Summary
Et svært nøyaktig in vitro høygjennomstrømningsanalysesystem ble utviklet for å evaluere anticancer-legemidler ved hjelp av pasientavledede tumororganoider (PUD), som ligner kreftvev, men er uegnet for in vitro høygjennomstrømningsanalysesystemer med 96-brønns og 384-brønnsplater.
Abstract
Pasientavledede tumororganoider (PUD) forventes å være en preklinisk kreftmodell med bedre reproduserbarhet av sykdom enn tradisjonelle cellekulturmodeller. PUD-er har blitt generert fra en rekke menneskelige svulster for å rekapitulere arkitekturen og funksjonen til tumorvev nøyaktig og effektivt. Imidlertid er PUD-er uegnet for et in vitro high-throughput analysesystem (HTS) eller celleanalyse ved hjelp av 96-brønns eller 384-brønnsplater når de evaluerer anticancer medisiner fordi de er heterogene i størrelse og danner store klynger i kulturen. Disse kulturene og analysene bruker ekstracellulære matriser, som Matrigel, for å skape tumorvevstillaser. Derfor har PUD-er lav gjennomstrømning og høye kostnader, og det har vært vanskelig å utvikle et passende analysesystem. For å løse dette problemet ble det etablert en enklere og mer nøyaktig HTS ved hjelp av PDOer for å evaluere styrken til anticancer medisiner og immunterapi. En in vitro HTS ble opprettet som bruker PUD-er etablert fra solide svulster dyrket i 384-brønnsplater. En HTS ble også utviklet for vurdering av antistoffavhengig cellulær cytotoksisitetsaktivitet for å representere immunresponsen ved hjelp av PUD-er dyrket i 96-brønnsplater.
Introduction
Human kreftcellelinjer er allment akseptert for å studere kreftbiologien og evaluere kreftmidler. Imidlertid bevarer disse cellelinjene ikke nødvendigvis de opprinnelige egenskapene til kildevevet fordi deres morfologi, genmutasjon og genuttrykksprofil kan endres under kultur over lange perioder. Videre dyrkes de fleste av disse cellelinjene i en monolayer eller brukes som murine xenografts, som ingen av dem fysisk representerer tumorvev1,2. Dermed kan den kliniske effekten av kreftmidler ikke være den samme som observert i kreftcellelinjer. Derfor er in vitro-systemer, som ex vivo-analyser ved hjelp av pasientavledede tumor xenografter eller pasientavledede tumororganoider (PUD) og tumorsfæroidmodeller som nøyaktig reproduserer strukturen og funksjonen til tumorvev, utviklet. Økende bevis tyder på at disse modellene forutsier pasientens respons på anticancer agenter ved å være direkte sammenlignbar med tilsvarende kreftvev. Disse in vitro-systemene er etablert for forskjellige tumorvevstyper, og tilhørende høygjennomstrømningsanalysesystemer (HTS) for legemiddelscreening er også utviklet3,4,5,6,7. Heterogene ex vivo organoid kulturer av primære svulster hentet fra pasienter eller pasientavledede tumor xenografts har fått betydelig trekkraft de siste årene på grunn av deres enkle kultur og evne til å opprettholde kompleksiteten av celler i det stromale vevet8,9,10. Disse modellene forventes å øke forståelsen av kreftbiologien og lette evalueringen av legemiddeleffekt in vitro.
