Summary
Este artigo descreve o isolamento das células da válvula aórtica do rato por um procedimento de colagem de duas etapas. Células de válvulas isoladas do rato são importantes para a realização de diferentes ensaios, como este ensaio de calcificação in vitro, e para investigar as vias moleculares que levam à mineralização da válvula aórtica.
Abstract
A calcificação das células válvulas aórticas é a marca registrada da estenose aórtica e está associada à fibrose da cúmlica da válvula. As células intersticiais da válvula (VICs) desempenham um papel importante no processo de calcificação na estenose aórtica através da ativação de seu programa de desdiferente para células semelhantes a osteoblastos. Os VICs do mouse são uma boa ferramenta in vitro para a elucidação das vias de sinalização que conduzem a mineralização da célula da válvula aórtica. O método aqui descrito, utilizado com sucesso por esses autores, explica como obter células recém-isoladas. Foi realizado um procedimento de colagem em duas etapas com 1 mg/mL e 4,5 mg/mL. O primeiro passo é crucial para remover a camada celular endotelial e evitar qualquer contaminação. A segunda incubação de colagem é facilitar a migração de VICs do tecido para a placa. Além disso, discute-se um procedimento de coloração de imunofluorescência para a caracterização do fenótipo das células da válvula isolada do rato. Além disso, o ensaio de calcificação foi realizado in vitro utilizando-se o procedimento de medição do reagente de cálcio e a coloração vermelha de alizarina. O uso da cultura primária da célula de válvula de camundongos é essencial para testar novos alvos farmacológicos para inibir a mineralização celular in vitro.
Introduction
A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD) é a doença cardíaca valvular mais prevalente nas populações ocidentais, afetando quase 2,5% dos idosos com mais de 65 anos de idade1. Cavd afeta mais de seis milhões de americanos e está associado a mudanças nas propriedades mecânicas dos folhetos que prejudicam o fluxo sanguíneo normal1,2. Atualmente, não há tratamento farmacológico para impedir a progressão da doença ou ativar a regressão mineral. A única terapia eficaz para tratar cavd é a substituição da válvula aórtica por cirurgia ou substituição da válvula aórtica transcateter3. Por isso, é imprescindível investigar os mecanismos moleculares que levam à mineralização da válvula para identificar novos alvos farmacológicos. De fato, a estenose aórtica não tratada tem várias consequências adversas, como disfunção ventrículo esquerda e insuficiência cardíaca4.
A válvula aórtica consiste em três camadas conhecidas como fibrosa, esponiosa e ventricular, que contêm VICs como a célula predominante tipo5. A fibrosa e a ventricular são cobertas por uma camada de células endoteliais vasculares (VECs)5. Os VECs regulam a permeabilidade das células inflamatórias, bem como os sinais paracrinos. O aumento do estresse mecânico pode afetar a integridade dos VECs e perturbar a homeostase da válvula aórtica, levando à invasão celular inflamatória6. As análises de microscopia eletrônica de varredura mostraram endotélio interrompido em uma válvula aórtica calcificada humana7.
Análises histológicas do tecido calcificado revelam a presença de osteoblastos e osteoclartos. Além disso, observou-se diferenciação osteogênica dos VICs tanto in vitro quanto no tecido da válvula humana8. Este processo é orquestrado principalmente pelo fator de transcrição relacionado ao Runt 2 (Runx2) e pelas proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs)8,9.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos animais aqui descritos foram aprovados pela Escola de Medicina Icahn no comitê institucional de núcleo e uso do Monte Sinai.
1. Preparação antes do isolamento da célula da válvula de camundongos adultos
- Limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos mostrados na Figura 1A utilizando 70% de v/v de etanol e, posteriormente, autoclavando-os por 30 minutos. limpe o espaço cirúrgico com 70% de etanol.
- Adicione 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Prepare uma alíquota de 50 mL de salina tamponada com fosfato de 1x (PBS). Mantenha as soluções no gelo.
- Prepare soluções de colagenase de 1 mg/mL e 4,5 mg/mL e utilize 5 mL de cada solução em tubos de 15 mL para realizar todo o procedimento. Para preparar 5 mL de colagenase de 1 mg/mL, misturar 5 mg de colagenase com 2,5 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, fetal bovino -free) e 2,5 mL de 10 mM HEPES complementado com antibióticos (1% penicilina-estreptomicina a partir da etapa 1.2). Filtre as soluções através de um filtro de 0,22 μm para remover qualquer contaminação.
