Summary
В этой статье описывается изоляция клеток аортального клапана мыши с помощью двухэтапной коллагеназы. Изолированные клетки мышиного клапана важны для выполнения различных анализов, таких как этот анализ кальцификации in vitro, и для исследования молекулярных путей, ведущих к минерализации аортального клапана.
Abstract
Кальцификация клеток аортального клапана является отличительной чертой аортального стеноза и связана с фиброзом клапанного куспида. Клапанные интерстициальные клетки (ВИК) играют важную роль в процессе кальцификации при стенозе аорты путем активации их программы дедифференциации к остеобластоподобным клеткам. Мышиные ВИК являются хорошим инструментом in vitro для выяснения сигнальных путей, приводящих к минерализации клетки аортального клапана. Способ, описанный в настоящем описании, успешно используемый этими авторами, объясняет, как получить свежеизолированные клетки. Двухэтапная процедура коллагеназы проводилась с 1 мг/мл и 4,5 мг/мл. Первый шаг имеет решающее значение для удаления слоя эндотелиальных клеток и предотвращения любого загрязнения. Вторая инкубация коллагеназы предназначена для облегчения миграции ВИК из ткани в пластину. Кроме того, обсуждается процедура иммунофлуоресцентного окрашивания для фенотипной характеристики изолированных клеток мышиного клапана. Кроме того, анализ кальцификации проводили in vitro с использованием процедуры измерения кальциевого реагента и окрашивания ализарином красным цветом. Использование первичной культуры клеток мышиного клапана имеет важное значение для тестирования новых фармакологических мишеней для ингибирования минерализации клеток in vitro.
Introduction
Кальцинированная болезнь аортального клапана (CAVD) является наиболее распространенным заболеванием клапанного сердца в западных популяциях, затрагивающим почти 2,5% пожилых людей старше 65 лет1года. CAVD поражает более шести миллионов американцев и связан с изменениями механических свойств листочков, которые ухудшают нормальный кровоток -1,2. В настоящее время не существует фармакологического лечения, чтобы остановить прогрессирование заболевания или активировать минеральную регрессию. Единственной эффективной терапией для лечения CAVD является замена аортального клапана хирургическим путем или транскатетерная замена аортального клапана3. Поэтому крайне важно исследовать молекулярные механизмы, ведущие к минерализации клапанов, для выявления новых фармакологических мишеней. Действительно, нелеченный стеноз аорты имеет несколько неблагоприятных последствий, таких как дисфункция левого желудочка и сердечная недостаточность4.
Аортального клапана состоит из трех слоев, известных как фиброза, губчатая и желудочковая, которые содержат ВИК как преобладающий тип клеток5. Фиброза и желудочковые покрыты слоем эндотелиальных клеток сосудов (VEC)5. VEC регулируют проницаемость воспалительных клеток, а также паракринные сигналы. Повышенное механическое напряжение может повлиять на целостность VEC и нарушить гомеостаз аортального клапана, что приводит к воспалительной инвазии клеток6. Анализ сканирующей электронной микроскопии показал нарушение эндотелия в кальцинированном аортального клапане человека7.
Гистологические анализы кальцинированной ткани выявляют наличие остеобластов и остеокластов. Кроме того, остеогенная дифференцировка ВИК наблюдалась как in vitro, так и в ткани клапана человека8. Этот процесс в основном управляется связанным с Runt фактором транскрипции 2 (Runx2) и костными морфогенетическими белками (BMP)8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры для животных, описанные здесь, были одобрены Медицинской школой Икана в Институциональном ядре и комитете по использованию горы Синай.
1. Подготовка перед изоляцией клеток клапана у взрослых мышей
- Очистите и стерилизуйте все хирургические инструменты, показанные на рисунке 1А, используя 70% v/v этанола и впоследствии автоклавируя их в течение 30 мин. очистите хирургическое рабочее пространство 70% этанолом.
- Добавьте 500 мкл пенициллина-стрептомицина к 50 мл 10 мм HEPES. Приготовьте аликвоту в 50 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Держите растворы на льду.