En rekke nye PUD-er ble nylig opprettet fra forskjellige typer tumorvev, utpekt som F-PUD, under Fukushima Translational Research Project. PUD-ene danner store celleklynger med en morfologi som ligner på kildesvulsten og kan dyrkes i mer enn seks måneder11. De komparative histologi- og omfattende genuttrykksanalysene viste at egenskapene til PUD-ene er nær de av deres kildesvulstvev, selv etter langvarig vekst under kulturforhold. Videre ble det etablert en egnet HTS for hver type PUD i 96-brønns og 384-brønnsplater. Disse analysene ble brukt til å evaluere flere molekylære målrettede midler og antistoffer. Her ble standard kjemoterapeutikk (paclitaxel og karboplatin) som brukes til endometriekreft evaluert ved hjelp av F-PUD-er avledet fra en pasient som ikke reagerte på paclitaksel og karboplatin. Følgelig var celleveksthemmeraktiviteten til paclitaksel og karboplatin mot denne PUD svak (IC50: >10 μM). I tillegg har tidligere forskning rapportert at følsomheten til noen F-PUD-er til kjemoterapeutiske midler og molekylære målrettede midler er i samsvar med den kliniske effekten11,12,13. Til slutt ble endringer i pdoenes høyere rekkefølge forårsaket av kreftmidler analysert ved hjelp av et tredimensjonalt celleanalysesystem12,13. Resultatene av evalueringen av kreftmidler ved bruk av PUD-basert HTS er sammenlignbare med de kliniske resultatene som er oppnådd for disse midlene. Her presenteres en protokoll for en enklere og mer nøyaktig HTS som kan brukes til å evaluere styrken til anticancer agenter og immunterapi ved hjelp av PUD-modellene.
Protocol
Alle eksperimenter som involverer menneskeskapte materialer ble utført under Helsinkideklarasjonen og godkjent på forhånd av etikkkomiteen ved Fukushima Medical University (godkjenningsnummer henholdsvis 1953 og 2192; godkjenningsdatoer 18. mars 2020 og 26. mai 2016). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter som ga de kliniske prøvene som ble brukt i denne studien.
1. Kultur av PUD-er
MERK: F-PUD-er danner celleklynger som viser en rekke heterogene morfologier og vokser i suspensjonskultur (Figur 1). Videre kan F-PUD-er dyrkes i mer enn 6 måneder og kan kryopreserveres for fremtidig bruk.
- Opptining av lagrede PUD-er (dag 0)
- Opptining og frø-PUD (f.eks. RLUN007, lungeadenokarsinom) på dag 0 (figur 1). Tilsett først 15 ml medium for PUD-er (se Materialtabell) som inneholder 1 % av B-27-tilskuddet og 30 ng/ml epidermal vekstfaktor til et sterilt sentrifugerør på 50 ml.
- Etter å ha fjernet det frosne hetteglasset fra lagring av flytende nitrogen, må du forsiktig omrøre PUD-ene i et 37 °C vannbad i 2 minutter. Deretter fjerner du hetteglasset fra vannbadet, tørker hetteglasset med 70% etanol, og flytter deretter hetteglasset inn i et biologisk sikkerhetsskap.
- Overfør innholdet i hetteglasset til røret som inneholder 15 ml medium for PUD-er. Bland PUD-ene og mediet ved å pipette forsiktig opp og ned fem ganger med en 3 ml overføringspipette. Sentrifuger røret ved 200 x g i 3 min ved ~25 °C og kast supernatanten. Resuspend PUD pellet i 5 ml friskt medium og overfør til en 25 cm2 kolbe (se Tabell over materialer) med skånsom pipettering. Til slutt, kultur PUD-ene i en inkubator ved 37 °C i 5 % CO2.
- Endre medium to ganger i uken (dager 3-7). Sentrifuger PUD-suspensjonen for å utfelle celleklyngene, og erstatt 4 ml av mediet (80 % volum). Resuspend cellene i det friske mediet.
MERK: Mesteparten av RLUN007 vises som celleklynger som er 100-500 μm i diameter. Når fargen på fenolrød i mediet endres til gul som vist i figur 1A, må du bytte ut mediet oftere. Hvis mediet blir gult dagen etter utskifting, og hver celleklynge slås sammen for å danne større klynger som er > 500 μm i diameter, passerer passasjen med et delt forhold på 1:2. - Subkultur (dag 8-28) av PUD-er
MERK: Gitt vanskeligheten med å faktisk måle antall enkeltceller, bestemmes tidspunktet for passasjen basert på en passende celleklyngetetthet og størrelsen på PUD-pellet etter sentrifugering (Figur 1B). Når det gjelder RLUN007, når volumet av PUD-pellet 30 μL (mettet tetthet i 25 cm2 kolber) ca. 2 uker etter opptining.- For overføring fra en 25 cm2 kolbe til to 25 cm2 kolber (P1), overfør PUD-suspensjonen til et sentrifugerør og sentrifuger ved 200 x g i 2 minutter ved ca. 25 °C. Beregn volumet på PUD-pelletsen, og kast supernatanten. Resuspend PUD pellets ved hjelp av en 5 ml pipette i 5 ml friskt medium. Pipette forsiktig opp og ned fem ganger ved lav hastighet. Overfør deretter halvparten av volumet på PUD-fjæringen (2,5 ml) til to kolber, og tilsett 2,5 ml friskt medium til hver kolbe. Kultur cellene ved 37 °C i 5 % CO2.
