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Immunology and Infection

मूत्र पथ संक्रमण और बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके चूहों में उनके उपचार का देशांतर अनुवर्ती

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62614
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 4
1Laboratory of Ion Channel Research (LICR), VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, Leuven, Belgium & Department of Cellular and Molecular Medicine, KU Leuven, 2Biomedical MRI, Department of Imaging & Pathology, KU Leuven, 3Belgium & KU Leuven Centre of Microbial and Plant Genetics, VIB-KU Leuven Center for Microbiology, Leuven, 4Laboratory of Experimental Urology, Department of Development and Regeneration, KU Leuven

Summary

यह पांडुलिपि बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके बैक्टीरियल लोड के वीवो विश्लेषण में चूहों में मूत्र पथ संक्रमण और बाद में देशांतर को प्रेरित करने के लिए लक्स ऑपरन के साथ यूरोपैथोजेनिक बैक्टीरिया के इंट्रावेसिकल प्रशासन का वर्णन करती है।

Abstract

मूत्र पथ संक्रमण (यूटीआई) मनुष्यों में सबसे आम जीवाणु संक्रमण के बीच रैंक और नियमित रूप से अनुभवजन्य एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज कर रहे हैं । हालांकि, बढ़ते माइक्रोबियल प्रतिरोध के कारण, सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता में गिरावट आई है। वैकल्पिक उपचार विकल्प खोजने के लिए, यूटीआई रोगजनन और यूटीआई संवेदनशीलता निर्धारित करने वाले तंत्रों की बेहतर समझ की बहुत आवश्यकता है। एक पशु मॉडल में इसकी जांच करने के लिए, यूटीआई के पाठ्यक्रम का अध्ययन करने के लिए एक प्रजनन योग्य, गैर-आक्रामक परख अपरिहार्य है।

वर्षों के लिए, बैक्टीरियल लोड की गणना के लिए सोने के मानक एक विशेष नमूना मात्रा के लिए कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) का निर्धारण किया गया है । इस तकनीक के लिए पोस्टमार्टम अंग समरूपता और धारावाहिक कमजोर पड़ने, डेटा उत्पादन और प्रजनन क्षमता को सीमित करने की आवश्यकता होती है। एक विकल्प के रूप में, बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (BLI) बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है। लक्स ऑपरन के साथ पैथोजन लेबलिंग संवेदनशील पता लगाने और मात्राकरण को गैर-आक्रामक तरीके से अनुमति देती है, जिससे देशांतर अनुवर्ती कार्रवाई को सक्षम किया जा सकता है। अभी तक यूटीआई रिसर्च में बीएली को अपनाना सीमित रहता है।

यह पांडुलिपि माउस मूत्र पथ संक्रमण मॉडल में ब्ली के व्यावहारिक कार्यान्वयन का वर्णन करती है। यहां, बैक्टीरिया, इंट्रावेस्टिकल इन्स्टिलेशन और इमेजिंग को बनाने के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड प्रदान किया जाता है। सीआईयू के साथ वीवो सहसंबंध की जांच की जाती है और एंटीबायोटिक-उपचारित जानवरों के साथ अनुपचारित संक्रमित जानवरों के बैक्टीरियल लोड की तुलना करके एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट प्रदान किया जाता है। इसके अलावा, वीवो यूटीआई मॉडल में ब्ली के कार्यान्वयन के लिए विशिष्ट लाभों, सीमाओं और विचारों पर चर्चा की जाती है। यूटीआई रिसर्च फील्ड में बीएआई के लागू होने से यूटीआई के रोगजननों पर शोध और यूटीआई को रोकने और इलाज के नए तरीकों की खोज में काफी सुविधा होगी।

Introduction

मूत्र पथ संक्रमण (यूटीआई) मनुष्यों में सबसे आम जीवाणु संक्रमणों में से हैं। सभी महिलाओं में से लगभग आधी अपने जीवनकाल के दौरान एक रोगसूचक यूटीआई का अनुभवहोगा 1. मूत्राशय तक सीमित संक्रमण मूत्र आवृत्ति, तात्कालिकता, हेमेटुरिया, असंयम और दर्द में वृद्धि जैसे मूत्र लक्षणों को जन्म दे सकता है। जब संक्रमण ऊपरी मूत्र पथ पर चढ़ता है, तो रोगियों को अस्वस्थता, बुखार, ठंड लगना और पीठ दर्द के साथ पाइलोनेफ्राइटिस का विकास होता है। इसके अलावा , यूटीआई के 20% रोगी आवर्ती संक्रमणों से पीड़ित हैं जिसके परिणामस्वरूप एंटीबायोटिक संवेदनशीलता में नाटकीय कमी आती है2,3,4. हाल के वर्षों में, आवर्ती यूटीआई के उपचार और रोकथाम के लिए उपन्यास चिकित्सा में रुचि बढ़ रही है। निचले मूत्र पथ की सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा और आक्रमण और उपनिवेशीकरण के लिए आवश्यक जीवाणु उग्रता कारकों की बेहतर समझ के बावजूद, उपचार शासन में कोई क्रांतिकारी परिवर्तन दैनिक मूत्र संबंधी अभ्यास2में अनुवाद नहीं किया गया है। वीवोमें यूटीआई रोगजनकता और संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए, एक प्रजनन योग्य और गैर-आक्रामक परख अपरिहार्य है।

कई पशु यूटीआई मॉडल को नेमाटोड से लेकर वानरों तक का वर्णन किया गया है, लेकिन मुरीन मॉडल का मुख्य रूप से5, 6उपयोग कियाजाताहै। इस मॉडल में (महिला) चूहों के ट्रांसयूरेथ्रल कैथेटराइजेशन और बाद में बैक्टीरियल सस्पेंशन, सबसे अधिक यूरोपैथोजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई (यूपीईसी) के इंस्टीलेशन होते हैं, सीधे मूत्राशय ल्यूमेन7में। टीका लगाने के बाद, बैक्टीरियल लोड को पारंपरिक रूप से कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएलयू) का निर्धारण करके निर्धारित किया गया है। इस तकनीक के लिए पशुओं को पोस्टमार्टम अंग समरूपता और धारावाहिक कमजोर पड़ने, डेटा उत्पादन और प्रजनन क्षमता को सीमित करने के लिए त्याग करने की आवश्यकता है । इसके अलावा, व्यक्तिगत जानवरों में बैक्टीरियल लोड का देशांतर अनुवर्ती इस तकनीक का उपयोग करना संभव नहीं है।

