Summary
타액선은 유전자 치료를 위한 조직 표적 사이트로서, 특히 유전자 전달에 의한 예방 접종 영역에서 제안되었다. 역행 마루드 주입을 활용한 비인간 영장류 모델에서 유전자 전달을 시연합니다.
Abstract
침샘은 이미 인체 실험으로 이어지는 유망한 결과를 가진 유전자 치료를 위한 매력적인 조직 표적입니다. 그(것)들은 본질적으로 혈류량으로 단백질을 분비할 수 있고 쉽게 접근할 수 있습니다, 그(것)들을 유전자 전송에 의하여 대체 호르몬 생산 또는 예방 접종을 위한 잠재적으로 우수한 조직 사이트를 만들기. 유전자 전달을 위한 건의한 방법은 타액 덕트를 통해 경피 주입 및 역행 주입을 포함합니다. 우리는 비 인간 영장류에서 역행 타액 선동맥 주입 (RSGI)을 수행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 parotid 유두의 식별, 기본 치과 도구를 사용하여 스텐슨의 덕트를 수착하고 밀봉하는 외상성 방법, 폴리에틸렌 튜브 및 시아노아크라이레이트, 적절한 주입 속도를 포함한 중요한 해부학 적 랜드 마크를 설명합니다. 이것은 전달의 가장 외상적인 방법이지만, 방법은 여전히 전달 될 수있는 부피 (<0.5 mL)와 덕트와 동맥에 외상의 잠재력에 의해 제한됩니다. 당사는 불소시경검사를 사용하여 인퓨아이 선으로 완전히 전달될 수 있음을 입증하고, 면역히스토케로 전달된 유전자의 전형 및 발현을 더욱 입증한다.
Introduction
타액선은 타액의 외분 생산으로 잘 알려져 있지만, 연구자들은 오랫동안혈류1에직접 단백질을 분비하는 능력을 인식하여 대체 호르몬이나 항체 생산과 같은 전신 투여를 위한 유전자 치료의 잠재적 인 표적이 되었습니다. 실제로, 타액선은 분비(재산 근육 부족), 벡터 확산을 제한할 수 있는 무거운 캡슐화, 비통합 벡터에 대한 안정성을 제공하는 잘 분화된 조직 등 다른 조직 표적에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 또한 심각한 부작용이 발생할 경우 타액선은 생명에 중요하지 않으며 외과적으로 제거 될 수 있습니다. 즉시 직관적이지는 않지만, 파로티드 땀샘은 메인 배설덕트인 스텐센덕트2를통해 입에서 쉽게 접근할 수 있습니다.
유전자 치료를 위한 타액 조직의 장점을 감안할 때, 이 조직 표적을 탐구에 있는 관심이 증가하고 있습니다. 설치류, 개 및 비인간 영장류 모델에서 이미 수많은 연구가 수행되었으며 적어도 하나의 인간 임상 시험이3,4,5로진행중이다. 유전자 치료 목적을 위해이 조직 표적의 유용성을 더 탐구하고 개발하기 위해 더 많은 비 인간 영장류 연구가 수행되어야합니다. 이 논문은 비인간 영장류 모델에서 트랜스포메이션을 위한 벡터 유전자를 전달하기 위해 스텐센덕트를 통해 파로티드 땀샘에 접근하는 방법을 설명합니다. 선으로 들어갈 때 덕트의 내후및 해부학의 전달을 눈에 띄게 입증하기 위해, 방사선 대조를 이용하여 형광술이 수행되었다. 벡터의 성공적인 전도를 입증하기 위해, 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터에그fp 유전자가 사용되었다. Ad5는 타액 조직을 변형시킬 수 있는 잘 기술된 벡터이다. 궁극적인 임상 사용을 위해 너무 면역원성이지만, 효율적인 트랜스듀션을 보장하기 위해 이 데모 연구를 위해 Ad5 벡터를 선택했습니다. 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 생산을 평가하는 것은 변환 다음 벡터 유전자의 성공적인 전사 및 번역을 입증하는 잘 설명 된 방법이며 여기에서 수행되었습니다.
