Summary
이 프로토콜은 체외에서지질에 간세포의 과잉 노출에 의해 생성 된 steatosis 및 분자, 생화학, 세포 변화를 연구하는 도구가 될 것입니다.
Abstract
이전에 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)으로 알려진 대사 기능 장애 관련 지방간 질환(MAFLD)은 비만, 당뇨병 제2형 및 이상지질혈증과의 관계로 인해 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 간 질환입니다. 간 절제기증에 지질 방울의 축적인 간 질비증은, 염자 간염, 섬유증 및 말기 간 질환에서 관찰되는 염증을 선행하는 질병의 주요 특징이다. 간세포에 지질 축적은 xenobiotics와 내인성 분자의 적절한 신진 대사를 방해할 뿐만 아니라 질병의 진보로 이어지는 세포 과정을 유도할 수 있습니다. steatosis의 실험 연구는 생체 내에서수행 될 수 있지만, 스테토시스의 연구에 대한 체외 접근은 다른 장점을 가진 보완 도구입니다. 지질 과부하 조절 배지의 간세포 배양은 산화 및 망상 응력, 자가식, 증식, 세포사멸, 등등 지질 축적과 관련된 세포 과정의 식별을 허용하는 간 간 스테토시스 연구를 위한 우수한 재현 가능한 옵션뿐만 아니라 약물 효과성, 독성 검사 등 다른 많은 응용 분야 중에서도 볼 수 있다. 여기서, 지질 과부하 조절 배지에서 간세포 배양의 방법론을 기술하는 것을 목표로 하였다. HepG2 세포는 팔미타트 나트륨과 올레아테 나트륨으로 조절된 RMPI 1640 배지에서 배양되었다. 중요한 것은, 이 2개의 지질의 비율은 질병 도중 간에서 생기는 것과 같이 세포 증식 및 적당한 사망률을 유지하면서 지질 물방울 축적을 선호하기 위하여 중요합니다. 방법론은, 지질용액주식의 제조로부터, 혼합물, 배지, 및 간세포 배양에 첨가된 것이 도시된다. 이 접근법으로, 오일 레드 O 스테인링에 의해 쉽게 관찰 할 수있는 간세포에서 지질 방울뿐만 아니라 증식 / 사망률의 곡선을 식별 할 수 있습니다.
Introduction
신진 대사 기능 장애와 관련 된 지방 간은 전 세계적으로 매우 널리 퍼집니다1,2; 인구의 최대 25%가3에영향을 받는 것으로 추정됩니다. 이전에 비알코올성 지방간질환(NAFLD)으로 알려진 이 질환은 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병형 2형, 이상지질혈증과 관련된 병발생을 정확하게 반영하기 위해 대사 기능 장애관련 지방간질환(MAFLD)에 대한 명칭을 업데이트하고 있으며, 질병3,4의가능한 관리와 함께 가능하다.
이름에 관계없이, 질병은 간에서 지질의 비정상적으로 높은 축적을 특징으로 하는 조직 병리학적 변화의 넓은 스펙트럼을 포함 (>5% 간세포에서 지방의 지방의5)그리고 일반적으로 간단한 steatosis에서 발견 지질 축적을 통해 진행 될 수 있습니다., 차례로 섬유증의 개발로 이어질 수 있습니다., cirrhis, cirrhisis의 개발로 이어질 수 있습니다. 간세포 암및 간부전5,6,7,8. 그것의 증가 보급 때문에, MAFLD는 간 이식의 첫번째 표시 및 간세포암9의주요한 원인이 될 것으로 예상됩니다.
그것은 지방 간 질환의 양성 또는 온화한 형태로 간주 되었지만, 간 steatosis는 사실 MAFLD에서 신진 대사 키10. 다른 신진 대사 경로는 간에서 지질 축적에 의해 영향을 받습니다., 포함 하 여 하지만 지질 합성에 제한, 수출, 그리고 신진 대사10. 인슐린 저항성, 산화 스트레스, 망상 스트레스 및 세포 기능 장애는 간 리포독성(11,12)과강하게 연관된다. 한편, 지방 간세포는 반응성 산소 종의 표적으로, 지질 과산화물, 단백질 탄산염 및핵산(13)의부관으로 대사산물을 렌더링한다. 세포 수준에서, 지방 간세포는 미토콘드리아손상(14,세포 노화15,세포 노화16,파이롭토시스12,및자가식(17)을겪을 수 있다.