1995 में, छूत एट अलने जीवित जानवरों में रोग प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए बायोल्यूमिनेसेंट-टैग किए गए रोगजनकों के उपयोग का सुझाव दिया8,9। तब से, बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (ब्ली) को कई संक्रमण मॉडलों जैसे मेनिनजाइटिस, एंडोकार्डाइटिस, ऑस्टियोमाइलाइटिस, त्वचा और मुलायम ऊतक संक्रमण आदिपरलागू किया गया है। मुरीन यूटीआई मॉडल में, फोटोराबडस ल्यूमिनेसेन्स से पूर्ण लक्स ऑपरन(लक्ससीडीएबी)के साथ एक यूपीईसी तनाव का उपयोग13किया जा सकता है। एक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया बैक्टीरियल लूसिफ़ेरेस द्वारा उत्प्रेरित की जाती है जो ऑक्सीजन की उपस्थिति में कम फ्लेविन मोनोन्यूक्लियोटाइड के साथ प्रतिक्रिया करने वाली लंबी श्रृंखला एल्डिहाइड के ऑक्सीकरण पर निर्भर करती है, ऑक्सीडाइज्ड फ्लेविन, एक लंबी श्रृंखला फैटी एसिड और प्रकाश12। सब्सट्रेट्स के संश्लेषण के लिए आवश्यक लूसिफ़ेरेस और अन्य एंजाइमों के लिए लक्स ऑपरन एन्कोड करता है। इसलिए, सभी मेटाबोलिक रूप से सक्रिय बैक्टीरिया लगातार एक एक्सोजेनस सब्सट्रेट12के इंजेक्शन की आवश्यकता के बिना नीले हरे (490 एनएम) प्रकाश का उत्सर्जन करेंगे। लक्स-टैगकिए गए बैक्टीरिया द्वारा उत्सर्जित फोटॉन को अत्यधिक संवेदनशील, कूल्ड चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरों का उपयोग करके कैप्चर किया जा सकता है।

यूटीआई के लिए एक मॉडल में बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरिया का उपयोग जीवाणु भार के देशांतर, गैर-आक्रामक मात्राकरण के लिए अनुमति देता है, जो सीआईयू निर्धारण के लिए अनुवर्ती के दौरान निश्चित समय बिंदुओं पर जानवरों के त्याग की आवश्यकता को छोड़ देता है। संभावनाओं की विस्तृत श्रृंखला के बावजूद, अन्य क्षेत्रों में इस BLI तकनीक की मजबूती और यूटीआई के क्लासिक मॉडलों पर इसके फायदे के लिए सबूत जमा करना, इसे यूटीआई अनुसंधान में व्यापक रूप से लागू नहीं किया गया है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक विस्तृत कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करता है और भविष्य के सभी यूटीआई अनुसंधान के लिए BLI के फायदों पर प्रकाश डालता है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोग यूरोपीय संघ समुदाय परिषद के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे और केयू Leuven (P158/2018) की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. खेती बैक्टीरिया(7,13,14से अनुकूलित)

