Summary
オープングローブの目の怪我は、農村部や軍事関連のシナリオで数日間治療を受けず、失明を引き起こします。治療は視力の損失を最小限に抑えるために必要とされる。ここでは、臓器文化のオープングローブ傷害モデルについて詳しく説明します。このモデルを用いて、これらの傷害を安定させる潜在的な治療は適切に評価することができる。
Abstract
オープングローブの怪我は視力の結果が悪く、しばしば視力が永久的に失われます。これは、農村部の環境における傷害と医療介入と、眼科ケアが容易に利用できない軍事医療アプリケーションとの間の延長遅延によるものです。未治療の傷害は、眼が水密シールを失った後に感染しやすいだけでなく、眼内低血圧による組織の生存率の喪失である。開いた地球の傷害を一時的に封止する治療薬は、適切に発達すれば、眼内圧を回復し、適切な眼科ケアが可能になるまで感染を防ぐことができるかもしれない。製品開発を容易にするために、ここで詳述される、損傷後の少なくとも72時間の治療性能を追跡するための前セグメント臓器培養オープングローブ傷害プラットフォームの使用である。豚前セグメント組織は、カスタム設計の臓器培養皿で維持され、生理学的眼圧で保持することができる。穿刺傷害は、軍関連の傷害サイズと同様に、直径4.5mmまでの損傷サイズを発生させることができる空気動力システムで作成することができます。眼内圧の喪失は、損傷後72時間で観察され、眼の水密シールの適切な傷害誘導および喪失を確認する。治療性能は、傷害誘導後の眼への適用によって追跡され、その後、複数の日の眼圧を追跡することができる。また、前部損傷モデルは、透明性の評価、眼力学、角膜上皮の健康、組織の生存率などの前部系統生理学を機能的および生物学的に追跡するために広く使用されている方法に適用可能である。全体として、ここで説明する方法は、眼科ケアが容易に利用できないときに一時的に開いた地球の傷害を密封するための生体材料治療薬の開発に向けた必要な次のステップである。
Introduction
オープングローブ(OG)傷害は、治療を受けていないか、または少なくとも傷害後に安定した視力の永久的な損失をもたらす可能性があります 1.しかし、農村部や軍事シナリオの戦場など、眼科介入へのアクセスが容易に利用できない遠隔地では、遅延が蔓延しています。治療が容易に利用できない場合、現在の治療基準は、医療介入が可能になるまで、硬質シールドで目を保護することです。軍事医療では、この遅延は現在24時間までですが、空気の避難が不可能な都市環境での戦闘活動では、今後72時間まで増加すると予想される2,3,4。これらの遅延は、眼科介入へのアクセスが制限されている農村部の遠隔地の民間アプリケーションではさらに長くなる可能性があります5,6.未治療のOG傷害は、眼の水密シールが損なわれることによる感染および眼圧(IOP)の喪失に対して非常に脆弱である7,8。IOPの喪失は組織の生存率に影響を与える可能性があり、傷害と治療の間の遅延が長すぎる場合に視力を回復させる可能性は低い医療介入を行う 9.
眼科の専門家に到達するまでのOG傷害をシールするための容易に適用可能な治療薬の開発を可能にするために、ベンチトップOG傷害モデルは、以前に開発された10、11。このモデルでは、IOPが圧力トランスデューサによって捕捉されている間、豚の目全体に高速傷害が生じた。治療は、OG傷害部位12をシールする能力を評価するために適用することができる。しかし、このモデルはブタの目全体を使用するので、患者が専門ケアに達するまで治療部位を安定させなければならない72時間の可能なウィンドウ全体で長期的なパフォーマンスを追跡する方法を持たない即時治療性能を評価することができます。その結果、前セグメント臓器培養(ASOC)OG傷害モデルが開発され、長期治療性能13を追跡するためのプラットフォームとして本プロトコルに詳述された。
ASOCは、角膜などの前部セグメントの血管組織を維持するために広く用いられている技術であり、複数週の後核化14、15、16、17である。前部セグメントは、生理学的流量で流体を浸透させ、骨膜メッシュワーク流出領域を保存することによって生理学的IOP下で維持され、IOPを調節する組織を、ASOCセットアップ18、19中に行う。ASOCプラットフォームは、組織を生理学的に維持し、空気圧駆動装置を用いてOG傷害を誘発し、治療を適用し、傷害後少なくとも72時間の損傷安定化を追跡する。
ここでは、このプロトコルは ASOC プラットフォームを使用するためのステップ バイ ステップの方法論を提供します。まず、ASOC プラットフォームのセットアップ方法と製造方法について説明します。次に、プロトコルは、前部セグメントを無菌的に解剖し、骨膜メッシュワークを維持し、続いてカスタムメイドの臓器培養皿に前部セグメント組織を設定する方法を詳述する。その後、オープングローブ傷害を作成し、傷害の直後に治療を適用する方法を詳述する。最後に、このプロトコルは、眼の機能的、機械的、生物学的特性を評価し、損傷がどの程度安定しているかを評価するこの方法で使用できる特性評価パラメータの概要を提供します。全体的に見て、このモデルは、開いた地球の損傷を安定させ、治療するための製品開発を加速し、傷害後の視力の悪い予後を改善するために非常に必要なプラットフォームを提供する。
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Protocol
