Summary
Vi beskriver användningen av en svin hornhinnan för att testa den antivirala effekten av experimentella läkemedel.
Abstract
Virus och bakterier kan orsaka en mängd olika okulära ytdefekter och degeneration såsom sår och sår genom hornhinnans infektion. Med en seroprevalens som sträcker sig från 60-90% över hela världen, Herpes Simplex Virus typ-1 (HSV-1) orsakar ofta mucocutaneous skador i orofacial regionen som också manifesteras som skador och infektion-associerade blindhet. Medan nuvarande antivirala läkemedel är effektiva, kräver uppkomsten av resistens och persistens av giftiga biverkningar utveckling av nya antivirala mot denna allestädes närvarande patogen. Även om in vitro-bedömning ger vissa funktionella data om en framväxande antiviral, visar de inte komplexiteten i okulär vävnad in vivo. In vivo-studier är dock dyra och kräver utbildad personal, särskilt när man arbetar med virusagenter. Därför är ex vivo-modeller effektiva men billiga steg för antiviral testning. Här diskuterar vi ett protokoll för att studera infektion av HSV-1 med hjälp av svin hornhinnorna ex vivo och en metod för att behandla dem lokalt med befintliga och nya antivirala läkemedel. Vi visar också metoden att utföra en plack analys med HSV-1. De metoder som beskrivs kan användas för att utföra liknande experiment för att studera infektioner som liknar HSV-1 patogenen.
Introduction
Personer som lider av okulär infektioner ådrar sig ofta synförlust1. Med en hög seroprevalens över hela världen lider HSV-infekterade individer av återkommande ögoninfektioner som leder till hornhinnans ärrbildning, stromal keratit och neovaskularisering2,3,4,5. HSV infektioner har också visat sig orsaka mindre ofta, en rad allvarliga villkor bland immunkomprometterade, obehandlade patienter som encefalit och systemisk sjuklighet6,7,8. Läkemedel som Acyclovir (ACV) och dess nukleosidanaloger har visat konsekvent framgång med att bromsa HSV-1-infektion och till och med kontrollera reaktivering, men den långvariga användningen av dessa läkemedel är förknippad med njursvikt, fetala avvikelser och underlåtenhet att begränsa uppkomsten av läkemedelsresistens mot framväxandevirusstammar 9,10,11,12,13. Komplexitet i samband med HSV- 1 okulär infektioner, har tidigare studerats in vitro med monolayers och 3D kulturer av mänskliga hornhinnans celler och in vivo med hjälp av murin eller kanin okulär infektioner. Medan dessa in vitro-modeller ger betydande data om de cellulära biologiska komponenterna i HSV-1-infektioner, misslyckas de dock med att efterlikna den invecklade komplexiteten hos hornhinnans vävnad och gör lite för att belysa virusets dendritiska spridning14. Även om in vivo-system är mer insiktsfulla när det gäller att visa infektionsspridning i hornhinnorna och immunaktiveringssvar under HSV-1-infektion, kommer de däremot med förbehållet att de kräver utbildade utredare och stora anläggningar för djurvård för att förbise experimenten.
Här använder vi svin hornhinnorna som en ex vivo modell för att undersöka HSV-1 infektion inducerad sårsystem. Både den potentiella farmakologin hos vissa läkemedel samt cell- och molekylärbiologin i sårsystemet som orsakas av infektionen kan studeras genom vävnad explant kulturer. Denna modell kan också ändras för användning för andra virus- och bakterieinfektioner. I denna studie användes svin hornhinnorna för att testa den antivirala effekten av en preklinisk liten molekyl, BX795. Användningen av svin hornhinnorna föredrogs på grund av enkel tillgång och kostnadseffektivitet. Dessutom är svin hornhinnans modeller bra modeller av mänskliga ögon med hornhinnorna är lätta att isolera, tillräckligt stora för infektion och visualisering och robusta att hantera15. Svin hornhinnorna är också jämförbara med komplexiteten hos mänskliga hornhinnans modeller i både trans hornhinnans permeabilitet och systemisk absorption15. Genom att använda denna modell för studien kunde vi klargöra hur BX795 är värt att ytterligare undersökning som en kompetent hämmare av HSV-1 virusinfektion och lägger till litteraturen om att klassificera den som en potentiell liten molekyl antiviral förening16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All svinvävnad som användes i denna studie tillhandahölls av en privat organisation från tredje part och ingen av djurhanteringen utfördes av University of Illinois vid Chicagos personal.