간세포는 신진 대사에 대 한 높은 책임, 해독, 그리고 분자의 넓은 범위의 합성. 이러한 기능의 대부분은 steatosis에서 관찰 된 지질 축적에 의해 손상 될 수 있습니다. 따라서 steatosis를 정확하게 평가할 수 있는 재현 가능한 도구를 갖는 것이 매우 중요합니다. 이러한 의미에서 체외 모델은 쉽게 적용 가능하고 재현성이 높습니다. 체외에서 Steatosis는 다른 목표와 함께 사용 되었습니다16,18,19. HepG2 세포는 간세포 세포주로서 널리 사용된다. 문화가 쉽고 잘 특징지어지는 등의 장점이 있습니다. 아마도 HepG2 세포의 유일한 단점은 발암 세포주라는 사실이므로 결과를 분석 할 때 고려해야합니다. 여기서, 세포 배양에 널리 사용되는 지방산의 혼합물의 적용이 도시된다: 팔미산(PA) 및 올레산(OA)이 도시된다. PA와 OA 모두 문화20에서다른 결과를 제공합니다. PA(C 16:0)는 다이어트16에서얻은 가장 흔한 포화 지방산이다. PA는 NAFLD21의개발에 중요한 단계인 드노보 리포게네시스의바이오마커로 간주됩니다. PA는 매우 독성이 높은 것으로 나타났다22; 따라서 시험관내에서스테토시스를 유도하는 것이 좋습니다. OA (C 18:1)는 단일 불포화 지방산이다. PA와 는 달리, OA는 항 염증 및 산화 성분을 소유하는 것이 제안되었으며 PA12에중화할 수 있습니다. PA와 OA 는 모두 건강 또는질병(16)의상태에 관계없이 트리글리세라이드에 존재하는 주요 지방산이다. 표 1은 PA, OA 및 그 혼합물을 가진 간세포 배양의 예를 제공하며,12,23,24,25,26,27을보고한 결과도 제공한다. 다른 지방산은 또한 스테레산(C 18:0)28,29,30,리놀레산(C 18:1)28,30,31 및 그 컨쥬게이트(CLA)28,32,팔미톨레산(C 16:1)29를포함하는 간세포 배양에도 사용되어 왔다. 그러나, 그들의 사용은 문헌에서 가장 자주 보고됩니다, 아마도 그들의 간 풍부가 PA와 OA16보다는 더 낮기 때문에.
함께, 두 지방산은 시험관 내의 스테토시스와 유사하여, 증식 세포를 제공하며, 세포 사망률이 증가하고 대조군 조건에 비해 생존가능성이 낮습니다. 이러한 지방산의 각 염분도 사용할 수 있으며 사용할 수 있다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 간세포 배양에서 지질 과부하를 평가할 때 주요 문제 중 하나는 독성 모델과 스테토시스를 가장 잘 나타내는 모델 간의 분화에서 주어진다. 첫 번째 경우많은 모델을 설명할 수 있습니다. 사실, PA의 사용만으로도 그 중에서도 고려될 수 있으며, 사망률이 가장 높은 결과는12,16,23,24,25,26, 26,27로가장 뚜렷한 결과이다. OA의 경우에도 고용량의 사용은 독성 모델로 간주 될 수있다. 여기에 표시된 프로토콜은 다른 모델에서 관찰된 것과 비교하여 낮은 사망률을 나타내고 NAFLD에서 발생하는 점진적 지질 축적으로 며칠 동안 따를 수 있기 때문에 steatosis 발달에 따라 더 높습니다. 실험 조건을 통해 경미하고 가혹한 steatosis를 평가하는 가능성은 또 다른 이점으로 간주됩니다.
