Summary
Questo protocollo vuole essere uno strumento per studiare la steatosi e i cambiamenti molecolari, biochimici, cellulari prodotti dalla sovraeposizione degli epatociti ai lipidi in vitro.
Abstract
La steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD), precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), è la malattia epatica più diffusa in tutto il mondo a causa della sua relazione con obesità, diabete di tipo 2 e dislipidemia. La steatosi epatica, l'accumulo di goccioline lipidiche nel parenchima epatico, è una caratteristica chiave della malattia che precede l'infiammazione osservata nella steatoepatite, nella fibrosi e nella malattia epatica allo stadio terminale. L'accumulo di lipidi negli epatociti potrebbe interferire con il corretto metabolismo degli xenobiotici e delle molecole endogene, nonché indurre processi cellulari che portano all'avanzamento della malattia. Sebbene lo studio sperimentale della steatosi possa essere eseguito in vivo, gli approcci in vitro allo studio della steatosi sono strumenti complementari con diversi vantaggi. La coltura di epatociti in un mezzo condizionato da sovraccarico lipidico è un'eccellente opzione riproducibile per lo studio della steatosi epatica che consente l'identificazione dei processi cellulari legati all'accumulo lipidico, come stress ossidativo e reticolare, autofagia, proliferazione, morte cellulare, eccetera, nonché altri test tra cui l'efficacia dei farmaci e test tossicologici, tra molte altre possibili applicazioni. Qui, aveva lo scopo di descrivere la metodologia della coltura cellulare degli epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico. Le cellule HepG2 sono state coltivate in terreno RMPI 1640 condizionato con palmitato di sodio e oleato di sodio. È importante sottolineare che il rapporto di questi due lipidi è fondamentale per favorire l'accumulo di goccioline lipidiche, pur mantenendo la proliferazione cellulare e un tasso di mortalità moderato, come accade nel fegato durante la malattia. Viene mostrata la metodologia, dalla preparazione delle scorte di soluzioni lipidiche, dalla miscela, dall'aggiunta al mezzo e dalla coltura degli epatociti. Con questo approccio, è possibile identificare goccioline lipidiche negli epatociti che sono facilmente osservabili dalla colorazione O rosso olio, nonché curve dei tassi di proliferazione / mortalità.
Introduction
Il fegato grasso associato alla disfunzione metabolica è altamente prevalente in tutto il mondo1,2; si stima che fino al 25% della popolazione sia colpita3. Questa malattia precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), ha aggiornato la sua nomenclatura alla steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD) per riflettere accuratamente la patogenesi correlata all'obesità, all'insulino-resistenza, al diabete di tipo 2 e alla dislipidemia, nonché le possibili gestione della malattia3,4.
Indipendentemente dal nome, la malattia comprende un ampio spettro di cambiamenti istopatologici caratterizzati da un accumulo anormalmente elevato di lipidi nel fegato (>5% di grasso negli epatociti5) e potrebbe progredire attraverso l'accumulo lipidico tipicamente riscontrato nella steatosi semplice alla steatoepatite, che a sua volta potrebbe portare allo sviluppo di fibrosi, cirrosi, carcinoma epatocellulare e insufficienzaepatica 5,6,7,8. A causa della sua crescente prevalenza, MAFLD dovrebbe diventare la prima indicazione del trapianto di fegato e la principale causa di carcinoma epatocellulare9.
Sebbene sia stata considerata una forma benigna o lieve di malattia del fegato grasso, la steatosi epatica è in realtà la chiave metabolica in MAFLD10. Diverse vie metaboliche sono influenzate dall'accumulo di lipidi nel fegato, inclusi ma non limitati alla sintesi lipidica, all'esportazione e al metabolismo10. La resistenza all'insulina, lo stress ossidativo, lo stress reticolare e la disfunzione cellulare sono fortemente associati alla linotossicitàepatica 11,12. D'altra parte, gli epatociti grassi sono il bersaglio delle specie reattive dell'ossigeno, rendendo metaboliti come perossidi lipidici, carbonili proteici e addotti di acidi nucleici13. A livello cellulare, gli epatociti grassi potrebbero subire danni mitocondriali14, senescenza cellulare15, apoptosi16, piroptosi12e autofagia17, tra gli altri eventi.