- For overføring fra to 25 cm2 kolber til en 75 cm2 kolbe (P2), overfør PUD-suspensjonen fra to kolber til to sentrifugerør og sentrifuger PUD ved 200 x g i ca. 25 °C. Deretter estimerer du volumet av PUD-pelletsen og bruker pelletsen på nytt i 2,5 ml friskt medium (per rør). Kombiner deretter PUD-fjæringen i det ene røret med det i det andre og overfør det til en 75 cm2 kolbe som inneholder 10 ml ferskt medium. Kultur cellene ved 37 °C i 5 % CO2. Overfør de subkulturerte PUD-ene fra to 25 cm2 kolber til en 75 cm2 kolbe ca. 1 uke etter første passasje (Figur 1C).
2. Veksthemming HTS
MERK: Veksthemmeraktiviteten til kreftmidler mot PDA-er evalueres ved å måle det intracellulære ATP-innholdet, som vist i figur 2. Dette trinnet utføres ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig analysesett for celle levedyktighet (se Materialfortegnelse).
- På dag 0, kultur PUD-ene (f.eks. RLUN007) i kolber til tilstrekkelig antall celleklynger er tilgjengelige for analysen. En dag før sådd, overfør PUD-suspensjonen fra en 75 cm2 kolbe til et 15 ml rør og sentrifuge ved 200 x g i 2 minutter for å måle PUD-pelletsvolumet. Deretter bruker du PUD-pelletsen på nytt i 15 ml friskt medium og overfører den tilbake til en 75 cm2 kolbe. Kultur cellene ved 37 °C i 5 % CO2.
MERK: Det nødvendige PUD-pelletsvolumet avhenger av hver PUD-fortynningshastighet og antall 384-brønnsplater som brukes til analysen. For RLUN007 er det nødvendig med et 200 μL cellepelletsvolum for såing i ti 384-brønnsplater. - På dag 1 (24 timer etter at du har skiftet medium), hakker du PUD-ene ved hjelp av cellefragmenterings- og dispersjonsutstyr (se Materialtabell) med en filterholder som inneholder et 70 μm maskefilter. Fortynn deretter 15 ml av PUD-suspensjonen med 10x. Frø 40 μL av PUD-fjæringen i 384-brønns ultra-lav festesfæroid (rundbunn) mikroplater (se Materialtabell) ved hjelp av en cellefjæringsdispenser (se Materialtabell).
MERK: For mincingcelleklynger anbefales det å bruke det kommersielt tilgjengelige cellefragmenterings- og dispersjonsutstyret (se Materialfortegnelse). - Ved 24 timer etter sådd (dag 2) behandler du PUD-ene med 0,04 μL testmiddelløsninger ved endelige konsentrasjonsområder på 20 μM til 1,0 nM (10 serielle fortynninger) ved hjelp av en væskebehandler (se Materialtabell).
- På dag 8 (144 timer etter behandling av teststoff) tilsett intracellulær ATP målereagens til testbrønnene. Bland platene med en mikser og inkuber i 10 min ved 25 °C. Mål det intracellulære ATP-innholdet som luminescens ved hjelp av en plateleser (se Materialfortegnelse).
- For å beregne celle levedyktigheten, del mengden ATP i testbrønnene med den i kontrollbrønnene som inneholder kjøretøyet, med bakgrunnen trukket fra. For å beregne vekstraten over 6 dager, del mengden ATP i kjøretøyets kontrollbrønner med den i kjøretøyets kontrollbrønner 24 timer etter sådd.
