Summary
Øyeskader i åpen globus kan gå ubehandlet i flere dager i landlige eller militær-relevante scenarier, noe som resulterer i blindhet. Terapeutiske behandlinger er nødvendig for å minimere tap av syn. Her beskriver vi en organkultur åpen globusskademodell. Med denne modellen kan potensielle terapeutiske behandlinger for stabilisering av disse skadene evalueres riktig.
Abstract
Skader i åpen globus har dårlige visuelle utfall, noe som ofte resulterer i permanent synstap. Dette skyldes blant annet en lengre forsinkelse mellom skade og medisinsk inngrep i landlige miljøer og militære medisinapplikasjoner der oftalmisk behandling ikke er lett tilgjengelig. Ubehandlede skader er utsatt for infeksjon etter at øyet har mistet sin vanntette forsegling, samt tap av vev levedyktighet på grunn av intraokulær hypotensjon. Terapeutiske behandlinger for å midlertidig forsegle åpne globusskader, hvis de er riktig utviklet, kan være i stand til å gjenopprette intraokulært trykk og forhindre infeksjon til riktig oftalmisk omsorg er mulig. For å lette produktutviklingen, detaljert her er bruken av et fremre segment organkultur åpen globusskadeplattform for sporing av terapeutisk ytelse i minst 72 timer etter skade. Porcine fremre segmentvev kan opprettholdes i spesialdesignede organkulturretter og holdes ved fysiologisk intraokulært trykk. Punkteringsskader kan opprettes med et pneumatisk drevet system som er i stand til å generere skadestørrelser opp til 4,5 mm i diameter, lik militærrelevante skadestørrelser. Tap av intraokulært trykk kan observeres i 72 timer etter skade som bekrefter riktig skadeinduksjon og tap av øyets vanntette forsegling. Terapeutisk ytelse kan spores ved bruk på øyet etter skadeinduksjon og deretter spore intraokulært trykk i flere dager. Videre gjelder den fremre segmentskademodellen for mye brukte metoder for funksjonelt og biologisk sporing av fremre segmentfysiologi, for eksempel vurdering av gjennomsiktighet, okulær mekanikk, hornhinnen epitelhelse og vev levedyktighet. Totalt sett er metoden beskrevet her et nødvendig neste skritt mot å utvikle biomaterialeterapeutiske terapier for midlertidig tetting av åpne globusskader når oftalmisk omsorg ikke er lett tilgjengelig.
Introduction
Skader på åpen globus (OG) kan føre til permanent synstap når de ikke behandles eller i det minste stabiliseres etter skade1. Forsinkelser er imidlertid utbredt i avsidesliggende områder der tilgang til oftalmisk intervensjon ikke er lett tilgjengelig, for eksempel i landlige områder eller på slagmarken i militære scenarier. Når behandling ikke er lett tilgjengelig, er den nåværende standarden for omsorg å beskytte øyet med et stivt skjold til medisinsk inngrep er mulig. I militærmedisin er denne forsinkelsen for tiden opptil 24 timer, men det forventes å øke opptil 72 timer i fremtidige kampoperasjoner i urbane miljøer der luftevakuering ikke er mulig2,3,4. Disse forsinkelsene kan være enda lengre i landlige, fjerntliggende sivile applikasjoner der tilgangen til oftalmisk intervensjon er begrenset5,6. En ubehandlet OG-skade er svært utsatt for infeksjon og tap av intraokulært trykk (IOP) på grunn av at øyets vanntette tetning blir kompromittert7,8. Tap av IOP kan påvirke vev levedyktighet, noe som gjør noen medisinsk inngrep usannsynlig å gjenopprette synet hvis forsinkelsen mellom skade og terapeutisk er for lang9.
For å muliggjøre utvikling av enkle å påføre terapeutiske behandlinger for tetning og skader til en oftalmisk spesialist kan nås, ble en stasjonær OG-skademodell tidligere utviklet10,11. Med denne modellen ble høyhastighetsskader opprettet i hele porcinøyne mens IOP ble fanget av trykktransdusere. Terapeutiske behandlinger kan deretter brukes til å vurdere deres evne til å forsegle OG skadestedet12. Men siden denne modellen bruker hele porcin øyne, kan den bare vurdere umiddelbar terapeutisk ytelse uten noen måte å spore langsiktig ytelse på tvers av det mulige 72 h-vinduet der terapeutisk må stabilisere skadestedet til pasienten når spesialbehandling. Som et resultat ble en fremre segmentorgankultur (ASOC) OG skademodell utviklet og detaljert i denne protokollen som en plattform for sporing av langsiktig terapeutisk ytelse13.
ASOC er en mye brukt teknikk for å opprettholde avascular vev av det fremre segmentet, for eksempel hornhinnen, i flere uker etter enucleation14,15,16,17. Det fremre segmentet opprettholdes under fysiologisk IOP ved å parfyme væske ved fysiologiske strømningshastigheter og bevare trabekulært maskeutløpsområde, vevet som er ansvarlig for å regulere IOP, under ASOC-oppsett18,19. ASOC-plattformen kan opprettholde vev fysiologisk, indusere en OG-skade ved hjelp av en pneumatisk drevet enhet, bruke en terapeutisk og spore skadestabilisering i minst 72 timer etter skade13.