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Protocol
모든 절차는 동물 연구를 위한 의학 클락슨 캠퍼스의 웨이크 포레스트 학교에서 수행되었습니다. 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)는 윤리적 고려 사항에 대한 자문을 받았으며 절차의 세부 사항은 검토를 위해 제출되었습니다. 웨이크 포레스트 IACUC는 우리의 연구 프로토콜을 승인하고 모든 절차는 iacUC 승인 프로토콜 #A17-147에 따라 수행되었다.
1. 주입 장치 준비
- 크기 10 폴리에틸렌 튜브 (PET10)를 가위를 사용하여 25cm 길이로 잘라냅니다.
- 검은 색 마커를 사용하여 한쪽 끝에서 1cm, 2cm에서 PET10을 표시합니다.
- Ad5-EGFP 용액의 0.5mL(109 바이러스 입자/mL)를 1mL(결핵) 주사기로 미리 채웁니다.
- 주사기에 부착된 29-31 G 바늘을 통해 PET10 튜브의 비 표시끝을 밀어냅니다. 일반적으로 배율하에서 이 작업을 수행하는 것이 더 쉽습니다.
- 튜브가 완전히 가득 차때까지 PET10에 솔루션을 주입하십시오 (무료 끝에서 보이는 드롭).
- 수술 용 스크럽, 긴 소매 가운, 불투과성 장갑, 수술 용 마스크, 얼굴 방패, 헤어 보닛 및 신발 커버를 포함한 전체 표준 PPE를 사용합니다.
2. 동물 준비
참고 : Cynomolgus 원숭이는 비디오 데모에 사용되었다. 다른 비 인간 및 인간 영장류의 해부학은 매우 유사하며 프로토콜은 다른 종과 관련이 있어야합니다.
- 타액 분비를 최소화하고 비염의 분포 및 보존을 최적화하기 위해 절차 15 분 전에 atropine의 0.05 mg/kg을 피하하십시오.
- 근육 내 케타민/미다졸람(10-15 mg/kg의 케타민, 미다졸람 0.01-0.05 mg/kg)을 사용한 5mL 주사기를 사용하여 마취를 제공합니다. 진정된 동물이 의식이 없고 자극에 반응할 수 없을 때 적절한 마취를 확인합니다.
3. 절차 수행
- 구강 리트랙터를 사용하여 입을 벌리면 버팀목이 됩니다.
- 고무 패드는 주입 될 선과 반대입의 측면에 상단 치아 뒤에 하드 미각에 re트랙터의 한쪽 끝의 고무 패드를 배치합니다. 다른 쪽 끝의 고무 패드를 상부 리트랙터와 같은 면에 놓습니다. 리트랙터의 스프링 동작이 입을 확장하고 열 수 있습니다.
- 상부 2nd 어금니에 인접한 후방 뺨에 스텐센 덕트의 오프닝인 파로티드 유두를 확인한다. 이것은 배율에 대한 치과 루프를 사용하여 시각화하는 것이 가장 좋습니다.
- 원물 팽창기의 지점으로 파로티드 유두를 부드럽게 팽창시다. 딜레이터의 지점을 유두의 중앙이나 개구부에 넣은 다음 부드럽게 앞뒤로 회전하는 것이 가장 좋습니다. 포인트는 천천히 유두를 입력하고 부드러운 회전의 약 20 - 30 s 이상 팽창한다.
- PET10 튜브를 팽창된 파로티드 유두에 삽입합니다. 이것은 불경한 끝에서 약 0.5cm 핀셋을 가진 PET10 관의 표시된 끝을 잡고 부드럽게 팽창한 유두에 관의 끝을 삽입해서 달성됩니다.
- 튜브 슬라이드를 돕기 위해 작은 회전 움직임에 의해 용이하게되는 튜브를 부드럽게 전진시키고 핀셋0.5cm 근동을 이전 그립으로 재조정합니다. 2cm 표시가 파로티드 유두에 도달할 때까지 이 것을 반복합니다.