  1. तैयारी
    1. एक ल्यूमिनेसेंट यूपीईसी तनाव चुनें जो प्रयोगात्मक जरूरतों को सबसे अच्छा फिट बैठता है।
      नोट: यहां, नैदानिक सिस्टिटिस आइसोल्टेड, यूटीआई89(ई. कोलाई),को मनुष्यों और कृंतक दोनों में अपनी यूरोपैथोजेनिक क्षमता के कारण चुना गया था, और मुरीन यूटीआई मॉडल5,7,15में इसका आम उपयोग किया गया था। पूर्ण लक्स ऑपरन(लक्ससीडीएबी)को ले जाने वाले बायोल्यूमिनेसेंट आइसोजेनिक तनाव को आगे UTI89-लक्स के रूप में जानाजाताहै। इस ऑपरन में कानमाइसिन सल्फेट (किमी) प्रतिरोध जीन भी होता है। इसलिए,13बायोल्यूमिनेसेंट कॉलोनियों का चयन करने के लिए किमी का उपयोग किया जा सकता है।
    2. चुना बैक्टीरियल स्ट्रेन7के लिए 600 नैनोमीटर (ओडी 600 एनएम) पर सीएलयू और ऑप्टिकल घनत्व के लिए एक सहसंबंध वक्र बनाएं।
      1. ऐसा करने के लिए, संस्कृति बैक्टीरिया (नीचे प्रोटोकॉल का उपयोग करके) और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 8 अलग-अलग कमजोर पड़ते हैं। इन सभी कमजोरुओं के लिए 600 एनएम पर ओडी को मापें और सीएलयू निर्धारित करने के लिए उन्हें लुरिया-बर्टानी (एलबी) प्लेटों पर प्लेट करें।
      2. सहसंबंध निर्धारित करने और एक मानक वक्र प्राप्त करने के लिए OD 600 एनएम मूल्यों और सीएलयू मूल्यों को प्लॉट करें।
        नोट: भविष्य के प्रयोगों के लिए, 600 एनएम पर आयुध डिपो को मापें और बैक्टीरियल समाधान में सीआईयू का तत्काल अनुमान लगाने के लिए इस मानक वक्र का उपयोग करें।
        सावधानी: यूपीईसी रोगजनक बैक्टीरिया हैं, सुनिश्चित करें कि कमरे ठीक से सुसज्जित हैं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करते हैं।
  2. तीन दिन पहले instillation
    1. बैक्टीरिया के ग्लिसरोल स्टॉक को बाहर निकालकर एकल उपनिवेश प्राप्त करें, एक टीका लूप का उपयोग करके, एलबी प्लेटों पर 50 μg/mL Km और संस्कृति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पूरक। 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए एक पैराफिन फिल्म के साथ इन प्लेटों को सील करें।
  3. दो दिन पहले इंसां
    1. 50 माइक्रोन/एमएल किमी के साथ पूरक एलबी शोरबा के 5 मिलील के साथ दोहरी स्थिति स्नैप कैप के साथ एक बाँझ 14 एमएल पॉलीस्टीरिन राउंड बॉटम ट्यूब भरें। एक टीका लूप के साथ एक एकल बैक्टीरियल कॉलोनी चुनें और इसे एलबी शोरबा में जोड़ें। उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए 10 एस के लिए भंवर।
    2. संस्कृति रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर खुली स्थिति में स्नैप कैप के साथ स्थिर।
      नोट: ई. कोलाई की स्थिर वृद्धि प्रकार 1-pili की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देती है, जो मूत्र एपिथेलियल कोशिकाओं के पालन और आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हैं।
    3. एक बाँझ Erlenmeyer या संस्कृति फ्लास्क तैयार करें।
  4. एक दिन पहले instillation
    1. इनक्यूबेशन के बाद, बैक्टीरियल संस्कृति के उचित समरूपता सुनिश्चित करने के लिए 10 एस के लिए ट्यूब भंवर। एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ताजा पौंड माध्यम के 25 एमएल के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन के 25 माइक्रोन जोड़कर एर्लेनमेयर में एक उप-संस्कृति बनाएं।
    2. एर्लेनमेयर और संस्कृति को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रूप से बंद करें।
  5. इंसटिलेशन के दिन
    1. भंवर 10 एस के लिए Erlenmeyer उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ।
    2. 3,000 x g और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 x g और अपकेंद्रित्र में Erlenmeyer से संस्कृति डालो। सुपरनेट को डिकेंट करें और 10 एस के लिए फिर से बाँझ पीबीएस और भंवर के 10 एमएल में बैक्टीरियल पेलेट को फिर से रिसंप करें।
    3. इनोकुलम (सीआईएफयू) की प्रायोगिक एकाग्रता चुनें और इसी ओडी 600 एनएम निर्धारित करने के लिए चरण 1.1.2 में प्राप्त मानक वक्र का उपयोग करें।
    4. रीरिल पीबीएस के 9 एमसीएल में पुनर्संरक्षित बैक्टीरियल कल्चर का 1 एमएल जोड़ें और 600 एनएम पर ओडी की जांच करें। बाँझ पीबीएस या केंद्रित बैक्टीरियल समाधान जोड़कर आगे समायोजित करें, जब तक कि वांछित ओडी 600 एनएम7तक न पहुंच जाए।
      नोट: उदाहरण के लिए, UTI89 के लिए-लक्स पीबीएस जोड़कर संस्कृति को तब तक समायोजित करें जब तक कि ओडी 600 एनएम 0.45 तक न पहुंच जाए, 2 x 107 सीएलयू/50 माइक्रोल के अनुरूप। व्यवहार्य सीएफयू की संख्या को सत्यापित करने के लिए, 300 से कम कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए ट्रिपलीकेट में एलबी प्लेटों पर पांचवें और छठे 10 गुना कमजोर पड़ने के 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने और प्लेट 50 माइक्रोन बनाएं। प्राप्त कॉलोनियों की गणना अगले दिन रात भर इनक्यूबेशन के बाद ३७ डिग्री सेल्सियस पर करें । ओडी ६०० एनएम एक पल पढ़ने के बाहर देता है, लेकिन गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में सीआईयू का उपयोग करें ।

2. जानवरों का टीका(7सेअनुकूलित,16)

