birleşik MDCK hücrelerinin T75 Flask'ından çıkarın. Tüm serum izlerini gidermek için 2x'i 1x PBS ile yıkayın. MDCK hücrelerini, 10 mL tripsin ekleyerek ve hücreler ayrılana kadar 20-30 dakika boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe ederek tripsinize edin.
- 1. Gün: MDCK hücrelerinin enfeksiyonu
- Enfeksiyon ortamını hazırlayın. Ortamı 24 delikli plakadaki MDCK tek katmanından çıkarın ve 2x'i 1x dPBS ile yıkayın. İkinci yıkama için, virüsün seri seyreltmelerini hazırlarken PBS'yi kuyucuklarda bırakın.
- Virüs örneklerini buz üzerinde çözün ve 10-1'den 10-6'ya kadar seri seyreltmeler elde etmek için 24 delikli bir plakada seri olarak seyreltin.
NOT: Örnek olarak, her bir oyuğun 270 μL enfeksiyon ortamı içeren 24 delikli bir plakaya doldurun. - Sıradaki ilk kuyucuğa 30 μL virüs örneği ekleyin. Yeni bir pipet ucu ile iyice karıştırın ve numuneyi 10 kat seyreltmek için sıradaki bir sonraki kuyucuğa aktarın. 10-6 seyreltme elde edilene kadar devam edin; Tüm virüs örnekleri için 9.2.1-9.2.3 adımlarını uygulayın.
- PBS'yi MDCK plakasından çıkarın ve hazırlanan viral seyreltmelerin 100 μL'si ile çift olarak enfekte edin. Kontrol kuyuları için, enfeksiyon ortamının 100 μL'sini ekleyin (viral numune olmadan). 35 °C'de %5 CO2 atmosferinde 1 saat boyunca inkübe edin ve her 15 dakikada bir kuru lekeleri ortadan kaldırmak için plakayı sallayın.
- Viral inokulumu çıkarın ve her kuyucuk için 1 mL sıvı kaplama ekleyin. 35 °C'de %5 CO2 atmosferinde 72 saat boyunca inkübe edin.
- 4. Gün (enfeksiyon sonrası 72 saat): plak görselleştirme
- Sıvı kaplamayı çıkarın ve hücreleri% 4 formaldehit ile 1 saat boyunca 1x PBS'de sabitleyin. Formaldehit çözeltisini çıkarın ve 1x PBS veya damıtılmış su ile bir kez yıkayın.
- 15 dakika boyunca% 1 kristal menekşe çözeltisi ekleyerek sabit hücreleri lekeleyin. Kristal menekşe boyasını çıkarın ve hücreleri akan suyla yıkayın. Plakayı rtp'de kurulayın.
- Kuruduktan sonra, plakları sayın ve viral titreyi aşağıdaki formüle göre hesaplayın:
Seyreltme faktörü × plak sayısı = 100 μL'de plak - şekillendirme ünitelerinin sayısı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konvansiyonel T hücreleri, viral klirensi kolaylaştırmak için viral enfeksiyona karşı adaptif immün yanıtın ana repertuarını oluştursa da, doğuştan gelen T hücresi popülasyonu, daha sonraki bir aşamada etkili klirens için viral yükü bastırmak için daha geniş bir spektrumda çalışır. Bu nedenle, bu protokol özellikle doğuştan gelen T hücrelerini, aktivasyonlarını ve influenza enfeksiyonunu takiben fonksiyonel popülasyonlarını, aynı donörden epitel ve bağışıklık hücresi örneklerine ihtiyaç duymadan incelemek için sağlam bir koşul yaratır. Bu protokol diğer virüslere de uygulanabilir, ancak apikal salınımlı virüslerle sınırlı olabilir, yani PBMC bölmesiyle temas etmek için bazal tabakaya hiçbir virüs girmemelidir.