1. Material
-
Reagenser
- Användning efter reagenser för plackanalys: pulvermetylcellulosa, Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM), fetala bovinserum (FBS), penicillin och streptomycin (P/S) för plackanalys.
- Använd kristallvioletttabletter och etanol (molekylärbiologisk kvalitet) för att förbereda kristallviolett lösning för plackanalys.
-
Vero cell tillväxt media - DMEM hela media
- Öppna DMEM-medieflaskan inuti vävnadshuven. Ta bort 55 ml media från flaskan med en serologisk pipett och kassera den. Tillsätt 50 ml FBS P/S till DMEM. Kyl vid 4 °C.
-
Plackanalysmedia - Lager av 5% metylcellulosamedia
- Mät 2,5 g metylcellulosapulver med en omrörande magnet inuti en 500 ml glasflaska och autoklavera den. När flaskan svalnat till rumstemperatur, ta 500 ml DMEM hela medier som innehåller 50 ml FBS och 5 ml P/S och tillsätt den i glasflaska som innehåller metylcellulosa.
- Rör om detta vid 4 °C i 2 dagar med en magnetomrörare. Kyl vid 4 °C.
-
Medieförberedelser för struken svinmajs
- Öppna en minimal flaska med viktiga medier (MEM) inuti vävnadshuven. Kassera 10 ml MEM från flaskan med en serologisk pipett.
- Tillsätt 5 ml insulinöverföringssyre -selen (ITS) och 5 ml antimykotisk-antibiotikum (AA) till mediet och kyl vid 4 °C.
-
Master och arbetslager av kristallviolett:
- För att göra den kristallvioletta stamlösningen, tillsätt 1 g kristallviolett pulver till 100 ml 20% etanol i vatten. Denna stock (1% w/v kristallviolett) kan lagras och användas i upp till år när den lagras på en plats som är mörk.
- För att göra ett arbetslager av detta, tillsätt 50 ml originallagerlösning till 350 ml vatten. Tillsätt 100 mL etanol till denna lösning för att göra en 500 ml fungerande kristallviolett lösning (0,1% w/v kristallviolett).
OBS: Båda dessa lösningar måste förvaras i mörker.
2. Förfarande
- Isolering av svin hornhinnorna från hela ögon17
- När svinögonen har mottagits från en lämplig leverantör, förvara på is om det finns en fördröjning med vävnadsbehandling enligt bild 1.
- Se till att personlig skyddsutrustning används och bärs under detta förfarande för att undvika kontaminering samt olyckor från spill av glaskroppshumor.
- Spraya arbetsområdet med 70% etanol för att rengöra och desinficera. För att säkerställa att arbetsutrymmet är stabilt, sprid ett bänkskydd och tejpa ner sidorna på ett säkert sätt enligt bild 2.
- Placera svinögonen på gasväven (figur 3). Använd 50 mm gasväv och håll den bakre delen (figur 4A) av svinögon enligt figur 4B med en hand.
- Med en 30 G nål, gör försiktigt en enda petning i ungefär mitten av ögats epitelyta noggrant och se till att det inte finns några skador på stroma (Figur 5). Petningen bör begränsas till epitel (~ 100-200 μm) för att undvika stromal inblandning.
- Använd ett skarpt steriliserat blad, gör ett litet snitt på sclera på 1 mm avstånd från hornhinnan. Skär kanten på hornhinnan så att den glasaktiga humorn inte läcker med en snabb och smidig roterande verkan av handen (Figur 6A). Genom att hålla hornhinnan vid hornhinnans sklerakant med en platt pincett, skär av de återstående tjudrande ögonmembranen med bladet (Figur 6B).
- Ta hornhinnan och placera den i en 12-brunnsplatta överlagrad med 2 ml hornhinnemedium. Hornhinnan bör placeras uppåt, vilket visas i en rad steg i figurerna 7A-D, figur 8).
- Tillsätt 5 μL av viruslösningen som innehåller 5 x 105 plackbildande enheter (PFU) på 17 GFP till den debriderade platsen på hornhinnans yta. Placera 12-brunnsplattan som innehåller infekterade svinmajsar i en inkubator med 5% CO2 i 72 timmar.
- Spraya eventuella ytterligare ögon som inte används i experiment med 10% blekmedel och kasseras säkert i biohazard påsar.