- Beregn 50 % hemmende konsentrasjon (IC50) og arealet under kurveverdiene (AUC) fra doseresponskurvene ved hjelp av programvare for biologisk dataanalyse (se Materialfortegnelse). Z-faktoren er en dimensjonsløs parameter som varierer fra 1 (uendelig separasjon) til <0, definert som Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, hvor σc+, σc-, μc+ og μc- er standardavvikene (σ) og gjennomsnittene (μ) av de høye (c +) og lave (c) kontrollene14, henholdsvis.
3. HTS med et celleplukkings- og bildesystem for veksthemming
MERK: Hvis det er et stort avvik (når variasjonskoeffisienten [CV] ved analysen er mer enn 20 %) i dataene ved hjelp av protokoll 2, kan PUD-er av valgt størrelse bli sådd i 96-brønns- eller 384-brønnsplater ved hjelp av et celleplukkings- og bildebehandlingssystem (figur 2). Protokollen er den samme som beskrevet i trinn 2.1 og 2.2 i forrige avsnitt. Dette trinnet utføres ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig celleplukkings- og bildebehandlingssystem (se Materialfortegnelser).
- På dag 1 setter du en 384-brønns ultra-lav festesfæroidmikroplate med 40 μL medium / samt en destinasjonsplate på celleplukkings- og bildesystemet.
- Fyll plukkkammeret (se Materialliste) med 6 ml kulturmedium og sentrifuge ved 1500 x g i 2 minutter for å fjerne luftbobler. Legg PUD-ene suspendert i mediet (PUD pelletsvolum, 4 μL) i plukkkammeret og sett på systemet.
- Stå kammeret i minst 1 minutt, etterfulgt av dispersjon, slik at celleklyngene legger seg på bunnen av kammeret; Deretter utfører du skanning av kammeret.
- Sett plukkstørrelsen til 140-160 μm (areal 15 386-20 000 μm2) på systemet for automatisk valg av celleklynger. Deretter kontrollerer du kvaliteten på de valgte celleklyngene på de skannede bildene og overfører ti celleklynger per brønn ved hjelp av plukktips (se Tabell over materialer) til målplaten.
- Utfør protokolltrinnene fra trinn 2.3 og fremover.
4. HTS for antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet
MERK: Dette trinnet utføres ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig system (se Materialfortegnelse), som er et måleinstrument for elektrisk impedans. Den brukes til å evaluere cytolyse av PDOer ved antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) med monoklonale antistoffer og naturlige morderceller (NK) (figur 3). NK-celler produseres fra perifere mononukleære celler i blodet ved hjelp av NK-celleproduksjonssettet (se Materialfortegnelser), i henhold til produsentens instruksjoner.
- Måling av ADCC-aktivitet
- På dag 0 kan du belegge en 96-brønnsplate (se Materialbord) med 50 μL 10 μg/ml fibronektinoppløsning (0,5 μg/brønn) ved 4 °C over natten.
- På dag 1, etter å ha fjernet fibronektinløsningen, tilsett 50 μL av kulturmediet til hver brønn for å måle bakgrunnsimpedansen.
- Før sådd, tilsett 5 ml cellekultur dissosiasjonsreagens (se Materialtabell) til PUD-ene (RLUN007: 100 μL av PUD-pelletsen i en 75 cm2 kolbe) og inkuber i en CO2-inkubator ved 37 °C i 20 minutter for å spre PUD-ene. For å stoppe trypsinisering, tilsett 5 ml medium, sentrifugering og fjern dissosiasjonsreagensen. Skyll PUD-ene med friskt medium og filtrer gjennom en 40 μm cellesil (se Materialtabell).
- Telle antall celler ved hjelp av en cellesynlighetsanalysator (se Materialfortegnelse).
- Overfør PUD-suspensjonen til et reservoar og bland med en flerkanals pipettor. Tilsett PUD-suspensjonen i brønner på 5 x 104 celler/brønn i en 96-brønnsplate. Hver brønn inneholder et sluttvolum på 100 μL. Plasser deretter platen i et biologisk sikkerhetsskap ved ca. 25 °C i 30 minutter.