このプロトコルを実行する前に、研究や訓練で動物を使用するための法的および倫理的要件があることに注意してください。生きた動物が眼組織の供給源として使用される場合は、始める前に、地元の倫理または法的機関(IACUCまたは倫理委員会など)の承認を求めてください。動物の使用承認を得る際に何か質問がある場合は、続行しないでください。我々は以前に、生後死後24時間以内に得られた新鮮なブタの目が生体内生理学に最も近く、これらの研究(動物技術、タイラー、TX、米国)10、13に比べて良好であると判断し、報告した。このプロトコル全体で生きている動物は使用されなかったが、組織ベンダーを使用して24時間以内に組織を得た。
注意:組織到着前に、臓器培養皿(補足プロトコル1)、クランプリング(補足プロトコル1)、皿スタンド(補足プロトコル1)、圧力トランスデューサデータコレクション設定(補足プロトコル2)、および空気圧穿刺プラットフォーム(補足プロトコル3)を製造する。食器、道具、消耗品を殺菌し、作業領域を準備します。彼らは通常、結合、余分な軌道組織が取り付けられているように、目に大きな解剖を行うために非無菌領域を持つことは有用です。開いたクリーンな作業面でこれらの最初のステップを実行し、その後、マイクロ解剖のためにBSC IIキャビネットに無菌で目を移します(キャビネット#1)。最適に、マイクロ解剖のために利用されるBSC IIキャビネットは、空気の流れを最小限に抑え、ワークスペースを最大化するために皿アセンブリBSC IIキャビネット(キャビネット#2)から分離されています。マイクロ解剖キャビネットを解剖顕微鏡で設置し、作業面(キャビネットから突き出たカメラや接眼部品)を視覚化する方法を設定します。
1. 滅菌ステップ、消耗品(詳細については、資料表を参照)、およびセットアップ
- 次の項目を準備し、ガス滅菌(各目に1キット):ASOC皿、クランプリング、Oリング付き2つの流体コネクタ、2つの18 Gニードルハブ、4つのネジ、PE-100チューブの2つの長さ(インキュベーター内の皿からシイリンジポンプと圧力トランスデューサデータ収集のセットアップ)の長さでなければなりません。 2つの18 G 90°曲がった針ハブ、2つの3ウェイバルブ。
- 以下のキットを準備し、オートクレーブします。
- 細かい鉗子1足、Vannasはさみ、中歯用鉗子1組、大きなハサミ1足、綿綿棒、カミソリの刃またはメスを含むマイクロ解剖計器キットを準備し、オートクレーブ。
- 組み立て式の器具キットを準備し、中歯鉗子1組、手術用はさみ1本、Lキー1本を含む。
- 必要に応じて毎日皿にクランプリングを締め付けるために1つのLキーを含む毎日のキット(量:文化の1日あたり1つ)を準備し、オートクレーブします。
- 目や前のセグメントを消毒し、保存するための4つの100 mLビーカーをオートクレーブ。
- 穿刺オブジェクトをオートクレーブします。
- ペトリ皿(1皿/目)、ガーゼ(1-2/目)、皿スタンド、20 mLシリンジ(1/アイ)、10 mLシリンジ(1/目)、ナイロンシリンジフィルター(1/目)を収集します。
- 滅菌培地を準備する:4%FBS、1xグルタマックス、1xゲンタマイシン、1x抗生物質抗ミキティック(AA;約30〜40 mL完全培地/眼) を備えたDMEM。
- AA-PBSを準備する:1x AA(〜500 mL)でPBS。
- 総解剖ツールパックを準備する:清潔で乾燥した大きな外科用ハサミと鉗子。
- 非無菌解剖ワークスペースを設定する:総解剖ツールパック、PBSと氷の上に水没した核豚の目、外科用ドレープ、PBSと100 mLビーカーから供給を収集します。外科的ドレープと大解剖に必要な項目をレイアウトします。
- 滅菌解剖ワークスペースを設定する:マイクロ解剖計器キット、滅菌ガーゼ、解剖顕微鏡、ベタジン溶液、滅菌PBS、滅菌媒体、4つの滅菌された100 mLビーカー、滅菌ペトリ皿から供給を収集します。BSC IIキャビネット#1に無菌転送。解剖顕微鏡で目を視覚化するためのキャビネットを設置します。
- ASOCアセンブリワークスペースを設定:ガス滅菌キット(皿キットと蓋キット)、組立機器キット、滅菌メディア、ディッシュスタンド、滅菌ペトリ皿、滅菌注射器、シリンジフィルターを収集します。BSC IIキャビネット#2に無菌転送。皿アセンブリのためのキャビネットを設定します。
- 目が安定し、穿刺の準備ができたら(72時間後セットアップ)、無菌でBSC IIキャビネットに移します。OG傷害誘導ワークスペースを設定:空気圧式傷害誘導装置( 補足3で詳述されたアセンブリ)とラボジャックとクロストラッキングバイスをASOCディッシュを保持します。
2. 組織の解剖
- 非無菌解剖ワークスペースを使用してブタ組織を準備します。
- 地元のアバトワール、動物研究、またはベンダーから核豚の目を調達します。配達中にPBSに沈んだ氷の目を維持し、受信時にすぐに使用してください。
- 眼窩外組織を切り取り、角膜シェルと視神経だけを残して結膜をトリミングします。大きな外科用はさみと鉗子を用いて、大解剖ツールパックで非無菌状態で解剖を行います。
- 実験的なセットアップに必要なすべての目が予備的/グロス解剖されるまで、氷の上の新鮮なPBSに目を戻します。
- 閉じた容器の中に2分間の10%ベタジン溶液で目を水没させ、BSC IIキャビネット#1に無菌で移す。セットアップ中の汚染を最小限に抑えるために、無菌条件下ですべての後続作業を行います。