  1. जानवरों की तैयारी
    1. अनुसंधान प्रश्न और नॉक आउट लाइनों की उपलब्धता, प्रायोगिक विवरण, और यूटीआई संवेदनशीलता5, 17में अंतर के आधार पर वांछित माउस तनाव(ओं)चुनें। ध्यान रखें कि मादा चूहों में ट्रांसयूरेथ्रल कैथेटराइजेशन आसान है। 8 सप्ताह से छोटे जानवरों का उपयोग न करें, क्योंकि वे इम्यूनोलॉजिकल रूप से अपरिपक्व हैं। यहां 12 हफ्ते की मादा C57Bl/6J चूहों का इस्तेमाल किया गया ।
    2. जानवरों को पहले से अच्छी तरह से ऑर्डर करें और उन्हें 7 दिनों के लिए आदर्श रूप से स्वीकार करने दें। मानक 12 एच प्रकाश/अंधेरे परिस्थितियों के तहत व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरों में समूह घर जानवरों ।
    3. संकेत के नुकसान को सीमित करने के लिए जानवरों के पेट क्षेत्र को शेव करें। हेयर रिमूवल क्रीम का इस्तेमाल न करें, क्योंकि इससे जानवरों की त्वचा जल्दी बर्न हो सकती है। प्रमुख हाथ से शेविंग करते समय गैर-प्रमुख हाथ से स्क्रफ और हिंद अंगों को कसकर पकड़कर जानवर को नियंत्रित करें। वैकल्पिक रूप से, आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत दाढ़ी।
      नोट: जानवरों को इमेजिंग से 2 दिन पहले मुंडा रहे थे, जानवरों को ध्यान में रखते हुए मुंडा क्षेत्र आगे भी दूल्हा होगा ।
    4. पूरे प्रयोग में पानी और मानक भोजन विज्ञापन लिबिटम प्रदान करें। हालांकि, पैदाल के दौरान मूत्राशय की मात्रा को कम करने के लिए जलसेक से पहले 2 घंटे पानी से जानवरों को वंचित करें।
    5. एक बाँझ 24 जी एंजियोकैथेटर टिप एक 100 μL सिरिंज पर माउंट और चरण 1.5.3 में तैयार जीवाणु समाधान के साथ सिरिंज भरें।
      नोट: पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसेंस निर्धारित करने के लिए, इन्स्टिलेशन से पहले एक बेसलाइन छवि प्राप्त करें (चरण 3, नीचे देखें)।
  2. जानवरों का इन्स्टिलेशन
    1. जानवरों को एक इंडक्शन चैंबर में रखें और उन्हें वाहक गैस (3% पर प्रेरण और रखरखाव 1.5% पर) के रूप में शुद्ध ऑक्सीजन के साथ आइसोफ्लुनान की साँस लेने का उपयोग करके एनेस्थेटाइज करें।
    2. एक जानवर को रीढ़ की स्थिति में एक कामकाजी सतह पर रखें और इन्सिलेशन के दौरान नाक शंकु का उपयोग करके एक स्थिर आइसोफ्लाणे एनेस्थीसिया बनाए रखें। आंखों का मरहम लगाएं।
    3. कोमल संपीड़न लगाने और सुपरापुबिक क्षेत्र पर परिपत्र आंदोलनों को बनाकर अवशिष्ट मूत्र को निष्कासित करें। पैदा करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ निचले पेट को साफ करें।
    4. कैथेटर टिप को सामान्य खारा के साथ चिकनाई करें। गैर प्रमुख हाथ की तर्जनी को पेट पर रखें और धीरे-धीरे ऊपर की ओर धकेलें। मूत्रमार्ग के कैथेटराइजेशन को 90 डिग्री कोण (खड़ी) में शुरू करें और एक बार प्रतिरोध का सामना करना पड़े, इसे आगे (0.5 सेमी) डालने से पहले क्षैतिज रूप से झुकाएं।
      नोट: कभी भी कैथेटर को जबरदस्ती न धकेलें, क्योंकि इससे मूत्रमार्ग को नुकसान होगा। कोमल टर्निंग मोशन कैथेटर प्रविष्टि में सहायक हो सकता है। दूसरी ओर, प्रतिरोध की कमी आमतौर पर योनि में गलत प्रविष्टि को इंगित करती है।
    5. बैक्टीरियल इनोकुलम (2 x 107 सीएलयू) के 50 माइक्रोन का धीमा (5 μL/s) इन्सिलेशन करें।
      नोट: उच्च मात्रा या तेजी से instillation गुर्दे के लिए भाटा पैदा हो सकता है । तकनीक के अभ्यास के दौरान, रिफ्लक्स का मूल्यांकन करने के लिए नीली स्याही का उपयोग किया जा सकता है।
    6. इंसिलेशन के बाद सिरिंज और कैथेटर को कुछ और सेकंड के लिए जगह में रखें और फिर रिसाव को रोकने के लिए धीरे-धीरे वापस ले लें। किसी भी अनियमितता जैसे रिसाव या खूनी मीटस की उच्च मात्रा रिकॉर्ड करें और यदि आवश्यक हो तो जानवरों को बाहर करें।
    7. इमेजिंग कक्ष के नाक शंकु पर रीढ़ की स्थिति में जानवर की स्थिति और सभी शेष जानवरों के लिए पिछले कदम 2.1.1-2.1.6 दोहराएं। प्रयोगात्मक समूह के अनुसार एक कैथेटर का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि संज्ञाहरण जारी रखा जाता है और पहले और अंतिम जानवर के बीच समय को कम करता है।
    8. यदि आवश्यक हो, तो इमेजिंग (चरण 3) से पहले या बाद में एंटीबायोटिक दवाओं या प्रयोगात्मक दवाओं को प्रशासित करें। उदाहरण के लिए, एन्रोफ्लोक्सासिन को प्रशासित करने के लिए, 1/100 कमजोर पड़ने के लिए 3.96 एमएल शारीरिक नमकीन के लिए एन्रोफ्लोक्सेसिन (100 मिलीग्राम/एमएल) समाधान के 40 माइक्रोन जोड़ें। 100 माइक्रोन/10 ग्राम को सुबह 9 बजे और शाम 5 बजे इंजेक्ट करें ताकि 3 दिनों तक रोजाना दो बार 10 मिलीग्राम/किलो एन्रोफ्लोक्सासिन का संचालन किया जा सके ।

3. बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग

  1. इमेजिंग मापदंडों की तैयारी और चयन
    1. BLI अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की टेबलदेखें) और कैमरा और स्टेज कंट्रोलर सिस्टम का परीक्षण करने और सीसीडी कैमरे को -90 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के लिए इमेजिंग डिवाइस (सामग्री की टेबलदेखें) में आरंभीकरण पर क्लिक करें।
      नोट: इस प्रक्रिया के दौरान, दरवाजा बंद कर दिया जाता है, और नियंत्रण कक्ष पर आरंभीकरण की प्रगति का पालन किया जा सकता है। एक हरी बत्ती इंगित करती है कि -90 डिग्री सेल्सियस का तापमान पहुंच गया है। यदि आरंभीकरण पूरा होने से पहले इमेजिंग का प्रयास किया जाता है तो एक चेतावनी दिखाई देगी।
    2. सुनिश्चित करें कि डेटा स्वचालित रूप से सहेजा जाता है: अधिग्रहण ऑटो-सेव पर क्लिक करें और सही फ़ोल्डर का चयन करें।
    3. ल्यूमिनेसेंस और फोटोग्राफका चयन करें । डिफ़ॉल्ट ल्यूमिनेसेंस सेटिंग्स की जांच करें: ब्लॉक करने के लिए एक्सिटेशन फिल्टर सेट करें और ओपनकरने के लिए उत्सर्जन फ़िल्टर।
    4. पहली छवि लेते समय ऑटो के लिए एक्सपोजर समय निर्धारित करें, खासकर जब पर्याप्त संख्या में फोटॉन मायने रखता है सुनिश्चित करने के लिए एक मंद संकेत की उम्मीद करते हैं। वीवो माप और उज्ज्वल संकेतों के लिए, एक्सपोजर समय ~ 30 एस के लिए निर्धारित करें। यदि छवि संतृप्त है, तो एक चेतावनी दिखाई देगी। अगर ऐसा होता है तो एक्सपोजर टाइम कम करें।
    5. मीडियम बिनिंग, एफ/स्टॉप 1 चुनें और सही फील्ड ऑफ व्यू(एफओवी)(5 जानवरों के लिए डी) चुनें ।
    6. चूहों इमेजिंग करते समय विषय ऊंचाई को 1 सेमी तक सेट करें।
    7. तकनीकी प्रतिकृति के रूप में, तीन छवियों का एक अनुक्रम प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष में तीन बार जोड़ने पर क्लिक करें ।
  2. इमेजिंग
    1. रीढ़ की स्थिति में इमेजिंग कक्ष में चूहों को रखें और पूरे प्रयोग में संज्ञाहरण (आइसोफ्लुन 1.5%) बनाए रखने के लिए कई गुना नाक शंकु का उपयोग करें। एक साथ 5 चूहों तक छवि और प्रतिबिंब को रोकने के लिए प्रकाश चकरा का उपयोग कर जानवरों को अलग।
    2. दरवाजा बंद करो और इमेजिंग अनुक्रम शुरू करने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें।
    3. प्रयोग (जंगली प्रकार और नॉकआउट जानवरों, उपचार, इमेजिंग के दिन, आदि) के बारे में विस्तृत जानकारी भरें। इमेजिंग सेटिंग्स, जैसे एक्सपोजर टाइम, स्वचालित रूप से सहेजे जाते हैं।
    4. इमेजिंग चैंबर से चूहों को निकालें और उन्हें उनके पिंजरे में वापस कर दें। संज्ञाहरण के बाद पूरी वसूली के लिए जांच करें। कुछ ही मिनटों के भीतर, जानवरों को पूरी तरह से जाग और अन्वेषणात्मक होना चाहिए। अनल्जेसिया प्रदान न करें क्योंकि इससे यूटीआई कोर्स18में हस्तक्षेप हो सकता है ।
    5. अगले इमेजिंग चक्र तक हवादार रैक के लिए पिंजरों वापस। प्रयोग पूरा होने के बाद, सीओ2 एस्फिक्सेशन या सर्वाइकल अपभ्रंश द्वारा जानवरों को इच्छामृत्यु दें। संकट को कम करने के लिए आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया की वसूली से पहले ऐसा करें।
  3. छवियों का विश्लेषण
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करें और ब्राउजपर क्लिक करके प्रायोगिक फ़ाइल लोड करें।
    2. छवि के रंग पैमाने को समायोजित करने के लिए टूल पैलेट का उपयोग करें। सभी छवियों के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग करके परिणामों के दृश्य पहलू का मानकीकरण करें, यानी, न्यूनतम 104 से अधिकतम 107 फोटॉन के साथ एक लॉगरिथम स्केल का उपयोग करें। ये समायोजन कच्चे डेटा को प्रभावित नहीं करते हैं बल्कि केवल ग्राफिकल प्रस्तुति को प्रभावित करते हैं।
    3. छवि पर ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को आकर्षित करने के लिए आरओआई टूल का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि आरओआई पूरे क्षेत्र को कवर करने और सभी छवियों के लिए एक ही आयाम का उपयोग करने के लिए काफी बड़ा है। यहां, पेट के निचले हिस्से पर 3.5 सेमी x 4.5 सेमी का एक वर्ग आरओआई रखा गया था।
    4. प्रकाश तीव्रता (गिनती या कुल फोटॉन प्रवाह) की मात्रा निर्धारित करने के लिए आरओआई माप पर क्लिक करें। इन डेटा का निर्यात करें और तकनीकी प्रतिकृति के औसत का उपयोग करें।
      नोट: मायने रखता है कैमरे द्वारा पता चला फोटॉन की संख्या का प्रतिनिधित्व करते है और केवल छवि गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । डेटा की रिपोर्ट करने के लिए, कुल फोटॉन फ्लक्स का उपयोग करें। कुल फोटॉन फ्लक्स अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है क्योंकि यह सतह से उत्सर्जित प्रकाश का प्रतिनिधित्व करता है और यह एक कैलिब्रेटेड इकाई है, जिसे एक्सपोजर समय (प्रति सेकंड) के लिए सही किया जाता है।

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Representative Results

वीवो ब्ली में इन्स्टिलेशन के समय इनोकुलम के सीएलएफओ के साथ संबंधित है।
वीवो में ब्ली की पहचान सीमा और इनोकुलम के सीएलयू के साथ सहसंबंध का मूल्यांकन करने के लिए, चूहों को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में UTI89-लक्स और पीबीएस की विभिन्न सांद्रता से संक्रमित किया गया था। पैदा करने से पहले, असंक्रमित जानवरों को पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसेंस निर्धारित करने के लिए स्कैन किया गया था। बाद की छवियों को तुरंत बाद इन्स्टिलेशन(चित्रा 1A)प्राप्त किया गया । UTI89-लक्स के instillation के बाद, बायोल्यूमिनेसेंस 2 x 10 4 सीएफयू से ऊपर मजबूती से पता लगाया गया था और इनोकुलम केसीएफयू और बायोल्यूमिनेसेंस के बीच एक रैखिक संबंध स्थापित किया गया था(चित्र 1 बी)। इसके विपरीत, कुल फोटॉन प्रवाह पीबीएस के साथ डाले गए जानवरों के लिए पृष्ठभूमि संकेतों के बराबर था और 2 x 103 सीएलयू के सबसे कम बैक्टीरियल एकाग्रता पर था।