- Overfør platen til instrumentet i en CO2 inkubator ved 37 °C. Registrer endringer i impedanssignalene hvert 15.
- Tine NK-cellene i et 37 °C vannbad samme dag som PUD-såingen. Overfør cellene fra hetteglasset til et 15 ml rør som inneholder 10 ml medium for NK-celler (se Materialtabell) og sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved ca. 25 °C. Kast supernatanten og resuspend cellepellet i 10 ml friskt medium. Etter celletelling justerer du celletettheten til 1 x 106 celler / ml og overfører til en 75 cm2 kolbe. Kultur NK-cellene i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C.
- På dag 2 forbereder du antistoffløsningene (fosfatbufret saltvann) ved 10 ganger den endelige konsentrasjonen i sterile V-bunn 96-brønnsplater.
- Fjern 60 μL medium fra hver brønn, og tilsett 10 μL trastuzumab eller cetuksimaboppløsning (10 μg/ml, 1 μg/ml og 0,1 μg/ml) til PUD-ene. Overfør platene tilbake til instrumentet i en inkubator og registrer celleindeksen i 1 time.
- Overfør NK-celleopphenget til et 50 ml rør og tell cellenummeret. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter og juster NK-celletettheten til 1 x 106 celler / ml og 2 x 106 celler / ml med mediet for PDOene.
- Legg til 50 μL NK celleoppheng i effektorcellene (NK) ved et mål (RLUN007) celleforhold på 1:1 eller 2:1. De endelige konsentrasjonene av antistoffene er 1 μg/ml, 0,1 μg/ml og 0,01 μg/ml. Oppbevar platen ved ca. 25 °C i 15 minutter, og returner platene til instrumentet.
- Datainnsamling og analyse
- Konverter celleindeksen til prosent cytolyseverdier ved hjelp av analyseprogramvare (se Materialfortegnelse).
- Prosentcytolysen refererer til prosentandelen av målceller drept av NK-celler kontra målceller (PUD) alene som en kontroll. Trekk celleindeksene til brønnene som bare inneholder NK-celler, fra indeksen for prøvebrønnene ved hvert tidspunkt. Normaliser hver verdi til celleindeksen umiddelbart før tilsetning av antistoffer. Konverter den normaliserte celleindeksen til prosent cytolyse ved hjelp av følgende ligning: % cytolyse = (1 - normalisert celleindeks [utvalgsbrønner]) / normalisert celleindeks (mål alenebrønner) x 100.
Representative Results
En svært nøyaktig HTS ble utviklet ved hjelp av PUD og 384-brønns mikroplater for å evaluere anticancer agenter, og utviklingen av en HTS for hver PUD ble tidligere rapportert10,11,12,13. Ytelsen til HTS ble evaluert ved å beregne CV-ene og Z-faktoren. Z'-faktoren er en allment akseptert metode for validering av analysekvalitet og ytelse, og analysen er egnet for HTS hvis denne verdien er >0,514. Kontrolldatumpunktene i 384-brønnsplateanalysen ved bruk av RLUN007 viste liten variasjon, med CV-verdier på 5,8 % og beregnede Z-faktorer på 0,83, som vist i figur 4. Disse resultatene indikerer at denne analysen har høy ytelse for HTS. For å undersøke sensitiviteten til PUD-er overfor anticancer-midler ved hjelp av HTS, veksthemming ble vurdert ved hjelp av RLUN007 behandlet med åtte anticancer agenter, spesielt epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) hemmere (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib, og rociletinib) og paclitaxel, som er standard kliniske behandlinger for ikke-småcellet lungekreft, og mitomycin C som en positiv kontroll. IC50- og AUC-verdiene til anticancer-midlene for hver PUD vises i figur 4. RLUN007 viste høy følsomhet (IC50 < 2 μM, AUC < 282) for alle EGFR-hemmere og andre anticancer-midler. Sigmoidkurver beregnet for alle dataene indikerte at veksthemmeraktiviteten til anticancer-midlene kunne måles nøyaktig.