| 지방산 | 여건 | 결과 | 참조 | ||
| PA | 농도: 200 μM | 지질 축적 | Yan et al, 201925. | ||
| 시간 노출: 24 시간 | 간세포 손상 | ||||
| 트라미나제 고도 | |||||
| PA | 농도: 50, 100 및 200 μM | 지질 축적 | Xing 외, 201924. | ||
| 시간 노출: 24 시간 | |||||
| PA | 농도: 250 μM, 500 μM, 750 μM 및 1,000 μM | 지질 축적 | 왕 외, 202026. | ||
| 시간 노출: 24 시간 | 세포 생존가능성의 점진적 감소 | ||||
| OA/PA의 혼합 | 농도: 1 mM | 지질 축적 | 샤오 외, 202027. | ||
| 시간 노출: 24 시간 | 리포 독성을 보고하지 않음 | ||||
| 요금: 2OA:1PA | |||||
| OA/PA의 혼합 | PA 200 μM 및 400 μM의 첫 번째 자극 및 OA 200 μM의 두 번째 자극 | 지질 축적. | Zeng 외, 202012. | ||
| 농도:400 μM PA: 200 μM OA | PA에 의해 유도된 지방 독성의 증거는 OA의 자극에 의해 감소되었다. | ||||
| 요금: 2PA:1OA | |||||
| 시간 노출: 24 시간 | |||||
| OA/PA의 혼합 | 농도: 400 μM PA: 200 μM OA | 지질 축적 | 첸 외, 201823. | ||
| 요금: 2PA:1OA | |||||
| 시간 노출: 24 시간 | |||||
| OA/PA의 혼합 | 농도 :50 및 500 μM | 두 가지 유형의 스테토시스 의 생성 : 온화한 스테토시스와 심한 스테토시스. |
캄포스와 구즈만 2021 | ||
| 요금: 2PA:1OA | 지질 과부하의 만성 박람회 시뮬레이션 | ||||
| 시간 노출: 24시간, 2일, 3일, 4일. | |||||
표 1. 스테토원성 조건에서 간세포 배양. 표는 사용된 지방산의 모형, 유지된 조건 및 간세포 배양에 있는 관찰된 결과를 제시합니다. PA: 팔미산. OA: 올레산.
마지막으로,이 모델은 steatosis와 지방 간뿐만 아니라 steatosis의 맥락에서 간 대사, 합성 및 해독 경로에 적용 할 수 있습니다. 또한, 체외 유도 된 steatosis 질병의 잠재적인 마커뿐만 아니라 치료 대상의 식별에 대 한 증거를 제공할 수 있습니다.
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Protocol
1. 표준 및 조건된 중간 준비
- 표준 RPMI 1640을 준비하기 위해, 페니실린-스트렙토마이신 용액의 10% (v/v) 및 페니실린-스트렙토마이신 용액의 1%(v/v)를 보충한다. 0.22 μm 필터를 사용하여 매체를 4°C.에 저장합니다.
- 팔미타테 스톡 솔루션을 준비하려면 이전에 소 세럼 알부민(지질 프리)의 1%로 보충된 표준 RPMI 1640에서 50mMMM 의 팔미타테 솔루션을 준비합니다. 이 주식의 5-10 mL의 부피로 충분합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 스톡 용액을 살균합니다. 최대 1개월 동안 빛으로부터 보호된 4°C에 보관하십시오.
- 올레아테 스톡 솔루션을 준비하려면, 이전에 소 세럼 알부민 (지질 무료)의 1 %로 보충 된 표준 RPMI 1640에서 올레아테의 50 mM 솔루션을 준비합니다. 10mL의 부피가 충분합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 스톡 용액을 살균합니다. 최대 1개월 동안 빛으로부터 보호 -20°C에 보관하십시오.
- 이전에 준비된 주식에서 스테토겐성 배지를 준비하려면 1부 팔미타테(2부 올레아테 스테토겐성 배지)를 2부로 준비합니다.
- 온화한 Steatosis: 1 부 팔미타테의 100 mL를 준비: 표준 RPMI 1640에 2 부 올레아테 (50 μM) 믹스. 0.22 μm 필터를 사용하여 살균하십시오. 최대 1 주일 동안 4 °C에 보관하십시오.