Her gir protokollen en trinnvis metodikk for bruk av ASOC-plattformen. Først beskriver den hvordan du setter opp og fremstiller ASOC-plattformen. Deretter beskriver protokollen hvordan man aseptisk dissekerer det fremre segmentet og opprettholder det trabekulære maskearbeidet, etterfulgt av å sette opp fremre segmentvev i spesialbygde organkulturretter. Deretter beskriver den hvordan du lager åpne globusskader og bruker terapeutisk umiddelbart etter skade. Til slutt gir protokollen en oversikt over karakteriseringsparametere som er mulige for bruk med denne metoden som vurderer funksjonelle, mekaniske og biologiske egenskaper i øyet og hvor godt skaden ble stabilisert. Totalt sett gir denne modellen en sårt tiltrengt plattform for å akselerere produktutvikling for stabilisering og behandling av åpne globusskader og forbedre den dårlige synsprognosen etter skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før du utfører denne protokollen, må du være oppmerksom på at det er juridiske og etiske krav til bruk av dyr i forskning og opplæring. Hvis levende dyr brukes til kilden til okulært vev, søk godkjenning av den lokale etiske eller juridiske myndigheten (IACUC eller Etikkkomiteen, etc.) før du begynner. Hvis det er spørsmål om å få godkjenning for bruk av dyr, ikke fortsett. Vi har tidligere bestemt og rapportert at friske porcin øyne oppnådd og brukt innen 24 h post-mortem sammenlignet nærmest in vivo fysiologi og klarte seg godt for disse studiene (Animal Technologies, Tyler, TX, USA)10,13. Ingen levende dyr ble brukt gjennom hele denne protokollen, ved hjelp av en vevsleverandør for å skaffe vev innen 24 timer.
MERK: Før vevsankomst fremstiller du organkulturrettene (Tilleggsprotokoll 1), klemringer (Tilleggsprotokoll 1), parabolstativer (Tilleggsprotokoll 1), innsamling av trykktransduserdata (Tilleggsprotokoll 2) og pneumatisk punkteringsplattform (Tilleggsprotokoll 3). Steriliser oppvasken, verktøyene og forsyningene og forbered arbeidsområdene. Det er nyttig å ha et ikke-sterilt område for å utføre grov disseksjon på øynene, da de vanligvis kommer med bindevev i bane. Utfør disse første trinnene på en åpen, ren arbeidsflate, og overfør deretter øynene aseptisk til et BSC II-skap for mikro disseksjon (skap #1). Optimalt er BSC II-kabinettet som brukes til mikro disseksjon skilt fra parabolenhetenS BSC II-skap (skap #2) for å minimere luftstrømmen og maksimere arbeidsområdet. Sett opp mikro disseksjonsskapet med et dissekeringsmikroskop og en måte å visualisere arbeidsflaten på (kamera eller okularer som stikker ut fra skapet).
1. Steriliseringstrinn, rekvisita (se Materialtabell for mer informasjon) og oppsett
- Forbered og gasssteriliser følgende elementer (1 sett for hvert øye): ASOC-tallerken, klemring, to fluidiske kontakter med O-ringer, to 18 G nålenav, fire skruer, to lengder PE-100 slange (avstandslengden skal være lang nok til å strekke seg fra parabolen inne i inkubatoren til sprøytepumpen og trykktransduserens datainnsamlingsoppsett), to 18 G 90° bøyde nålenav, to 3-veis ventiler.
- Klargjør og autoklaver følgende sett.
- Forbered og autoklaver mikro-disseksjonsinstrumentsettet, som inneholder ett par fine tang, ett par Vannas-saks, ett par middels tannede tang, ett par store saks, bomullspinne og et barberblad eller skalpell.
- Forbered og autoklaver monteringsinstrumentsettet, som inneholder ett par middels tannede tang, ett par kirurgisk saks og en L-nøkkel.
- Forbered og autoklaver det daglige settet (mengde: en per kulturdag), som inneholder en L-nøkkel for å stramme klemringer til retter hver dag etter behov.
- Autoklaver fire 100 ml beger for desinfisering og lagring av øyne og fremre segmenter.
- Autoklaver punkteringsobjektene.
- Samle følgende sterile gjenstander: Petri parabolen (1 tallerken/øye), gasbind (1-2/øye), parabolen stativ, 20 ml sprøyter (1/øye), 10 ml sprøyter (1/øye), nylon sprøyte filtre (1/øye).
- Forbered sterile medier: DMEM med 4% FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicin, 1x antibiotika-antimykotisk (AA; ca. 30-40 ml komplett media / øye).
- Forbered AA-PBS: PBS med 1x AA (~500 ml).
- Forbered den grove disseksjonsverktøypakken: ren og tørr stor kirurgisk saks og tang.
- Sett opp det ikke-sterile disseksjonsområdet: Samle forsyninger fra brutto disseksjonsverktøypakke, enukserte svineøyne nedsenket i PBS og på is, kirurgisk gardin, 100 ml beger med PBS. Legg ut den kirurgiske gardinen og gjenstandene som kreves for grov disseksjon.
- Sett opp det sterile disseksjonsområdet: Samle forsyninger fra mikro disseksjonsinstrumentsett, steril gasbind, dissekering av mikroskop, betadinoppløsning, steril PBS, sterile medier, fire steriliserte 100 ml beger, steril Petri-tallerken. Aseptisk overføring til BSC II-kabinett #1. Sett opp skapet for å visualisere øynene på dissekeringsmikroskopet.