Şekil 1'deki temsili sonuçlara dayanarak, bu protokol bir 3T3 besleyici katmanındaki birincil hücre süspansiyonundan yetiştirilen hNESPC popülasyonlarının elde edilmesine yardımcı olabilir. Şekil 1, hNESPC'lerin 3T3 besleyici katmanında büyüdükçe beklenen ilerlemesinin bir örneğini sunmaktadır. Bu hücreler, fonksiyonel siliyer ve kadeh hücreleri ile tamamlanan çok katmanlı hNEC'ler elde etmek için ALI kültüründe farklılaşma için kullanılacaktır (Şekil 4). HNEC'ler kullanılarak, doğuştan gelen T-hücresi aktivasyonu, akış sitometrisi kullanılarak araştırılabilir. Şekil 5'te gösterilen sonuçlar, influenza virüsü ile enfekte olmuş hNEC'leri içeren ko-kültürde anlamlı olarak artmış olan MAIT hücresi, γδ-T hücresi ve NK hücre popülasyonlarının tespitini göstermektedir. Bu kurulum daha sonra influenza virüsünün diğer suşlarına, suşlar arasındaki evrensel popülasyonu, diğer virüsleri ve doğuştan gelen T hücresi popülasyonlarını aktive etme yeteneklerini ortaya çıkarmak için uygulanabilir. Ek olarak, tespit paneli, enfekte epitel hücreleri ile ko-kültür koşulları altında ilgili aktivasyonlarını gözlemlemek için ilgili doğuştan gelen bağışıklık hücresi popülasyonuna göre özelleştirilebilir.
Şekil 1: Tohumlamadan 2/5/10 gün sonra 3T3 besleyici katmanında yetiştirilen hNESPC'ler. 2. Gün: 3T3 besleyici katmanında tohumlamadan 2 gün sonra gözlemlenmesi gereken hNESPC'lerin adacıklarına dikkat edin (bir örnek beyaz bir okla ayrılmıştır). 5. Gün: 2. günde gözlemlenen adacıklar artık daha büyük olmalıdır (hNESPC'lerin adalarının örnekleri yeşil dairelerle sınırlandırılmıştır) ve 3T3 tabakasının dejenere olduğu gözlemlenmelidir. 10. Gün: hNECPS'ler, 3T3 hücrelerinin çok az veya hiç görünmediği tüm plakaya hakim olmalıdır. 2. Gün ve 5. Gün için ölçek çubukları = 200x büyütmeye dayalı olarak 50 μm, 10. Gün için ölçek çubuğu = 100x büyütmeye dayalı olarak 100 μm. Kısaltma: hNESPCs = insan burun epiteli kök / progenitör hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: 24 delikli ve 12 delikli plakalardaki membran ekleri için kuyu diyagramları. Her bölme için kullanılacak orta hacme dikkat edin. hNESPC'ler membran eklerinin apikal odalarına ekilir. Kısaltma: hNESPCs = insan burun epiteli kök / progenitör hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ALI ko-kültür kuruluşu için 24 delikli ve 12 delikli plakalardaki membran ekleri için kuyu diyagramları. Her bölme için kullanılacak orta hacme dikkat edin. Orta değişiklikler arasındaki farklı aralıklar (2 gün/3 gün) için kullanılacak orta hacimdeki farklılıklara dikkat edin. Kısaltma: ALI = hava-sıvı arayüzü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: β4-Tubulin ve MUC5AC bir hNEC tabakasının birlikte boyanması. β4-Tubulin yeşil, MUC5AC ise kırmızı renkte boyanır. Çekirdekler DAPI ile mavi renkte boyanır. MUC5AC, mukus üreten kadeh hücrelerinin varlığını gösterirken, β4-tübülin, siliyer hücrelerde kirpiklerin varlığını gösterir. Ölçek çubuğu = 600x büyütmeye dayalı olarak 20 μm. Kısaltmalar: hNEC = insan