Summary
该协议提出了一种利用谷胱甘肽相关的供体珠与 GST 融合的 TPR-motif 共同伴奏和接受珠以及 Hsp90 衍生肽来探索蛋白质- 蛋白质相互作用的技术。我们使用此技术筛选小分子，以破坏 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 相互作用，并识别出有效和选择性的 Hsp90-FKBP51 相互作用抑制剂。
Abstract
针对热休克蛋白 90 （Hsp90） - 可可酮相互作用提供了专门调节 Hsp90 依赖细胞内过程的可能性。Hsp90 C 终点站保存的 MEEVD 五肽负责与共护的四肽重复 （TPR） 主题的相互作用。FK506 结合蛋白 （FKBP） 51 和 FKBP52 是两个类似的 TPR 主题共同伴奏涉及类固醇激素依赖性疾病具有不同的功能.因此，识别专门阻断Hsp90和FKBP51或FKBP52之间相互作用的分子为几种人类疾病提供了有希望的治疗潜力。在这里，我们描述了放大发光接近同质测定程序，以调查Hsp90与其合作伙伴FKBP51和FKBP52之间的相互作用。首先，我们以谷胱甘肽S转移酶（GST）标记形式纯化了含TPR图案的蛋白质FKBP51和FKBP52。利用与谷胱甘肽相关的供体珠与 GST 融合的 TPR-motif 蛋白和接受珠，以及 Hsp90 的 10 mer C 终端肽，我们探索了同质环境中的蛋白质-蛋白质相互作用。我们利用此检测屏蔽小分子，以破坏 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 相互作用，并识别出有效和选择性的 Hsp90-FKBP51 相互作用抑制剂。
Introduction
分子伴奏有助于蛋白质平衡，包括蛋白质折叠、运输和降解。它们调节几个细胞过程，与许多疾病有关，如癌症和神经退行性疾病1。热休克蛋白90（Hsp90）是最重要的伴奏之一，其功能取决于ATP水解驱动的构象变化，并与由其共同伴奏2调解的客户蛋白结合。尽管Hsp90作为治疗靶点的潜力显而易见，但微调其功能是一个很大的挑战。有几个Hsp90抑制剂针对N终端ATP结合区，已在临床试验中评估，但没有一个已被批准营销3。由于缺乏一个明确的配体绑定口袋4，针对Hsp90的C终端区域已经取得了有限的成功4。最近，小分子对Hsp90-cochaperone相互作用的破坏被作为替代策略5进行了研究。以Hsp90-cochaperone相互作用为目标不会引起一般细胞应激反应，并有可能具体调节各种细胞内过程。Hsp90 C 终点站保存的 MEEVD 五肽负责与共伴6的四肽重复 （TPR） 主题的相互作用。在人类蛋白质数据库中注释的736种TPR主题含图案的蛋白质中，有20种不同的蛋白质通过这种肽7与Hsp90相互作用。分子争夺MEEVD肽结合会破坏Hsp90和含有TPR域的共同伴奏之间的相互作用。肽结合场具有类似的第三级结构，但不同TPR主题域之间的整体同源性相对较低，提供了一个机会来识别分子，特别是能够阻止Hsp90和特定TPR-主题共同伴奏之间的相互作用。在这些TPR-motif共同伴奏中，FK506结合蛋白（FKBP）51和FKBP52是类固醇激素受体（SHR）信号的调节器，并涉及多种类固醇激素依赖性疾病，包括癌症、压力相关疾病、代谢疾病和阿尔茨海默氏症8。虽然FKBP51和FKBP52的份额>80%的序列相似性，但它们的功能不同：FKBP52是SHR活动的正调节器，而FKBP51在大多数情况下是负监管机构。因此，识别分子，特别是阻断Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用，为相关疾病提供了有希望的治疗潜力。
1994年，乌尔曼EF等人首次研制出一种Mpl化L微生P生源性Asay（阿尔法屏幕）。现在，它被广泛用于检测不同类型的生物相互作用，如肽10，蛋白质11，DNA12，RNA13和糖14。在这项技术中，有两种珠子（直径200纳米），一种是捐赠珠，另一种是接受珠。生物分子固定在这些珠子上;他们的生物相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。由于单氧寿命短，只能扩散至200纳米。如果接受珠在附近，其硫氧生成物与在370纳米下产生化疗的单氧发生反应。这种能量进一步激活荧光灯在同一接受珠发出光在520-620纳米15。如果生物相互作用中断，接受珠和供体珠无法接近，导致单氧衰变和低生成信号。