- Visualisering
OBS: Viruset bör visualiseras varje dag före tillsats av läkemedel.- Slå på stereomikroskopet och LED-ljuskällan och låt maskinens lampa värmas upp innan hornhinnorna avbildas. Bär försiktigt plattan av hornhinnorna till instrument utan att störa lösningen. Byt filter så att GFP (380-460 nm) används för att titta på prover. Ställ in exponeringstiden på 500 ms för att ta bilder.
- Placera först hornhinnans platta under stereoskopet och ta bilderna vid den lägsta förstoringen på 7,5x. Följ upp detta med en serie ökande förstoringsbilder (t.ex. 15x, 25x, 35x) så att all virusspridning och dendritbildning visualiseras tydligt
- Se till att återföra de infekterade hornhinnorna tillbaka till vävnadskulturens inkubator och spara alla bilder som togs.
- Kvantifiering av virusinfektion
OBS: Virustitrar från svinmajsar bör utvärderas varje dag för att analysera effekten av läkemedelsbehandling.- För att kvantifiera virus, sådd Vero celler med en densitet av 5 x 105 celler per brunn om du använder en 6-brunnsplatta som gjorts i detta experiment. Gör detta en dag före infektionen. Inkubera de pläterade cellerna över natten för att säkerställa att de är konfluenta för virusk kvantifiering.
- Aliquot 500 μL serumfria medier i flera mikrocentrifugrör. Sätt in steril bomullsspetsad bomullspinne doppad i de serumfria mediafyllda rören. Bomullspinnarna måste doppas och blötas i minst 5 minuter före användning.
- Utan att störa de underliggande medierna, transportera den infekterade svin hornhinnans platta till ett biosäkerhetsskåp. Använd de våta bomullspinnerna, gör 3 varv medurs och 3 varv moturs med en diameter av 5 mm från mitten av den infekterade svinmajsea utan att applicera överdrivet tryck.
- Sätt tillbaka bomullspinnen i det serumfria mediafyllda mikrocentrifugröret och rotera det medurs och moturs 5 gånger. Bomullspinnens metallspets ska skäras kort så att den passar helt i mikrocentrifugröret och locket kan stängas.
- Placera mikrocentrifugröret som innehåller bomullsspetsen på en virvelmaskin och virvel i hög hastighet i 1 minut.
- Utför virusk kvantifiering via en plackanalys på dessa prover.
OBS: Detta kvantifieringssteg måste utföras dag 2, 4 och eventuellt på 6 dagar efter infektion.
- Virus kvantifiering genom plack analys
OBS: För att utföra en plackanalys, odla och plätera Vero-celler till en 6-brunnsplatta och säkerställa 90% sammanflöde av celler före analysstart. Använd en sammanflödeskolv på 75 cm2 av dessa celler. Alla steg nedan måste utföras inuti ett biosäkerhetsskåp.- Tvätta det sammanflödesmonager av Vero-celler i kolven med 10 ml färsk fosfatbuffert saltlösning (PBS) efter att ha aspirerat odlingsmediet. Upprepa tvättsteget igen med PBS efter att ha aspirerande den första uppsättningen tvättlösning.
- Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin till cellmonalayern. Inkubera kolven vid 37 °C i 5 minuter. Med blotta ögat, se till att cellerna lossnar från kolvens inre yta. Om inte, vänta i ytterligare 5 minuter innan du undersöker kolven igen. När celler verkar vara avskilda, tillsätt 9 ml hela mediet i monoskiktet för att säkerställa att cellerna lossnar helt från kolvens yta.
- Samla alla celler från kolven tillsammans med hela mediet och placera dem i ett 15 ml centrifugeringsrör.
- För varje brunn av de 6 brunnsplattor som används för plackanalys, använd 300 μL från centrifugröret. Toppa varje brunn på 6 brunnsplattan med 2 ml hela media. Lämna plattorna i inkubatorn över natten så att de kan växa och bilda ett sammanflöde av monoskikt i varje brunn.
- För att utföra en plackanalys måste en seriell utspädning av prover utföras före kvantifieringen av viruset.
- Utför enstock 10faldig utspädning av viruset i mikrocentrifugrör med serumfria medier tills en utspädning på 10-8 uppnås. När vid en utspädning på 10-3, överför 1 ml av utspädningen till monoskiktet av pläterade celler efter att ha aspirerande tillväxtmedierna på cellerna från 6-brunnsplattan, kommer detta att vara infektionssteget. Inkubera den infekterade plattan vid inkubatorn vid 37 °C i 2 timmar.