burun epitel hücresi; MUC5AC = müsin 5AC; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 24 saat boyunca burun epiteli veya influenza ile enfekte epitel olsun veya olmasın inkübe edilen PBMC'lerin temsili sonuçları. MAIT, Vδ1 T hücreleri, Vδ2 T hücreleri ve NK hücrelerinin aktivasyonu, Vα 7.2 TCR, Vδ1 TCR, Vδ2 TCR, CD56 ve CD69 boyama dahil olmak üzere hücre tipine özgü belirteçler tarafından belirlendi. Kapıların üzerindeki değerler CD69-pozitif hücrelerin yüzdesini gösterir. Kısaltmalar: PBMC'ler = periferik kan mononükleer hücreleri; Epith = nazal epitel; GRIP-Epith = influenza ile enfekte epitel; MAIT = mukozal ilişkili değişmez T hücreleri; NK = doğal katil; TCR = T-hücresi reseptörü; CD = farklılaşma kümesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Orta | Yemek tarifi | Kompozisyon | Yorum |
| Orta 3 | DMEM/Besin Karışımı F-12 | 500 mL | |
| İnsan Epitelyal Büyüme Faktörü | 5 ng/mL | ||
| Insülin | 2,5 μg/mL | ||
| Kolera Toksini | 0,1 nM | ||
| Hidrokortizon | 0,5 μg/mL | ||
| 3,3',5-triiodo-l-tironin | 2 nM | ||
| N-2 takviyesi | 5 mL | 10 μL/mL | |
| Antibiyotik-Antimikotik | 5 mL | ||
| Farklılaşma Medyası | PneumaCult-ALI Bazal Ortam | 441 mL | |
| PneumaCult-ALI 10x Takviyesi | 50 mL | ||
| Hidrokortizon Çözeltisi (200x) | 2,5 mL | ||
| %0.2 (2 mg/mL; 1000 IU/mL) Fosfat Tamponlu Tuzlu Suda Heparin Sodyum Tuzu | 1 mL | ||
| Antibiyotik-Antimikotik (100x) | 5 mL | ||
| PneumaCult-ALI Bakım Eki (100x) | 500 μL | Sadece kullanımdan hemen önce eklenmelidir | |
| Dulbecco'nun Minimal Temel Ortamını (DMEM) tamamlayın | DMEM/Yüksek Glikoz | 450 mL | |
| Isı ile inaktive Fetal Sığır Serumu | 50 mL | ||
| Antibiyotik-Antimikotik (100x) | 5 mL | ||
| Komple Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Orta | RPMI 1640 (w L-Glutamin) | 445 dev/dak | |
| Isı ile inaktive Fetal Sığır Serumu | 50 mL | ||
| Antibiyotik-Antimikotik (100x) | 5 mL | ||
| Complete Eagle'ın Minimum Temel Ortamı (EMEM) | EMEM (w L-Glutamin) | 450 mL | |
| Isı ile inaktive Fetal Sığır Serumu | 50 mL | ||
| Enfeksiyon Ortamı | EMEM (w L-Glutamin) | 4 mL | |
| TPCK Tripsin (500 μg/mL) | 8 μL | 1 μg/mL'lik Nihai TPCK Tripsin Konsantrasyonu | |
| Manyetikle Aktive Edilmiş Hücre Sıralama Tamponu | 1x PBS | 498 milyon L | |
| 0,5 milyon EDTA | 2 mL | ||
| BSA (Doku Kültürü Sınıfı) | 2.5 gr | ||
| Mitomisin C-Takviyeli Komple DMEM | Komple DMEM | 10 mL | |
| Mitomisin C | 500 μL | Mitomisin C (10 μg/mL) |
Tablo 1: Kullanılan medya tarifi.
| Hücre yüzeyi işaretleyicisi | Florofor |
| Vδ1 T-hücresi reseptörü (TCR) | Floresein izotiyosiyanat (FITC) |
| Vδ2 TCR | Peridinin-kolorfil-protein (PerCP) |
| CD3 | V500 sürümü |
| CD8 | Allophycocyanin-Siyanin 7 boya (APC-Cy7) |
| CD14 | Fikoeritrin (PE)-CF594 |
| CD56 | Fikoeritrin (PE)-Siyanin 7 (Cy7) |
| CD69 | Parlak Menekşe 421 (BV421) |
| CD83 | Allophycocyanin (APC) |
| CD161 | Parlak Menekşe 605 (BV605) |
| Vα 7,2 | Fikoeritrin (PE) |
| CD38 | Parlak Ultraviyole 395 (BUV395) |
Tablo 2: Numune yüzey boyama belirteçleri.