- Sett opp arbeidsområdet for ASOC-montering: Samle gasssteriliserte sett (parabolsett og lokksett), monteringsinstrumentsett, sterile medier, tallerkenstativer, sterile Petri-retter, sterile sprøyter og sprøytefiltre. Aseptisk overføring til BSC II-kabinett #2. Sett opp skapet for tallerkenmontering.
- Når øynene er stabilisert og klare for punktering (72 timer etter oppsett), overfører de dem aseptisk til et BSC II-skap. Sett opp ARBEIDSOMRÅDET OG-skadeinduksjon: Pneumatisk drevne skadeinduksjonsenheter (montering detaljert i Supplemental 3) og Lab Jack og tverrsporingssender for å holde ASOC-parabolen.
2. Disseksjon av vev
- Forbered svinevevet ved hjelp av ikke-sterilt disseksjonsarbeidsområde.
- Procure enucleated porcine øyne fra en lokal abattoir, dyrestudier, eller leverandør. Hold øynene på is nedsenket i PBS under levering og bruk umiddelbart etter mottak.
- Klipp bort det ekstraorbitale vevet og trim konjunktivene og la bare hornhinnensklerle skall og optisk nerve. Utfør disseksjonen under ikke-sterile forhold med stor kirurgisk saks og tang i en grov disseksjonsverktøypakke.
- Plasser øynene tilbake i fersk PBS på is til alle øyne som kreves for eksperimentelt oppsett har vært foreløpige /grove dissekert.
- Senk øynene ned i 10% betadinoppløsning i 2 min i lukkede beholdere og overfør aseptisk til BSC II-kabinett #1. Utfør alle etterfølgende arbeider under sterile forhold for å minimere forurensninger under oppsett.
- Sterilt dissekere fremre segmenter.
- Etter 2 min i betadinoppløsning, overfør øynene til tre serielle vasker av steril AA-PBS for å fjerne overflødig betadinoppløsning fra okulær overflate samtidig som steriliteten til okulært vev opprettholdes. Etter tre vasker, opprettholde vevet i AA-PBS inntil videre bruk.
- Hemisect øyet ved hjelp av en barberblad / skalpell og buet saks. Plasser øyet på en AA-PBS-gjennomvåt gasbind og lag et snitt med et sterilt barberblad eller skalpell nær øyets ekvator (60/40 delt med 40 på den fremre siden). Ved hjelp av buet kirurgisk saks, hemisect øyet for å isolere det fremre øyet (hornhinnen halvparten).
MERK: Kuttet rundt det fremre segmentet må være kontinuerlig for å forhindre ujevne, grove kanter i scleraen som vil skape væskelekkasjer etter oppsett i organkulturen. - Bruk mikroscissors som en spade for å øse glasslegemet humor fra det fremre segmentet. Fjern objektivet fra det fremre segmentet ved hjelp av mikroscissorer. La de fremre segmentene ligge i AA-PBS inntil videre disseksjonstrinn.
MERK: Alle øynene som vil bli dissekert kan holdes på dette trinnet og en etter en tatt gjennom resten av disseksjonsprosessen. - Med et dissekerende mikroskop, kutt tilbake iris til irisrot gradvis, radialt til trabekulært netting (TM) er synlig. TM er et pigmentert vev som består av fibre omkretsorientert rundt hornhinnensklerle skall. Forsiktig kutt i iris mot irisroten vil avsløre dybden på TM under vevet.
- Klipp 360° rundt iris på samme dybde som det første kuttet i vevet for å eksponere hele TM-regionen. Rydd opp eventuelle gjenværende gjenværende iris som dekker TM etter behov.
- Trim ciliary kroppen rester bakre til TM, forlater bare et tynt bånd av vev bakre til TM-regionen (ca. 1 mm).
- Plasser det dissekerte fremre segmentet (AS) i mediet inntil videre oppsett i ASOC i BSC II-kabinett #2.
MERK: Alle øyne kan holdes på dette tidspunktet før ASOC-oppsett hvis en enkelt bruker utfører disseksjon og organkulturrettmontering.
3. Sette opp fremre segmenter i organkulturretter
- Legg en enkelt AS i en Petri-tallerken med AS invertert (kopp opp). Bruk en bomullspinne, våt i media og forsiktig dab i midten av hornhinnen for å fjerne noe pigment. Bruk tang til å holde øyet og samme vattpinne, tørk bomullspinnen rundt scleraen for å fjerne ekstra pigment.
- Snu AS og legg på toppen av den nederste delen av retten over den forhøyede regionen, sentrert hornhinnen over den forhøyede regionen i parabolen. Plasser klemringen oppå den nyplasserte AS.
- Plasser fire skruer i de tilsvarende hullene for å holde ringen på plass med AS under ringen. Stram skruene forsiktig med L-tasten.
MERK: Strammetrinnet vil skje daglig gjennom hele eksperimentet, så målet med den første strammingen her er å sikre at mediet ikke lekker mens du unngår å bryte klemringen. - Med et sterilt Petri-tallerkensett, legg toppen over parabolen og snu oppsettet. Fest tallerkenstativet. Fest de fluidiske kontaktene med O-ringer til gjengede porter på undersiden av parabolen.
- Til en fluidisk kontakt fester du et 18 G 90° bøyd nålenav, en lengde på slangen, et 18 G nålenav, et sprøytefilter i nylon, en treveisventil og en 20 ml sprøyte fylt med medier.
