Summary
نحن نصف استخدام قرنية البورسين لاختبار فعالية الأدوية التجريبية المضادة للفيروسات.
Abstract
يمكن أن تسبب الفيروسات والبكتيريا مجموعة متنوعة من عيوب سطح العين والانحطاط مثل الجروح والقرحة من خلال عدوى القرنية. مع وجود التآكل المصلي الذي يتراوح بين 60-90٪ في جميع أنحاء العالم، وفيروس الهربس البسيط نوع-1 (HSV-1) يسبب عادة الآفات المخاطية في المنطقة الأورو-الوجهية التي تظهر أيضا كآفات والعمى المرتبطة بالعدوى. في حين أن الأدوية المضادة للفيروسات الحالية فعالة ، فإن ظهور مقاومة واستمرار الآثار الجانبية السامة يتطلب تطوير مضادات للفيروسات جديدة ضد هذا الممرض في كل مكان. على الرغم من أن التقييم في المختبر يوفر بعض البيانات الوظيفية المتعلقة بمضادات الفيروسات الناشئة ، إلا أنها لا تثبت تعقيد الأنسجة العينية في الجسم الحي. ومع ذلك ، في دراسات الجسم الحي مكلفة وتتطلب موظفين مدربين ، خاصة عند العمل مع العوامل الفيروسية. وبالتالي نماذج الجسم الحي السابق هي خطوات فعالة ولكنها غير مكلفة للاختبار المضاد للفيروسات. هنا نناقش بروتوكول لدراسة العدوى عن طريق HSV-1 باستخدام القرنيات البرسينية ex vivo وطريقة لعلاجها موضعيا باستخدام الأدوية المضادة للفيروسات الموجودة والجديدة. كما أننا نثبت طريقة إجراء فحص البلاك باستخدام HSV-1. ويمكن استخدام الأساليب المفصلة لإجراء تجارب مماثلة لدراسة العدوى التي تشبه مسببات الأمراض HSV-1.
Introduction
الناس الذين يعانون من التهابات العين غالبا ما تتكبد فقدان البصر1. مع ارتفاع مستوى الانتشار المصلي في جميع أنحاء العالم، HSV المصابين الأفراد يعانون من التهابات العين المتكررة التي تؤدي إلى تندب القرنية، التهاب القرنية سترومال والأوعية الدموية الجديدة2،3،4،5. وقد أظهرت العدوى HSV أيضا أن يسبب أقل تواترا, مجموعة من الحالات الخطيرة بين المرضى الذين يعانون من نقص المناعة, غير المعالجة مثل التهاب الدماغ والمراضة الجهازية6,7,8. وقد أظهرت أدوية مثل Acyclovir (ACV) ونظائرها النيوكليوسيد نجاحا ثابتا في الحد من عدوى HSV-1 وحتى إعادة تنشيط السيطرة بعد الاستخدام المطول لهذه الأدوية يرتبط بالفشل الكلوي وتشوهات الجنين وعدم تقييد ظهور مقاومة الأدوية للسلالات الفيروسية المتطورة9و10و11و12و13. التعقيدات المرتبطة بالتهابات العين HSV-1، وقد درست سابقا في المختبر باستخدام monolayers والثقافات 3D من خلايا القرنية البشرية وفي الجسم الحي باستخدام عدوى عين مورين أو أرنب. في حين أن هذه النماذج في المختبر توفر بيانات هامة عن المكونات البيولوجية الخلوية للعدوى HSV-1، إلا أنها تفشل في محاكاة التعقيد المعقد للأنسجة القرنية ولا تفعل الكثير لإلقاء الضوء على الانتشار التشجري للفيروس14. في المقابل ، على الرغم من أن في أجهزة الجسم الحي هي أكثر الثاقبة في إظهار انتشار العدوى في القرنيات واستجابات التنشيط المناعي خلال عدوى HSV -1 ، فإنها تأتي مع التحذير من أنها تتطلب محققين مدربين ومرافق كبيرة لرعاية الحيوان للتغاضي عن التجارب.