- 無菌解剖前セグメント。
- ベタジン溶液で2分後、眼組織の無菌性を維持しながら眼表面から余分なベタジン溶液を除去するために、滅菌AA-PBSの3つの連続的なするしに目を移す。3回の使用後、さらに使用するまでAA-PBSで組織を維持する。
- カミソリの刃/メスと湾曲したはさみを使用して目を半球にします。AA-PBS浸漬ガーゼに目を置き、目の赤道の近くに無菌カミソリの刃またはメスで切開を作成します(前側に40で60/40分割)。湾曲した外科用ハサミを使用して、眼を半減して前眼(角膜半分)を分離する。
注:前のセグメントの周りのカットは、臓器培養で設定した後に流体漏れを作成するスクレラのギザギザ、粗いエッジを防ぐために連続する必要があります。 - 前部区分からの膜のユーモアをすくうためにシャベルとしてマイクロシザーを使用してください。マイクロシザーを使用して、前セグメントからレンズを取り外します。さらに解剖ステップが終わるまで、AA-PBSの前部をそのままにしておきます。
注:解剖されるすべての目は、このステップで保持することができ、解剖プロセスの残りの部分を通して1つずつ取ることができます。 - 解剖顕微鏡を用いて、虹彩を徐々に虹彩根に切り返し、骨底メッシュワーク(TM)が見えるまで放射状に切り返す。TMは角膜シェルの周りに周方向の繊維を含む色素組織です。虹彩根に向かって虹彩に慎重にカットすると、組織の下にTMの深さを露出します。
- TM領域全体を露出させるために、最初の切断と同じ深さで虹彩の周りを360°カットします。必要に応じて、TMをカバーする残りの残留アイリスをクリーンアップします。
- 毛様体残骸を後部TMにトリミングし、TM領域(約1mm)に後部組織の薄いバンドのみを残します。
- BSC II キャビネット #2 の ASOC でさらにセットアップするまで、メディアに解剖前セグメント (AS) を配置します。
注: 単一のユーザーが解剖および臓器培養皿アセンブリを実行している場合、ASOC セットアップの前にこの時点ですべての目を保持することができます。
3. 臓器培養皿の前セグメントの設定
- ASを反転したペトリ皿に単一のASを置きます(カップアップ)。綿棒を使用して、メディアに濡れ、角膜の中央にやさしく手を出して顔料を取り除きます。鉗子を使って目と同じ綿棒を持ち、綿棒を強輪の周りで拭き取り、余分な顔料を取り除きます。
- ASを反転し、高い領域の上に皿の底部の上に置き、皿の高い領域の上に角膜を中心に置きます。クランプリングを新しく配置した AS の上に置きます。
- 対応する穴に4本のネジを入れ、リングの下にASを付けてリングを所定の位置に保持します。Lキーでネジを軽く手で締めます。
注:締め付けのステップは実験を通して毎日行われるので、ここでの最初の締め付けの目標は、クランプリングを壊すことを避けながら、メディアが漏れないようにすることです。 - 滅菌ペトリ皿セットで、皿の上に置き、セットアップを反転します。皿のスタンドを取り付けます。Oリング付きの流体コネクタを、皿の底部のネジ付きポートに取り付けます。
- 1つの流体コネクタに、18 G 90°曲がった針ハブ、チューブの長さ、18 Gの針ハブ、ナイロンシリンジフィルター、三方弁、および媒体で満たされた20 mLシリンジを取り付けます。
- 第2の流体コネクタに、18 G 90°度曲がった針ハブ、チューブの長さ、18G針ハブ、三方弁、および無菌10 mLシリンジのバレル部分を取り付けます(これはASOCから液体と気泡を捕捉する貯水池として機能します)。
- 三方弁がシリンジに適切に開いている場合、ステップ3.5で特定された流体コネクタポートを使用して、ASを膨らませ、チューブ内のメディアを充填し、最終的には貯水池を使用して、システムを通してメディアを静かに押し込みます。
注: メディアが ASOC 皿に漏れた場合、AS はクランプ リングで十分にしっかりと固定されません。 - 優しく皿にメディアを押し込み、皿を反転して泡を押し出して貯水池に入れ、泡を取り除きます。
- 皿を置き、直立します。ペトリ皿の底部をスタンドの足の下に置き、チューブを巻き込まないように注意してください。
4. 前セグメント臓器培養の開始
- ASOC はインキュベーションの準備が整いました。細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)にASOC皿を入れます。圧力トランスデューサの上のインキュベーター内のASOC皿の高さが知られており、IOPを正確に計算するために考慮されていることを確認してください(補足プロトコル4)。
- チューブラインを37°C、5%CO2インキュベータードアの底面から通り抜け、ドアの開閉を妨げないようにします。20 mLのシリンジを2.5 μL/minにセットしたシリンジポンプに取り付けます。
- 圧力トランスデューサ装置に貯留槽とチューブラインを配置します。管ラインに入る気泡を避けるためにラインを通ってPBSを流しながら、側面の3ウェイバルブを圧力トランスデューサのセットアップに接続します。
注:システムが設定された後、臓器培養の間、微生物の成長とリザーバー汚染の可能性を減らすために、貯留層からPBSを空にします。 - まず、データ ファイルを保存するための microSD カードが存在することを確認して、IOP データ収集を開始します。次に、圧力トランスデューサの設定をオンにして、データ収集を開始します。