| qPCR Reaksiyon Karışımı | qPCR Master Mix | 5 μL |
| Nükleaz İçermeyen Su | 3 μL | |
| İleri Astar (1 mM) | 0,5 μL | |
| Ters Astar (1 mM) | 0,5 μL | |
| cDNA (12.5 ng/μL) | 1 μL | |
| Toplam Reaksiyon Hacmi | 10 μL | |
| RT-PCR Reaksiyon Karışımı | RT-PCR 5x Arabellek | 2,5 μL |
| Rastgele Astarlar (500 ng/μL) | 0,2 μL | |
| RNaz İnhibitörü | 0,625 μL | |
| dNTP Karışımı | 2,5 μL | |
| Ters Transkriptaz | 0,5 μL | |
| RNA (200 ng/μL) | 1 μL | |
| Nükleaz İçermeyen Su | 12.675 μL | |
| Toplam Reaksiyon Hacmi | 20 μL |
Tablo 3: Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve kantitatif PCR (qPCR) reaksiyon karışımları için reçete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virüslere karşı doğuştan gelen immün yanıtlar, antiviral yönetimde az araştırılan bir çalışma alanıdır. Hava yolu epitel hücreleri ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, bir enfeksiyon sırasında viral replikasyonu baskılamak için uyum içinde çalışır, ayrıca viral yük kontrol altında tutulmazsa aşırı aktif adaptif yanıtın belirleyicisi olarak hizmet eder12,13,17. Bununla birlikte, uygun bir antiviral yanıt vermek için doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin aktivasyonunu araştırmak için epitelyal-doğuştan gelen bağışıklık çapraz etkileşiminin incelenmesi için ilgili bir insan modelinin geliştirilmesi bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu ALI ortak kültür modeli, nazal epitel tabakası ve bağışıklık hücreleri arasındaki bir dizi etkileşimi değerlendirmek için kullanılabilecek çok yönlü bir tekniği temsil eder. Bu model in-vitro-diferansiye hNEC'leri, akış sitometrisi yoluyla PBMC aktivasyon analizini ve viral enfeksiyonu birleştirdiğinden, bu protokolün başarısını sağlamak için önemli adımların çoğu açıkça sınırlandırılmıştır. Ek olarak, hem üst hem de alt solunum yollarından in-vitro-farklılaşmış hücrelerin kullanılabileceği hava yolunun ilgili kısmına daha fazla modifikasyon yapılabilir ve protokole başka bir çok yönlülük katmanı eklenir.
Bununla birlikte, viral enfeksiyonda epitel-immün hücre çapraz konuşması ile çalışırken, virüslerin hNEC'ler tarafından salınan erken lokal epitel kaynaklı çözünür faktörleri tanımlamak için PBMC'lerle doğrudan etkileşime girmemesi kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, bu model polarize viral salınımlı virüsleri incelemek için daha uygundur, burada virüsler sadece apikal yüzeyden apikal odaya tomurcuklanır, örneğin influenza virüsleri12 ve SARS-CoV-2 virüsü19. Ek olarak, apikal salınımlı virüslerin deneyi tehlikeye atan bazal odaya sızmasını önlemek için, yeterli kalınlıkta sağlam bir epitel tabakası hayati önem taşımaktadır. Bu nedenle, TEER ölçümünün ve viral RNA nicelleştirmesinin yapılması, sonuçlarınbazal oda 13,16,20'ye viral sızıntılardan arındırılmış olmasını sağlamak için önemlidir. >1000'in bir TEER okuması, polarize salınımlı virüsler için uygun bozulmamış çok katmanlı bir hücre anlamına gelir; bazal ortam herhangi bir viral RNA kontaminasyonundan arındırılmış olmalıdır13,15,16. Bununla birlikte, rinovirüsler gibi çift yönlü salınımlı virüsler için modelin faydası araştırılmaya devam etmektedir16. Bu tür virüsler soylarını polarize bir şekilde serbest bırakmakla sınırlı değildir ve epitelin hem apikal hem de bazal bölgelerine çift yönlü olarak yeni virüsler salabilirler. Bu modelin polarize olmayan salınıma sahip virüslere uygulanabilmesi için daha fazla optimizasyon gereklidir.