NOTA: Mantenha as soluções no gelo para proteger as enzimas. - Aqueça a solução DMEM a 37 °C antes de usar em todas as etapas descritas abaixo. Prepare o meio completo suplementando OMEM com 1% de penicilina-estreptomicina, 1% piruvato de sódio, 5 mL de L-glutamina de 200 mM, 1 mL de reagente eliminatório de micoplasma (ver a Tabela de Materiais),e 10% FBS.
2. Isolamento das células válvulas
- Para obter 106 células para o experimento, use cinco camundongos de 8 semanas de idade (mínimo de três). Coloque o mouse em uma câmara de indução junto com um pequeno pedaço de papel de tecido encharcado com 1 mL de isoflurane, mas não permita contato com o tecido. Para confirmar que o animal está totalmente anestesiado; verificar o reflexo de beliscar o dedo do dedo do dedo, e, em seguida, eutanásia o rato por luxação cervical. Use isoflurane para aliviar qualquer dor antes da luxação cervical, pois o procedimento descrito abaixo é terminal.
- Coloque o mouse em uma plataforma de dissecação e conserte as patas com cânulas para mantê-lo no lugar. Limpe o peito e o abdômen com etanol; abra o abdômen e o peito com uma tesoura. Com uma pequena tesoura cirúrgica, corte entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo para exsanguinar o rato. Perfunda o coração com 10 mL de 1x pbs frio para remover sangue do coração.
- Corte o coração e mantenha 3 mm da aorta ascendente como mostrado na Figura 1B. Disseca a válvula aórtica sob um estereótipo. Corte o coração horizontalmente no meio dos ventrículos(Figura 1C). Corte o ventrículo esquerdo em direção à aorta e disseca cuidadosamente a válvula aórtica(Figura 1D-F). Misture as válvulas em um pequeno prato de cultura de tecido de 35 mm.
- Lave as válvulas isoladas em um prato de cultura celular de 75 mm com 5 mL de HEPES frio (10 mM) complementados com antibióticos (1% penicilina-estreptomicina) para remover sangue(Figura 2). Prepare dois tubos de 15 mL de colagenase 1 mg/mL e 4,5 mg/mL conforme descrito acima na etapa 1.3.
NOTA: Após a dissecção, manipule as válvulas isoladas em uma capa biossegurança estéril para minimizar a contaminação. - Incubar as válvulas em colagenase tipo I (1 mg/mL) por 30 min a 37 °C com agitação contínua(Figura 2). Centrifugar o tubo por 5 min a 150 × g,lavar a pelota uma vez com 2 mL de HEPES (10 mM) e vórtice para 30 s em alta velocidade. Despeje o conteúdo deste tubo em um prato de cultura de 35 mm, e transfira cuidadosamente os fragmentos de tecido usando pinças finas em um novo tubo.
NOTA: Nesta fase, os VICs ainda não estão dissociados do tecido, e a pelota contém pedaços de tecido. Para evitar contaminação com células endoteliais, não centrífugue após o vórtice na etapa 2.5. - Incubar a pelota em um tubo de 15 mL com 5 mL de colagenase tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C sob agitação contínua por 35 min. Suspenda as células com uma pipeta de 1 mL para separar as células e centrífugas a 150 × g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o supernatante e suspenda a pelota em 2 mL de DMEM completo. Centrifugar a 150 × g por 5 min a 4 °C. Repita este passo duas vezes para limpar as células.
NOTA: A pelota ainda terá alguns fragmentos de tecido. - Suspenda a pelota em 1 mL de meio completo, e emplaque as células em um poço de um prato de cultura celular de 6 poços em uma quantidade mínima de meio para facilitar seu apego ao prato de cultura. Deixe as células, sem perturbação, em uma incubadora de 37 °C com 5% de dióxido de carbono.
- Após 3 dias, verifique as células sob o microscópio para verificar um bom crescimento próximo aos detritos teciduais. Uma vez que 1.000 células são visíveis sob o microscópio, remova cuidadosamente os detritos teciduais com pinças autoclavadas, e mude o meio.