注: 圧力トランスデューサ データ収集装置の設定の詳細については、 補足プロトコル 2を参照してください。
5. ASOCの日々のメンテナンス
- ASOCが平衡化するために24時間を持っていた後、37°C、5%CO2インキュベーターから皿を取り出し、BSC IIキャビネットに入れる。
注: 圧力データ取得では、アソクがインキュベーターから取り除かれ(高さ変更)、キャビネットで調整されるため、これらの時間はスパイクのように見えます。 - ペトリプレートの各皿の下に漏れをチェックしてください。存在する場合は、皿の下にしっかりとした流体接続を確認し、必要に応じて締め直します。滅菌Lキーを使用して、クランピングリングのネジを締め付けて、皿の上の漏れを確認します。
注:ASのクリンラ組織は圧縮し、24時間の厚さを減らし、クランプリングを締める必要があります。 - よく皿からメディアを吸引します。
注: 骨柱状メッシュワークは、ASOC にポンプで送られるメディアから流体をフィルタリングしています。したがって、メディアは、エッジに沿ってASOC皿に存在します。 - トラップされた気泡を取り除くためにステップ3.7と3.8を繰り返します。
- シリンジポンプのシリンジを補充し、シリンジポンプが動作していることを確認し、ASOCへの灌流のためのバルブの位置合わせを確認します。ASOC皿を37°C、5%CO2インキュベーターに戻します。
注: 最適な方法として、これらの手順は毎日実行する必要があります。しかし、20 mL のメディアの開始量、ASOC 皿の井戸容積、および 2.5 μL/min のポンプ速度を使用すれば、システムを数日間妨げずに稼働させるのに十分なはずです。
6. 空気圧穿刺装置によるOG傷害誘導
メモ:空気圧穿刺装置の構築は 補足プロトコル3で詳述されています。OG傷害は、IOPが安定した後に誘発され、これは通常培養で3日後に起こる。許容可能なIOP値は、生理学的IOPに基づく5〜20mmHgであり、 これは補足プロトコル2で説明されているように、IOPデータファイルを評価するか、圧力測定システムでLEDインジケータを設定することによって決定することができる。
- ステップ1.10で詳述されているようにOG傷害誘導のためのBSC IIキャビネットを準備する。穿刺プラットフォームを圧縮空気ラインに接続します。滅菌穿刺物をチャックに取り付けます。
メモ:空気圧縮機を使用してデバイスに電力を供給できますが、圧力が50 psiを超える場合は、タンク圧縮空気または内蔵の実験室ラインで十分です。 - 穿刺プラットフォームの圧力調整器を50 psiに設定し、直径4.5mmまでの物体に対して十分な穿刺力を与えます。クロストラッキングバイスを穿刺プラットフォームの前のラボジャックに配置し、傷害誘導時にASOC皿を保持します。
- 37°C、5%CO2インキュベーターからASOCセットアップを取り外し、蓋を取り外して脇に置いた後、穿刺プラットフォーム(図2)に垂直なクロストラッキングバイスに入れます。前部セグメントは浸透したまま、3方向バルブポートを圧力トランスデューサに閉じてトランスデューサへの過圧損傷を防ぎます。
- ピストンアームを最大距離まで伸ばし、角膜の頂点を穿刺対象の1mm以内に配置します。ピストンアームを引き込み、前セグメントを穿刺物体に1cm近づけます。
注:この距離はASOC皿を押さない高効率傷害誘導のために最大限に活用された。 - 穿刺装置を電源を入れ、デバイスの2番目のスイッチでソレノイドバルブを開けて発射します。デバイスを後退するには、2番目のスイッチをもう一度押して、穿刺装置を目から取り外します。目視検査と傷害現場からの漏洩による適切な傷害誘導を確認します。
- ASOC皿を万力から取り除きます。蓋を皿アセンブリに戻し、圧力トランスデューサーに流動ラインを開きます。ASOCを37°C、5%CO2インキュベーターに戻します。
注:この時点で、治療はOG傷害をシールするためのその有効性を評価するためにASに適用することができる。
7. カルチャからの ASOC の削除
注: エンドポイント分析に応じて(可能なエンドポイント方法については 、代表的な結果 を参照)、ASはASOCディッシュに膨張したままにする必要があり、他の方法では培養チャンバから分離されたAS組織が必要です。以下の方法論は、臓器培養皿からASを取り出し、セットアップの残りの部分を削除する方法を説明します。
- 37°C、5%CO2インキュベーターからASOC料理を取り除きます。3方向バルブをシリンジとリザーバに閉じ、チューブをシステムから取り外します。シリンジ、リザーバー、フィルターを捨てます。洗浄と滅菌のために、3ウェイバルブ、チューブ、およびニードルハブを別の容器に入れます。
- 皿の底の流動的な接続から針のハブを取り外します。流体コネクタとOリングのネジを解除します。すべてのアイテムを洗浄および殺菌用の容器に入れます。
- Lキーを使用して、クランプリングから4本のネジを取り外します。クランプリングを慎重に取り外します。
- 鉗子を使用して、皿からASを取り出し、エンドポイント分析と画像に応じて、固定または適切なバイオハザード廃棄物に入れます。
8. IOP データ分析
- microSDカードをコンピュータに接続して、最新の実験実行からデータを含む .txt ファイルを削除します。