उपचार के दौरान देशांतर अनुवर्ती के लिए एक उपकरण के रूप में BLI
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या अनुमेय एंटीबायोटिक उपचार के उपचारात्मक प्रभाव को देशांतर ब्ली का उपयोग करके प्रदर्शित किया जा सकता है, 20 जानवरों को 2 x 107 क्लिफ़/50 माइक्रोन के एक इनोकुलम से संक्रमित किया गया था, और इनमें से 10 जानवरों का इलाज पहले 3 दिनों के बाद संक्रमण के दौरान दैनिक रूप से 10 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम के साथ किया गया था । संक्रमित लेकिन अनुपचारित नियंत्रण समूह में प्राकृतिक विकास और इलाज समूह में संक्रमण काइनेटिक्स पर एंटीबायोटिक उपचार के प्रभाव दोनों को विस्तार से कल्पना की जा सकतीहै (चित्रा 2)। जीवाणु भार में तत्काल कमी, जैसा कि कुल फोटॉन फ्लक्स द्वारा मापा जाता है, एन्रोफ्लोक्सेसिन की पहली खुराक के बाद देखा गया था। इलाज जानवरों में से कोई भी जीवाणु भार में बाद में वृद्धि हुई थी । संक्रमित लेकिन अनुपचारित नियंत्रण समूह में अंतर-विषय परिवर्तनशीलता अधिक थी और बैक्टीरियल लोड में कमी धीमी थी । 10 दिन में, नियंत्रण समूह के 10 जानवरों में से 8 अपने पूर्व-instillation पृष्ठभूमि के बराबर एक BLI संकेत करने के लिए लौट आए थे । प्रत्येक जानवर के लिए समग्र जीवाणु भार लॉग-रूप से परिवर्तित कुल फोटॉन फ्लक्स के वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र का उपयोग करके गणना की गई थी। 10 दिनों के समय पाठ्यक्रम में एन्रोफ्लोक्सेसिन और अनुपचारित जानवरों के साथ इलाज किए गए जानवरों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर देखा गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि BLI एक यूटीआई के रोग पाठ्यक्रम पर संभावित उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Figure 1
चित्रा 1: वीवो ब्ली में इंसिलेशन के समय इनोकुलम के सीएलएफओ के साथ संबंधित है। (A)मूत्राशय में बैक्टीरियल इन्सलेशन के तुरंत बाद इनोकुलम (2 x 103 -2x 108 सीएलयू) की बढ़ती सांद्रता से संक्रमित चूहों के वीवो ब्ली में प्राप्त प्रतिनिधि छवियां । सीएलयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां। (ख)इनोकुलम (सीएफयू) की एकाग्रता की तुलना में मूत्राशय क्षेत्र (कुल फोटॉन फ्लक्स) पर उत्सर्जित बायोल्यूमिनेसेंस का मात्राकरण। BLI सिग्नल को पीबीएस नियंत्रण, अपाई टी-टेस्ट की तुलना में पृष्ठभूमि और पी = 0.015 की तुलना में 2 x 104 सीएलयू (पी = 0.0002) से ऊपर मजबूती से पता लगायागया था। 2 x 103-2 x 108 सीएलयू से लेकर इनोकुली के लिए पियर्सन सहसंबंध आर = 0.9995 (पी < 0.0001) था। बीजी = पृष्ठभूमि, पीबीएस = फॉस्फेट बफर नमकीन, सीएलयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:उपचार के दौरान देशांतर अनुवर्ती कार्रवाई के लिए एक उपकरण के रूप में BLI। (ए)यूटीआई89-लक्स के 2 x 10 7 सीएलयू से संक्रमित जानवरों के लिए कुल फोटॉन फ्लक्स के व्यक्तिगत निशान और 3 दिनों के लिए प्रतिदिन दो बार एन्रोफ्लॉक्सासिन 10 मिलीग्राम/किलोग्राम के साथ इलाज किया जाता है (नीला) बनाम एक अनुपचारित नियंत्रण समूह (काला), एन = 10 प्रति समूह । बीजी = पृष्ठभूमि। (ख)पैनल ए में दिखाए गए जानवरों से निशान का विश्लेषण, एन्रोफ्लोक्सेसिन (ब्लू) और नियंत्रण समूह (ब्लैक) दोनों के लिए लॉग-ट्रांसफॉर्म्ड टोटल फोटॉन फ्लक्स के एयूसी की रिपोर्टिंग । N = 10 प्रति समूह, मतलब ± एसडी, 0.0001 < अकर्मित टी-टेस्टपी। AUC = वक्र के तहत क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सीएलयू की तुलना में BLI के फायदे मायने रखता है
देशांतर डेटा
माइक्रोबियल बोझ की मात्रा निर्धारित करने के लिए सीआईएफयू की गणना करने की पारंपरिक विधि का एक बड़ा नुकसान पोस्टमार्टम अंग समरूप की आवश्यकता है, जो प्रति पशु केवल एक क्रॉस-सेक्शनल डेटा पॉइंट प्रदान करता है। इसके विपरीत, BLI संक्रमित जानवरों के गैर-आक्रामक देशांतर अनुवर्ती सक्षम बनाता है। जानवरों को दिन में 2 से 3 बार इमेज किया जा सकता है, जो संक्रमण के काइनेटिक्स में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, एक ही जानवर के दोहराए गए उपाय पर्याप्त रूप से संचालित प्रयोगों के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को काफी कम करते हैं। इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने अंतर व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता पर ध्यान केंद्रित कर सकते है और जांच या एक उपन्यास एजेंट के साथ जानवरों के इलाज से पहले, वे वास्तविक समय डेटा का उपयोग करके पूर्वप्रजातीय जीवाणु भार के साथ जानवरों का चयन कर सकते हैं । दूसरी ओर, एक प्रयोग के AUC का उपयोग कर शोधकर्ताओं को समग्र जीवाणु लोड पर ध्यान केंद्रित करने के लिए और एक भी पार अनुभागीय मूल्य पर नहीं की अनुमति देता है । यूटीआई सेटिंग में देशांतर और वास्तविक समय के डेटा के वर्धित मूल्य को अधिक अनुमानित नहीं किया जा सकता है।

संक्रमण के प्रसार की पहचान
ब्ली के साथ प्राप्त छवियों का स्थानिक संकल्प अन्य साइटों की पहचान करने के लिए पर्याप्त है जो लक्स-या फ्लूक-टैगकिए गए रोगजनकों द्वारा उपनिवेश हैं19। यूटीआई के लिए, गुर्दे में आरोही संक्रमण या रक्त के प्रसार अत्यधिक प्रासंगिक निष्कर्ष हैं। इस प्रायोगिक सेटिंग में, निचले मूत्र पथ से परे UTI89-लक्स द्वारा प्रेरित संक्रमणों के किसी भी प्रसार को नहीं देखा गया था। यह इस तनाव को ध्यान में रखते हुए मुख्य रूप से सिस्टिटिस का कारण बनता है।

