Summary
唾液腺已被提议为基因治疗的组织靶点，特别是在通过基因转移接种疫苗方面。我们演示了利用逆行性皮质输液的非人类灵长类动物模型中的基因传递。
Abstract
唾液腺是基因治疗的有吸引力的组织靶点，其有希望的结果已经导致人体试验。它们天生就能够将蛋白质分泌到血液中，并且很容易获得，因此它们有可能成为替代激素生产或通过基因转移接种疫苗的优越组织部位。建议的基因传递方法包括皮下注射和通过唾液导管逆行输液。我们演示如何在非人类灵长类动物中执行逆行唾液格兰输液 （RSGI）。我们描述了重要的解剖学地标，包括鉴定帕皮拉，一种利用基本牙科工具、聚乙烯管和氰酸丙烯酸酯对斯滕森的导管进行罐装和密封的创伤性方法，以及适当的输液率。虽然这是创伤最小的分娩方法，但该方法仍然受到能够交付的体积（<0.5 mL）以及管道和腺体可能遭受创伤的限制。我们使用荧光镜检查证明，注入物可以完全输送到腺体中，并通过免疫造血术进一步证明典型载体的转导和传递基因的表达。
Introduction
虽然唾液腺以产生唾液的外分泌而闻名，但研究人员早已认识到它们能够将蛋白质直接分泌到血液中，从而成为系统性施用（如替代激素或抗体生产）基因治疗的潜在靶点。事实上，唾液腺比其他组织靶点具有几个优势，例如产生分泌蛋白质的固有能力（缺乏特性肌肉）、可以限制病媒扩散的重封装，以及为不整合载体提供稳定性的分化良好的组织。此外，在发生严重不良事件时，唾液腺对生命不至关重要，可以手术切除。虽然不是立即直观，帕罗蒂腺也很容易从嘴里通过他们的主要排泄管道，斯滕森的管道2。
鉴于唾液组织对基因治疗的益处，人们越来越有兴趣探索这一组织目标。在啮齿动物、犬类和非人类灵长类动物模型中已经进行了许多研究，至少一项人类临床试验正在进行中。为了进一步探索和发展这种组织靶点用于基因治疗的目的，将需要更多的非人类灵长类动物研究。本文描述了一种通过斯滕森的管子访问帕罗蒂腺的方法，以提供一个向量基因，用于在非人类灵长类动物模型中进行转导。为了明显地演示输液和管道进入腺体的解剖学，使用放射性对照器进行了荧光镜检查。为了证明一个载体的成功转导，使用了腺病毒血清型5（Ad5）矢量egfp基因。Ad5 是一种描述良好的载体，能够转导唾液组织。虽然它太免疫原性，最终临床使用，Ad5载体被选中为这个示范研究，以确保有效的转导。评估增强型绿色荧光蛋白 （EGFP） 的生产是一种经过充分描述的方法，可以证明转导后向量基因的转录和翻译成功，并在此完成。
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Protocol
所有程序都在威克森林医学院克拉克森校区进行动物研究。当局动物护理及使用委员会（IACUC）已征询有关合乎道德的考虑，并提交审查程序的细节。威克森林国际自然保护联盟批准了我们的研究协议，所有程序都是根据IACUC批准的协议#A17-147完成的。
1. 准备输液装置
- 使用一把剪刀将尺寸 10 聚乙烯管 （PET10） 切割成 25 厘米长。
- 使用黑色标记在 1 厘米和 2 厘米的一端标记 PET10。
- 将 0.5 mL 的 Ad5-EGFP 溶液（109 个病毒颗粒/mL）预填充到 1 mL（结肠库林）注射器中。
- 将 PET10 管的无标记端滑动到连接到注射器上的 29-31 G 针头上。在放大下执行此任务通常更容易。
- 将溶液注入 PET10，直到管子完全满（在自由端可见掉落）。
- 使用全标准 PPE，包括手术磨砂、长袖长袍、防渗手套、外科面罩、面罩、发帽和鞋套。
2. 准备动物
注：视频演示使用了西诺莫尔格斯猴。其他非人类和人类灵长类动物的解剖结构非常相似，协议应翻译给其他物种。
- 在手术前15分钟以皮下方式注射0.05毫克/千克阿托平，以尽量减少唾液分泌物，优化输液的分布和保留。
- 使用5mL注射器进行麻醉，注射肌肉内氯胺酮/米达佐兰（10-15毫克/千克氯胺酮和0.01-0.05毫克/千克米达佐兰）。当饱和动物失去知觉，无法对刺激做出反应时，确认适当的麻醉。
3. 执行程序
- 使用口腔缩回器支撑张开的嘴。
- 将缩回器一端的橡胶垫放在上牙后面的硬味觉上，放在嘴侧，与将要注入的腺体相对。将另一端的橡胶垫与上部缩回器放在下侧犬的同一侧。轻轻让缩回器的弹簧动作展开并张开嘴。
- 识别帕罗蒂帕皮拉，斯滕森的管子的开口，在后脸颊上，毗邻上2摩尔 。这是最好的可视化使用牙科循环放大。
- 用圆锥形蒸腾器点轻轻地拉皮条的乳香。最好将蒸丁器的点放入中心或打开，然后轻轻地来回旋转。点应慢慢进入乳香草，并提请它超过约20-30s的温和旋转。
- 将 PET10 管插入扩张的帕罗蒂帕皮拉。这是最好的实现，通过举行 PET10 管的标记端与钳子约 0 . 5 厘米从远端，轻轻地插入管尖到扩张的。
- 轻轻地推进管子，这通常通过小旋转运动，以帮助管滑动，然后调整钳子0.5厘米近在以前的抓地力。重复这个，直到2厘米的标记达到帕罗蒂帕皮拉。
- 在乳香和插入管周围的脸颊上涂抹氰酸丙烯酸酯，等待它干燥（没有特定数量记录，仅足以密封斯滕森的管道乳香管入口）。这通常需要不到一分钟，并有助于密封帕皮拉和减少注入回口腔的溢出。