注: ファイルはマイクロコントローラを制御するコードで名前が付けられ、実験ごとに更新する必要があります( 補足プロトコル2を参照)。 - データをスプレッドシートにインポートします。
- データを12列に整理します:11の圧力トランスデューサチャンネルのそれぞれについて時間(分)とmV信号を表示します。最初の10チャンネルは、10個のASOC実験セットアップに対応しています。最終的なトランスデューサ信号は、入力信号の変化によりmV信号が変化しなかったことを確認するための制御チャネルとして、空気に開かれたセンサを対象とします。mV信号を確認するためのプロット制御チャネル対時間は全体にわたって一貫していた。
- 各センサーの初期キャリブレーションから生成された傾きインターセプト方程式を使用して、10チャンネルのmV信号をmmHgに変換します( 補足プロトコル4を参照)。
- 実験時間の過程で IOP がどのように変動するかを決定するために、10 チャネルのそれぞれに対して、プロット時間 (データ解釈を簡略化するために日に変換) を行います。
- データ内のキーポイントでの平均 IOP 値を決定して、OG 損傷誘導の前後の値と、その値の変更方法をより簡単に比較できます。ASOC の各日における IOP を決定するために、各 24 時間間隔のデータの平均 2 ~ 3 時間。
注: IOP の代表的な結果を 図 4に示します。
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Representative Results
光学コヘレンス断層撮影(OCT)を介して撮影された画像は、OG傷害目のために示され、成功した傷害誘導がどのように見えるかを説明します。 図3 は、損傷直後および72時間後にAS組織を負傷させたコントロールおよびOGの画像を示す。2 つのビュー:損傷部位を通る断面画像とトップダウン最大強度投影(MIP)を表示して、画像の表面積を視覚化します。コントロール目は角膜に顕著な破壊を示さないが、OG傷害後に角膜全体を横切る明確な傷害を見つけることができる。MIPからは、怪我の形や大きさが不規則であるが、傷害サイズは72時間にわたって減少することは明らかである。以前は、この効果は、13をテストした多くの傷害サイズに対して有意であることが示されている。
このプロトコルで説明されているOG傷害モデルの主なデータ出力は、実験のセットアップの過程で眼圧です。データは、キャリブレーション(補足プロトコル4)を介してmmHgに変換することができる各圧力トランスデューサからの出力としてミリボルトの単位で記録されます。IOPデータと実験時間の経過の例は、許容できると考えられる眼と、使用可能と見なされない目に対して提供される(図4A)。圧力トレースデータから、培養で24時間後にセンサーに目が取り付けられましたが、IOPは培養の最初の72時間にわたって変動し続けています。臓器培養におけるAS組織の生理的IOPは約8〜10mmHgであり、2x及び1/2xの範囲は、値が安定した後に使用できるIOP値のゲートとして決定された(5〜20mmHg)。その範囲にあった目だけが、プロトコルの残りの部分で使用することができます。以前の実験から、我々は、必要な範囲で安定する目のASOCセットアップで達成された90%の成功率を持っていた(図4B)。
OG損傷および治療介入によるIOPの変化に関する結果も提供される(図4C,D)。OG傷害誘導後、圧力は大幅に低下し、組織がASOCから取り除かれるまでそのまま残る必要があります(図4C)。傷害誘導後の眼が圧力を低下させなければ、眼の水密シールが損なわれた場合にIOPが減少する必要があるとして、損傷が成功しなかったということを示している。しかし、傷害サイズが小さいほど自己治癒し、IOPが回復する可能性があります。OG傷害誘導後に眼に治療が適用された場合、IOPの修復はASOC中に追跡することができる。この概念は、2.4 mm OG傷害に適用されるダーマボンド接着剤を示すデータで実証されています(図4D)。治療の有無にかかわらず5つの別々のASOC実験の平均結果が示され、治療がIOPを増加していることは明らかである。この方法は、IOPを復元するための治療の有効性を測定し、その圧力がキー72hポストOG傷害を越えて回復したかどうかを追跡することができる。
さらに、ASOC プロトコルは、エンド ユーザーの実験要件を満たすために、幅広い特性評価エンドポイントで使用できるように適応可能です。培養中、眼を離れる流出培地は、ASOC中、OG傷害誘導後、または治療後に起こるタンパク質レベル変化の追跡に利用できる、毎日または毎時に収集することができる。例えば、ゼラチンザイモグラフィーは、創傷治癒および組織リモデリング20を追跡するためにマトリックスメタロプロテイナーゼレベルを検出するために以前に行われてきた。さらに生物学的エンドポイントは、組織生存率21、22を評価するための伝統的な免疫組織化学法を介して培養から組織を除去した後に可能であり、角膜23、24、または抗体ベースの染色に対する病態生理学的変化を25,26に対して追跡する。