在这里，我们描述了使用这种技术筛选小分子，抑制Hsp90和TPR共同伴奏之间的相互作用的协议，特别是FKBP51和FKBP52。与Hsp90极端C终点站对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。纯化 Gst 标记的 Tpr 共同伴奏与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。当Hsp90衍生肽和TPR-motif共同伴奏器之间的相互作用将珠子聚集在一起时，就会产生放大信号（图1A）。如果筛选的小分子可以抑制Hsp90和TPR-主题共同伴奏之间的相互作用，这个放大的信号将减少（图1B）。他们的IC50 可以通过定量测量来计算。此协议可以扩展到任何伴奏 - TPR-motif 共同伴奏相互作用的兴趣，并在新分子的发展中非常重要，特别是阻止Hsp90和FKBP51或FKBP52之间的相互作用。
图1：本检测的基本原则。（A） 纯化GST-FKBP51与谷胱甘肽相关的捐赠珠子相互作用。与Hsp90极端C终点相对应的10种氨基酸长肽附着在接受珠上。Hsp90 衍生肽和 FKBP51 的 TPR 域之间的相互作用使捐赠者和接受者珠子接近。在680纳米处，捐赠珠中的光敏剂照亮并转换氧气为单氧。接受珠上的硫化物衍生物与单氧发生反应，在 370 nm 处产生化疗。这种能量进一步激活同一接收珠中的荧光，以 520-620 nm 发射光。（B） 当小分子抑制Hsp90和FKBP51之间的相互作用时，供体和接受珠无法接近。然后，寿命短的单氧衰变，并且不产生可检测的信号。请单击此处查看此图的较大版本。
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Protocol
注：此协议概述显示在 图 2中。
1. GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达和净化 （图 2A）
-
质 粒
注：从图像联盟获取用于人类FKBP51（克隆 ID：5723416）和用于人类 FKBP52（克隆 ID：7474554）的 cDNA 克隆。- 用引物放大人类 Fkbp51 Dna （前进; 5 'Ggatccatactactgaggt - 3'， 反向; 5 '- CTCGCTCTCTCCAC - 3'）， 包含巴姆希和 Xhoi 悬垂， 克隆成 pgex6 - 1 载体在巴姆希 / Xhoi 限制站点。
- 用引物（前方;5'-加特卡特加特-3'，反向;5'-CTCGGCTCTCTCCAC-3'）放大人类FKBP52 DNA，其中含有EconRI和XhoI悬垂，克隆成pGEX6-2载体在EcoRI/XhoI限制站点。
注：PCR 反应设置和条件显示在 表 1 和 表 2中。 - 根据制造协议验证插入的序列，将质粒转化为化学上称职的大肠杆菌。
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蛋白质表达和纯化
- 在 1 升蒸馏水中加入 25 克 Luria 肉汤 （LB） 基座，以制作 LB 溶液。在 121 °C 下自动将其高压 15 分钟。冷却后，加入50微克/mL安培素。
- 以表达 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 的细菌群为例，在 1.5 mL 管中与 500 μL 的 LB 溶液混合。旋涡。
- 在覆盖着铝箔的 Erlenmeyer 烧瓶中加入 1 L 的 LB 溶液中的"1.2.2"混合物。在 37 °C 的摇床中将埃伦迈尔烧瓶孵化过夜。
- 通过在埃伦迈尔烧瓶中加入1m异丙基-β-D硫化物（IPTG）来诱导蛋白质表达，并继续孵育2小时。
- 要获得细胞颗粒，离心机在 5，000 x g 为 15 分钟。取出超高超。
注：细胞颗粒可存储在 -20 °C 下。 - 将细胞颗粒重新悬念在 PBS 的 40 mL 中，并在冰上声波 3 x 20 s。加入 1 mM PMSF、1 m EDTA 和蛋白酶抑制剂鸡尾酒 （1 片）， 以防止蛋白溶解。
- 将悬架离心 30 分钟 50，000 x g 以去除细胞碎片，并将超高纳特应用到 5 mL GST 陷阱柱上。
- 用 30 mL PBS 清洗柱子后，在 PBS 中用 5 mL 的 10 mM 谷胱甘肽清洗 GST-FKBP51 和 GST-FKBP52。
- 将蛋白质浓缩到 15 mL 10.000 MWCO 离心装置上。要去除免费谷胱甘肽，请通过 PD-10 列将浓缩物与 0.5 倍 PBS 平衡，并再次集中到滤芯离心机设备上。
- 收集含蛋白质的分数。验证 SDS-PAGE 中的蛋白质，并将蛋白质浓度调整为 1 毫克/毫升。
注：典型蛋白质产量为2-5毫克/升培养。蛋白质可以储存在-20°C。
2. 将Hsp90 C终端肽与接受珠耦合（图2B）