هنا نستخدم القرنيات البورسينية كنموذج الجسم الحي السابق لفحص نظام الجرح الناجم عن العدوى HSV-1. يمكن دراسة كل من الصيدلة المحتملة لبعض الأدوية وكذلك الخلية والبيولوجيا الجزيئية لنظام الجروح الناجم عن العدوى من خلال ثقافات الأنسجة. ويمكن أيضا تعديل هذا النموذج لاستخدامها لالتهابات أخرى الفيروسية والبكتيرية كذلك. في هذه الدراسة، استخدمت القرنيات البورسينية لاختبار فعالية مضادة للفيروسات من جزيء صغير قبل السريرية، BX795. ويفضل استخدام القرنيات البورسينية بسبب سهولة الوصول وفعالية التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، نماذج القرنية porcine هي نماذج جيدة من عيون الإنسان مع القرنيات يجري من السهل عزل، الحجم الكافي للعدوى والتصور وقوية للتعامل مع15. القرنيات البورسينية هي أيضا مماثلة لتعقيد نماذج القرنية البشرية في كل من نفاذية القرنية عبر وامتصاص الجهازية15. باستخدام هذا النموذج للدراسة، تمكنا من توضيح كيف BX795 يستحق المزيد من التحقيق كمثبط المختصة من عدوى فيروس HSV-1 ويضيف إلى الأدب لتصنيفه كمركب مضاد للفيروسات جزيء صغير محتمل16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم توفير جميع أنسجة البورسين المستخدمة في هذه الدراسة من قبل منظمة خاصة تابعة لطرف ثالث ولم يتم تنفيذ أي من التعامل مع الحيوانات من قبل موظفي جامعة إلينوي في شيكاغو.
1. المواد
-
الكواشف
- استخدام الكواشف التالية لالقياس البلاك: مسحوق ميثيلسليلوز، دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM)، مصل الأبقار الجنينية (FBS)، البنسلين والستريبتوميسين (P /S) لايقازيح البلاك.
- استخدام أقراص الكريستال البنفسجي والإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية) لإعداد الكريستال البنفسجي حل لالتقايس البلاك.
-
Vero وسائل الإعلام نمو الخلية -- DMEM وسائل الإعلام كلها
- افتح زجاجة وسائط DMEM داخل غطاء محرك الأنسجة. إزالة 55 مل من وسائل الإعلام من زجاجة باستخدام ماصة المصلية والتخلص منه. إضافة 50 مل من FBS من P / S إلى DMEM. يبرد عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
-
وسائط فحص البلاك - مخزون من وسائط ميثيلسليلوز بنسبة 5٪
- قياس 2.5 غرام من مسحوق ميثيلسليلوز مع مغناطيس اثارة داخل زجاجة 500 مل وautclave ذلك. بعد زجاجة يبرد لدرجة حرارة الغرفة، واتخاذ 500 مل من وسائط كاملة DMEM تحتوي على 50 مل من FBS و 5 مل من P / S وإضافته إلى زجاجة تحتوي على ميثيلسليلوز.
- حرك هذا عند 4 درجة مئوية لمدة يومين باستخدام ستيرر مغناطيسي. يبرد عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
-
إعداد وسائل الإعلام للقرنية البورسينية المقتطعة
- افتح زجاجة الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (MEM) داخل غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة. تجاهل 10 مل من MEM من الزجاجة باستخدام ماصة مصلية.
- إضافة 5 مل من الأنسولين نقل السيلينيوم (ITS) و 5 مل من المضادة لليميكوتيك المضادات الحيوية (AA) إلى وسائل الإعلام والتبريد في 4°C.