- Til den andre fluidiske kontakten, fest et 18 G 90 ° graders bøyd nålenav, lengde på rør, et 18 G nålenav, en treveisventil og fatdelen av en steril 10 ml sprøyte (dette vil fungere som et reservoar for å fange væske og bobler fra ASOC).
- Når treveisventiler åpnes på riktig måte til sprøytene, skyver du forsiktig mediet gjennom systemet ved hjelp av væskekontaktporten som ble identifisert i trinn 3.5 for å blåse opp AS, fylle medier i slangen og til slutt reservoaret.
MERK: Hvis mediet lekker ut i ASOC-retten, er ikke AS godt nok festet med klemringen. - Fjern bobler ved å skyve media forsiktig inn i parabolen og invertere parabolen for å skyve ut boblene og inn i reservoaret.
- Plasser parabolen og stå oppreist. Plasser den nederste delen av en Petri-tallerken under føttene på stativet, pass på at du ikke fanger slangen.
4. Starte fremre segment organkultur
- ASOC er nå klar for inkubasjon. Plasser ASOC-retten i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2). Forsikre deg om at høyden på ASOC-parabolen i inkubatoren over trykktransduserne er kjent og gjort rede for for å beregne IOP nøyaktig (Tilleggsprotokoll 4).
- Rett rørlinjene ut gjennom bunnen av 37 °C, 5 % CO2 inkubatordør slik at de ikke forstyrrer åpningen og lukkingen av døren. Fest 20 ml sprøyten til sprøytepumpen som er satt til 2,5 μL/min.
- Plasser slangeledningen med reservoaret ved trykktransduserinstrumentet. Koble side 3-veisventilen til trykktransduseroppsettet mens du strømmer PBS gjennom linjen for å unngå at luftbobler kommer inn i rørlinjene.
MERK: Tøm PBS fra reservoarene etter at systemet er satt opp for å redusere sannsynligheten for reservoarforurensning med mikrobiell vekst så lenge organkulturen varer. - Start innsamling av IOP-data ved først å sikre at et microSD-kort er til stede for lagring av datafiler. Slå deretter på trykktransduseroppsettet for å starte datainnsamlingen.
MERK: Detaljer for å sette opp innsamlingsenheten for trykktransduserdata finnes i Tilleggsprotokoll 2.
5. Daglig vedlikehold av ASOC
- Etter at ASOC har hatt 24 timer til å likevekte, fjern oppvasken fra 37 °C, 5 % CO2-inkubator og plasser dem i BSC II-kabinettet.
MERK: Ved innsamling av trykkdata ser disse tidsperiodene ut som pigger når ASOC-ene fjernes fra inkubatoren (høydeendring) og justeres i skapet. - Se etter lekkasjer under hver tallerken på Petri-tallerkenen. Kontroller om det finnes tette væskeforbindelser under parabolen, og stram om nødvendig til igjen. Se etter lekkasjer i parabolen med en steril L-nøkkel for å stramme skruene i klemringen.
MERK: AS sclera-vevet komprimerer og reduserer tykkelsen med 24 timer, og klemringen må strammes. - Aspirer media fra retten godt.
MERK: Trabecular meshwork filtrerer væske fra mediet som pumpes inn i ASOC. Derfor vil media være til stede i ASOC-parabolen langs kantene. - Gjenta trinn 3.7 og 3.8 for å fjerne eventuelle fanget luftbobler.
- Påfyll sprøyter på sprøytepumpene, sørg for at sprøytepumpene er i drift, og bekreft justeringen av ventiler for perfusjon i ASOC. Returner ASOC-retten til 37 °C, 5 % CO 2-inkubator.
MERK: Optimalt bør disse trinnene utføres daglig. Imidlertid bør bruken av et 20 ml startvolum av medier, ASOC-parabolens brønnvolum og en pumpehastighet på 2,5 μL / min være tilstrekkelig til å la systemet kjøre i flere dager uforstyrret.
6. OG skadeinduksjon med pneumatisk drevet punkteringsenhet
MERK: Konstruksjonen av den pneumatiske punkteringsenheten er beskrevet i Tilleggsprotokoll 3. OG-skader oppstår etter at IOP har stabilisert seg, som normalt oppstår etter 3 dager i kulturen. Akseptable IOP-verdier er 5-20 mmHg basert på fysiologisk IOP, som kan bestemmes ved å evaluere IOP-datafilene eller angi LED-indikatorer i trykkmålingssystemet som beskrevet i Tilleggsprotokoll 2.
- Klargjør BSC II-kabinettet for OG-skadeinduksjon som beskrevet i trinn 1.10. Koble punkteringsplattformen til en trykkluftledning. Fest det sterile punkteringsobjektet til chucken.
MERK: En luftkompressor kan brukes til å drive enheten, men tanktrykkluft eller innebygde laboratorielinjer kan være tilstrekkelig hvis trykket er større enn 50 psi. - Sett trykkregulatoren på punkteringsplattformen til 50 psi for tilstrekkelig punkteringskraft på gjenstander opp til 4,5 mm i diameter. Plasser tverrsporingsstikken på labkontakten foran punkteringsplattformen for å holde ASOC-parabolen under skadeinduksjon.