- 심한 Steatosis: 1부 팔미타테 100mL 준비: 표준 RPMI 1640에서 2부 올레아테(500 μM) 믹스를 준비한다. 0.22 μm 필터를 사용하여 살균하십시오. 최대 1 주일 동안 4 °C에 보관하십시오.
- 주식 솔루션에 대한 대체 준비.
- 상기와 같이 자유지질 알부민을 사용하여 각각의 지방산을 사용하여 두 가지 스톡 솔루션을 모두 준비한다.
- 무료 지질 알부민이 부족한 경우 팔미타테와 올레아테 소금을 사용하십시오.
- 절대 에탄올2mL에 팔미타제 또는 올레아테를 녹인 다음 표준 RPMI 1640(5-10mL)의 최종 부피에 섞는다. 표준 RPMI 1640 배양 배지에서 교반하여 직접 올레아테를 녹입니다.
- 70°C에서 수조에서 배양하여 에탄올의 증발을 허용; 완전히 섞으세요.
- 모든 경우에 0.22 μm 필터를 사용하여 두 스톡 솔루션을 모두 소독합니다. 팔미타테 스톡 용액을 4°C에 저장하고 20°C에서 재고 용액을 올레아테합니다. 두 솔루션을 모두 빛으로부터 보호합니다. 이러한 솔루션은 1개월 동안 안정적입니다.
2. 문화 이전
- 24웰 플레이트에서 잘 당 100,000 HepG2 세포를 시드. 표준 RPMI 1640의 1mL을 추가합니다.
- 24시간 동안 37°C 및 5% CO2에서 사전 배양하여 세포 부착을 허용합니다.
3. 스테토제닉 문화
- 사전 배양 후 표준 RPMI 1640 배지를 폐기하고 그에 따라 스테토겐성 배지를 추가합니다.
- 상체를 버리고 24 시간마다 신선한 steatogenic 배지를 추가하십시오.
4. 생존 능력 및 사망률 평가
- 24웰 플레이트에서 잘 당 100,000 HepG2 세포를 시드. 표준 RPMI 1640의 1mL을 추가합니다.
- 37°C에서 24시간 및 5% CO2에대한 사전 배양.
- steatogenic 배지에 대한 표준 RPMI 1640 배지를 변경합니다.
- 24시간, 2일, 3일, 4일 동안 배양하여 24시간마다 스테토겐성 배지를 상쾌하게 한다.
- 적절한 시간 후에 는 상체를 폐기하십시오.
- 0.05%의 500 μL을 트립신-EDTA의 500 μL을 추가하여 우물에서 세포를 분리합니다. 37°C에서 5분, CO25% 배양한다.
- 마이크로튜브에서 재중단된 세포를 수집합니다.
- 300 x g의 원심 분리기와 상체를 폐기하십시오.
- 표준 RPMI 1640의 200 μL을 추가하고 셀을 다시 일시 중지합니다.
- 신선한 마이크로튜브에 0.4% 트립팬 블루 용액 15μL을 추가합니다. 이전 셀 서스펜션의 15 μL과 섞는다.
- 혈종계에 얼룩진 및 비염색세포를 계산합니다.
- 그에 따라 생존율과 사망률을 계산합니다.
생존 가능성 =
사망률 =
5. 오일 레드 O와 지질 염색
- 24웰 플레이트에 모든 웰에 세포 배양 커버슬립을 넣습니다.
- 씨앗 100,000 잘 당 HepG2 세포. 표준 RPMI 1640의 1mL을 추가합니다.
- 37°C에서 사전 배양하고 24시간 동안 5%CO2를 배양합니다.
- steatogenic 배지에 대한 표준 RPMI 1640 배지를 변경합니다.
- 24시간, 2일, 3일, 4일 동안 배양하고, 24시간마다 스테토겐성 배지를 상쾌하게 한다.
- 적절한 시간 후에 는 상체를 폐기하십시오.
- 인산완충식식염(PBS)의 1mL로 세척합니다. 상부체를 폐기합니다.
- PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 1 mL로 수정하십시오.
- 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 파라포름알데히드의 과잉을 폐기하십시오.