-
ماجستير والمخزون العامل من الكريستال البنفسجي:
- لجعل الكريستال البنفسجي الأسهم الحل، إضافة 1 غرام من مسحوق الكريستال البنفسجي إلى 100 مل من الإيثانول 20٪ في الماء. هذا المخزون (1٪ ث / الخامس الكريستال البنفسجي) يمكن تخزينها واستخدامها لمدة تصل إلى سنة عند تخزينها في مكان مظلم.
- لجعل مخزون العمل من هذا، إضافة 50 مل من الأسهم الأصلي الحل إلى 350 مل من الماء. إضافة 100mL من الإيثانول لهذا الحل لجعل 500 مل حل الكريستال البنفسجي العمل (0.1٪ ث / الخامس الكريستال البنفسجي).
ملاحظة: كل هذه الحلول تحتاج إلى تخزين في الظلام.
2. الإجراء
- عزل القرنيات Porcine من عيون كاملة17
- عند تلقي عيون porcine من بائع مناسب ، قم بتخزينه على الجليد إذا كان هناك تأخير في معالجة الأنسجة كما هو مصور في الشكل 1.
- تأكد من استخدام معدات الحماية الشخصية وارتداؤها أثناء هذا الإجراء لتجنب التلوث وكذلك الحوادث الناجمة عن انسكاب الفكاهة الزجاجية.
- رش منطقة العمل مع الإيثانول 70٪ لتنظيف وتطهير. لضمان مساحة العمل مستقرة، ونشر غطاء مقاعد البدلاء والشريط أسفل الجانبين بشكل آمن كما هو في الصورة في الشكل 2.
- ضع عيون الخنزير على الشاش (الشكل 3). باستخدام شاش 50 ملم، عقد المقطع الخلفي (الشكل 4A) من عيون porcine كما هو مبين في الشكل 4B بيد واحدة.
- مع إبرة 30 G، وجعل بلطف كزة واحدة في ما يقرب من مركز سطح الظهارية للعين بعناية وضمان عدم وجود ضرر لستروما (الشكل 5). يجب أن تقتصر الوخزة على الظهارة (~ 100-200 ميكرومتر) لتجنب المشاركة السترومية.
- باستخدام شفرة معقمة حادة، وجعل شق صغير على تصلب على مسافة 1 ملم من القرنية. قطع حافة القرنية ضمان أن الفكاهة الزجاجية لا تسرب باستخدام عمل سريع وسلس الدورية من جهة (الشكل 6A). عن طريق عقد القرنية على حافة القرنية الصلبة مع ملاقط مسطحة، وقطع الأغشية الربط المتبقية من العين باستخدام شفرة(الشكل 6B).
- تأخذ القرنية ووضعها في لوحة 12 جيدا مضافا مع 2 مل من القرنية المتوسطة. وينبغي وضع القرنية التي تواجه، أظهرت في سلسلة من الخطوات في الأرقام 7A-D، الشكل 8).
- إضافة 5 ميكرولتر من محلول الفيروس الذي يحتوي على 5 × 105 وحدات تشكيل البلاك (PFU) من 17 GFP إلى الموقع الحطام على سطح القرنية. ضع اللوحة ذات ال 12 بئرا التي تحتوي على قرنيات بورسينية مصابة في حاضنة تحتويعلى 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة.
- رش أي عيون إضافية لا تستخدم في التجربة مع 10٪ التبييض والتخلص منها بشكل آمن في أكياس المخاطر البيولوجية.
- التصور
ملاحظة: يجب تصور الفيروس كل يوم قبل إضافة الأدوية.- قم بتشغيل مجهر الاستريو ومصدر ضوء LED واترك مصباح الجهاز يسخن قبل تصوير القرنيات. حمل بعناية لوحة القرنيات إلى الصك دون الإخلال الحل. تغيير مرشح بحيث GFP (380-460 نانومتر) يستخدم للنظر في العينات. تعيين وقت التعرض إلى 500 مللي ثانية لالتقاط الصور.