Celleplukkings- og bildesystemet brukes når dataene varierer betydelig ved hjelp av metodikken ovenfor. Celleplukkings- og bildesystemet, som plukker celleklynger nøyaktig uten å skade dem, muliggjør nøyaktige HTS-analyser ved å justere celleklyngestørrelsen for å utelukke celleavfall fra analysesystemet. Når systemet ikke ble brukt, var CV-verdien 26,0 % og Z-faktorverdien 0,23 (data vises ikke). CV- og Z-faktorverdiene ble imidlertid forbedret med henholdsvis 6,4 % og 0,81 ved hjelp av systemet.
For å undersøke cytolyse av PUD-er med ADCC-aktivitet ved hjelp av det elektriske impedansmålingsinstrumentet, som overvåker antall, morfologi og vedlegg av celler i lang varighet, ble endringer i impedanssignaler vurdert ved hjelp av RLUN007 behandlet med antistoffene (trastuzumab og cetuksimab) og NK-celler som effektorceller i en 96-brønnsplate. Sammenlignet med kontrollen som bare består av målceller, økte prosentandelen cytolyse med tiden. Den nådde 45 % eller 75 % etter 6 timer ved et E:T-forhold på 1:1 (figur 5A, C) eller 2:1 ( figur5B,D) uten antistoffene. NK cellemediert cytolyse ved bruk av trastuzumab var ca. 60 % og 90 % med et forhold på henholdsvis 1:1 (figur 5A, 1 μg/ml) og 2:1 (figur 5B, 1 μg/ml) ved henholdsvis 6 t. Cetuksimab hadde derimot en doseavhengig innvirkning på NK cellemediert cytolyse (figur 5C,D). Ved den høyeste konsentrasjonen av cetuksimab ble RLUN007 ødelagt med henholdsvis 90 % og 100 % med et forhold på henholdsvis 1:1 og 2:1 (Figur 5C,D). Effekten av trastuzumab var svakere enn for cetuksimab, med bare 60% cytotoksisitet. Disse resultatene indikerer at PUD-analysesystemet kan evaluere ADCC-aktivitet ved hjelp av sanntidsimpedansbasert teknologi.
Figur 1: Kritiske punkter for PUD-kultur. (A) Fargeendring i mediet. (B) Måling av mengden PUD-er fra pelletsstørrelsen ved å fôre et sentrifugerør som inneholder PUD-ene med rør merket på nivåer for 50-200 μL. (C) PUD-tetthet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsummering av protokollen som brukes til å lage et analysesystem med høy gjennomstrømning ved hjelp av mikroplater med 384 brønner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammendrag av protokollen for høygjennomstrømningsanalyse av ADCC-aktivitet. ADCC, antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet; NK, naturlig morder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Høygjennomstrømningsanalysesystem for vekstinhibering med kreftmidler. Doseresponskurve av RLUN007 til anticancer midler. De hakkede PUD-ene ble sådd i 384 brønnplater. Disse ble behandlet i 6 dager med ti forskjellige konsentrasjoner av kreftmidler (mellom 10 μM og 1,5 nM). Dataene representerer gjennomsnittet ± standardavviket for triplikateksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Høy gjennomstrømningsanalyse for ADCC-aktivitet. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuksimab. (A,C) Et 1:1-forhold mellom RLUN007 og effektorceller. (B,D) Cytolyse med et forhold mellom RLUN007: effektorceller på 1:2. Aktiviteten ble målt 12 timer etter tilsetning av effektorcellene. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± standardavvik for tre replikeringsprøver. ADCC, antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Den unike egenskapen til PUD-er er at de ikke er enzymatisk delt inn i enkeltceller under kultur eller analyse og opprettholder celleklynger i kultur. Derfor kan antall celler ikke telles nøyaktig under et mikroskop. For å løse dette problemet bestemmes antall celler visuelt ved å fôre et sentrifugerør som inneholder cellene med rør merket med nivåer for 50-200 μL (Figur 1B). Videre, fordi det er vanskelig å måle pelletsvolumet av celleklynger dyrket i en 25 cm2 kolbe visuelt, ble passasjetiden bestemt ved hjelp av middels fargeendring fra rød til gul og den merkbare økningen i enkeltceller eller rusk sammenstilt med tiden for passivisering som indikatorer (Figur 1A,C). Dette er poenget med passivitet for PUD-er. Mengden PUD-pellets måles visuelt etter sentrifugering ved hver mediumendring. Når pelletsvolumet slutter å øke, og mediet blir gult dagen etter middels utskifting, anses mediet å være mettet med tetthet, og passivring utføres. Pelletsvolumet er definert for hver PUD. Hvis PUD-ene ikke sprer seg, endres mengden medium fra 80% til 50% på tidspunktet for middels utveksling, og tettheten av PUD-er økes i kulturen.