- Приготовьте 1 мг/мл и 4,5 мг/мл растворов коллагеназы и используйте 5 мл каждого раствора в пробирках по 15 мл для выполнения всей процедуры. Чтобы приготовить 5 мл коллагеназы 1 мг/мл, смешайте 5 мг коллагеназы с 2,5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM, фетальная бытовая сыворотка (FBS)-free) и 2,5 мл 10 мМ HEPES, дополненной антибиотиками (1% пенициллин-стрептомицин со ступени 1.2). Фильтруйте растворы через фильтр 0,22 мкм, чтобы удалить любые загрязнения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите растворы на льду для защиты ферментов. - Нагрейте раствор DMEM до 37 °C перед использованием на всех этапах, описанных ниже. Готовят полную среду, дополняя ДМЭМ 1% пенициллин-стрептомицин, 1% пируват натрия, 5 мл 200 мМ L-глутамина, 1 мл реагента для элиминации микоплазмы (см. Таблицу материалов)и 10% FBS.
2. Изоляция клапанных ячеек
- Чтобы получить 106 клеток для эксперимента, используйте пять 8-недельных мышей (минимум три). Поместите мышь в индукционную камеру вместе с небольшим кусочком папиросной бумаги, пропитанным 1 мл изофлурана, но не допускайте контакта с тканью. Подтвердить, что животное полностью обезболено; проверьте рефлекс щипа на ноготь, а затем усыплите мышь при вывихе шейки матки. Используйте изофлуран для облегчения любой боли до шейного вывиха, так как процедура, описанная ниже, является терминальной.
- Поместите мышь на рассекающую платформу и зафиксируйте лапы канюлями, чтобы удерживать ее на месте. Очистить грудь и живот этанолом; открыть живот и грудь ножницами. С помощью небольших хирургических ножниц разрезают между левым предсердием и левым желудочком, чтобы отшлифовать мышь. Перфузировать сердце 10 мл холодного 1x PBS для удаления крови из сердца.
- Отрежьте сердце и держитесь на 3 мм от восходящей аорты, как показано на рисунке 1B. Рассектать аортального клапана под стереомикроскопом. Разрезать сердце горизонтально в середине желудочков(рисунок 1С). Разрезайте левый желудочек по направлению к аорте и аккуратно рассекте аортального клапана(рисунок 1D-F). Объедините клапаны вместе в небольшую 35-миллиметровую чашку для культивирование тканей.
- Промыть изолированные клапаны в чашке для культивации клеток 75 мм с 5 мл холодного HEPES (10 мМ), дополненного антибиотиками (1% пенициллин-стрептомицин) для удаления крови(рисунок 2). Подготовьте две пробирки по 15 мл коллагеназы 1 мг/мл и 4,5 мг/мл, как описано выше на этапе 1.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: После рассечения манипулируйте изолированными клапанами в стерильной вытяжке биобезопасности, чтобы свести к минимуму загрязнение. - Инкубировать клапаны в коллагеназе типа I (1 мг/мл) в течение 30 мин при 37 °C с непрерывным встряхиванием(рисунок 2). Центрифугируют трубку в течение 5 мин при 150 × г,промывают гранулу один раз 2 мл HEPES (10 мМ) и вихрь в течение 30 с на высокой скорости. Вылейте содержимое этой трубки в 35-миллиметровую культурную посуду, и аккуратно переложите фрагменты ткани тонким пинцетем в новую трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ВИК все еще не диссоциированы от ткани, и гранула содержит кусочки ткани. Чтобы избежать загрязнения эндотелиальными клетками, не следует центрифугировать после вихря на этапе 2.5. - Инкубировать гранулы в пробирке 15 мл с 5 мл коллагеназы типа I (4,5 мг/мл) при 37 °C при непрерывном перемешивании в течение 35 мин. Повторно приостанавливают клетки с помощью пипетки 1 мл для разделения клеток и центрифуги при 150 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Выбросьте супернатант и повторно суспендьте гранулу в 2 мл полного DMEM. Центрифуга при 150 × г в течение 5 мин при 4 °C. Повторите этот шаг дважды, чтобы очистить ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула все еще будет иметь некоторые фрагменты ткани. - Повторно суспендрить гранулу в 1 мл полной среды и нанести ячейки на одну скважину чашки для культивирования клеток с 6 скважинами в минимальном количестве среды, чтобы облегчить их прикрепление к чашке для культивирования. Оставьте клетки нетронутыми в инкубаторе с 37 °C с 5% углекислого газа.