- أولا، ضع لوحة القرنية تحت المجسم والتقاط الصور بأقل تكبير 7.5x. اتبع هذا الأمر مع سلسلة من الصور التكبير المتزايد (على سبيل المثال، 15x، 25x، 35x) بحيث يتم تصور جميع انتشار الفيروسية وتشكيل dendrite بوضوح
- تأكد من إعادة القرنيات المصابة مرة أخرى إلى حاضنة زراعة الأنسجة وحفظ جميع الصور التي تم التقاطها.
- القياس الكمي للعدوى بالفيروس
ملاحظة: يجب تقييم عوارض الفيروسات من القرنيات البورسينية كل يوم لتحليل تأثير العلاج الدوائي.- لقياس الفيروس، خلايا فيرو البذور في كثافة 5 × 105 من الخلايا لكل بئر إذا باستخدام لوحة 6-جيدا كما فعلت في هذه التجربة. القيام بذلك قبل يوم واحد من العدوى. احتضان الخلايا المطلية بين عشية وضحاها لضمان أنها التقاء لتحديد كمية الفيروس.
- Aliquot 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الحرة المصل في أنابيب الطرد الدقيق متعددة. إدراج القطن المعقم مسحة يميل مغموسة في أنابيب الوسائط الحرة المصل شغلها. مسحات القطن تحتاج إلى أن تكون مغموسة ورطبة لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الاستخدام.
- دون إزعاج وسائل الإعلام الأساسية، نقل لوحة القرنية porcine المصابة إلى خزانة السلامة البيولوجية. باستخدام مسحات القطن الرطب، وجعل 3 الثورات في اتجاه عقارب الساعة و 3 الثورات عكس اتجاه عقارب الساعة في قطر 5 ملم من وسط القرنية porcine المصابة دون تطبيق الضغط المفرط.
- إدراج مرة أخرى مسحة القطن في وسائل الإعلام الحرة مصل شغل أنبوب الطرد الدقيق وتدويرها في اتجاه عقارب الساعة ومضادة عقارب الساعة 5 مرات. يجب قطع الطرف المعدني لمسحة القطن بحيث يتناسب تماما مع أنبوب الطرد المركزي الدقيق ويمكن إغلاق الغطاء.
- ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على طرف القطن المسحات على آلة دوامة ودوامة بسرعة عالية لمدة دقيقة واحدة.
- إجراء القياس الكمي للفيروس عن طريق فحص البلاك على هذه العينات.
ملاحظة: يجب إجراء خطوة القياس الكمي هذه في الأيام 2 و4 واختياريا في 6 أيام بعد العدوى.
- تحديد كمية الفيروسات بواسطة مقايسة البلاك
ملاحظة: لإجراء فحص البلاك، تنمو ولوحة خلايا Vero في لوحة 6 جيدا وضمان التقاء 90٪ من الخلايا قبل بدء الفحص. استخدام قارورةالتقاء 75 سم 2 من هذه الخلايا. جميع الخطوات أدناه تحتاج إلى القيام بها داخل خزانة السلامة البيولوجية.- غسل أحادي الطبقة التقاء خلايا Vero في القارورة مع 10 مل من الفوسفات الطازج العازلة المالحة (PBS) بعد أسبيراتينغ الوسط الثقافة. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني بعد أسبيراتينغ المجموعة الأولى من محلول الغسيل.
- إضافة 1 مل من 0.05٪ تريبسين إلى أحادي الخلية. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بالعين المجردة، تأكد من فصل الخلايا عن السطح الداخلي للقارورة. إذا لم يكن كذلك، انتظر لمدة 5 دقائق أخرى قبل فحص القارورة مرة أخرى. عندما تظهر الخلايا منفصلة، أضف 9 مل من الوسائط الكاملة إلى الطبقة الأحادية لضمان إزاحة الخلايا تماما من سطح القارورة.