- 증류수 1mL로 세포를 헹구는 다.
- 70% 이소프로판올 1mL을 넣고 5분 동안 배양합니다.
- 이소프로판올의 과잉을 버리십시오. 이 시점에서 PBS 세척이 필요하지 않습니다.
- 오일 레드 O 용액 1mL을 넣고 30분 동안 배양합니다.
- 오일 레드 O 용액의 초과를 폐기합니다.
- 증류수 1mL로 헹구는 다.
- 헤마톡슬린 용액 500 μL을 추가합니다. 3 분 동안 배양하십시오.
- 헤마톡슬린 용액의 과잉을 버리십시오.
- 증류수 1mL로 헹구는 다.
- 400x배율(목표 40배, 안구 10x)에서 현미경으로 관찰하십시오.
6. 지질 함량의 형태측정 평가
- 웰의 전체 영역에서 10개의 광학 필드의 사진을 무작위로 선택하고 캡처합니다. 모든 우물에 대해 반복합니다.
- 페레이라(33)에따라 ImageJ 소프트웨어의 색상 임계값 도구를 사용하여 빨간색 스테인드 영역의 백분율을 평가한다.
- 페레이라(33)에따라 ImageJ 소프트웨어의 입자 분석 도구를 사용하여 스테인드 영역을 광학 분야의 전체 영역과 비교한다.
- 모든 우물의 평균 백분율을 계산합니다.
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Representative Results
간세포는 우물의 표면 전체에 걸쳐 성장하는 스테토생 성 배지 디스플레이에서 배양; 그러나, 지방 간세포는 제어 매체에서 배양된 세포에 비해 더 낮은 성장속도를 보여줍니다. OA 및 PA의 제안 된 비율 및 농도는 배양 중에 세포 생존을 보장합니다. 24웰 플레이트에서 잘 매리면 1 x 105 세포를 파종하면 도 1에도시된 바와 같이 최적의 인플루엔자 역할을 한다.
배양된 세포의 생존력은 대조군과 비교하여 스테토겐성 군, 경증 및 중증에서 낮았다. 실제로, 문화의 시간이 증가함에 따라 생존가능성은 점진적으로 감소하여 4일 간 중증(그림2A)에서60%로 가장 낮은 수준으로 떨어졌다. 이에 따라, 세포에서 배양된 간세포에서 사망률이 높았으며, 지질에 노출되는시점(도 2B)에따라 점진적으로 증가하였다. 세포 수는 증식(도2C)의결과로 점진적으로 증가하였다. 그러나, 증식율은 3일과 4일에 온화한 steatosis에서 더 낮았습니다. 대조적으로, 가혹한 steatosis는 24 h에서 더 낮은 증식과 연관되었습니다.
제안된 프로토콜에서 배양된 HepG2 세포는 세포 내 지질 축적, 세포 내 지질 축적의 가장 중요한 특징을 보여줍니다. 오일 레드 O를 가진 염색 세포는 도 3 및 도 4에도시된 바와 같이 스테토겐성 조건하에서 배양된 세포에서 지질 방울의 적어도 2배 증가를 관찰할 수 있었다. 세포내 지방은 스테토겐성 배지에서 배양의 노출 시에 따라 증가하였다(도3). 온화한 steatosis에서, 지질 내용물 2 일에서 증가 했다, 반면 심한 steatosis에서, 그들은 24 시간에서 상당히 높았다.