- 유두와 삽입 된 튜브 주위에 뺨에 시아노아크 릴레이트를 적용하고 건조 때까지 기다립니다 (특정 금액은 기록되지 않고 스텐센의 덕트 유두입구를 밀봉하기에 충분함). 이것은 전형적으로 1 분 미만 소요하고 parotid 유두를 밀봉하고 구강에 다시 불양의 유출을 감소시키는 것을 돕습니다.
- 주사기 함량을 100 μL/min의 속도로 5분 이상 천천히 밀어 넣습니다. 이 느린 주입 속도는 덕트 내 압력의 급격한 증가로 인한 덕트 부상의 위험을 최소화합니다.
- PET10을 주입이 완료된 후 최소 5분 동안 그대로 둡니다. 덕트를 밀봉하고 비소가 파로티드 선에 남아 있도록 하십시오.
- 부드러운 견인력으로 PET10을 제거하십시오. 시아노아크라이레이트는 튜브로 자유롭게 풀릴 수 있습니다.
- 반대쪽에서 3.2~3.8단계를 반복합니다.
- 두 parotids 주입 하 고 두 PET10 튜브 제거 후 천천히 구두 re트랙터를 해제.
참고: 양측의 전체 절차는 30분 미만이어야 합니다.
4. 절차 후 치료
- 주입이 완료되고 스텐센의 덕트 탈유 후 마취 효과가 마모 될 때까지 동물을 관찰하십시오 (일반적으로 20-30 분 후 시술).
- 동물 음료를 제공하고 완전히 깨어나서 음식을 제공하고 일상적인 치료를 재개하십시오.
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Representative Results
성공적인 절차, 변환 및 전사
도 1은 후방 우수한 뺨에2nd 어금니에 인접한 파로티드 유두를 나타낸다. 이미지는 또한 입 중괄호의 올바른 배치, 하드 입맛에 하나의 고무 끝 및 입시 종개에 다른 고무 끝을 보여줍니다. 도 2는 PET10의 2cm 마크에서 파로티드 유두의 성공적인 캔레이션 후 촬영한 이미지를 나타낸다. 도 3은 스텐센덕트를 통해 파로티드 선으로 용액의 분기를 보여주는 방사성 주입의 순간에 형광시경 이미지를 나타낸다. 이 불소 이미지는 내포제의 해부학 및 분포를 보여주는 유일한 의도에 대해 수행되었다. 벡터 전달을 위해 이 절차를 수행할 때불소 검사가 필요하지 않습니다. 도 4는 조직병리학에 적색으로 된 EGFP 면역염색을 나타낸다. 덕트 및 아시나르 세포는 모두 적색으로 염색되어 두 세포 유형모두에서 성공적인 트랜스듀션과 전사를 나타냅니다. 요약하면, 이 네 가지 수치는 해부학의 시각화와 Ad5 벡터 EGFP의 변환과 적절한 RSGI를 보여줍니다.
그림 1: 파로티드 유두. 후면 뺨의2nd 어금니에 인접한 파로티드 유두를 강조하는 그림의 원을 주목하십시오. 또한 입 중괄호의 배치에 주의, 하드 미각에 하나의 고무 끝과 하부 개에 다른 고무 밴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PET10에 의한 파로티드 유두 통. 2nd 어퍼 어에 인접한 후방 뺨에 위치한 파로티드 유두(arrowhead)에서 볼 수 있는 PET10 튜브의 2cm 마크를 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 경동맥으로 확산을 보여주는 불소 시경 영상. 스텐센 덕트(화살표헤드) 끝에 분기를 기록하여 파로티드 선(Circle)의 작은 덕트로 분기합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: parotid 선의 병리학 슬라이드. 덕탈/아시나르 파로티드 조직에 의한 EGFP(빨간색으로 염색)의 현현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 스텐슨의 덕트를 통해 parotid 선으로 역행 주입의 프로토콜을 설명합니다. 설명된 방법론은 유전자 치료 및 그밖 응용을 위한 사이트로 타액 조직의 유용성을 탐구하는 연구원에 의해 잠재적으로 이용될 수 있는 지도를 제공합니다.