- جمع جميع الخلايا من قارورة جنبا إلى جنب مع وسائل الإعلام بأكملها ووضعها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
- لكل بئر من 6 لوحات الآبار التي تستخدم في فحص البلاك، استخدم 300 ميكرولتر من أنبوب الطرد المركزي. أعلى كل بئر من لوحة بئر 6 مع 2 مل من وسائل الإعلام بأكملها. اترك اللوحات في الحاضنة بين عشية وضحاها للسماح لها بالنمو وتشكيل طبقة أحادية التقاء في كل بئر.
- من أجل إجراء فحص البلاك ، يجب إجراء تخفيف متسلسل للعينات قبل تحديد كمية الفيروس.
- إجراء سجل101 أضعاف تخفيف الفيروس في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة باستخدام وسائل الإعلام الحرة المصل حتى يتم التوصل إلى تخفيف من10-8. عندما في تخفيف10-3، نقل 1 مل من التخفيف إلى طبقة واحدة من الخلايا المطلية بعد التجسس وسائل الإعلام النمو على الخلايا من لوحة بئر 6، وهذا سيكون خطوة العدوى. احتضان اللوحة المصابة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- يستنشق وسائل الإعلام العدوى القائمة، وغسل مع برنامج تلفزيوني مرتين بلطف لمعطف الخلايا وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام المحملة ميثيلسليلوز لكل بئر لجميع الآبار 6. حضانة لمدة 72 ساعة أو حتى يمكن رؤية تشكيل لويحات. يمكن تحديد لويحات من خلال تشكيل فجوات صغيرة بين الخلايا في أحادية الخلية.
- أضف 1 مل من الميثانول ببطء إلى زاوية كل بئر، باستخدام الجدار كطرف توجيهي. احتضان لوحة 6 بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. يستنشق ببطء محتويات كل بئر من لوحة دون إزعاج أو التحريض على أحادية الخلية.
- إضافة 1 مل من الكريستال البنفسجي حل العمل إلى كل بئر من 6 لوحة بئر، وضمان تغطية جميع الخلايا. احتضان لوحة بئر 6 في الظلام لمدة 30 دقيقة. تجاهل الحل البنفسجي الكريستال عن طريق قرصنة وتجفيف الآبار على ورقة ماصة.
- عد عدد لويحات في أعلى تخفيف جيدا لتحديد إجمالي محتوى الفيروس في حل البداية. كرر العملية مرتين لتأكيد التيتر الفيروسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لفهم فعالية مضادات الفيروسات التجريبية ، يجب اختبارها على نطاق واسع قبل إرسالها للتجارب السريرية البشرية الحية. وفي هذا الصدد، يتعين تحديد مجموعات المراقبة الإيجابية والسيطرة السلبية والاختبار. وقد استخدمت منذ فترة طويلة Trifluorothymidine (TFT) كعلاج المفضل لعلاج التهاب القرنية الهربس موضعيا16. تستخدم كسيطرة إيجابية، ومجموعات القرنية TFT تعامل تظهر انتشار العدوى أقل. كتحكم سلبي ، استخدمنا DMSO أو التحكم في السيارة المذاب في PBS. BX795، الدواء التجريبي قبل السريري كان مجموعة الاختبار. تم تخصيص ما مجموعه 4 قرنيات لكل مجموعة وأضيفت الأدوية 3 مرات كل يوم إلى القرنيات البورسينية. تظهر نتائجنا باستخدام التصوير المفلور المجسم أن الفعالية المضادة للفيروسات ل BX795 تشبه TFT في السيطرة على الانتشار الفيروسي. يمكن تصور الانتشار الفيروسي في دراساتنا من خلال تصوير قناة الفلورسينس الخضراء في المنظار المجسم. لاحظنا أن المركبة التي عالجت فقط القرنيات مجموعة المكافحة السلبية أظهرت انتشار الفيروس من منطقة العدوى المركزية إلى محيطها قبل 6 أيام بعد التلقيح الفيروسي الأولي ، في حين أن كلا الدواءين (BX795 و TFT) يزيلان العدوى في اليوم 4 -6 صور(الشكل 9A). وبالمثل، مسحات العين التي اتخذت في اليومين 2 و 4 بعد العدوى تظهر تثبيط كامل للفيروس في السيطرة الإيجابية والعينات المعالجة BX795 في حين لوحظ زيادة حادة في ترتي الفيروس المعدية في مجموعة المكافحة السلبية(الشكل 9B).