機能的角膜メトリックは、ASOCで維持された眼からも得ることができる。角膜上皮の完全性は、青色光源27,28を用いて蛍光透視染色および画像取得を介して評価することができる。培養から除去した後、角膜組織は、単純な画像取得13を通じて透明性について評価することができる。従来の眼イメージングは、治療介入の有無にかかわらず組織構造を評価するためにも行うことができる。OCT画像は、図3に示すように、角膜を通して断面画像を作成することができ、非侵襲的にキャプチャすることができ、培養中の組織を維持しながら画像収集を可能にする可能性がある。スリットランプ顕微鏡、超音波、生体共焦点顕微鏡などの他の画像化モダリティは、さらに解剖学的情報を取得するために適応することもできる。
最後に、前部セグメントの機械的特性の評価は、OG傷害またはその後の治療が基礎組織に及ぼす影響を理解するために捕捉することができる。IOP データ収集だけでは、眼の水密シールの完全性がどのように損なわれているかを強調していますが、以前は、追加の機械的特徴10,11をいじめるために追加のテストメトリックを測定できることを示しました。眼圧コンプライアンスは、インフレ(体積変化/圧力変化)による眼圧の変化を説明する一括機械的特性で、注射器ポンプを使用して、突然の少量の流体を眼に注入し、圧力トランスデューサで結果として生じる圧力上昇を記録することができる。より高いコンプライアンスは、組織が硬くなく、治療材料特性が基礎となる角膜組織とどのように異なるかを追跡するために使用できることを示しています。眼からの漏れ率または従来の流出設備は、測定および算出して、圧力20,29の単位当たりの眼を離れる正確な流体流量を決定することができる。最後に、治療的検査に関しては、破裂圧力を測定して、治療の失敗の前に眼が保持できる最大圧力を決定することができる。これは、パフォーマンスを傷つけていない目と比較したり、時間12、13でパフォーマンスの変化を追跡するために使用できます。
図1: ASOC のセットアップの図 目はカスタムメイドのオルガン文化料理に保持され、クランプリングで所定の位置に保持されます。ASOCメディアはバルブAを介してシリンジポンプを介して注入され、圧力トランスデューサに接続され、バルブBでのその後のデータ取得は、各バルブのオープンポートが青色でハイライトされ、黄色は閉じたチャネルを示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: OG損傷セットアップの概要( A)空気圧式損傷装置のセットアップ左から右へ、圧縮空気は圧縮空気ラインを介して装置に導入され、圧力計で測定される50 psiに圧力を設定するためにレギュレータを通過する。2つのソレノイドバルブは、穿刺物体を保持するドリルチャックの拡張/引き込みを指示するために、リニアアクチュエータに接続されています。Viseは、適切なx、y、z位置に目を保持するために穿刺装置の前に配置される。(B)代表ASOCは、傷害誘導装置の前に置かれる。デバイスとその構造の詳細については、 補足プロトコル 3を参照してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: ASOC OG傷害実験の光コヘレンス断層撮影画像画像は、コントロール目(負傷していない)とOG負傷した目がすぐに怪我の後と72時間の後の怪我のために示されています。角膜(左側)と角膜表面のトップダウン最大強度投影図(右側)を通る断面図として表示されます。この図は、Sniderらら13の許可を得て適応されています。
図4: ASOC実験の代表 IOP 結果( A) ASOC セットアップの最初の 72 時間の生 IOP データ目は72時間で穿刺されるため、最初の3日間のデータが評価され、IOPが許容可能なIOP範囲(5〜20mmHg)で安定するかどうかを判断します。代表的な結果から、5つの目のうち3つは許容可能なIOP範囲内にあり、1つはIOPが高すぎるので、1つはIOPが低すぎます(プロット上の強調表示された黄色の領域の外に落ちる)。(B) 直前の実験での n = 50 の ASOC セットアップの IOP 安定化を行い、ASOC 法による典型的な成功率を実証した。(C) 72時間の傷害誘導後の3つの異なるOG傷害サイズと比較して、傷つけていない眼のためのIOP。IOPの消失は明らかであり、回復の兆候はない。(D) ダーマボンド接着剤で治療した傷害と比較して、IOPの損傷結果。一部の目は密閉されているためエラー率は高く、他の目は封印されていないが、この方法は72時間の損傷後のIOPへの変化を追跡することができる。この図は、スナイダーら13の許可を得て適応されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ASOC OG傷害プラットフォームには、方法論を使用する際に成功する可能性を高めるために強調すべき重要なステップがあります。まず、前部セグメントの解剖の間、骨膜メッシュワークを維持することは不可欠ですが、正しく行うことは困難です。もしTMが破壊された場合、眼は生理学的圧力を維持せず、実験的使用の適格性基準を満たさない。適切な解剖が得られるまで、追加の無菌技術の課題を導入するのではなく、まず通常の条件下で解剖プロセスを実践することをお勧めします。第二に、ASOCの皿に目を入れるとき、彼らは流体が漏れるのを防ぐのに十分にタイトですが、ASOC皿に損傷を与えないように十分に緩んでいることが不可欠です。眼がしっかりと固定されていないと、非生理学的手段を通じて眼から液体が漏れ出し、IOPがほとんどまたはまったくない。しかし、目を下に止めるクランプリングはプラスチック製で、締め付け過ぎれば簡単に折れる可能性があります。リングの下の強膜組織が最初の24時間の間に組織を圧迫し、緩めるので、2日間にわたって目を締め付ける必要があります。1日目に締め付けに対する抵抗が感じられるまでリングを締め、培養で24時間後に同様のレベルに再締め付けして、最良の結果を得ることをお勧めします。