절차의 성공을 보장하기 위한 여러 가지 중요한 단계가 있습니다. 무엇보다도 모든 절차 단계를 부드럽게 완료해야 합니다. 입의 강력한 브레이싱은 하악 서브럭스로 발생할 수 있습니다. 스테네센덕트에 용액을 신속하게 주입하거나 파로티드 유두의 강력한 수분 또는 신속한 주입은 급성 덕트 눈물이나 만성 덕트 협착증을 초래할 수 있습니다.
둘째, 마취가 투여되고 효과적인지 확인하십시오. 적절한 마취없이, 단계중 어느 것도 쉽게 달성 할 수 없으며 동물과 인간의 부상의 위험이 크게 증가합니다. 우리는 케타민과 미다졸람을 가진 근육 마취를 선택했습니다, 이는 비 인간 영장류 연구6에있는 표준 식이요법입니다. 우리는 atropine이 절차 도중 타액 분비를 감소시키고, 해부학의 가시성을 향상하고, 변환7,8의 감산의 세척을 감소시키기 위한 중요한 것을 고려합니다.
종종 도전적인 단계는 PET10의 초기 수식과 파라티 유두와 스텐센의 덕트로 의진보입니다. 삽입하는 동안 PET10의 부드러운 회전은 이러한 단계를 용이하게합니다. 과도한 밀어붙이는 것은 덕트 부상으로 이어질 수 있습니다.
절차는 주로 조직의 취약성 및 크기에 의해 제한됩니다. 이를 위해서는 적절한 캐닝, 튜브 의 사전 및 비혼물의 전달을 보장하기 위해 매우 부드러운 기술과 돋보기 루프 및 작은 도구를 사용해야 합니다. 또 다른 잠재적 인 제한은 parotid 땀샘이 수용 할 수 있다는 비식증의 양입니다. 이전 연구는 각 parotid 선에 0.5 mL의 최대 볼륨을 주입, 동물 당 총 1 mL6,9,10. 이것은 직접 절차 자체에 영향을 미치지 않지만, infusate의 약물 농도에 따라, 그것은 원하는 생리적 효과에 대한 제한을 증명할 수 있습니다.
RSGI는 타액 선 주입이 바람직한 경우 가장 작은 외상성 옵션을 제공합니다. 경피 성 또는 미국 유도 경피 주사와 같은 대안은 안면 신경 손상의 위험을 수반합니다. 또한 이러한 절차는 전체 선에 대한 적절한 분포를 달성하지 못할 수 있지만 RSGI는 덕트 시스템을 사용하여 분포를 보장합니다. 불소 시경법은 RSGI가 전체 동맥 전체에 걸쳐 좋은 분포와 함께 전체 불경구를 제공한다는 것을 보여주기 위해이 문서의 목적을 위해서만 표준 방사선 대조 솔루션으로 수행되었다. 이는 Ad5 벡터의 실제 주입과는 별도로 수행되었다. 유전자 벡터를 전달하기 위해 RSGI 도중 수행된 불소 검사 및/또는 그밖 엑스레이 화상 진찰은 도움이 되지 않을 것이고 추천되지 않습니다.
유전자 전이에 의한 치료 분야가 계속 진화함에 따라 표적 조직으로서의 타액선은 이미 인기를 얻고 있다2,5. Ponzio 등은 예방접종4의대상으로 타액 땀샘의 장점에 대한 훌륭한 검토를 제공합니다. 우리가 입증 한 캡슐화 된 비 중요한 선 조직은 쉽게 접근 할 수 있으므로 parotid 땀샘은 이상적인 유전자 치료 플랫폼을 구성합니다. RSGI는 땀샘으로 유전자 전송을 위한 가장 작은 외상성 기술을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 절차 촬영에 자신의 시청각 지원에 대한 씨 Cagney 젠트리에게 감사드립니다. 우리는 또한이 프로젝트를 추구하는 학문적 지원을위한 헤프너 VA 의료 센터를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
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- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
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