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Hsp90 肽制剂
- 合成十种氨基酸肽NH2-EDASRMEEVD-COOH对应于人类Hsp90β异形（UniProt ID：P08238）的氨基酸714-724，通过肽合成服务。
- 将 PBS 中的 Hsp90 肽稀释至 1 毫克/mL 浓度。
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接受者珠准备
- 将 PBS 中未合并的接受珠稀释至 1 毫克/mL 浓度，并转移到 1.5 mL 管中。
- 以离心机清洗 16，000 x g 进行 15 分钟。小心地取出超高等。
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共轭
- 将珠子和肽的比例设定为 10：1。在含有1毫克接受珠颗粒的1.5mL管中（如上所述），加入1 mL的PBS（pH 7.4），0.1毫克稀释肽， 1.25 μL 的 Tween-20， 10 μL 的 400 mM 溶液氰化钠 （NaBH3CN） 在水中。
警告：纳BH3CN有毒：使用烟罩和手套。纳布3CN 解决方案应新鲜准备。 - 在 37 °C 下孵育 24 小时，在旋转摇床上进行端端搅拌（10-20 转/分）。
- 将珠子和肽的比例设定为 10：1。在含有1毫克接受珠颗粒的1.5mL管中（如上所述），加入1 mL的PBS（pH 7.4），0.1毫克稀释肽， 1.25 μL 的 Tween-20， 10 μL 的 400 mM 溶液氰化钠 （NaBH3CN） 在水中。
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反应淬火和珠子清洗
- 添加 20 μL 的 1 M Tris-HCl （pH 8.0） 解决方案，以阻止未受反应的站点。在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 离心机在 16，000 x g （或最大速度） 15 分钟在 4 °C. 取出超高颗粒，在 1 mL 的 Tris-HCl 溶液（100 mM，pH 8.0）中重新使用珠粒。
- 重复洗涤步骤三次。
- 上次离心后，在存储缓冲器（1 mL 0.5 × PBS 中以 1 毫克/兆升的存储缓冲器重新使用珠子，其中 0.01% 为防腐剂）。将结合的接受者珠子溶液存储在受保护的 4 °C 光下。
警告：钠酸钠有毒：使用烟罩和手套。
3. 检测GST-FKBP51或GST-FKBP52与Hsp90 C终端肽之间的相互作用，并抑制小分子质量化合物（图2C）
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GST 标记的蛋白质与谷胱甘肽捐赠者珠子相互作用
- 在384井板块中设置反应。
- 准备包含 10 μg/mL 谷胱甘肽捐赠者珠的溶液，以 0.5 倍 PBS、pH 7.4 表示。
注：经过长时间的储存，珠子会稳定下来，需要涡流。 - 将 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 添加到 10 μg/mL 的最终浓度中。
- 在25°C的黑暗中孵育10分钟。
注：在此步骤中，GST 标记的蛋白质将与附着在珠子上的谷胱甘肽相互作用。对于每口井，将使用 22.5 μL 的混合物。约束合作伙伴的集中度必须由经验确定。提提 GST-FKBP51 和 GST-FKBP52，并选择提供最佳信号的浓度。
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复合添加
- 对 DMSO 中的测试化合物进行串行稀释。
注：使用的浓度通常为 10、30、100、300、1，000 和 3，000 μM。 - 在板的每个井的一角添加 0.25 μL 的 DMSO（负控制）或 Hsp90 C 终端肽（正控制，30 μM）或化合物。使用三重酸盐进行每种复合浓度。
- 在每口油井中加入22.5微升含有谷胱甘肽供体珠的溶液，并加入GST标记的蛋白质。
- 用手轻轻摇动盘子，但要彻底。在 25 °C 的黑暗中孵育 15 分钟。
注：在此期间，化合物将在Hsp90 C终端肽结合站点与TPR域相互作用。
- 对 DMSO 中的测试化合物进行串行稀释。
-
接受者珠子添加
- 在 0.5x PBS 中将接收器珠与附加的 Hsp90 C 终端肽稀释至 100 μg/mL。
- 在每口井中加入 2.25 μL 稀释的接受珠。
- 轻轻但彻底地混合。在 25 °C 的黑暗中孵育 15 分钟。