- Fjern ASOC-oppsettet fra 37 °C, 5 % CO 2-inkubator, og plasser det i tverrsporingssenderen vinkelrett på punkteringsplattformen (figur 2) etter at du har fjernet lokket og satt det til side. Hold det fremre segmentet gjennomsyrende, men lukk av 3-veis ventilporten til trykktransduseren for å forhindre overtrykksskader på svingeren.
- Utvid stempelarmen til maksimal avstand og plasser hornhinnens toppunkt innen 1 mm fra punkteringsobjektet. Trekk stempelarmen tilbake og før det fremre segmentet 1 cm nærmere punkteringsobjektet.
MERK: Denne avstanden er optimalisert for høyeffektiv skadeinduksjon uten å treffe ASOC-parabolen. - Avfyr punkteringsanordningen ved å slå den på og åpne magnetventilen med den andre bryteren på enheten. For å trekke tilbake enheten, trykk på den andre bryteren igjen for å fjerne punkteringsenheten fra øyet. Kontroller riktig skadeinduksjon ved visuell inspeksjon og medielekkasje fra skadestedet.
- Fjern ASOC-tallerkenen fra skrustikken; sett lokket tilbake på tallerkenenheten og åpne den fluidiske linjen til trykktransduseren. Plasser ASOC tilbake i 37 °C, 5 % CO 2-inkubatoren.
MERK: På dette tidspunktet kan terapeutisk brukes på AS for å vurdere effekten for tetning av OG-skader.
7. Fjerne ASOC fra kultur
MERK: Avhengig av endepunktanalyse (se Representative Resultater for mulige endepunktmetoder) må AS forbli i ASOC-retten oppblåst mens andre metoder krever AS-vev isolert fra kulturkammeret. Metodikken nedenfor beskriver hvordan du tar AS ut av orgelkulturrettene og fjerner resten av oppsettet.
- Fjern ASOC-rettene fra 37 °C, 5 % CO 2-inkubator. Lukk 3-veisventilen til sprøyten og reservoaret og koble slangen fra systemet. Kast sprøyten, reservoaret og filteret. Plasser 3-veis ventiler, slanger og nålenav i en separat beholder for vasking og sterilisering.
- Koble nålenavene fra de fluidiske tilkoblingene på bunnen av parabolen. Løsne de fluidiske kontaktene og o-ringene. Legg alle gjenstander i en beholder for vasking og sterilisering.
- Fjern de fire skruene fra klemringen ved hjelp av L-tasten. Fjern klemringen forsiktig.
- Bruk tang, fjern AS fra fatet og, avhengig av endepunktanalyse og bilde, plasser i fikserings- eller passende biofareavfall.
8. IOP-dataanalyse
- Koble microSD-kortet til en datamaskin for å fjerne .txt fil som inneholder data fra den siste eksperimentelle kjøringen.
MERK: Filen er navngitt i koden som kontrollerer mikrokontrolleren og bør oppdateres for hvert eksperiment (se Tilleggsprotokoll 2). - Importere dataene til et regneark.
- Organiser dataene i 12 kolonner: Tid (i min) og mV-signal for hver av 11 trykktransduserkanaler. De ti første kanalene tilsvarer ti ASOC eksperimentelle oppsett. Det endelige svingersignalet er for en sensor åpen for luft som en kontrollkanal for å bekrefte at mV-signalet ikke endret seg på grunn av endringer i inngangssignalet. Plottkontrollkanal kontra tid for å bekrefte at mV-signalet var konsistent gjennom hele.
- Konverter mV-signalene for ti kanaler til mmHg ved hjelp av hellings-skjæringspunktligninger generert fra den første kalibreringen av hver sensor (se Tilleggsprotokoll 4).
- Plotttid (konverter til dager for å forenkle datatolkning) i forhold til hver av de ti kanalene for å bestemme hvordan IOP svingte over det eksperimentelle tidsforløpet.
- Bestem gjennomsnittlige IOP-verdier på nøkkelpunkter i dataene for å enklere sammenligne verdier mellom hver av dem og hvordan de endres før og etter OG-skadeinduksjon. Gjennomsnittlig 2-3 t data for hvert intervall på 24 timer for å bestemme IOP på hver dag i ASOC.
MERK: Representative IOP-resultater vises i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilder tatt via optisk koherenstomografi (OCT) vises for OG-skadede øyne for å illustrere hvordan en vellykket skadeinduksjon ser ut. Figur 3 viser bilder for kontroll og OG skadet AS-vev umiddelbart etter skade og 72 timer senere. To visninger vises: tverrsnittsbilder gjennom skadestedet og MIPer (maximum intensity projection) for å visualisere overflateområdet i bildet. Kontroll øyne viser ingen merkbar forstyrrelse i hornhinnen, mens klare skader kan være plassert som krysser hele hornhinnen etter OG skade. Fra MIPer er det tydelig at skader er uregelmessige i form og størrelse, men skadestørrelsen reduseres over 72 timer. Tidligere har denne effekten vist seg å være betydelig for en rekke skadestørrelser testet13.