- Aspirera det befintliga infektionsmedierna, tvätta med PBS två gånger försiktigt för att täcka celler och tillsätt 2 ml metylcellulosabelastad media per brunn till alla 6 brunnar. Inkubera i 72 timmar eller tills plack bildas. Plack kan identifieras genom bildandet av små mellanrum mellan celler i cellmonalayern.
- Tillsätt 1 ml metanol långsamt i hörnet av varje brunn med väggen som styrspets. Inkubera 6 brunnsplattan vid rumstemperatur i 15 min. Aspirera långsamt innehållet i varje brunn från plattan utan att störa eller omröra cellmonalayern.
- Tillsätt 1 ml kristallviolett arbetslösning till varje brunn på 6 brunnsplatta, så att alla celler är täckta. Inkubera 6 brunnsplattan i mörkret i 30 min. Kassera den kristallvioletta lösningen genom att aspirera den och torka brunnarna på ett ark absorberande papper.
- Räkna antalet plack vid den högsta utspädningsbrunnen för att kvantifiera det totala virusinnehållet i startlösningen. Upprepa processen två gånger för att bekräfta virustitern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att förstå effekten av de experimentella antivirala måste de testas i stor utsträckning innan de skickas för kliniska prövningar in vivo. I detta avseende måste positiv kontroll, negativ kontroll och testgrupper identifieras. Trifluorothymidin (TFT) har länge använts som den föredragna behandlingen för att behandla herpes keratitis lokalt16. Används som en positiv kontroll, TFT behandlade hornhinnans grupper visar lägre infektion spridning. Som en negativ kontroll använde vi DMSO eller fordonsstyrning upplöst i PBS. BX795, den experimentella prekliniska drogen var testgruppen. Totalt 4 hornhinnorna tilldelades varje grupp och drogerna tillsattes 3 gånger varje dag till svin hornhinnorna. Våra resultat med stereoskopisk fluorescensavbildning visar att den antivirala effekten av BX795 liknar TFT för att kontrollera virusspridning. Virusspridning i våra studier kan visualiseras genom att avbilda den gröna fluorescenskanalen i stereoskopet. Vi observerade att fordonet endast behandlade negativa kontrollgruppen hornhinnorna visade spridning av viruset från den centrala infektionszonen till dess periferi med 6 dagar efter inledande viral inokulering, medan båda läkemedlen (BX795 och TFT) rensa infektionen i dag 4 - 6 bilder (Figur 9A). På samma sätt visar de okulära svabbprover som tas dag 2 och 4 efter infektion en fullständig hämning av virus i den positiva kontrollen och BX795 behandlade prover medan en kraftig ökning av infektiös virus titer observeras i den negativa kontrollgruppen (figur 9B).
Bild 1:Svinögon hålls på is tills vävnaden bearbetas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Arbetsbänksinställningar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3:Svinögon placerade på gasväv. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4:Svinöga med 30G nål på bilden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 5:30 G nål används; hål i mitten av epitelytan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 6:Roterande åtgärder som används för att skära runt hornhinnans kant med skarpt steriliserat blad (A,B). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 7: Bilder från Hornhinnan. A,B) Hornhinnan slutligen skuren med vass sax(C)Isolerad hornhinna hålls av pincett (D) Helt isolerad hornhinna, klar att användas Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 8: Hornhinnorna placerade i 12-brunnsplatta och inkuberade i 72 timmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Progression av virusspridning som tagits under infektionsförloppet. Nyligen strukna svin hornhinnorna smittades med HSV-1 17-GFP och (A) avbildas med mikroskop på dag 2, 4 och 6 post infektion. Aktuell behandling med DMSO, TFT eller BX795 startades dag 2 efter infektion. B)Plackanalyser utfördes med hjälp av svabbprover från svinmajsarna på Vero-celler. Tvåvägs ANOVA-test utfördes för att förstå betydande skillnader mellan behandlingsgrupperna. n=4, ****p=0,0001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare forskning har visat att BX795 har en lovande roll som antiviralt medel mot HSV-1-infektion; genom att hämma tankbindande kinas 1 (TBK1)16. Både TBK1 och autofagi har spelat en roll i att hämma HSV-1 infektion som visats på mänskliga hornhinnans epitelial celler. BX795 visade sig vara maximalt effektiv med antiviral aktivitet vid en koncentration av 10μM och med hjälp av både western blot analys och viral plack analys av viktiga virala proteiner, BX795 visade sig hämma HSV-1 infektion jämförbar med aktiviteten i TFT16. Studien på hornhinnorna av svin följde samma analys och erhöll liknande resultat som visats ovan. BX795 visar sig vara lika effektiv som TFT vid hämmande infektion - bilder tagna av svin hornhinnorna vid dag 4 och 6 av infektion visar jämförbara resultat i både TFT och BX795. Plack analyser utförs för att kvantifiera utsöndrade virions förstärker också dessa resultat16. BX795 har också visat sig ha antivirala effekter in vitro och dess användning lokalt i musmodeller in vivo har också visat undertryckande av hornhinnans HSV-1 infektion16.