Gli epatociti sono altamente responsabili del metabolismo, della disintossicazione e della sintesi di una vasta gamma di molecole. Molte di queste funzioni potrebbero essere compromesse dall'accumulo lipidico osservato nella steatosi. Pertanto, è di grande importanza disporre di strumenti riproducibili che consentano una valutazione accurata della steatosi. In questo senso, i modelli in vitro sono facilmente applicabili e altamente riproducibili. La steatosi in vitro è stata utilizzata con diversi obiettivi16,18,19. Le cellule HepG2 sono ampiamente utilizzate come linea cellulare di epatociti. Ha vantaggi come essere facile da cultura e ben caratterizzato. Forse, l'unico svantaggio delle cellule HepG2 è il fatto che si tratta di una linea cellulare cancerogena, quindi questo deve essere considerato quando si analizzano i risultati. Qui, viene mostrata l'applicazione di una miscela di acidi grassi ampiamente utilizzati nella coltura cellulare: acido palmitico (PA) e acido oleico (OA). Sia PA che OA offrono risultati diversi nella cultura20. PA (C 16:0) è l'acido grasso saturo più comune ottenuto dalla dieta16. La PA è considerata un biomarcatore della lipogenesi de-novo,un passo cruciale nello sviluppo della NAFLD21. Il PA si è dimostrato altamente tossico22; pertanto, potrebbe non essere raccomandato indurre la steatosi in vitro. OA (C 18:1) è un acido grasso monoinsaturo. In contrasto con la PA, l'OA è stato suggerito per possedere proprietà antinfiammatorie e antiossidanti, essendo in grado di contrastare PA12. Sia PA che OA sono i principali acidi grassi presenti nei trigliceridi, indipendentemente dalle condizioni di salute o dalla malattia16. La Tabella 1 fornisce esempi della coltura di epatociti con PA, OA e la loro miscela, nonché i risultati riportati12,23,24,25,26,27. Altri acidi grassi sono stati utilizzati anche nella coltura degli epatociti, tra cui l'acido stearico (C 18:0)28,29,30,l'acido linoleico (C 18:1)28,30,31 e i suoi coniugati (CLA)28,32,l'acido palmitoleico (C 16:1)29. Tuttavia, il loro uso è meno frequentemente riportato in letteratura, forse perché la loro abbondanza epatica è inferiore a PA e OA16.
In combinazione, entrambi gli acidi grassi assomigliano alla steatosi in vitro, fornendo cellule proliferanti, con aumento della morte cellulare e minore vitalità rispetto alle condizioni di controllo. Vale la pena ricordare che i rispettivi sali di questi acidi grassi sono disponibili e possono essere utilizzati pure. Uno dei problemi principali nella valutazione del sovraccarico lipidico nella coltura cellulare degli epatociti è dato nella differenziazione tra modelli tossicologici e un modello che rappresenta al meglio la steatosi. Molti modelli possono essere contabilizzati nel primo caso. In effetti, l'uso della PA da solo potrebbe essere considerato tra questi, e l'alta mortalità è l'esito più evidente12,16,23,24,25,26,27. L'uso di dosi elevate anche nel caso di OA può anche essere considerato come un modello tossicologico. Il protocollo qui mostrato è in maggiore conformità con lo sviluppo della steatosi poiché mostra una bassa mortalità rispetto a quella osservata in altri modelli e consente di seguirlo per diversi giorni con accumulo lipidico progressivo come si verifica nella NAFLD. La possibilità di valutare la steatosi lieve e grave attraverso condizioni sperimentali è considerata un altro vantaggio.