Den primære datautgangen for OG-skademodellen som er beskrevet i denne protokollen, er intraokulært trykk i løpet av det eksperimentelle oppsettet. Data registreres i enheter av millivolt som en utgang fra hver trykktransduser som kan konverteres til mmHg via kalibrering (Supplementary Protocol 4). Eksempel på IOP-data kontra det eksperimentelle tidskurset er gitt for øyne som anses som akseptable og andre som ikke vil bli ansett som brukbare (Figur 4A). Fra trykksporingsdataene ble øynene festet til sensorer etter 24 timer i kulturen, men IOP fortsetter å svinge i løpet av de første 72 h i kulturen. Fysiologisk IOP for AS vev i organkultur er ca 8-10 mmHg, så 2x og 1/2x rekkevidde ble bestemt som en port for brukbare IOP-verdier etter at verdiene har stabilisert seg (5-20 mmHg). Bare øyne som var i det området ville være tillatt for bruk med resten av protokollen. Fra tidligere eksperimenter hadde vi en suksessrate på 90% som ble oppnådd i ASOC-oppsett for øyne som stabiliserer seg i ønsket område (Figur 4B).
Resultatene for hvordan IOP endres på grunn av OG-skade og terapeutisk inngrep er også gitt (Figur 4C,D). Etter OG-skadeinduksjon skal trykket falle betydelig og forbli slik til vevet fjernes fra ASOC (figur 4C). Hvis et øye etter skadeinduksjon ikke reduseres i trykk, indikerer dette at en vellykket skade ikke ble indusert, da IOP bør reduseres hvis øyets vanntette forsegling er kompromittert. Imidlertid kan mindre skadestørrelser selv helbrede, noe som kan føre til at IOP blir gjenopprettet. Hvis terapeutisk påføres øyet etter OG-skadeinduksjon, kan restaurering av IOP spores under ASOC. Dette konseptet er demonstrert med data som viser et Dermabond-lim påført 2,4 mm OG-skader (Figur 4D). Gjennomsnittlige resultater for fem separate ASOC-eksperimenter med og uten terapeutisk vises, og det er tydelig at terapeutisk øker IOP. Denne metoden kan måle effekten av terapeutisk for å gjenopprette IOP og spore om det trykket gjenopprettes over de viktigste 72 h etter OG-skaden.
Videre er ASOC-protokollen tilpasningsdyktig for bruk med et bredt spekter av karakteriseringsendepunkter for å oppfylle sluttbrukerens eksperimentelle krav. Under kultur kan utstrømningsmedier som forlater øyet samles på daglig eller til og med timebasis som kan brukes til å spore endringer i proteinnivå som oppstår under ASOC, etter OG-skadeinduksjon eller etter terapeutisk bruk. For eksempel har gelatin zymografi tidligere blitt utført for å oppdage matrisemetalloproteinasenivåer for å spore sårheling og vevsoppussing20. Ytterligere biologiske endepunkter er mulige etter å ha fjernet vev fra kultur via tradisjonelle immunhiistokjemiske metoder for å vurdere vev levedyktighet21,22, spore patofysiologiske endringer i hornhinnen23,24, eller antistoffbasert farging for ethvert protein av interesse25,26.
Funksjonelle hornhinnen beregninger kan også oppnås fra øynene opprettholdt i ASOC. Hornhinnen epitel integritet kan vurderes via en fluorescein øye flekk og bilde oppkjøp ved hjelp av en blå lyskilde27,28. Etter fjerning fra kultur kan hornhinnen vev vurderes for åpenhet gjennom enkel bildeoppkjøp13. Tradisjonell okulær avbildning kan også utføres for å vurdere vevsstruktur med eller uten terapeutisk inngrep. OCT-bilder, som vist i figur 3, kan lage tverrsnittsbilder gjennom hornhinnen og kan fanges ikke-invasivt, noe som potensielt tillater bildesamling samtidig som vev i kulturen opprettholdes. Andre avbildningsmodaliteter som mikroskopi av spaltelamper, ultralyd eller in vivo konfektmikroskopi kan også tilpasses for å innhente ytterligere anatomisk informasjon.
Til slutt kan vurdering av mekaniske egenskaper til det fremre segmentet fanges for å forstå effekten av OG-skaden eller etterfølgende terapeutisk på det underliggende vevet. Mens IOP-datainnsamling alene fremhever hvordan integriteten til øyets vanntette forsegling har blitt kompromittert, har vi tidligere vist at ytterligere testmålinger kan måles for å erte ut flere mekaniske funksjoner10,11. Okulær samsvar, en klumpet mekanisk egenskap som beskriver hvordan intraokulært trykk endres på grunn av inflasjon (endring i volum / trykkendring), kan måles med en sprøytepumpe for å injisere plutselige små mengder væske i øyet og registrere den resulterende trykkøkningen med en trykktransduser. Høyere samsvar indikerer at vevet er mindre stivt og kan brukes til å spore hvordan terapeutiske materialegenskaper skiller seg fra det underliggende hornhinnen vev. Lekkasjehastighet fra øyet eller et tradisjonelt utstrømningsanlegg kan måles og beregnes for å bestemme den nøyaktige fluidiske strømningshastigheten som etterlater øyet per trykkenhet20,29. Til slutt, med hensyn til terapeutisk testing, kan bristetrykk måles for å bestemme det maksimale trykket øyet kan holde før terapeutisk svikt. Dette kan brukes til å sammenligne ytelse med uskadede øyne eller til å spore endringer i ytelse med tid12,13.