डेटा प्रजनन और तुलना
सीएलयू की गिनती की तुलना में ब्ली का उपयोग करते समय प्रयोगों की प्रजनन क्षमता अधिक होती है। शास्त्रीय रूप से, समरूपता के धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने के ट्रिपलिकेट्स चढ़ाया जाता है और केवल 30 से 300 सीएलयू वाली प्लेटों को सीएलयू की कुल संख्या की गणना करने के लिए गिना जाता है। यह विधि बोझिल है, उच्च परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है, इसके परिणामस्वरूप कई व्यर्थ प्लेटें हैं, और मानव त्रुटियों से अत्यंत प्रवण हैं। इसके अलावा, सीएलयू की रिपोर्ट करने के तरीके पर कोई आम सहमति नहीं है, अर्थात्, प्रति ग्राम मूत्राशय ऊतक, प्रति मूत्राशय, या प्रति 1 एमएल होमोजेनेट। यह विभिन्न समूहों के परिणामों की तुलना को बेहद मुश्किल प्रदान करता है और BLI और कुल फोटॉन प्रवाह के उपयोग से सुधारा जा सकता है।

विधि के विचार और सीमाएं
वीवो में ब्ली से संबंधित शास्त्रीय विचारों के अलावा जैसे फर या हीमोग्लोबिन द्वारा फोटॉनों का अवशोषण, बलिदान के समय ब्ली और सीएलयू की गिनती होने पर कुछ विचार किए जाते हैं।

सबसे पहले, बलिदान के समय दोनों तरीकों के बीच विसंगतियों20का सामना कर रहे हैं, खासकर जब एंटीबायोटिक चिकित्सा का उपयोग किया जाता है । इसलिए, बलिदान के समय ब्ली और सीएलयू के बीच सहसंबंध उप-ोढ़ीय हो सकता है और जरूरी प्रासंगिक नहीं है। BLI के लिए, कुल फोटॉन प्रवाह उम्मीद से कम हो सकता है, क्योंकि चुनौती दी बैक्टीरिया वसूली और मरम्मत प्रक्रियाओं की ओर अपने चयापचय को पुनर्निर्देशित कर सकते हैं, बजाय प्रकाश उत्सर्जन । इसके अतिरिक्त, BLI माप वीवो में वास्तविक समय में बैक्टीरिया और उनके चयापचय के एक स्नैपशॉट को कैप्चर करता है, जिसके परिणामस्वरूप कम BLI संकेत होते हैं यदि बैक्टीरिया इमेजिंग के समय निष्क्रिय या लम्बी स्थिति में होते हैं। दूसरी ओर, CFU दृढ़ संकल्प के लिए, दवा को चुनौती दी बैक्टीरिया अपने संक्रामक आवास (यानी, एक बायोफिल्म) और चढ़ाया जा रहा है के बाद एक सब या कुछ भी नहीं तरीके से प्रतिक्रिया । एक बार आगर पर चढ़ाया, चुनौती दी बैक्टीरिया असुधार्य रूप से घायल हो सकता है और नमूदार कालोनियों में विकसित करने में असमर्थ है, जिसके परिणामस्वरूप कम CFU21मायने रखता है । इसके अतिरिक्त, चुनौती दी बैक्टीरिया एक व्यवहार्य लेकिन गैर कृषि योग्य राज्य (VBNC) में प्रवेश कर सकते हैं । वे चयापचय रूप से सक्रिय और व्यवहार्य रहते हैं, लेकिन अब मानक प्रयोगशाला मीडिया पर खेती योग्य नहीं हैं। वीबीएनसी राज्य में प्रवेश करने वाले या बायोफिल्म्स में व्यवस्थित बैक्टीरिया का पता बीवाई के साथ आसानी से लगाया जा सकता है, जबकि सीएफयू की गणना के लिए अतिरिक्त प्रसंस्करण21,22,23की आवश्यकता होती है। अंत में, बायोल्यूमिनेसेंस और व्यवहार्य मायने गिनती सेल फिजियोलॉजी के विभिन्न पहलुओं को मापती है और न ही कोशिका व्यवहार्यता21का निश्चित संकेतक माना जाना चाहिए।

इसके अलावा, नमूना प्रसंस्करण में अंतर के कारण ब्ली या सीएलयू गिनती द्वारा मापा गया बैक्टीरियल लोड की परिभाषा अलग है। सीएलयू की गिनती का उपयोग करते समय, मूत्राशय की दीवार के भीतर रहने वाले केवल बैक्टीरिया को समरूप और गिना जाता है। इसके विपरीत, BLI मूत्र और मूत्रमार्ग में बैक्टीरिया द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों को भी कैप्चर करता है। हमारी राय में, उत्तरार्द्ध कुल बैक्टीरियल लोड का शारीरिक रूप से अधिक सही प्रतिनिधित्व है क्योंकि इसमें सभी शारीरिक रूप से प्रासंगिक डिब्बे (मूत्राशय, मूत्र और मूत्रमार्ग) शामिल हैं।

सीआईयू के विपरीत, BLI को आनुवंशिक रूप से परिवर्तित ल्यूमिनेसेंट बैक्टीरिया के उत्पादन की आवश्यकता होती है। सम्मिलन स्थल के आधार पर, यह प्रशंसनीय है कि जीनोम में लक्स ओपरन की शुरूआत बैक्टीरियल तनाव की उग्रता क्षमता को बदल सकती है। इसलिए, एक नया बायोल्यूमिनेसेंट तनाव विकसित करते समय, इसकी उग्रता और विकास विशेषताओं की तुलना माता-पिता के तनाव10,13से की जानी चाहिए। हालांकि, जीनोम संपादन में हाल ही में प्रगति सभी प्रमुख जीवाणु रोगजनकों के कुशल और डरावने टैगिंग के लिए अनुमति देते हैं, जिससे उग्रता या उपचार प्रतिक्रियाओं पर प्रभाव सीमित होता है। इसके अलावा, जेनेटिक इंजीनियरिंग बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर जीन की सशर्त अभिव्यक्ति की ओर संभावनाओं को खोलता है और इसलिए, प्रासंगिक जीवाणु उपजनसंख्या, जीन अभिव्यक्ति, आदि24, 25के वीवो मापने में ।