| Acidi | Condizioni | Risultati | Riferimento | ||
| BABBO | Concentrazione: 200 μM | Accumulo di lipidi | Yan et al, 201925. | ||
| Tempo di esposizione: 24 h | Danno agli epatociti | ||||
| Elevazione delle transaminasi | |||||
| BABBO | Concentrazione: 50, 100 e 200 μM | Accumulo di lipidi | Xing et al, 201924. | ||
| Tempo di esposizione: 24 h | |||||
| BABBO | Concentrazione: 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1.000 μM | Accumulo di lipidi | Wang et al, 202026. | ||
| Tempo di esposizione: 24 h | Riduzione progressiva della vitalità cellulare | ||||
| Mix di OA/PA | Concentrazione: 1 mM | Accumulo di lipidi | Xiao et al, 202027. | ||
| Tempo di esposizione: 24 h | Non segnala linotossicità | ||||
| Tariffa: 2OA: 1PA | |||||
| Mix di OA/PA | Prima stimolazione con 200 μM e 400 μM di PA e poi seconda stimolazione con 200 μM di OA | Accumulo di lipidi. | Zeng et al, 202012. | ||
| Concentrazione:400 μM PA: 200 μM OA | L'evidenza di licotossicità indotta dalla PA è stata ridotta dalla stimolazione dell'OA. | ||||
| Tariffa: 2PA: 1OA | |||||
| Tempo di esposizione: 24 h | |||||
| Mix di OA/PA | Concentrazione: 400 μM PA: 200 μM OA | Accumulo di lipidi | Chen et al, 201823. | ||
| Tariffa: 2PA: 1OA | |||||
| Tempo di esposizione: 24 h | |||||
| Mix di OA/PA | Concentrazione: 50 e 500 μM | Generazione di due tipi di steatosi: steatosi lieve e steatosi grave. |
Campos e Guzmán 2021 | ||
| Tariffa: 2PA: 1OA | Simula l'esposizione cronica del sovraccarico lipidico | ||||
| Tempo di esposizione: 24 h, 2 giorni, 3 giorni e 4 giorni. | |||||
Tabella 1. Coltura di epatociti in condizioni steatogene. La tabella presenta il tipo di acido grasso utilizzato, le condizioni mantenute e i risultati osservati nella coltura degli epatociti. PA: Acido palmitico. OA: Acido oleico.
Infine, questo modello è applicabile non solo allo studio della steatosi e del fegato grasso, ma anche alle vie epatiche metaboliche, sintetiche e di disintossicazione nel contesto della steatosi. Inoltre, la steatosi indotta in vitro potrebbe fornire prove per l'identificazione di potenziali marcatori della malattia e bersagli terapeutici.
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Protocol
1. Preparazione del mezzo standard e condizionato
- Per preparare rpmI 1640 standard, integrare il terreno di coltura RPMI 1640 con il 10% (v/v) di siero bovino fetale (FBS, precedentemente inattivato dal calore) e l'1% (v/v) di soluzione di penicillina-streptomicina. Conservare il mezzo a 4 °C.Sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 μm.
- Per preparare la soluzione stock di palmitato, preparare una soluzione di palmitato da 50 mM nello standard RPMI 1640 precedentemente integrato con l'1% di albumina sierica bovina (priva di lipidi). Un volume di 5-10 ml di questo stock sarà sufficiente. Sterilizzare la soluzione stock utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce per un massimo di 1 mese.
- Per preparare la soluzione stock di oleati, preparare una soluzione di oleato da 50 mM nello standard RPMI 1640 precedentemente integrato con l'1% di albumina sierica bovina (priva di lipidi). Un volume di 10 ml sarà sufficiente. Sterilizzare la soluzione stock utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare a -20 °C al riparo dalla luce per un massimo di 1 mese.
- Per preparare il mezzo steatogeno dalle scorte precedentemente preparate, preparare un palmitato in 1 parte: mezzo steatogeno oleato in 2 parti a due possibili livelli: steatosi lieve e grave.
- Steatosi lieve: Preparare 100 mL di palmitato in 1 parte: oleato in 2 parti (50 μM) miscela in RPMI 1640 standard. Sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
- Steatosi grave: preparare 100 mL di una miscela di palmitato in 1 parte: oleato in 2 parti (500 μM) in RPMI 1640 standard. Sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
- Preparazione alternativa per le soluzioni stock.
- Preparare entrambe le soluzioni stock utilizzando i rispettivi acidi grassi utilizzando l'albumina lipidica libera come indicato sopra.