- Через 3 дня проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться в хорошем росте вблизи тканевого мусора. Как только под микроскопом будет видно 1000 клеток, аккуратно удалите остатки тканей автоклавным пинцетем и измените среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Табличку не следует беспокоить; если необходимое количество клеток не наблюдается, поместите чашку для культивации клеток обратно в инкубатор еще на 2 дня. - Когда клетки будут на 70% сливаться (2,5 × 105),попробуйте и затем перенесите их в 75 мм чашку для культивирование тканей.
3. Анализ идентичности и морфологии клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентное окрашивание использовалось для изучения морфологии клеток и загрязнения эндотелиальных клеток.
- Очистите вытяжку с 70% v/v/ этанолом. Поместите стерильные крышки (22 мм х 22 мм) в 6-скважинные пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы стерилизовать крышки, промыть их 70% этанолом и держать в капюшоне на ночь под ультрафиолетовым светом. - Посеять 100 000 клеток на скважину в 6-скважинную пластину. Через 24 ч промыть клетки дважды в 1x PBS и зафиксировать их в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 20 мин. Дважды промыть ячейки с помощью 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки могут храниться в PBS при 4 °C до начала процедуры окрашивания. - Чтобы проверить чистоту ВИК, используйте альфа-гладкомышечные актины (αSMA), виментин и кластер дифференцировки 31 (CD31) для обнаружения загрязнения VEC.
- Приготовьте аликвоту блокирующего буфера, перемешав 500 мкл нормальной сыворотки (того же вида, что и вторичное антитело), 9,5 мл 1x PBS и 30 мкл Triton X-100. Инкубируют клетки в 2 мл блокирующего буфера в течение 1 ч.
- Готовят буфер разведения антител, содержащий 30 мкл тритона X-100, 10 мл 1x PBS и 0,1 г бычих сывороточных альбуминов (BSA).
- Возьмите пустую коробку с наконечниками, заполните половину коробки водой, чтобы создать влажную камеру. Накройте держатель наконечника влажной тканью, а затем листом парапленки.
- Возьмите 1 мкл первичного антитела и смешайте его со 100 мкл буфера разведения, приготовленного на этапе 3,5. Поместите 50 мкл разбавленного антитела на парапленку. Возьмите крышки из колодцев, переверните их и поместите сверху капли антител; инкубируют клетки в течение ночи с антителом.
- Добавьте 1 мл PBS в 6-скважинную пластину. Осторожно выньте крышку из парапленки, переверните ее и поместите в колодец. Промыть клетки непрерывным мягким перемешиванием в течение 5 мин. Замените PBS на свежий PBS; промыть клетки 3 раза.
- Инкубируют клетки с разбавленным вторичным антителом (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) в течение 1 ч. Добавьте 1 мкл вторичного антитела к 500 мкл буфера разбавления антител (полученный на этапе 3.5). Накройте пластину алюминиевой фольгой. Промыть клетки 3 раза 1 мл 1x PBS с непрерывным перемешиванием.
- Установите крышки с 50 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндол(DAPI)-монтажной средой и наблюдайте за клетками под микроскопом для анализа морфологии клеток и загрязнения VEC.
4. Анализ кальцификации in vitro
- Очистите вытяжку 70% этанолом, прогрейте среду DMEM до 37 °C.
- Посейте 100 000 клеток/кондицион в 6-скважинные пластины в полном DMEM и культивируете в течение 24 ч при 37 °C.
- Готовят кальцифицирующую среду, смешивая 2 мМ2PO4,10-7 М инсулина и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты в ДМЭМ с 5% FBS. К 93 мл ДМЭМ добавляют 5 мл ФБС, 1 мл антибиотиков (конечная концентрация 1%), 1 мл пирувата натрия (100 мМ), 27,5 мг2РО4, 5,8 мкл инсулина и 5 мг аскорбиновой кислоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм перед использованием. - Через 24 ч замените надмную среду на кальцифицивную среду. Инкубировать клетки в течение 7 дней при 37 °C. На3-й день замените свежей кальцифицирующим средством и поместите пластину обратно в инкубатор, чтобы завершить 7 дней лечения.