الشكل 1:عيون Porcine أبقى على الجليد حتى تتم معالجة الأنسجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد مقاعد البدلاء العمل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عيون Porcine وضعت على الشاش. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: Porcine العين مع إبرة 30G في الصورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: 30 G إبرة المستخدمة; ثقب المحرز في وسط سطح الظهارية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6:العمل الدورية المستخدمة لقطع حول حافة القرنية باستخدام شفرة معقمة حادة (A، B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: صور القرنية. (أ، ب) القرنية قطع أخيرا باستخدام مقص حاد (ج) يتم عقد القرنية المعزولة من قبل ملاقط (D) قرنية معزولة تماما، وعلى استعداد للاستخدام يرجى انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: القرنيات وضعت في لوحة 12 جيدا واحتضانها لمدة 72 ساعة.
الشكل 9: تطور انتشار الفيروسية التي اتخذت أثناء العدوى. وقد أصيبت القرنيات البورسينية الطازجة بفيروس HSV-1 17-GFP و (A) تم تصويرها باستخدام المجهر في الأيام 2 و 4 و 6 بعد العدوى. بدأ العلاج الموضعي مع DMSO أو TFT أو BX795 في اليوم الثاني بعد العدوى. (ب)تم إجراء فحوصات البلاك باستخدام مسحات مأخوذة من القرنيات البورسينية على خلايا فيرو. تم إجراء اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه لفهم الاختلافات الكبيرة بين مجموعات العلاج. n = 4 ، ****p =0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أظهرت الأبحاث السابقة BX795 أن يكون لها دور واعد كعامل مضاد للفيروسات ضد عدوى HSV-1; عن طريق تثبيط كيناز تانك ملزمة 1 (TBK1)16. وقد لعبت كل من TBK1 وautphagy دورا في المساعدة على منع العدوى HSV-1 كما هو موضح على الخلايا الظهارية القرنية البشرية. وقد تبين BX795 لتكون فعالة إلى أقصى حد مع النشاط المضاد للفيروسات بتركيز 10μM واستخدام كل من تحليل لطخة الغربية وتحليل البلاك الفيروسية من البروتينات الفيروسية الرئيسية, وقد تبين BX795 لمنع عدوى HSV-1 مماثلة لنشاط TFT16. الدراسة على القرنيات البورسينية اتبعت نفس التحليل وحصلت على نتائج مماثلة كما هو موضح أعلاه. يظهر BX795 أن تكون فعالة تماما مثل TFT في تثبيط العدوى - الصور التي اتخذت من القرنيات porcine في اليوم 4 و 6 من العدوى تظهر نتائج مماثلة في كل من TFT و BX795. كما تعزز مقايسات البلاك التي أجريت لقياس الفيروسات المفرزة هذه النتائج16. وقد أظهرت BX795 أيضا أن يكون لها آثار مضادة للفيروسات في المختبر واستخدامه موضعيا في نماذج الماوس في الجسم الحي كما أظهرت قمع التهاب القرنية HSV-116.