NOTA: A placa não deve ser perturbada; se o número necessário de células não for observado, coloque o prato de cultura celular de volta na incubadora por mais 2 dias. - Quando as células são 70% confluentes (2,5 × 10 5 ), experimento edepoistransferem-nas para um prato de cultura tecidual de 75 mm.
3. Análise da identidade celular e morfologia
NOTA: A coloração da imunofluorescência foi utilizada para estudar morfologia celular e contaminação de células endoteliais.
- Limpe o capô com 70% v/v/ etanol. Coloque tampas estéreis (22 mm x 22 mm) em placas de 6 poços.
NOTA: Para esterilizar as tampas, lave-as com 70% de etanol e mantenha-as no capô durante a noite sob luz ultravioleta. - Sementes 100.000 células por poço em uma placa de 6 poços. Depois de 24 horas, lave as células duas vezes em 1x PBS, e fixe-as em 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 minutos. Lave as células novamente duas vezes com 1x PBS.
NOTA: Neste ponto, as células poderiam ser mantidas em PBS a 4 °C até o início do procedimento de coloração. - Para verificar a pureza dos VICs, utilize actina muscular alfa-lisa (αSMA), vimentina e cluster de diferenciação 31 (CD31) para detectar contaminação com VECs.
- Prepare uma alíquota de tampão de bloqueio misturando 500 μL de soro normal (a mesma espécie do anticorpo secundário), 9,5 mL de 1x PBS e 30 μL de Triton X-100. Incubar as células em 2 mL do tampão de bloqueio por 1 h.
- Prepare o tampão de diluição de anticorpos contendo 30 μL de Triton X-100, 10 mL de 1x PBS e 0,1 g de albumina de soro bovino (BSA).
- Pegue uma caixa de pontas vazia, encha metade da caixa com água para criar uma câmara úmida. Cubra o suporte da ponta com um tecido molhado e, em seguida, com uma folha de parafilm.
- Pegue 1 μL do anticorpo primário e misture-o com 100 μL do tampão de diluição preparado na etapa 3.5. Coloque 50 μL do anticorpo diluído no parafilme. Pegue as tampas dos poços, vire-as e coloque-as no topo das gotas de anticorpo; incubar as células durante a noite com o anticorpo.
- Adicione 1 mL de PBS na placa de 6 poços. Retire cuidadosamente o deslizamento do parafilme, vire-o e coloque-o no poço. Lave as células com uma agitação suave contínua por 5 minutos. Substitua o PBS por PBS fresco; lavar as células 3 vezes.
- Incubar as células com o anticorpo secundário diluído (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) por 1h. Adicione 1 μL do anticorpo secundário a 500 μL do tampão de diluição de anticorpos (preparado na etapa 3.5). Cubra a placa com papel alumínio. Lave as células 3 vezes com 1 mL de 1x PBS com agitação contínua.
- Monte as tampas com 50 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI)-montagem média, e observe as células sob o microscópio para analisar a morfologia das células e contaminação do VEC.
4. Ensaio de calcificação in vitro
- Limpe o capô com 70% de etanol, aqueça o médio DMEM a 37 °C.
- Semente 100.000 células/condição em placas de 6 poços em DMEM completo, e cultura por 24 h a 37 °C.
- Prepare o meio calcificante misturando 2 mM de NaH2PO4, insulina de 10-7 M e 50 μg/mL ácido ascórbico em DMEM com 5% de FBS. Para 93 mL de DMEM, adicione 5 mL de FBS, 1 mL de antibióticos (concentração final 1%), 1 mL de piruvato de sódio (100 mM), 27,5 mgs de NaH2PO4, 5,8 μL de insulina e 5 mg de ácido ascórbico.
NOTA: Filtre a solução usando um filtro de 0,22 μm antes de usar. - Após 24 horas, substitua o meio supernante pelo meio calcificador. Incubar as células por 7 dias a 37 °C. No3º dia, substitua por meio calcificador fresco, e coloque a placa de volta na incubadora para completar os 7 dias de tratamento.
- Após 7 dias, remova o meio e lave as células duas vezes com 2 mL de 1x PBS. Incubar as células em 1 mL de ácido clorídrico de 0,6 N (HCl) por 24 h a 37 °C. Colete o HCl em um tubo de 1,5 mL e evapore-o em um evaporador rotativo. Suspenda o conteúdo de todos os tubos em 60 μL de HCL.