그림 1: 세포 성장. HepG2 간세포 배양 제어(도 1A-D)및 온화한 스테토겐 성 조건(도 1E-H). 사진은 문화의 1-4 일에서 성장을 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: 생존율과 사망률. (A)생존율. (B)필멸의 삶. (C)셀 번호. HepG2 간세포 배양 제어 및 스테토겐성 조건은 trypan blue 염색에 의한 생존력과 사망률을 평가하였다. ± SD를 의미합니다. 문화의 시간당 삼중에서 두 개의 독립적 인 실험. 서클: 제어 조건; 사각형: 온화한 스테토시스; 삼각형: 심한 스테토시스. 일방적인 ANOVA는 동일한 조건에 대한 조건과 문화의 시간을 비교하는 데 사용되었습니다. p < 0.05는 중요한 것으로 간주되었다 : "*"- 심한 steatosis 대 제어; "§"- 제어 vs 가벼운 스테토시스; "¶"- 온화한 대 심한 스테토시스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 지질 축적. HepG2 간세포 배양 제어 및 스테토겐성 조건은 오일 레드 O 스테인링에 의해 지질 함량에 대해 평가되었고, 그 다음으로 ImageJ 소프트웨어(NIH, USA)를 이용한 형태분석이 뒤따랐다. 지질의 백분율은 각 광학 분야의 전체 영역으로 100%를 고려한 오일-레드 O(지질)에 의해 염색된 영역의 백분율을 나타낸다. ± SD를 의미합니다. 문화의 시간당 삼중에서 두 개의 독립적 인 실험. 서클: 제어 조건; 사각형: 온화한 스테토시스; 삼각형: 심한 스테토시스. 일방적인 ANOVA는 동일한 조건에 대한 조건과 문화의 시간을 비교하는 데 사용되었습니다. p < 0.05는 중요한 것으로 간주되었다 : "*"- 심한 steatosis 대 제어; "§"- 제어 vs 가벼운 스테토시스; "¶"- 온화한 대 심한 스테토시스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 시험관내의 스테토시스. HepG2 간세포 배양제어(도 4A-D),경증 스테토겐성(도4E-H),및 심한 스테토겐성(도4I-L)조건은 오일 레드 O 염색에 의해 지질 함량을 평가하였다. 사진은 24시간에서 4일까지 간세포 지질 방울을 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 시험관 내에서steatosis를 연구하는 전략을 제공하기 위한 것입니다. 세포 배양은 세포, 분자, 생화학 및 다른 조건에 노출된 세포의 독성학적 측면을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 접근법으로, steatosis는 MAFLD인 복잡한 질병의 단계로뿐만 아니라 지질에 대한 간세포 과다 노출 및 그러한 노출로 인한 가능한 결과로 도포될 수 있습니다. 따라서, 그것의 응용 프로그램은 MAFLD의 생리병리학에 국한되지 않습니다, 그러나 지방 간을 가진 환자가 치료 약, 오염 물질, steatosis에 의해 영향을 받을 지도 모르다 그밖 조건 중에 드러난다는 사실에. 따라서, 이 프로토콜은 독성학, 약리학 및 질병의 처리를 위한 치료 표적의 식별에 있는 잠재적인 응용을 가지고 있습니다.
이 프로토콜의 개발에, 가장 중요한 단계 중 하나는 steatogenic 믹스의 준비입니다 : 팔미타트의 1 부분 : 2 일부터 스테토시스를 유도 하는 올레아테의 2 부분(그림 3, 도 4),간세포가 증식 할 수 있도록 생존율과 증가 사망률(그림 2). 그러나, 감소된 생존율은 30%-40%를 초과해서는 안 됩니다, 그 장기적으로 따를 수 있는 보다는 오히려 독성 효력을 나타낼 수 있기 때문에. 간 steatosis는 지질에 장기 과다 노출의 결과. 이런 의미에서 지질은 처음에는 간세포에 대한 가벼운 애정으로 축적되어 이 모델에서 관찰됩니다. 또 다른 특징은 지질 방울 프로파일입니다. 온화한 스테토시스에서, 지질 방울의 증가 크기는 문화의 진행 중에 관찰된다(도 4E-H). 심한 스테토시스에서, 물방울 크기는 온화한 스테토시스(도 4I-L)에비해 상당히 높은 반면, 컨트롤은 지질 방울 크기의 변화를 나타내지 않는 반면(도 4A-D).
최대 1주일 동안 온화하고 심한 스테토겐성 미디어를 4°C에서 저장하는 것이 바람직하다. 그 후, 신선한 steatogenic 매체를 준비하는 것이 좋습니다. 그러나, OA 재고는 최대 한 달 동안 -20°C에서 보존될 수 있는 반면, PA 재고는 최대 한 달 동안 4°C로 보관될 수 있다. 제안 된 시간 후 이러한 주식 솔루션을 사용 하 여 지방산의 저하의 위험을 나타낼 수 있습니다. 모든 사용 전에 용액의 적절한 농도를 보장하기 위해, 비 에스테르 지방산 (NEFA) 분석 키트에 의해 지방산 농도를 측정하는 것이 좋습니다.