تساهم الدراسة في إنشاء BX795 كمجمع فعال وقيادة للتطبيق المضاد للفيروسات واسع الطيف ضد عدوى HSV-1. من خلال إظهار فعاليتها في نماذج porcine مماثلة ل TFT ، BX795 تقف لتكون ناجحة في نماذج العدوى متعددة16. بالإضافة إلى ذلك، BX795 مهم كما ثبت أن تكون فعالة في سلالات الفيروسات متعددة، حتى HSV-1 (كوس)tk12 الذي يقاوم دواء آخر يستخدم على نطاق واسع Acyclovir (ACV)16. BX975 الخلايا المعالجة تظهر القليل جدا من التعبير عن HSV-1 البروتين الفيروسي gB التي تشهد على فعاليته تثبيط فيروس HSV-1. BX795 هو أيضا يوضح فعالية أفضل لمكافحة الفيروسات بجرعات أقل بالمقارنة مع العلاجات الأخرى والعلاجات المضادة لفيروس الهربس. وعلاوة على ذلك، تركيزات علاجية من BX795 (حتى التركيز المقترح من 10 ميكرومتر) تظهر أي السمية الخلوية السلبية تجاه الخلايا - لا إغراء موت الخلايا المبرمج وموت الخلية، والتي هي مرة أخرى مماثلة للسيطرة TFT16.
وتشمل الخطوات الحاسمة داخل قسم البروتوكول عزل القرنية البورسينية عن العين بأكملها. وهذا ينطوي على حطام القرنية في وسط العين باستخدام إبرة ويتطلب القليل جدا من القوة لضمان عدم وجود مشاركة سترومال تليها استئصال القرنية من سطح العين بلطف دون إزعاج القزحية. مجموعة أخرى من الخطوات الحاسمة تشمل أجزاء تنطوي على نصائح القطن قبل التبول ومسح سطح القرنية. يجب أن تكون الحركة لطيفة لضمان عدم طرد ظهارة القرنية من سطح العين.
يمكن إجراء التعديل على خطوة الحطام الظهاري. بدلا من استخدام إبرة 30 G لجعل كزة واحدة في وسط القرنية، يمكن للمجرب استخدام شفرة معقمة أو إبرة 30 G لجعل بلطف خدوش على شكل شبكة إلى ظهارة القرنية. وهذا يضمن عدوى قوية إلى الظهارة.
يجب استخدام قرنيات البورسين في نفس يوم الشراء ويجب ألا تعقد لأكثر من 24 ساعة. القرنيات البورسينية المحفوظة في الثلج لفترة أطول من 4 ساعة سوف تؤدي إلى القزحية التمسك القرنية. وهذا يجعل من الصعب فصل القرنية عن بقية العين أثناء ختان الأعصاب. ليس كل القرنيات البرسينية ستصاب بالعدوى على حد سواء. يجب أن يصيب المجرب ما لا يقل عن 5 عيون لكل مجموعة ثم يختار القرنيات المصابة على قدم المساواة في اليوم الثاني بعد العدوى للمضي قدما في التجربة.
أهمية التقنية الحالية ينطوي على فعالية التكلفة لاستخدام porcine على القرنيات البشرية. هذه التقنية هي أيضا كبيرة بسبب نضارة النسبية للقرنيات المستخدمة بالمقارنة مع القرنيات البشرية.
وتشمل التطبيقات المستقبلية للتقنية الحالية على سبيل المثال لا الحصر استخدامها في اختبار دراسات نفاذية الدواء ، ودراسات الصيدلة والديناميكية الحية السابقة. يمكن استخدام قرنيات البورسين أيضا لاختبار الأدوية المضادة للبكتيريا والفطريات بالإضافة إلى الأدوية المضادة للفيروسات. ويمكن أيضا أن تستخدم القرنيات لمقاايسات التئام الجروح في الجسم الحي السابق لدراسة الجروح السكري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح ولا عن مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح المعاهد القومية للصحة (R01 EY024710، RO1 AI139768، وRO1 EY029426) إلى D.S. A.A. بدعم من منحة F30EY025981 من المعهد الوطني للعيون، المعاهد القومية للصحة. أجريت دراسة باستخدام القرنيات البورسينية التي تم الحصول عليها من شركة بارك للتعبئة، 4107 شارع آشلاند، نيو سيتي، شيكاغو، IL-60609
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | - | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | Special order by request | |
| Procedure bench covers - as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