NOTA: O procedimento de secagem é importante para concentrar a solução e ter o mesmo volume para cada condição. - Use uma placa de 96 poços para medir a concentração de cálcio usando reagente Arsenazo III, disponível em um kit pronto para uso (consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes).
- Prepare uma solução padrão de cálcio de concentração de 10 mg/dL. Pesar 10 mg de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) e dissolver em 100 mL de água destilada.
- Em uma placa clara de 96 poços, pipet 2 μL de solução em branco (HCl, 0,6 N), a solução padrão, a amostra por poço (10 mg/dL) e as amostras. Realize o experimento em triplicado para verificar a variabilidade da pipetação. Adicione 200 μL do reagente para cada condição.
NOTA: As amostras acima de 15 mg/dL devem ser diluídas 1:1 com soro fisiológico, re-ensaio, e o resultado multiplicado por dois. - Incubar a reação por 15 minutos em temperatura ambiente.
NOTA: A reação é estável por 60 min. - Leia e grave a absorvância da placa a 650 nm. Use a seguinte fórmula para calcular a quantidade de cálcio nas amostras:
Cálcio (mg/mL) = (Absorvância de amostra/absorvância de padrão) × Concentração de padrão
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Representative Results
Como as válvulas aórticas murinas têm tipicamente 1 mm de diâmetro, pelo menos três válvulas devem ser agrupadas para coletar um milhão de células viáveis para diferentes procedimentos experimentais. As diferentes etapas do processo de isolamento VIC são mostradas na Figura 1 e Figura 2. Como é difícil raspar manualmente o tecido da válvula, é preferível usar o estresse de tesoura criado por vórtice para remover os VECs. De fato, os resultados da coloração da imunofluorescência CD31 mostraram a ausência de contaminação das células endoteliais(Figura 3D). Além disso, os VICs expressos do mouse e α-SMA, que são os principais marcadores das células válvulas (Figura 3B,C).
Mineralização celular in vitro
Um kit de reagente de cálcio foi usado para medir a concentração de cálcio; as células tratadas com meio calcificador têm maior concentração de cálcio em comparação com as células não tratadas(Figura 4A). A concentração de cálcio foi normalizada com a concentração total de proteínas. A coloração vermelha de Alizarin confirmou as medidas do kit de reagente de cálcio, mostrando nódulos de cálcio positivos vermelhos(Figura 4B).
Figura 1: Descrição da dissecção da válvula. (A) Imagem representativa de todos os instrumentos cirúrgicos necessários para a dissecção, a tesoura 2 é necessária para abrir a pele do camundongo e da tesoura 3 para abrir o peito. As pinças 5 e 6 são necessárias para segurar a pele e abrir o peito. (B) Deixe 3 mm de tecido da aorta (seta preta). (C) Corte o coração no meio dos ventrículos com a tesoura número 4. (D) Abra o coração em direção à válvula aórtica com uma tesoura 3. Use as pinças finas 7 e 8 para dissecar cuidadosamente a válvula aórtica. A válvula é visível e tem alguns pontos pretos que são característicos do tecido da válvula dos ratos (seta azul). (E) Aumente a ampliação para visualizar melhor a válvula aórtica. Isolar a válvula com a tesoura pequena 4; (F) manter o tecido com pinça 7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Descrição representativa do isolamento da célula da válvula do rato. Abreviaturas: HEPES = 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanethanesulfonic ácido; RT = temperatura ambiente; DMEM = Meio Águia modificada de Dulbecco; FBS = soro bovino fetal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fenótipo de célula da válvula do rato. Visão microscópica de (A) células válvulas recém-isoladas. Manchas de imunofluorescência mostrando(B) células vimentina-positivas e (C) α-SMA. As células são negativas para(D) coloração CD31. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôndole; CD31 = cluster de diferenciação 31; α-SMA = ato muscular alfa-liso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ensaio de calcificação in vitro. (A) Calcificação média induzida vic calcificante in vitro,que foi medida com um kit de reagente. (B) Imagem microscópica mostrando manchas positivas vermelhas (à direita) para nódulos de cálcio. (C) A coloração vermelha alizarina mostrou nódulos positivos de cálcio (seta preta) de VICs em resposta ao meio calcificador. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: CTL- = Controle; mVICs = células intersticiais valvulares do rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo apresenta um protocolo detalhado do isolamento celular da válvula do rato para a cultura primária. Três válvulas aórticas de camundongos de 8 semanas foram agrupadas para obter um número adequado de células. Além disso, este protocolo descreve a caracterização do fenótipo VIC e o ensaio de mineralização in vitro. O método foi adaptado do protocolo descrito anteriormente por Mathieu et al.7.