注：在此步骤中，供体和接受珠被蛋白质肽相互作用拉近。反应混合物的最终体积为 25 微升。因此，化合物的最终浓度从0.1到30μM不等。
-
板读取
注：使用相关模式设置的板读取器阅读板。- 打开仪器并打开软件
- 选择相关协议。
- 单击 "编辑板图 "并选择板中使用的井进行测量。
- 单击 "下一步 "继续并 运行 所选协议。
- 测量后，单击 "显示结果 "查看结果。
- 导出数据。
4. 数据分析
-
Z 的因子和信号与背景 （S/B） 比率
- 使用以下方程计算测定中的 Z'因子和 S/B 比率：
Z'1-（3+pos=3=neg）/=μμ-
S/B=μ内格/μpos
其中，σ和μ分别表示正 （Hsp90 C 端肽、30 μM） 和负 （DMSO） 控件的标准偏差和手段。Z'因子> 0.5 将确保检测足够坚固，可以进行筛查。为了监测检测灵敏度，还计算了S/B比率。
- 使用以下方程计算测定中的 Z'因子和 S/B 比率：
-
剂量响应曲线和IC 50
注：使用非线性回归分析，通过软件来适应Hsp90-cochaperonesPPI抑制剂的数据。- 在"欢迎对话"中创建 XY 数据表并选择 X数字，Y Enter 3（如果三重）在并排列中复制值。
- 将样品的信号数据正常化为负对照组。将浓度值导入 X 列，将信号值导入 Y 列。
- 单击 "分析 "并选择"转换|下的转换 浓度 （X）" 正常化。选择 转换到对数。
注：这将将浓度转换为日志刻度。如果您的起始浓度为零，请将其设置为非常小的数字，该数字实际上是零（例如，0.1 nM），不会丢失这些值，因为没有定义零的对数。 - 单击分析并选择XY 分析下的非线性回归（曲线拟合），打开剂量响应抑制并选择日志（抑制剂）与响应 - 可变坡度。
- 单击 "确定" 查看 结果 （包含 IC50 值）和 图形。
图2：本协议的示意图。（A ） GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达和纯化。（B） 将 Hsp90 C 终端肽与接受珠耦合。（C） 调查 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 和 Hsp90 C 终端肽之间的相互作用的检测。用小分子质量化合物抑制。使用 BioRender.com 创建请单击此处查看此图的较大版本。
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Representative Results
在我们的测定中，Z'因子和S/B比率分别为0.82和13.35（图3A），表明我们的测定对于高通量筛选是可靠可靠的。然后，我们用它来筛选小分子质量化合物。 图3B 对伴奏-协茶酮与选定小分子（D10）的相互作用呈现剂量依赖抑制。D10 的剂量响应曲线由非线性回归分析生成，根据该分析计算 IC50 值。D10 显示剂量依赖抑制在 Hsp90 - GST-FKBP51 和 Hsp90 - GST-FKBP52 PPI。但IC50 的值不同：其IC50 代表Hsp90 - GST-FKBP51相互作用为65纳米，而对于Hsp90 - GST-FKBP52相互作用，没有在最高的复合浓度（100 μM）下实现完全抑制，其IC50 估计为>30微米。这些结果提供了证据，证明可以用小分子选择性抑制Hsp90-HKBP51或Hsp90-FKBP52 PPI（FKBP51和FKBP52的TPR域具有60%序列标识和>80%序列相似性），此检测可用于此筛选。
图3：检测分析与结果。（A）Z的因子与信号与背景（S/B）比的此测定。数据表示来自 48 口油井的 （1） 阳性控制 （Hsp90 C 终端肽、30 μM） 和 （+） 负控制 （DMSO） 的信号。Z 值 0.82 和 S/B 比率 13.35 是根据这两个数据群计算得出的。（B） 抑制选择的化合物 （D10） 对 Hsp90 与 FKBP51 （+） 或 FKBP52 （+） 的相互作用在本次测定中。D10 抑制 Hsp90-FKBP51 或 Hsp90-FKBP52 剂量依赖。其IC50是 65 nM 用于 Hsp90-FKBP51 交互，但超过 30 μM 用于 Hsp90-FKBP52 交互。数据已正常化到对照组，并表示为 SEM ±意思。请单击此处查看此图的较大版本。
| 反应组件 | 卷 （μL） |
| PCR 缓冲器 （5 x 浓缩物） | 4 |
| 前进引数 | 1 |
| 反向引向 | 1 |
| 质粒 | 0.5 |
| dNTP 混合 （每个 10 mM） | 0.5 |
| 磷离子DNA聚合酶 | 0.5 |