- Через 7 дней удалите среду и дважды промыть клетки 2 мл 1x PBS. Инкубируют клетки в 1 мл 0,6 Н соляной кислоты (HCl) в течение 24 ч при 37 °C. Соберите HCl в трубку 1,5 мл и испарите его во вращательном испарителе. Повторно приостановить содержание всех пробирок в 60 мкл HCl.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура сушки важна для концентрации раствора и одинакового объема для каждого состояния. - Используйте 96-скважинную пластину для измерения концентрации кальция с помощью реагента Arsenazo III, доступного в готовом к использованию наборе (см. Таблицу материалов для получения более подробной информации).
- Готовят стандартный раствор кальция концентрацией 10 мг/дл. Взвесить 10 мг гидроксида кальция (Ca(OH)2) и растворить в 100 мл дистиллированной воды.
- В прозрачной 96-скважинной пластине пипеткуют 2 мкл заготовочного раствора (HCl, 0,6 Н), стандартный раствор, образец на скважину (10 мг/дл) и образцы. Выполните эксперимент в трех вариациях, чтобы проверить изменчивость дозирования. Добавьте 200 мкл реагента для каждого состояния.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы с содержанием выше 15 мг/дл следует разбавлять физиологическим раствором 1:1, повторно провести анализ, а результат умножить на два. - Инкубируют реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция стабильна в течение 60 мин. - Считывание и запись поглощения пластины при 650 нм. Используйте следующую формулу для расчета количества кальция в образцах:
Кальций (мг/мл) = (Поглощение образца/поглощение стандартного) × Концентрация стандартного
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поскольку мышиные аортальные клапаны обычно имеют диаметр 1 мм, по крайней мере три клапана должны быть объединены, чтобы собрать миллион жизнеспособных клеток для различных экспериментальных процедур. Различные этапы процесса изоляции ВМЦ показаны на рисунках 1 и 2. Поскольку трудно вручную соскоблить ткань клапана, предпочтительно использовать сдвиговое напряжение, создаваемое вихрем, для удаления VEC. Действительно, результаты иммунофлуоресцентного окрашивания CD31 показали отсутствие загрязнения эндотелиальными клетками(рисунок 3D). Кроме того, мышиные ВИК экспрессируют виментин и α-СМА, которые являются основными маркерами клеток клапанов(рисунок 3B,C).
Минерализация клеток in vitro
Для измерения концентрации кальция использовался набор реагентов кальция; клетки, обработанные кальцифицирующим средством, имеют более высокую концентрацию кальция по сравнению с необработанными клетками(рисунок 4А). Концентрацию кальция нормализовали с общей концентрацией белка. Красное окрашивание ализарином подтвердило измерения набора кальций-реагентов, показав красные положительные кальциевые узлы(рисунок 4B).
Рисунок 1:Описание рассечения клапана. (A) Репрезентативное изображение всех хирургических инструментов, необходимых для рассечения, ножницы 2 необходимы для вскрытия кожи мыши и ножницы 3 для открытия грудной клетки. Пинцет 5 и 6 нужен, чтобы удерживать кожу и открывать грудь. (B) Оставьте 3 мм ткани из аорты (черная стрелка). (C) Разрезать сердце посередине желудочков ножницами No4. (D) Открыть сердце в сторону аортального клапана ножницами 3. Используйте тонкий пинцет 7 и 8 для тщательного рассечения аортального клапана. Клапан виден и имеет несколько черных точек, которые характерны для ткани клапана мыши (синяя стрелка). (E) Увеличьте увеличение, чтобы лучше визуализировать аортальный клапан. Изолировать клапан маленькими ножницами 4; (F)поддерживают ткани пинцетем 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Репрезентативная характеристика изоляции ячеек мышиного клапана. Сокращения: HEPES = 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота; RT = комнатная температура; DMEM = модифицированная среда Eagle Дульбекко; FBS = фетальная бытовая сыворотка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Фенотип клеток мышиного клапана. Микроскопический вид(А)свежеизолированных клеток клапана. Иммунофлуоресцентное окрашивание, показывающее(B)виментин-положительные клетки и(C)α-СМА. Клетки отрицательны для окрашивания(D)CD31. Шкала стержней = 200 мкм. Сокращения: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; CD31 = кластер дифференциации 31; α-СМА = альфа-гладкомышеный актин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Анализ кальцификации in vitro. (A) Богатаяфосфатами кальцифицирующая среда индуцировала кальцификацию ВМЦ in vitro,которую измеряли с помощью набора реагентов. (B) Микроскопическое изображение, показывающее красное положительное окрашивание (справа) для кальциевых узлов. (C)Красное окрашивание ализарином показало положительные кальциевые узлы (черная стрелка) ВИК в ответ на кальцифицирующую среду. Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: CTL- = Контроль; mVICs = клапанные интерстициальные клетки мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье представлен подробный протокол изоляции клеток мышиного клапана для первичной культуры. Три аортального клапана у 8-недельных мышей были объединены для получения достаточного количества клеток. Кроме того, этот протокол описывает характеристику фенотипа ВИЦ и анализ минерализации in vitro. Метод был адаптирован из ранее описанного протокола из Mathieu et al.7.