Durante o isolamento das válvulas aórticas, deve-se tomar cuidado para evitar todas as fontes de contágio possível para proteger as células da contaminação bacteriana ou de micoplasma. Na verdade, é crucial autoclave todas as ferramentas cirúrgicas antes de iniciar os experimentos. A solução HEPES deve ser suplementada com 1% de antibióticos para minimizar a infecção bacteriana. Além disso, o micoplasma pode causar citopatologia e, consequentemente, interferir em todos os parâmetros medidos na cultura celular10.
Células de revestimento em pratos de pequenas culturas com menor volume de cultura média é fundamental para o crescimento e proliferação do VIC. Deixar o tecido se instalar e aderir ao prato de cultura celular permite a migração celular do tecido para a parede do prato. Dado que as células isoladas de camundongos jovens proliferam mais rapidamente, recomenda-se transferir células para um prato de cultura maior de 75 cm2 após 5 dias de cultura. Manter as células até 80% de confluência é crucial para minimizar a diferenciação dos VICs a um fenótipo de miofibroblast8.
Como mostrado pela imagem de imunofluorescência, as células válvulas isoladas mostram um fenótipo semelhante ao fibroblasto. Os VICs têm um citoplasma alongado e expressam tanto a vimentina quanto a αSMA, conforme descrito por estudos anteriores. O presente trabalho confirmou que o fenótipo vic do camundongo é semelhante ao descrito anteriormente para VICssuínos 11 e VICs humanos12. A maioria dos estudos in vitro sobre estenose aórtica são realizados em células de animais de grande porte8,11. A principal desvantagem dos VICs suínos é sua diferenciação espontânea a um fenótipo osteoblasto in vitro mesmo na mídia normal13. No entanto, os VICs do mouse não calcificam espontaneamente mesmo em passagens mais altas.
Os VICs do rato diferenciam-se do fenótipo do osteoblasto em resposta ao meio calcificante usando ácido ascórbico, insulina e estimulação de fosfato. Este artigo descreve um método quantitativo de medição de cálcio usando um kit e um método qualitativo usando a coloração vermelha de Alizarin. Ambos os métodos apresentaram aumento significativo da calcificação em resposta ao tratamento médio calcificador. O kit de medição de cálcio é o método padrão-ouro, que oferece uma medição quantitativa exata de cálcio14.
No reagente Arsenazo III, a interferência de magnésio é evitada pela inclusão de sulfonato de 8 hidroxiquinolina. O cálcio reage com o reagente para formar um complexo de cor roxa, que absorve a 650 nm. A intensidade da cor é proporcional à concentração de cálcio. A precisão do reagente Arsenazo-III foi previamente validada com espectrofotometria de absorção atômica. O mesmo método é utilizado em laboratórios clínicos para medir a concentração total de cálcio em fluidos biológicos14. A calcificação na estenose aórtica é principalmente hidroxiapatita, como mostrado com a análise dispersiva de microscopia eletrônica de varredura de energia de raios-X7,12,15. De fato, é importante analisar a calcificação da membrana celular em vez de o cálcio livre para imitar com mais precisão a calcificação do tecido da válvula aórtica.
Os camundongos representam uma boa fonte de VICs para o estudo de mecanismos moleculares que levam à calcificação da válvula aórtica. No entanto, tenha em mente que os VICs in vitro não são semelhantes aos VICs em válvulas vivas. Outra limitação é o fato de que um pool de válvulas de 3-5 ratos é necessário para fazer uma única cultura celular. A piscina deve ser de ratos sem-água para minimizar as variações. Além disso, experimentos devem ser realizados em triplicado para confirmar todos os achados. No entanto, o uso de toda a válvula aórtica na cultura pode aliviar essa limitação. No entanto, esses estudos in vitro devem ser validados no tecido humano para fortalecer os achados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
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