- Quando manca l'albumina lipidica libera, utilizzare sali di palmitato e oleato.
- Sciogliere il palmitato o l'oleato in 2 ml di etanolo assoluto e quindi mescolare nel volume finale dello standard RPMI 1640 (5-10 ml). Sciogliere l'oleato direttamente mescolando nel terreno di coltura standard RPMI 1640.
- Consentire l'evaporazione dell'etanolo incubandolo a bagnomaria a 70 °C; mescolare accuratamente.
- In ogni caso, sterilizzare entrambe le soluzioni stock utilizzando filtri da 0,22 μm. Conservare la soluzione stock di palmitato a 4 °C e la soluzione stock di oleato a - 20 °C. Proteggi entrambe le soluzioni dalla luce. Queste soluzioni sono stabili per 1 mese.
2. Pre-cultura
- Semina 100.000 cellule HepG2 per pozzetti in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 standard.
- Pre-incubazione a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore, consentendo il fissaggio della cella.
3. Coltura steatogena
- Dopo la precoltura, scartare il mezzo standard RPMI 1640 e aggiungere il mezzo steatogeno di conseguenza.
- Scartare il surnatante e aggiungere un mezzo steatogeno fresco ogni 24 ore.
4. Valutazione della vitalità e della mortalità
- Semina 100.000 cellule HepG2 per pozzetti in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 standard.
- Pre-incubazione per 24 ore a 37 °C e 5% CO2.
- Cambiare il mezzo standard RPMI 1640 per il mezzo steatogeno.
- Incubare per 24 ore, 2 giorni, 3 giorni e 4 giorni rinfrescando il mezzo steatogeno ogni 24 ore.
- Dopo il tempo appropriato, scartare il surnatante.
- Staccare le cellule dal pozzo aggiungendo 500 μL di tripsina-EDTA allo 0,05%. Incubare per 5 minuti a 37 °C e 5% CO2.
- Raccogliere le cellule sospese in un microtubo.
- Centrifugare a 300 x g ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 200 μL di RPMI 1640 standard e risospentare le celle.
- Aggiungere 15 μL di soluzione blu di trypan allo 0,4% in un microtubo fresco. Mescolare con 15 μL della precedente sospensione cellulare.
- Contare le cellule macchiate e non macchiate in un emocitometro.
- Calcola i tassi di vitalità e mortalità di conseguenza.
Vitalità =
Mortalità =
5. Colorazione lipidica con Oil-Red O
- Metti una copertura di coltura cellulare in ogni pozzo in una piastra a 24 pozzetti.
- Semina 100.000 cellule HepG2 per pozzo. Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 standard.
- Pre-incubazione a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore.
- Cambiare il mezzo standard RPMI 1640 per il mezzo steatogeno.
- Incubare per 24 ore, 2 giorni, 3 giorni e 4 giorni, rinfrescando il mezzo steatogeno ogni 24 ore.
- Dopo il tempo appropriato, scartare il surnatante.
- Lavare con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Scartare il surnatante.
- Fissare con 1 ml di paraformaldeide al 4% in PBS.
- Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Scartare l'eccesso di paraformaldeide.
- Risciacquare le cellule con 1 mL di acqua distillata.
- Aggiungere 1 mL di isopropanolo al 70% e incubare per 5 min.
- Scartare l'eccesso di isopropanolo. Un lavaggio PBS non è necessario a questo punto.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di O rosso olio e incubare per 30 minuti.
- Scartare l'eccesso della soluzione O rosso olio.
- Risciacquare con 1 mL di acqua distillata.
- Aggiungere 500 μL di soluzione di ematossilina. Incubare per 3 min.
- Scartare l'eccesso di soluzione di ematossilina.
- Risciacquare con 1 mL di acqua distillata.
- Osservare al microscopio con un ingrandimento di 400x (Obiettivo 40x, Oculare 10x).
6. Valutazione morfometrica del contenuto lipidico
- Seleziona e cattura in modo casuale fotografie di 10 campi ottici dall'area completa del pozzo. Ripeti per ogni pozzo.
- Valuta la percentuale di area macchiata di rosso utilizzando lo strumento Soglia colore nel software ImageJ secondo Ferreira e Rasband33.