Figur 1: Diagram over ASOC-oppsettet. Øynene holdes i spesialbygde organkulturretter og holdes på plass med en klemring. ASOC-medier infunderes via sprøytepumpe gjennom ventil A og kobles til en trykktransduser, og etterfølgende datainnsamling med Valve B. Åpne porter i hver ventil er uthevet i blått mens gult indikerer lukkede kanaler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over OG-skadeoppsettet. (A) Pneumatisk drevet skadethetsoppsett. Fra venstre til høyre introduseres trykkluft til enheten via en trykkluftledning, som passerer gjennom en regulator for å stille trykk på 50 psi målt ved trykkmåleren. To magnetventiler er koblet til en lineær aktuator for direkte utvidelse/tilbaketrekking av chucken som holder punkteringsobjektet. Skrustikken er plassert foran punkteringsenheten for å holde øyet på riktig x-, y-posisjon. (B) Representativ ASOC plasseres foran skadeinduksjonsanordningen. Ytterligere detaljer om enheten og konstruksjonen er beskrevet i Tilleggsprotokoll 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Optisk koherenstomografi Bilder av ASOC OG skadeeksperimenter. Bilder vises for kontrolløyne (uskadet) og OG-skadde øyne umiddelbart etter skade og 72 timer etter skade. Visninger vises som tverrsnitt gjennom hornhinnen (venstre side) og maksimal intensitetsprojeksjonsvisning av hornhinnens overflate (høyre side). Figuren er tilpasset med tillatelse fra Snider et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative IOP-resultater for ASOC-eksperimenter. (A) Rå IOP-data for de første 72 t ASOC-oppsettet. Øynene punkteres ved 72 timer, slik at de første 3 dagene med data vurderes for å avgjøre om IOP stabiliserer seg i det akseptable IOP-området (5-20 mmHg). Fra de representative resultatene faller tre av de fem øynene innenfor det akseptable IOP-området, mens man har IOP for høyt og man har IOP for lavt (faller utenfor den uthevede gule regionen på tomten). (B) Stabilisert IOP for n = 50 ASOC-oppsett fra tidligere eksperimenter for å demonstrere den typiske suksessraten med ASOC-metoden. (C) IOP for uskadede øyne sammenlignet med tre forskjellige OG-skadestørrelser etter skadeinduksjon i 72 timer. Tapet av IOP er tydelig, uten tegn til utvinning. (D) Skadde IOP-resultater sammenlignet med skader behandlet med et Dermabond-lim. Selv om feilfrekvensen er høy på grunn av at noen øyne er forseglet og andre ikke, kan metoden spore endringer i IOP i løpet av 72 timers perioden etter skade. Figuren er tilpasset med tillatelse fra Snider et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfiler. Klikk her for å laste ned disse filene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er kritiske skritt med ASOC OG skadeplattformen som bør fremheves for å forbedre sannsynligheten for suksess når du bruker metodikken. For det første, under den fremre segmentet disseksjon, bevaring av trabecular meshwork er viktig, men utfordrende å gjøre riktig. Hvis TM blir forstyrret, vil øyet ikke opprettholde fysiologisk trykk og vil ikke oppfylle kvalifikasjonskriterier for eksperimentell bruk. Det anbefales å praktisere disseksjonsprosessen under normale forhold først i stedet for å innføre de ekstra aseptiske teknikkutfordringene til riktige disseksjoner er oppnådd. For det andre, når du setter øynene i ASOC-rettene, er det viktig at de er stramme nok til å forhindre at væske lekker, men løs nok til å forhindre skade ASOC-rettene. Hvis øyet ikke er festet tett, vil væske lekke ut fra øyet gjennom ikke-fysiologiske midler som resulterer i lite eller ingen IOP. Klemringen som holder øyet nede er imidlertid plastisk og kan lett brytes hvis den er fortettet. Det er viktig å klemme øynene ned over 2 dager, da skleralt vev under ringen vil komprimere og løsne vevet i løpet av de første 24 timer. Det anbefales å stramme ringene bare til motstanden mot stramming merkes på dag 1 og følge opp dette ved å stramme på nytt til lignende nivåer etter 24 timer i kulturen for best resultat.
For det tredje er det viktig å forstå fullt ut hvor væskestrømmen er rettet til enhver tid når du bruker denne modellen. Hver ASOC-tallerken er koblet til flere treveisventiler for å lede væskestrømmen fra sprøytepumpen eller 10 ml sprøytereservoar og kobles til trykktransdusere. Ulike forekomster av installasjonsprosessen krever at ventiler plasseres på en slik måte at luftbobler skylles fra øyet eller for å beskytte trykktransdusere mot overtrykk. Det bør fortsatt utvises forsiktighet for å forstå hva som er åpent/nært til enhver tid før kritiske protokolltrinn. Til slutt er det viktig å opprettholde steriliteten i hele ASOC OG-skadeprotokollen, men lett å tape på tvers av flertrinnsprosessen og flere dager. Perfusjonsmedier inneholder høye nivåer av antibiotika og antimykotika for å forhindre dette, og øynene er nedsenket i betadin før de settes opp for å forhindre forurensninger, men det er fortsatt kritiske trinn der feil er mest sannsynlig. Unngå kontakt med øynene under det første oppsettet i parabolen mens du strammer klemringene på plass og hold dekslene på oppvasken til enhver tid når de ikke er i bruk. Et mer sannsynlig eksponeringstrinn er under det daglige ASOC-vedlikeholdet. Det er viktig å gjøre disse rutinemessige trinnene i et biosikkerhetsskap, selv om det ser ut til at de raskt kan oppnås uten å fjerne øynene fra inkubatoren. Nøye etter protokollen og opprettholde god aseptisk teknikk bør minimere forurensningsrisiko på tvers av de 6-dagers ASOC-eksperimentene.