PA 및 OA뿐만 아니라 각각의 소금은 지질 축적을 유도하기 위해 별도로 사용되어 왔습니다. 그러나, 모든지방산(16,20)에대해 차이가 관찰된다. 한편으로는 단독으로 사용되는 팔미타테는 스테토시스의 좋은 유도제입니다. 세포사멸, 간 인슐린 저항성, 미토콘드리아 기능 장애,망상응력 16,34,35,36을유도한다. 그러나, 팔미타테는16,34의독성이 높고, 배양에서 단독으로 사용할 것으로 예상되는 결과는 PA 및 OA16,20의혼합물에 비해 생존력이 낮고 사망률이 높다. 한편, 올레야는 또한 스테토시스를 유도한다. 그것은 드 노보 리포게네스, 인슐린저항성 37,38및과증식(38)을 유도한다. 그러나, 올레야테로 관찰된 결과는 종종 팔미타테및혼합물(16,20)에비해 온화하다. 이는 보호 역할과 관련이 있을 수 있습니다. Oleate는 올리브 오일의 주요 구성 요소, 지중해 다이어트의 핵심 성분, MAFLD에 대 한 잘 알려진 성공적인 전략 중 하나39.
이 프로토콜은 재현성과 결과를 얻는 데 걸리는 짧은 시간으로 인해 steatosis를 연구하는 좋은 도구로 간주 될 수 있습니다. 이는 MAFLD의 실험 모델을 사용하는 것과 비교하여 설치류 모델을 사용하는 데 내재된 윤리적 문제를 의미하지않는다는 사실을 추가합니다. 이 프로토콜은 steatogenic 매체가 매 24 시간마다 새로 고쳐지는 경우 며칠 동안 수행 될 수 있습니다. 이 모델은 또한 비용 효율적이며 광범위한 응용 프로그램을 보유하고 있습니다. 그것은 또한 그밖 세포주, 뿐 아니라 간세포에 조정될 수 있습니다, 그러나 비만 도중 지질 과노출에 의해 영향을 받은 세포의 넓은 범위. 이 프로토콜의 한계 중 하나는 HepG2 셀의 사용입니다. 이것은 발암 성 세포주이기 때문에 일부 결과를 은폐하거나 증가시킬 수 있습니다. 그러나, 이러한 유형의 연구에서 HepG2 세포의 적용은 건강한간세포(40)에대한 지질 대사의 유사성으로 인해 널리 받아들여진다. 혼합물 PA:2OA의 사용은 NAFLD/MAFLD 환자41의혈액에서 관찰된 NEFA의 프로파일과 완전히 유사하지 않기 때문에 논란의 여지가 있는 것으로 판명될 수 있다. 리놀렌 또는 스티어산을 포함한 다른 지방산은 이 프로토콜의 추가 수정 및 개선에 포함될 수 있습니다. 또 다른 제한은 MAFLD의 진행에 종사하는 부비동성 내피, Kupffer, 간 질산 세포 등을 포함하여 간에서 존재하는 다른 간 세포와의 상호 작용이 결여된 단 하나의 세포 유형, 간세포만 연구된다는 사실이다. 더욱이, 이것은 steatosis를 독점적으로 유도하는 모형입니다, 자궁 간염과 섬유증에 아무 진행도 없이.
결론적으로, 연구는 간 세포의 맥락에서 세포기능뿐만 아니라 세포증의 연구에서 생체 내 의정서를 구현하기 쉽고 재현 가능하며 광범위한 응용 분야로 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 콘세조 나시오날 드 시엔시아 y Tecnología (코나시트, CB-221137)에 의해 투자되었다. 아드리아나 캄포스는 플라스타 드 닥터라도 엔 시엔시아스 비오메디카, 유니버시다드 나시오날 오토노마 데 멕시코의 박사 과정 학생이며, 코나시트(CVU: 1002502)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
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