En HTS egnet for PUD ble utviklet. Dens gjennomstrømning er minst ti til tjue 384-brønns plater utført ved hjelp av en 75 cm2 kolbe av PUD, og antall plater behandlet per dag er minst 50. I tillegg er resultatene av evalueringen av ulike anticancer-legemidler ved HTS ved hjelp av PDA-er allerede rapportert.
Når du utfører HTS, blir tilstopping av maskefilteret forårsaket av mincing av F-PUD-ene ved hjelp av cellefragmenterings- og dispersjonsutstyret adressert i utgangspunktet ved å endre maskestørrelsen på filteret til 100 μm. Det neste trinnet er å redusere volumet på PUD-suspensjonen som påføres glassbeholderen. Ved tilberedning av teststoffløsninger for HTS oppløses lavmolekylære forbindelser vanligvis i dimetylsulfoksid, og antistoffene oppløses i fosfatbufret saltvann. Riktig løsningsmiddel brukes som teststoff, og kontrolldataene hentes fra løsningsmidlet som brukes.
Nedenfor finner du en beskrivelse av hvordan man håndterer variasjoner i analysedataene. Hvis det er stor variasjon i dataene i testen ved hjelp av 384-brønnsplater, bør analyseplaten endres til et 96-brønns plateformat. PUD-fortynningsfaktoren (antall frøcelleklynger) undersøkes også etter sådd av platen. Til slutt kan celleplukkings- og bildesystemet brukes til å velge størrelsen på PUD-er for analysen. Før du legger til PUD-er i kammeret, bør enkeltceller og småcelleklynger fjernes ved lavhastighets sentrifugering for å kunne gjenkjenne PDOer på riktig måte. Hvis enkeltceller eller små celleklynger er synlige etter at du har lagt til PDI-er i kammeret, kan det utføres flere dispersjoner for å fjerne enkeltcellene. Deretter, selv om celleplukkings- og bildesystemet har en funksjon som gjør at platen kan holdes varm, brukes denne funksjonen ikke på grunn av fordampning av kulturmediet når systemet jobber i lang tid. Til slutt er volumet av celleklynger ukjent fordi det gjenkjennes av et planbilde. Hvis to eller flere PUD-er overlapper hverandre, gjenkjennes heller ikke en enkelt PUD på riktig måte. Det er imidlertid mulig å fjerne uønskede PDA-er ved hjelp av fjern-funksjonen ved å sjekke dem på det skannede bildet etter flyttingen.