- 以 100 μL/分钟的速度将注射器内容缓慢推移超过 5 分钟。这种缓慢的输液率将导管内压力突然增加导致管道损伤的风险降到最低。
- 输液完成后，将 PET10 留在原位至少 5 分钟。保持管道密封，让注入留在帕罗蒂腺。
- 以柔和的牵引力移除 PET10。氰化亚丙烯酸酯将拉自由与管。
- 在另一侧重复步骤 3.2 到 3.8。
- 在注入两个香肠和两个 PET10 管子被移除后，慢慢释放口腔减缩器。
注：双方的整个程序应少于30分钟。
4. 程序后护理
- 输液完成后，斯滕森的导管脱粒，观察动物，直到麻醉效果消失（通常在20-30分钟后程序）。
- 提供动物饮料，然后食物后，他们完全清醒，并恢复常规护理。
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Representative Results
成功的程序、转录和转录
图1 显示了后高级脸颊上与第 2摩尔相邻的帕罗蒂帕皮拉。图像还显示了嘴支撑的正确位置，硬味觉上的橡胶端和虹膜犬上的另一个橡胶端。 图2 显示了在PET10上2厘米标记下成功吃到帕罗蒂帕皮拉后拍摄的图像。 图3 显示了放射性逆向输液时的荧光镜图像，演示了溶液通过斯滕森的导管分枝并进入帕罗蒂德腺体。此荧光图像的执行只是为了演示注入物的解剖和分布。执行向量输送的此程序时不需要氟镜检查。 图4 显示EGFP在组织病理学上沾染红色。导管细胞和腹膜细胞都染成红色，表明两种细胞类型的成功转导和转录。总之，这四个数字显示了适当的RSGI与解剖学的可视化和Ad5矢量EGFP的转导。
图1： 帕罗蒂德乳香。 注意图上的圆圈，突出后脸颊上第 2个 摩尔旁边的乳香。还要注意嘴支撑的位置，硬味上有一个橡胶端，下犬上有另一个橡皮筋。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2： PET10的帕罗蒂德乳香草罐装。 请注意PET10管上的2厘米标记，在后脸颊上，靠近第2个 上摩尔的帕皮拉（箭头）可见。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3： 荧光镜图像显示扩散到帕罗蒂德腺体。 注意在斯滕森的管道（箭头）末端分支，因为它分支成较小的管道在帕罗蒂腺（圆）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：帕罗蒂德腺体的病理学幻灯片。 注意通过导管/腹膜帕罗蒂组织表达EGFP（染成红色）。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了通过斯滕森的管道向帕罗蒂德腺体进行逆行输注的协议。所描述的方法提供了指导，研究人员可以探索唾液组织作为基因治疗和其他应用场所的效用。
有许多关键步骤可以确保程序的成功。首先，所有程序步骤都应轻轻完成。有力的支撑嘴可能导致气管下行。强制罐装的帕皮拉或快速注入溶液到斯滕森的管道可能导致急性导管撕裂或慢性导管狭窄。
第二，确保麻醉已经实施并有效。如果没有适当的麻醉，任何步骤都不容易完成，动物和人类受伤的风险显著增加。我们选择了带氯胺酮和米达佐兰的肌肉内麻醉，这是非人类灵长类动物研究的标准方案。我们认为阿托平对于减少手术过程中的唾液分泌物，提高解剖学的能见度，减少输液在转导前洗净非常重要。
一个经常具有挑战性的步骤是PET10的初始罐装和推进到帕罗蒂帕皮拉和斯滕森的管子。PET10 的温和旋转，同时插入，有助于这些步骤。过度推力可能导致导管损伤。
这个过程主要受组织脆弱性和大小的限制。这需要非常温和的技术，并使用放大环和小型工具，以确保适当的罐装，提前管和输送的注入。另一个潜在的限制是注入的体积，帕罗蒂腺能够容纳。先前的研究已经注入了最大体积0.5mL到每个帕罗蒂腺，总计1mL每动物6，9，10。虽然这不会直接影响程序本身，取决于药物浓度的注入，它可能被证明是限制所需的生理效果。
如果需要唾液腺输液，RSGI 提供创伤最小的选择。替代方法，如皮下或美国引导的皮下注射，有面部神经损伤的风险。此外，这些程序可能无法实现对整个腺体的充分分配，而RSGI则利用管道系统确保分配。氟镜检查仅使用标准无线电对照溶液进行，仅为了证明 RSGI 在整个腺体中提供良好的分布。这是与 Ad5 矢量的实际输注分开执行的。在RSGI期间为传递基因载体而进行的荧光镜检查和/或其他X射线成像是无济于事的，也不建议。
随着基因转移治疗领域的不断发展，唾液腺作为靶向组织已经越来越受欢迎。庞齐奥等人对唾液腺作为免疫目标的益处进行了很好的回顾。正如我们所证明的封装的非生命性腺体组织很容易获得一样，帕罗蒂腺构成了一个理想的基因治疗平台。RSGI为基因转移到腺体提供了最少的创伤性技术。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢卡格尼·盖特先生在拍摄过程中的视听支持。我们还要感谢赫夫纳VA医疗中心为追求这个项目提供学术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
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