Studien bidrar till att etablera BX795 som en effektiv och ledande förening för bredspektrum antiviral tillämpning mot HSV-1 infektion. Genom att visa sin effekt i svinmodeller som jämförbara med TFT, BX795 står att vara framgångsrik i flera infektion modeller16. Dessutom är BX795 viktigt eftersom det har visat sig vara effektivt i flera virusstammar, även HSV-1 (KOS)tk12 som är resistent mot ett annat allmänt använt läkemedel Acyclovir (ACV)16. BX975 behandlade celler visar mycket lite uttryck för HSV-1 viralt protein gB som intygar dess hämningseffekt av HSV-1 virus. BX795 visar också bättre antiviral effekt vid lägre doser jämfört med andra behandlingar och anti-herpesvirusbehandlingar. Dessutom visar terapeutiska koncentrationer av BX795 (även föreslagen koncentration på 10 μM) ingen negativ cytotoxicitet mot celler - ingen apoptomotivering och celldöd, vilket återigen är jämförbart med TFT-kontrollen16.
Kritiska steg i protokollavsnittet inkluderar isolering av svinmajs från hela ögat. Detta innebär debridement av hornhinnan i mitten av ögat med hjälp av en nål och kräver mycket lite kraft för att säkerställa ingen stromal engagemang följt av excising hornhinnan från okulär ytan försiktigt utan att störa iris. En annan uppsättning kritiska steg inkluderar delar som involverar förtlande bomullsspetsar och svabbar hornhinnans yta. Rörelsen ska vara skonsam för att säkerställa att hornhinnans epitel inte lossas från den okulära ytan.
Ändring kan göras i epitelial debridement steg. Istället för att använda en 30 G nål för att göra en enda petning i mitten av hornhinnan, kan experimenteraren använda ett sterilt blad eller 30 G nål för att försiktigt göra gallerformade repor till hornhinnans epitel. Detta säkerställer robust infektion i epitelet.
Svin hornhinnorna bör användas samma dag som de upphandlas och bör inte hållas längre än 24 timmar. Svin hornhinnorna hålls i is längre än 4 h kommer att resultera i iris fastnar på hornhinnan. Detta gör det svårare att skilja hornhinnan från resten av ögat under excision. Inte alla svin hornhinnorna kommer att bli smittade lika. Experimenteraren bör infektera minst 5 ögon per grupp och sedan plocka lika infekterade hornhinner på dag 2 efter infektion för att fortsätta med experimentet.
Betydelsen av den nuvarande tekniken innebär kostnadseffektiviteten att använda svin över mänskliga hornhinnor. Tekniken är också signifikant på grund av den relativa friskheten hos hornhinnorna som används jämfört med mänskliga hornhinnor.
Framtida tillämpningar av den nuvarande tekniken inkluderar men inte begränsat till dess användning i test av läkemedelspermeabilitetsstudier, ex vivo farmakokinetiska och farmakodynamiska studier. Svin hornhinnorna kan också användas för att testa antibakteriella och svampdödande läkemedel utöver antivirala läkemedel. Hornhinnorna kan också användas för ex vivo sårläkning analyser för att studera diabetiker sår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt och inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NIH-bidrag (R01 EY024710, RO1 AI139768 och RO1 EY029426) till D.S. A.A. stöddes av ett F30EY025981-anslag från National Eye Institute, NIH. Studien genomfördes med hjälp av svin hornhinnorna som erhållits från Park Packing company, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | - | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | Special order by request | |
| Procedure bench covers - as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