第 3 に、このモデルを使用する場合、流体フローが常にどこに向いているかを完全に理解することが重要です。各ASOCディッシュは、シリンジポンプまたは10 mLシリンジリザーバから流体流れを指示し、圧力トランスデューサに接続するために、複数の3方向バルブに接続されています。セットアッププロセスの異なるインスタンスは、目から気泡をフラッシュしたり、過加圧から圧力トランスデューサを保護するために、このような方法でバルブを配置する必要があります。重要なプロトコルステップの前に、常にオープン/クローズの内容を理解するために注意する必要があります。最後に、ASOC OG傷害プロトコル全体での無菌性の維持は重要ですが、複数ステップの複数日のプロセス全体で失われやすいです。灌流媒体には、これを防ぐために高レベルの抗生物質と抗ミコティックが含まれ、汚染を防ぐためにセットアップする前に目がベタジンに沈んでいますが、間違いが最も可能性が高い重要なステップはまだあります。皿の初期セットアップ中に、クランプリングを所定の位置に締め付けながら目と接触しないようにし、使用していないときには常に皿に蓋をしてください。露出の可能性が高いステップは、日々の ASOC メンテナンス中です。それは、インキュベーターから目を取り除くことなくすぐに達成することができると思われる場合でも、バイオセーフティキャビネットでこれらのルーチンステップを行うことが重要です。プロトコルに注意して従い、優れた無菌技術を維持することは、6日間のASOC実験における汚染リスクを最小限に抑える必要があります。
全体的に見て、ASOC OG傷害のプラットホームは2つの主要な条件のために開いた地球の傷害を見ている他の方法論から独特である。まず、傷害誘導法である。利用される高速空気圧傷害装置は高い力量の傷害を誘発する。これは特に鋭くもない、または小さい直径の物と傷害を誘発することを可能にする。これは、形状が不規則な傷害をより密接に模倣します。爆発装置30、31に起因する高速シュラプネルの負傷。空気圧装置は不規則な形のシュラプネル模倣物と容易に合うことができるので、レーザー、針、またはメスの刃を使用してきれいで正確な傷害の幾何学を作成するために以前の方法と比較して治癒するより困難な傷害を作成する32、33、34。第二に、ASOC方法論は、最初の傷害誘導を超えて傷害の進行と治療性能を追跡することを可能にする。72 hまで追跡することは、以前に開発されたベンチトップOG傷害プラットフォーム10、11、12では不可能であり、このプロトコルを開発する背後にある動機でした。実際、細胞生存率は、ASOC13において少なくとも1週間、角膜内皮において高いままであった。ASOCは、この長期的な特性評価は、高価なin vivo実験に移行することなく達成できる唯一の手段です。
ASOC プラットフォームの主なアプリケーションは 2 倍です。第一に、このモデルは、特にそれらが時間とともにどのように変化するかを考慮して、オープングローブ傷害をさらに特徴付けるためのものです。前の研究では、OG傷害はこのように特徴付けられており、傷害13の後に72時間にわたって創傷治癒が観察された。さらに、発生する生物学的変化に関して72時間またはそれ以上の異なる傷害サイズ、形状、位置を追跡することは、OG傷害後に行わなければならない重要な医学的決定を知らせる。特定の傷害パラメータは角膜による自己治癒を可能にすることがあり、または介入が最初の24時間以内に適用されない場合、他のパラメータはより重篤である可能性があります。この情報は、限られた医療用品や避難資源が利用可能な場合、患者をトリアージする場合に非常に貴重です。
次に、ASOC OG プラットフォームを使用して製品開発の開発とテストを行うことができます。このアプリケーションでは、臓器培養プラットフォームは多くの役割を果たすことができます。最初の製品開発中に、より短い時間枠は、最も効果的なものを決定するために、製品製剤の範囲でテストすることができます。臓器培養システムは、このアプリケーションに対して、このアプリケーションに対して、さらに高スループットを実現し、追加のシリンジポンプを使用して、ここで詳述するシステムで可能な10の同時実験を超えて移動することができます。より洗練された製品の場合、より長いタイム ポイントを評価して、72 時間またはそれ以上のパフォーマンスを評価できます。最後に、一時的な安定化ではなくOG傷害を恒久的に治療する生物学的活性産物を評価する場合、創傷治癒評価が可能である可能性がある。