| 水（DNA等级） | 12.5 |
| 总 | 20 |
表1：为人类FKBP51和FKBP52DNA扩增而设置的PCR反应。
| 阶段 | 温度 （°C） | 时间 | 周期 |
| 初始变性 | 94 | 3 分钟 | 1 |
| 变性 | 94 | 30 秒 | 35 |
| 退火 | 56 | 30 秒 | |
| 外延 | 72 | 1 分钟 | |
| 最终扩展 | 72 | 5 分钟 | 1 |
| 注意：盖子温度为 105 °C。 |
表2：人类FKBP51和FKBP52DNA扩增的热细胞条件。
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Discussion
在这里，我们描述了一个协议，使用检测筛选小分子抑制Hsp90和TPR-motif共同伴奏之间的相互作用，特别是FKBP51和FKBP52。其高 Z 分数（>0.8）显示了高通量格式的坚固性和可靠性。结果可以在一小时内获得，需要少量的珠子、蛋白质和化合物。此外，此协议可以轻松扩展到任何 Hsp90/Hsp70 - TPR-主题共同伴奏感兴趣的相互作用。Hsp90 的几个 TPR-motif 共同伴奏与各种人类疾病有牵连，从阿尔茨海默氏症到自身免疫性疾病、癌症等。此处描述的协议为高通量筛选小分子提供了 体外 强健和廉价的检测，以抑制具有高度医学重要性的伴奏-科查佩龙相互作用。
此外，必须评估针对TPR领域和抑制与Hsp90相互作用的药物，不仅评估其对目标的亲和力，还评估其对其他TPR-主题蛋白的选择性。人类基因组编码>20种TPR主题蛋白，这些蛋白质能够与Hsp90C终端肽相互作用。使用谷胱甘肽珠和 GST 标记蛋白进行检测，可以评估药物对多个结合 TPR 合作伙伴的影响。我们的实验室拥有20种人类TPR蛋白的库，其GST标记的形式，可以获得亲和力和选择性配置文件，每个小分子测试。
此前已经表明，Hsp90和TPR共同伴奏之间的PPI是由Hsp90的C终端肽调停的：删除Hsp90 C-总站完全废除了TPR-主题共同伴奏6的约束。我们发现，在使用 Hsp90 C 终端肽的检测中，有效使用的化合物也能够使用谷胱甘肽（未显示数据）在拉下检测中抑制全长 Hsp90 与 GST-FKBP51/52 的相互作用。部分选定的化合物还通过表面质子共振技术显示出与FKBP51的结合亲和力，目前正在研究由共同结晶确定的特定结合点。
我们协议中的关键步骤是增加顺序：我们首先在小分子和TPR目标之间形成一个复合体。如果 FKBP51 和 Hsp90 C 终端肽之间的复合体已经形成，则需要更长的潜伏时间和更高的药物化合物浓度才能打破 PPI。这主要是由于珠子限制分子进入相互作用部位的听觉障碍。
可以将TPR蛋白和Hsp90 C终端肽分别与供体和接受珠子结合，并直接探测PPI。但是，由于影响相互作用动力学的溶液中分子运动减少，因此不建议将两个结合的伙伴共同连接到珠子上。这也增加了由于珠子大小而阻碍听诊的风险。因此，我们选择接受珠，加上Hsp90 C终端肽和谷胱甘肽捐赠者珠，在我们的测定中与GST标记的蛋白质相互作用，其中多个TPR合作伙伴可以评估。
在这种测定中，一些已识别的化合物很可能是假阳性的，因为它们干扰了检测技术，如淬火单氧、淬火光和散射光。假阳性结果也可以通过破坏GST标签与谷胱甘肽捐赠者珠的结合来诱导。当在 Hsp90-FKBP51 和 Hsp90-FKBP52 PPI 上筛选分子以识别选择性抑制剂时，可以避免这些误报结果。还应采用检测PPI的其他方法来验证选定的抑制剂。
我们检测的局限性在于，它不能用于检测细胞溶解物等粗生物样本中的Hsp90和TPR-motif共同伴奏之间的相互作用。在高通量筛选后，需要通过联合免疫沉淀和接近连体测定等其他方法验证Hsp90-TPR-主题共同伴奏PPI上所选化合物的抑制作用。
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Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了瑞典研究理事会（2018-02843）、大脑基金会（Fo 2019-0140）、卡罗林斯卡研究所老年病基金会、冈沃和约瑟夫·阿尼尔斯基金会、马格努斯·伯格瓦尔斯基金会、冈和伯蒂尔·斯托恩斯基金会、托雷·尼尔森医学研究基金会、玛格丽特·阿夫·乌格拉斯基金会和老仆人基金会的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
References
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