Totalt sett er ASOC OG skadeplattformen unik fra andre metoder som ser på åpne globusskader på grunn av to viktige kriterier. Først er skadeinduksjonsmetoden. Den høyhastighets pneumatiske skadeenheten som brukes, induserer skader med høy kraftmengde. Dette gjør det mulig å fremkalle skader med gjenstander som ikke er spesielt skarpe eller med liten diameter. Dette etterligner nærmere skader som er uregelmessige i form; høyhastighets splint skader som følge av eksplosive enheter30,31. Den pneumatiske enheten kan enkelt utstyres med uregelmessige splint-etterligningsobjekter for å skape skader som er mer utfordrende å helbrede sammenlignet med tidligere metoder ved hjelp av lasere, nåler eller skalpellblader for å skape rene, presise skadegeometrier32,33,34. For det andre tillater ASOC-metoden sporing av skadefremdrift og terapeutisk ytelse utover første skadeinduksjon. Å kunne spore opp til 72 timer var ikke mulig i den tidligere utviklede stasjonære OG skadeplattformen10,11,12 og var motivasjonen bak å utvikle denne protokollen. Faktisk forble celle levedyktigheten høy i hornhinnen endotel i minst 1 uke i ASOC13. ASOC er det eneste middelet denne langsiktige karakteriseringen kan oppnås uten å gå over til kostbare in vivo-eksperimenter.
De viktigste applikasjonene for ASOC-plattformen er todelt. For det første kan modellen brukes til ytterligere karakterisering av åpne globusskader, spesielt med tanke på hvordan de endres med tiden. I den forrige studien ble OG-skader karakterisert på denne måten, og sårheling ble observert over 72 timer etter skade13. Videre sporing av ulike skadestørrelser, former, steder i 72 timer eller enda lenger med hensyn til biologiske endringer som skjer, vil informere kritiske medisinske beslutninger som må tas etter OG-skader. Visse skadeparametere kan tillate selvhelbredelse av hornhinnen, eller andre parametere kan være mer alvorlige hvis intervensjonen ikke brukes innen de første 24 timer. Denne informasjonen vil være uvurderlig for triaging pasienter når begrenset medisinsk utstyr eller evakuering ressurser er tilgjengelig.
For det andre kan ASOC OG-plattformen brukes til å utvikle og teste produktutvikling. For denne applikasjonen kan organkulturplattformen fylle en rekke roller. Under den første produktutviklingen kan kortere tidsrammer testes med en rekke produktformuleringer for å bestemme hva som er mest effektivt. Organkultursystemet kan konfigureres for enda større høy gjennomstrømning for denne applikasjonen med ekstra sprøytepumper for å bevege seg utover de ti samtidige eksperimentene som er mulig med systemet som er beskrevet her. For mer raffinerte produkter kan lengre tidspoeng evalueres for å vurdere ytelsen i 72 timer eller potensielt enda lenger. Til slutt kan sårhelingsevaluering være mulig ved evaluering av biologisk aktive produkter som permanent kan behandle OG-skader i stedet for midlertidig stabilisering.
Det er imidlertid begrensninger med ASOC OG-plattformen som bør tas i betraktning. For det første, mens modellen tillater langsiktig vurdering av terapeutiske behandlinger, mangler den alt vev i øyet utenfor hornhinnen, som iris og linse. Disse ekstra vevene vil sannsynligvis bli påvirket av OG-skaden og kan spille en rolle i skadeprogresjonen. På samme måte mangler et isolert fremre segment immunresponselementer som vil bli inkludert når du går over fra ASOC-modellen til påfølgende dyreforsøk. Deretter er modellen bare egnet for å skape hornhinnen OG skader og potensielt limbal OG skader. Sklerale eller bakre OG-skader kan ikke induseres med denne metoden. Imidlertid resulterer mange av disse skadetypene i skade på netthinnen, noe som gjør midlertidig stabilisering terapeutisk usannsynlig å forhindre tap av syn35,36. Til slutt ble skader med modellen ut til 72 timer etter skaden bare sporet. ASOC har blitt brukt i andre applikasjoner ut til 2 uker, så modellen kan sannsynligvis brukes til disse applikasjonene, men den har ikke blitt testet på dette tidspunktet37,38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser. Synspunktene uttrykt i denne artikkelen er de av forfatteren (e) og gjenspeiler ikke den offisielle politikken eller posisjonen til US Army Medical Department, Department of the Army, Department of Defense eller den amerikanske regjeringen.
Acknowledgments
Dette materialet er basert på arbeid støttet av USAs forsvarsdepartement gjennom en interagency-avtale (#19-1006-IM) med Temporary Corneal Repair acquisition program (United States Army Medical Materiel Development Agency).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
- Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
- Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
- Riesberg, J., Powell, D., Loos, P.
- Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
- Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
- Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954 (2012).
- Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
- Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
- Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
- Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218 (2020).
- Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98 (2020).
- Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
- Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546 (2021).
- Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).
- Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
- Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18 (2021).
- Ren, H., Wilson, G.
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
- Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732 (2020).
- Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
- Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
- Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
- Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
- Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).
- Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
- Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
- Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
- Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
- Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
- Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541 (2013).
- Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
- Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
- Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
- Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).