ただし、ASOC OG プラットフォームには考慮すべき制限があります。まず、このモデルは治療の長期的な評価を可能にする一方で、虹彩やレンズなどの角膜シェルの外側の眼のすべての組織が欠けている。これらの追加組織は、OG傷害の影響を受ける可能性があり、傷害進行に役割を果たす可能性がある。同様に、孤立した前セグメントには、ASOCモデルから後続の動物実験に移行する際に含まれる免疫応答要素が欠けている。次に、このモデルは角膜OGの怪我および潜在的に四肢のOG傷害を作成するのに適している。強膜または後部OG傷害は、この方法では誘発することができない。しかし、これらの傷害タイプの多くは、その他の損傷を伴い、視力35,36の喪失を防ぐ可能性が低い一時的な安定化治療を行う。最後に、72時間後の怪我にモデルを出した怪我は追跡されただけです。ASOCは他のアプリケーションで2週間まで利用されてきたので、モデルはこれらのアプリケーションに利用できる可能性が高いが、現時点では37、38、39ではテストされていない。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。この記事で述べられています見解は著者のものであり、アメリカ陸軍医療部、陸軍省、国防総省、または米国政府の公式の方針や立場を反映していません。
Acknowledgments
この資料は、一時的な角膜修復取得プログラム(米国陸軍医療マテリエル開発庁)との機関間協定(#19-1006-IM)を通じて米国国防総省が支援する作業に基づいています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
- Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
- Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
- Riesberg, J., Powell, D., Loos, P.
- Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
- Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
- Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954 (2012).
- Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
- Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
- Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
- Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218 (2020).
- Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98 (2020).
- Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
- Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546 (2021).
- Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).
- Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
- Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18 (2021).
- Ren, H., Wilson, G.
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
- Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732 (2020).
- Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
- Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
- Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
- Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
- Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).
- Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
- Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
- Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
- Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
- Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
- Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541 (2013).
- Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
- Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
- Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
- Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).