Bu protokol farklı bireylerden insan örnekleriyle çalışmayı içerdiğinden, iki hNEC örneği aynı özellikleri ve yanıtları sergileyemez12,16. Örneğin, terminal olarak farklılaşmış hNEC tabakası tarafından üretilen mukusun viskozitesi büyük ölçüde farklılık gösterebilir. Kirpik gelişiminin hızı da farklı olabilir. Bu nedenle, bu protokolde belirtilen yönergelere bağlı kalarak bir miktar esneklik uygulamak önemlidir. Epitel hücre hatlarını kullanmak kesinlikle mümkün olsa da, bu, epitel tabakasının farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığını (mukus, farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimler) ortadan kaldıracaktır; bu, epitel çapraz konuşmasının PBMC'lerin tepkilerini nasıl etkilediğinin araştırılması için ideal olacaktır. Hücrelerin çok katmanlı olduğu burun dokularının fizyolojisini taklit etmek için birincil bir hücre çizgisi gereklidir ve farklı hücre tipleri kendi bireysel nişlerine lokalize edilir, ancak değişkenlik bir sorun olabilir. Bu bakımdan değişkenlik, heterojen hücre popülasyonunu ayırt etmek ve ayırmak için tek hücreli RNA dizilimi kullanılarak aşılabilir.
Değerlendirilebilecek etkileşim türleri aslında PBMC'lerin ve hNEC'lerin kökeni ile sınırlıdır. PBMC'ler ve hNEC'ler farklı donörlerden elde edildiğinde, epitel bütünlüğünün ve ayrılmasının sağlanması çok önemlidir. PBMC'ler hNEC'lerle temas ettiğinde, allojenik immün reaksiyonlar meydana gelebilir. Bu nedenle, ilgili olan tek etkileşim, yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi, membran eklerinden geçebilen çözünür faktörlerin aracılık ettiği etkileşimlerdir. Bununla birlikte, her iki hücre popülasyonu da aynı bireyden kaynaklandığında, bu model, hNEC'ler ve PBMC popülasyonu arasındaki geleneksel bağışıklık hücresi reaksiyonları, T hücresi aracılı sitotoksisite ve antikor aracılı yanıtlar da dahil olmak üzere artık değerlendirilebildiği için ek bir fayda katmanına sahiptir. Ek olarak, genomdaki değişikliklerin sitokin geni / protein ekspresyonu / sekresyonunu nasıl etkileyebileceğini incelemek için epigenetik çalışmalar da yapılabilir.
Ayrıca, belirli bir popülasyonu daha fazla araştırmak için bazal odaya farklı hücre popülasyonları eklenebilir. Bu, ilgilenilen hücre popülasyonlarını (T hücreleri, NK hücreleri, monositler) izole ederek ve PBMC'ler yerine bazal odaya sokarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu model, iki hücre popülasyonunun membran tarafından ayrılması nedeniyle doğrudan temas gerektiren hücresel etkileşimleri araştırmak için kullanılamaz. Bu nedenle, adaptif immün yanıtların araştırılması bu ayrıntı ile sınırlı olabilir. Sonuç olarak, bu ALI ko-kültür modeli, burun dokuları ve bağışıklık hücreleri arasındaki çapraz etkileşimin in vitro araştırılması için çok yönlü bir başlangıç noktası sunmaktadır. Bu makalede açıklanan protokol, popülasyonlar/koşullar değiştirilse bile yardımcı olacak bir kılavuz sağlamaya çalışmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
NUS Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalı ve Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Anabilim Dalı'ndaki araştırma personeline, hNEC kültürü ve viral kültür ile ilgili çalışmalardaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Ulusal Üniversite Hastanesi, Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalı'ndaki cerrahlara ve cerrahi ekibe, çalışma için gerekli hücre ve kan örneklerinin sağlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.
Bu çalışma Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi, Singapur No tarafından finanse edilmiştir. NMRC / CIRG / 1458/2016 (De Yun Wang için) ve MOH-OFYIRG19may-0007 (Kai Sen Tan'a). Kai Sen Tan, Avrupa Alerji ve Klinik İmmünoloji (EAACI) Araştırma Bursu 2019'dan burs desteği almaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L.
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M.
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