- Confronta l'area macchiata con l'area completa del campo ottico utilizzando lo strumento Analizza particelle nel software ImageJ secondo Ferreira e Rasband33.
- Calcola la percentuale media di ogni pozzo.
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Representative Results
Gli epatociti coltivati nel mezzo steatogeno mostrano una crescita su tutta la superficie del pozzo; tuttavia, gli epatociti grassi mostrano un tasso di crescita inferiore rispetto alle cellule coltivate in mezzo di controllo. Il rapporto proposto e la concentrazione di OA e PA, garantiscono la sopravvivenza cellulare durante la coltura. La semina 1 x 105 cellule per pozzetti in piastre a 24 pozzetti fornisce una confluenza ottimale come mostrato nella Figura 1.
La vitalità nelle cellule in coltura era inferiore nei gruppi steatogeni, lievi e gravi, rispetto alle condizioni di controllo. Infatti, la vitalità è progressivamente diminuita con l'aumentare del tempo della coltura, raggiungendo il minimo del 60% a 4 giorni nella steatosi grave (Figura 2A). Di conseguenza, il tasso di mortalità era più alto negli epatociti coltivati in condizioni steatogene e aumentava progressivamente con il tempo di esposizione ai lipidi (Figura 2B). Il numero di cellule è aumentato progressivamente a seguito della proliferazione (Figura 2C). Tuttavia, il tasso di proliferazione era più basso nella steatosi lieve a 3 giorni e 4 giorni. Al contrario, la steatosi grave è stata associata a una minore proliferazione a partire da 24 ore.
Le cellule HepG2 coltivate nel protocollo proposto mostrano la caratteristica più importante della steatosi, l'accumulo lipidico intracellulare. La colorazione delle cellule con Oil Red O ha permesso di osservare almeno un aumento di due volte delle goccioline lipidiche nelle cellule coltivate in condizioni steatogene come mostrato in Figura 3 e Figura 4. Il grasso intracellulare è aumentato in base al tempo di esposizione della coltura nel mezzo steatogeno (Figura 3). Nella steatosi lieve, il contenuto lipidico è aumentato dal giorno 2, mentre nella steatosi grave, erano significativamente alti da 24 ore.
Figura 1: Crescita cellulare. Coltura di epatociti HepG2 sotto controllo (Figura 1A-D) e condizioni steatogene lievi (Figura 1E-H). Le fotografie mostrano una crescita da 1-4 giorni di cultura. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Redditività e tassi di mortalità. (A) Vitalità. b)Mortalità. (C) Numero di cella. La coltura di epatociti HepG2 in condizioni di controllo e steatogene sono state valutate per la vitalità e i tassi di mortalità mediante colorazione blu di tripano. Media ± SD. Due esperimenti indipendenti in triplice copia per tempo di cultura. Cerchi: condizioni di controllo; Quadrati: steatosi lieve; Triangoli: grave steatosi. ANOVA unizionale è stato utilizzato per confrontare le condizioni e il tempo di coltura per la stessa condizione. p < 0,05 è stato considerato significativo: "*"- controllo vs steatosi grave; "§"- controllo vs steatosi lieve; "¶"- steatosi lieve vs grave. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Accumulo lipidico. La coltura di epatociti HepG2 in condizioni di controllo e steatogene è stata valutata per il contenuto lipidico mediante colorazione O rosso olio seguita da un'analisi morfometrica utilizzando il software ImageJ (NIH, USA). La percentuale di lipidi si riferisce alla percentuale di area macchiata da Oil-Red O (lipidi) considerando il 100% come l'area completa di ciascun campo ottico analizzato. Media ± SD. Due esperimenti indipendenti in triplice copia per tempo di cultura. Cerchi: condizioni di controllo; Quadrati: steatosi lieve; Triangoli: grave steatosi. ANOVA unizionale è stato utilizzato per confrontare le condizioni e il tempo di coltura per la stessa condizione. p < 0,05 è stato considerato significativo: "*"- controllo vs steatosi grave; "§"- controllo vs steatosi lieve; "¶"- steatosi lieve vs grave. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Steatosi in vitro. Le coltura di epatociti HepG2 in controllo (Figura 4A-D), le condizioni steatogene lievi (Figura 4E-H) e gravi steatogene (Figura 4I-L) sono state valutate per il contenuto lipidico mediante colorazione O rossa di olio. Le fotografie mostrano goccioline lipidiche epatocitarie da 24 ore a 4 giorni. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo ha lo scopo di fornire una strategia per studiare la steatosi in vitro. La coltura cellulare è un potente strumento per studiare gli aspetti cellulari, molecolari, biochimici e tossicologici delle cellule esposte a diverse condizioni. Con questo approccio, la steatosi può essere visualizzata non solo come uno stadio della malattia complessa che è MAFLD, ma anche come la sovraesposizione degli epatociti ai lipidi e i possibili esiti derivanti da tale esposizione. Pertanto, la sua applicazione non è limitata alla fisiopatologia di MAFLD, ma al fatto che i pazienti con fegato grasso sono esposti a farmaci terapeutici, contaminanti, tra le altre condizioni che potrebbero essere influenzate dalla steatosi. Pertanto, questo protocollo ha potenziali applicazioni in tossicologia, farmacologia e identificazione di bersagli terapeutici per il trattamento della malattia.
Allo sviluppo di questo protocollo, uno dei passaggi più critici è la preparazione del mix steatogeno: 1 parte di palmitato: 2 parti di oleato, che induce steatosi dal giorno 2 (Figura 3, Figura 4), consentendo agli epatociti di proliferare - nonostante una modesta diminuzione del tasso di vitalità e un aumento del tasso di mortalità (Figura 2). Tuttavia, la diminuzione della redditività non dovrebbe superare il 30%-40%, poiché ciò potrebbe rappresentare un effetto tossico piuttosto che uno che potrebbe essere seguito a lungo termine. La steatosi epatica è il risultato di una sovraesposizione a lungo termine ai lipidi. In questo senso, i lipidi si accumulano, in un primo momento, con lievi affezioni sugli epatociti, come osservato in questo modello. Un'altra caratteristica è il profilo delle goccioline lipidiche. Nella steatosi lieve, si osserva un aumento delle dimensioni delle goccioline lipidiche durante la progressione della coltura (Figura 4E-H). Nella steatosi grave, la dimensione delle goccioline è considerevolmente più alta rispetto alla steatosi lieve (Figura 4I-L), mentre i controlli non mostrano cambiamenti nella dimensione delle goccioline lipidiche (Figura 4A-D).
È preferibile conservare sia il mezzo steatogeno lieve che quello grave a 4 °C per un massimo di una settimana. Successivamente, si consiglia di preparare un mezzo steatogeno fresco. Tuttavia, lo stock OA può essere conservato a -20 °C per un massimo di un mese, mentre lo stock PA può essere conservato a 4 °C per un massimo di un mese. L'utilizzo di queste soluzioni stock dopo il tempo suggerito potrebbe rappresentare un rischio di degradazione degli acidi grassi. Per garantire la corretta concentrazione delle soluzioni prima di ogni utilizzo, si raccomanda di misurare le concentrazioni di acidi grassi mediante un kit di analisi degli acidi grassi non esterificati (NEFA).
PA e OA, così come i rispettivi sali, sono stati utilizzati separatamente per indurre l'accumulo di lipidi; tuttavia, le differenze sono osservate per ogni acido grasso16,20. Da un lato, il palmitato usato da solo è un buon induttore della steatosi. Induce morte cellulare, insulino-resistenza epatica, disfunzione mitocondriale, stress reticolare16,34,35,36. Tuttavia, il palmitato è altamente tossico16,34, e gli esiti attesi dall'uso di esso da solo in coltura includono una minore vitalità e una maggiore mortalità rispetto alla miscela di PA e OA16,20. D'altra parte, l'oleato induce anche la steatosi. Induce de novo lipogenesi, insulino-resistenza37,38,e iperproliferazione38. Tuttavia, gli esiti osservati con l'oleato sono spesso più lievi rispetto al palmitato e alla miscela16,20. Questo potrebbe essere correlato al suo ruolo protettivo. L'oleato è il componente principale dell'olio d'oliva, un ingrediente chiave nella dieta mediterranea, una delle ben note strategie di successo contro MAFLD39.