Det elektriske impedansmålingsinstrumentet brukes vanligvis til tilhengermålkreftceller for å overvåke endringer i impedans under celleproliferasjon. Det oppdages derfor ikke en endring i celleindeksen for ikke-tilfølgende PDOer. I et forsøk på å løse dette problemet er det nødvendig å undersøke såingsforholdene som PUD-tetthet og enzymatisk behandling (celledissosiasjonsenzym og behandlingstid) avhengig av type PUD. Brønnene i platen må også belegges med en passende ekstracellulær matrise for såing av PUD-er. PUD-er blir sådd uten enzymatisk behandling, avhengig av type PUD. RLUN007 ble brukt til å måle impedansen ved å så PUD-ene på en 96-brønnsplate etter å ha dispergert dem ved enzymatisk behandling. RLUN007 ble behandlet med cellekulturens dissosiasjonsreagens i 20 min ved 37 °C for å spre cellene og feste dem til brønnene på en 96-brønnsplate. Gitt at dissosierte RLUN007-celler umiddelbart danner aggregater, er det ønskelig å frø på platene like etter filtrering ved hjelp av en sil. Etter å ha overført celleopphenget fra røret til et reservoar, ble reservoaret forsiktig flyttet fra høyre til venstre to til tre ganger og pipettert opp og ned fem ganger før sådd på platen. Suspensjonen ble også blandet med hvert tillegg til brønnen. Platen ble deretter plassert i et biologisk sikkerhetsskap i 30 min (for PUD) eller 15 min (for NK-celler) slik at cellene kunne fordele seg jevnt i brønnen. Det andre viktige poenget er at behandling med antistoffer og NK-celler bør tidsdestreres før celleindeksen når et platå og verdien ikke er mindre enn 0,5. Når det gjelder RLUN007, er den optimale tiden for å starte analysen 20-22 timer etter plating, og cellenummeret for såing er 5 x 104 celler / brønn.
Generelt bruker kulturen og analysene for tumororganoider ekstracellulære matriser som Matrigel for å skape tumorvevstillaser eller enzymer som trypsin og kollagenase for å forstyrre organoidene3,4,5,6,7. Fordelen med denne metoden er at ingen ekstracellulær matrise eller enzymatisk behandling er nødvendig under kultur og analyse (bortsett fra analyser ved hjelp av det elektriske impedansmålingsinstrumentet), noe som reduserer arbeidsbehov og kostnader betydelig. Videre er denne metoden relativt enkel å tilpasse seg HTS analysesystemer og ulike målesystemer. Imidlertid er bruken av en ekstracellulær matrise ønskelig for noen forskningsformål fordi den kan fungere som et stillas for celler og påvirke morfogenese, differensiering og homeostase i vev.
I denne studien ble PUD-er (RLUN007) med EGFR-mutasjon (L858R) som er klinisk følsomme for EGFR-hemmere og høyt uttrykk for EGFR-genet (data ikke vist) brukt til å evaluere EGFR-hemmere. Det ble demonstrert at følsomheten til RLUN007 for EGFR-hemmere var høyere enn for andre lungekreftavledede F-PUD13 (figur 4). Dermed er en HTS ved hjelp av PUD-er, som beholder egenskapene til tumorvev, overlegen for evaluering av potensielle anticancer-midler og presenterer muligheter for legemiddelvurdering og fremskritt i personlig medisin. Selv om HTS er egnet for den første screeningen av midler, reproduserer den ikke tumormikromiljøet og kan dermed ikke evaluere effekten av legemidler in vivo. Derfor er et in vitro-system som kan etterligne humant tumorvev in vivo ved samkultur med vaskulære endotelceller og andre stromale celler eller organ-on-a-chip-teknologi i fravær av dyremodeller nå under utvikling.
Disclosures
Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation er et datterselskap av Fujifilm Wako Pure Chemicals, den kommersielle eieren av F-PUD og F-PUD media ved lisensoverføring.
Acknowledgments
Vi vil takke pasientene som ga de kliniske prøvene som ble brukt i denne forskningen. Denne forskningen støttes av tilskudd fra Translational Research Program of Fukushima Prefecture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
| 40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
| Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
| ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
| CELL HANDLER | Yamaha Motor | - | Cell picking and imaging system |
| CellPet FT | JTEC | - | Cell fragmentation and dispersion equipment |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
| Echo 555 | Labcyte | - | Liquid handler |
| EnSpire | PerkinElmer | - | Plate reader |
| E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
| Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
| F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | - | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
| Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
| Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
| Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
| Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
| Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | - | Cell viability analyzer |
| xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | - | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
| xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | - | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |
References
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Palechor-Ceron, N., et al. Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks. Cells. 8 (11), 1327 (2019).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Inoue, A., et al. Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research. Cancers (Basel). 11 (9), 1321 (2019).
- Hum, N. R., et al. Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo. Cancers (Basel). 12 (3), 690 (2020).
- Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).
- Takahashi, N., et al. An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids. Cells. 8 (5), 481 (2019).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