Во время изоляции аортальных клапанов необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать всех источников возможного заражения, чтобы защитить клетки от бактериального или микоплазмального загрязнения. Действительно, крайне важно автоклавировать все хирургические инструменты до начала экспериментов. Раствор HEPES должен быть дополнен 1% антибиотиками для минимизации бактериальной инфекции. Кроме того, микоплазма может вызывать цитопатологию и, следовательно, влиять на каждый параметр, измеренный в клеточной культуре10.
Покрытие клеток в небольших культурных блюдах с меньшим объемом питательной среды имеет решающее значение для роста и пролиферации ВМЦ. Позволяя ткани осесть и прилипать к чашке для культивирование клеток, клетка может мигрировать из ткани в стенку чашки. Учитывая, что изолированные клетки молодых мышей размножаются быстрее, рекомендуется переносить клетки в более крупную культурную чашку размером 75см2 после 5 дней культивации. Поддержание клеток до 80% слияния имеет решающее значение для минимизации дифференцировки ВИК до фенотипа миофибробластов8.
Как показала иммунофлуоресцентная визуализация, изолированные клетки клапана показывают фенотип, подобный фибробласту. ВИК имеют удлиненный цитоплазм и экспрессирует как виментин, так и αSMA, как описано в предыдущих исследованиях. Настоящая работа подтвердила, что фенотип ВИЦ мыши аналогичен фенотипу, описанного ранее для свиныхВИК 11 и ВИКчеловека 12. Большинство исследований in vitro на аортального стеноза проводятся на клетках крупных животных8,11. Ключевым недостатком свиных ВИК является их спонтанная дифференциация до фенотипа остеобластов in vitro даже в нормальных средах13. Тем не менее, мышиные ВИК не кальцинируются спонтанно даже в более высоких проходах.
Мышиные ВИК дифференцируются по фенотипу остеобластов в ответ на кальцифицирующую среду с использованием стимуляции аскорбиновой кислотой, инсулином и фосфатами. В данной статье описан количественный метод измерения кальция с помощью набора и качественный метод с использованием красного окрашивания Ализарином. Оба метода показали значительное увеличение кальцификации в ответ на обработку кальцифицирующими средами. Набор для измерения кальция является методом золотого стандарта, который предлагает точное количественное измерение кальция14.
В реагенте Arsenazo III магниевая интерференция предотвращается включением 8-гидроксихинолина сульфоната. Кальций реагирует с реагентом с образованием фиолетового цвета комплекса, который поглощается при 650 нм. Интенсивность цвета пропорциональна концентрации кальция. Точность реагента Арсеназо-III была предварительно подтверждена с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии. Этот же метод используется в клинических лабораториях для измерения общей концентрации кальция в биологических жидкостях14. Кальцинозом при стенозе аорты является в основном гидроксиапатит, как показано с помощью дисперсионной рентгеновской энергии сканирующей электронной микроскопии7,12,15. Действительно, важно анализировать кальцификацию клеточной мембраны, а не свободный кальций, чтобы более точно имитировать кальцификацию ткани аортального клапана.
Мыши представляют собой хороший источник ВИК для изучения молекулярных механизмов, приводящих к кальцификации аортального клапана. Однако имейте в виду, что ВИК in vitro не похожи на ВИК в живых клапанах. Другим ограничением является тот факт, что пул клапанов от 3-5 мышей необходим для создания одной клеточной культуры. Бассейн должен быть из мышей-однопометников, чтобы свести к минимуму вариации. Кроме того, эксперименты должны проводиться в трехягодии, чтобы подтвердить все результаты. Однако использование всего аортального клапана в культуре может облегчить это ограничение. Тем не менее, эти исследования in vitro должны быть подтверждены в тканях человека, чтобы укрепить результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C.
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P.
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