Questo protocollo potrebbe essere considerato come un bel strumento per studiare la steatosi grazie alla sua riproducibilità e al breve tempo necessario per ottenere risultati. Questo è in confronto con l'utilizzo di modelli sperimentali di MAFLD, aggiungendo il fatto che non implica le questioni etiche inerenti all'utilizzo di modelli di roditori. Questo protocollo consente di essere seguito per diversi giorni, a condizione che il mezzo steatogeno venga aggiornato ogni 24 ore. Questo modello è anche conveniente e possiede una vasta gamma di applicazioni. Può anche essere adattato ad altre linee cellulari, non solo epatociti, ma una vasta gamma di cellule colpite dalla sovraesposizione lipidica durante l'obesità. Uno dei limiti di questo protocollo è l'uso di celle HepG2. Poiché si tratta di una linea cellulare cancerogena, potrebbe nascondere o aumentare alcuni risultati. Tuttavia, l'applicazione delle cellule HepG2 in questi tipi di studi è ampiamente accettata a causa della sua somiglianza nel metabolismo lipidico con gli epatociti sani40. L'uso della miscela PA:2OA potrebbe anche rivelarsi controverso in quanto non assomiglia completamente ai profili di NEFA osservati nel sangue dei pazienti NAFLD/MAFLD41. Altri acidi grassi, tra cui gli acidi linolenico o stearico, potrebbero essere inclusi in ulteriori modifiche e miglioramenti di questo protocollo. Un'altra limitazione è il fatto che viene studiato un solo tipo di cellula, gli epatociti, mancando l'interazione con altre cellule epatiche presenti nel fegato, tra cui cellule endoteliali sinusoidali, Kupffer, stellate epatiche, ecc., Che sono impegnate nella progressione della MAFLD. Inoltre, questo è un modello per indurre esclusivamente la steatosi, senza progressione verso steatoepatite e fibrosi.
In conclusione, lo studio fornisce un protocollo in vitro di steatosi epatocitaria facile da implementare, riproducibile e con una vasta gamma di applicazioni nello studio della steatosi e della funzione epatocitaria nel contesto del fegato grasso.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos è una dottoranda presso il Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, ed è stata sostenuta da Conacyt (CVU: 1002502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
References
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).
- Eslam, M., et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement. Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).
- Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).
- Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
- Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. The natural course of non-alcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774 (2016).
- Reccia, I., et al. Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease. Metabolism. 72, 94-108 (2017).
- Tomita, K., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).
- Byrne, C. D., Targher, G.
- Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).
- Diehl, A. M., Day, C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Zeng, X., et al. Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis. Nutrition and Metabolism. 17, London. 11 (2020).
- Ore, A., Akinloye, O. A. Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease. Medicina (Kaunas). 55 (2), 26 (2019).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).
- Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).
- Gomez, M. J., et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).
- Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).
- Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. In vitro cell culture models of hepatic steatosis. Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).
- Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Lee, Y., et al. Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119 (2020).
- Alnahdi, A., John, A., Raza, H. Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid. Nutrients. 11 (9), 1979 (2019).
- Chen, X., et al. Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis. Life Sciences. 203, 291-304 (2018).
- Xing, J. H., et al. NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction. Life Sciences. 239, 116882 (2019).
- Yan, H., et al. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).
- Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells. Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).
- Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease. Life Sciences. 256, 117997 (2020).
- Avila, G., et al. In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes. Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).
- Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).
- Oh, J. M., et al. Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells. Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).
- Stellavato, A., et al. In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model. Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24 (2018).
- Pachikian, B. D., et al. Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis. PLoS One. 13 (2), 0192447 (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. ImageJ User Guide. , Ch. 30 132-135 (2012).
- Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology. , 404 (2020).
- Geng, Y., et al. Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621 (2020).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626 (2020).
- Chen, J. W., et al. Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).
- Burhans, M. S., et al. Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation. Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).
- Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease. Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).
- Nagarajan, S. R., et al. Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