अंत में, वीवो ब्ली में उन्नत इमेजिंग डिवाइस और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर तक पहुंच सीआईयू गणना के लिए आवश्यक बुनियादी उपकरणों की तुलना में एक सीमित कारक हो सकती है। हालांकि, इमेजिंग कोर के साथ सहयोग BLI के लिए आवश्यक खर्च और निवेश को कम कर सकते हैं ।

वीवो यूटीआई मॉडल में BLI के कार्यान्वयन के लिए विशिष्ट विचार
पशु मॉडल
एक मुरीन यूटीआई मॉडल के फायदे तीन गुना हैं: यह एक स्तनधारी मूत्र पथ में रोग प्रगति की निगरानी की अनुमति देता है, जानवरों और उनके रखरखाव अपेक्षाकृत सस्ती हैं, और उत्परिवर्ती लाइनें उपलब्ध हैं । दूसरी ओर, संक्रमण को शामिल करने से आमतौर पर ट्रांसयूरेथ्रल कैथेटराइजेशन और बैक्टीरिया की उच्च खुराक के बाद मूत्राशय ल्यूमेन में सीधे पैदा होता है, जिससे मूत्रमार्ग 5 के माध्यम से उदगम की प्राकृतिक प्रक्रिया को दरकिनार कर दियाजाताहै।

पशु आवास
प्रयोग के दौरान जानवरों को समूह में रखे जा सकते हैं। हमने संक्रमित जानवरों के साथ पिंजरों में प्रहरी जानवरों को पेश करके एक ही पिंजरे के जानवरों के बीच संचरण की घटना की जांच की है । प्रहरी जानवरों में से कोई भी एक पता लगाने योग्य जीवाणु लोड था, दोनों CFU और BLI के साथ मापा ।

मूत्राशय की मात्रा
ब्ली के साथ मुरीन यूटीआई मॉडल का संयोजन करते समय, शोधकर्ताओं को मूत्राशय के अद्वितीय शारीरिक गुणों को ध्यान में रखना चाहिए। मूत्राशय एक खोखला अंग है जिसमें मूत्र की अलग मात्रा होती है। यूटीआई के दौरान, बैक्टीरिया से पीड़ित मूत्र की उपस्थिति सैद्धांतिक रूप से मूत्राशय भरने की डिग्री के आधार पर कुल फोटॉन गिनती को प्रभावित कर सकती है। हालांकि, मूत्राशय की मात्रा का मानकीकरण अव्यावहारिक है और प्रायोगिक डिजाइन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, हमारे अनुभव में, मूत्राशय की मात्रा में अंतर कुल फोटॉन प्रवाह में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर में परिणाम नहीं है।

नमूना तापमान
इन विट्रो BLI (या एक सरल और सस्ता विकल्प के रूप में, एक ल्यूमिनोमीटर में बायोल्यूमिनेसेंस को मापने) का उपयोग यूयूजेनेट, मूत्र, या UTI89-लक्स युक्त बैक्टीरियल निलंबन पर बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए भी किया जासकताहै। हालांकि, नमूने का तापमान महत्वपूर्ण है क्योंकि फोटॉनों का उत्सर्जन एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया से होता है और इस प्रकार मेटाबोलिक गतिविधि और ऑक्सीजन की उपस्थिति की आवश्यकता होती है। अंग संचयन के दौरान तापमान में भारी परिवर्तन से बचा जाना चाहिए ताकि नमूना इमेजिंग से 5 मिनट पहले गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) चरण पर जांचने की अनुमति दे सके।

संभावित अनुप्रयोगों और महत्व
संक्षेप में, सीआईयू की गणना की बोझिल विधि यूटीआई क्षेत्र में अनुसंधान की प्रजनन क्षमता और प्रभावकारिता को सीमित कर रही थी। BLI के साथ प्रायोगिक सेटअप मूत्राशय फिजियोलॉजी, यूटीआई रोगजनन, और देशांतर अनुवर्ती सक्षम करके संवेदनशीलता पर वीवो यूटीआई अनुसंधान में अग्रिम होगा, जबकि अध्ययन के इन प्रकार के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को रिसर्च फाउंडेशन - फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ व्लांडरन) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था; G0A6113N), केयू Leuven की अनुसंधान परिषद (C1-TRPLe; टीवी और डब्ल्यूई) और VIB (टीवी के लिए) । W.E. रिसर्च फाउंडेशन के एक वरिष्ठ नैदानिक शोधकर्ता है-Flanders (FWO Vlaanderen) । तनाव UTI89-लक्स प्रो बीज प्रयोगशाला13से एक उदार उपहार था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate Corning 3925 for in vitro imaging
Aesculap ISIS Aesculap GT421 hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer Harvard apparatus limited N/A https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL Bayer N/A Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA BD 382912 Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice Janvier N/A
Centrifuge 5804R Eppendorf EP022628146
Dropsense 16 Unchained Labs Trinean to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco ThermoFisher Scientific REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L VWR international 85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap Corning 352057
Falcon 50ml cellstart Greiner 227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL Sigma-Aldrich 26203 to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop Roth 6174.1 holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g Dechra Veterinary products N/A Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer REF 124262 imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL Sigma-Aldrich CAS 25389-94-0
Living Imaging Software PerkinElmer N/A BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth Sigma-Aldrich REF L3022 alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar Sigma-Aldrich REF L2897 alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm ThermoFisher Scientific 101VR20 to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL Sigma-Aldrich SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean Unchained Labs 701-2007 to measure OD 600nm
UTI89-lux N/A N/A Generous gift from Prof. Seed
Vortex VWR international 444-1372

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References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
  2. O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
  3. Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
  6. Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
  7. Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
  8. Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
  9. Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
  10. Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
  11. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  12. Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
  13. Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
  14. Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
  15. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  16. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
  17. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
  18. Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
  19. Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
  20. Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
  21. Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
  22. Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
  23. Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
  24. Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
  25. Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 172 बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग मूत्र पथ संक्रमण बैक्टीरियल संक्रमण यूरोपैथोजेनिक ई. कोलाई मुरीन मॉडल लक्स ऑपरन फोटॉन
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Luyts, N., Vande Velde, G., Vanneste, M., De Bruyn, H., Janssens, A., Verstraeten, N., Voets, T., Everaerts, W. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (172), e62614, doi:10.3791/62614 (2021).

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