Summary
Este protocolo apresenta uma técnica para sondar interações proteína-proteína usando contas doadoras ligadas à glutationa com co-acompanhantes e contas aceitadoras de TPR fundidas gst-fused e contas aceitadoras juntamente com um peptídeo derivado de Hsp90. Usamos essa técnica para rastrear pequenas moléculas para interromper as interações de interação Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 e identificamos inibidores potentes e seletivos de interação Hsp90-FKBP51.
Abstract
O direcionamento da proteína de choque térmico 90 (Hsp90)-cochaperona interações fornece a possibilidade de regular especificamente os processos intracelulares dependentes de Hsp90. O pentapeptídeo meevd conservado no C-terminus de Hsp90 é responsável pela interação com o motivo de repetição de tetratricopeptida (TPR) de co-acompanhantes. FK506-binding protein (FKBP) 51 e FKBP52 são dois co-acompanhantes similares TPR-motivo envolvidos em doenças dependentes de hormônios esteroides com diferentes funções. Portanto, identificar moléculas especificamente bloqueando interações entre Hsp90 e FKBP51 ou FKBP52 fornece um potencial terapêutico promissor para várias doenças humanas. Aqui, descrevemos o protocolo para um ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificado para sondar interações entre Hsp90 e seus co-acompanhantes parceiros FKBP51 e FKBP52. Primeiro, purificamos as proteínas contendo motivos TPR FKBP51 e FKBP52 na forma de glutationa S-transferase (GST) marcada. Usando as contas doadoras ligadas à glutationa com proteínas TPR-motivos fundidas gst e as contas aceitadoras juntamente com um peptídeo terminal de 10-mer C de Hsp90, sondamos interações proteína-proteína em um ambiente homogêneo. Usamos este ensaio para testar pequenas moléculas para interromper as interações de interação Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 e identificamos inibidores potentes e seletivos de interação Hsp90-FKBP51.
Introduction
Acompanhantes moleculares contribuem para a homeostase proteica, incluindo dobramento de proteínas, transporte e degradação. Eles regulam diversos processos celulares e estão ligados a inúmeras doenças como câncer e doenças neurodegenerativas1. A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma das acompanhantes mais importantes cuja função depende de alterações conformais impulsionadas pela hidrólise ATP e vinculantes com proteínas do cliente mediadas por seus acompanhantes2. Apesar de um potencial óbvio do Hsp90 como alvo terapêutico, o ajuste fino de sua função representa um grande desafio. Existem vários inibidores de Hsp90 voltados para a região de ligação ATP n-terminal, que foram avaliados em ensaios clínicos, mas nenhum deles foi aprovado para comercialização3. Devido à falta de um bolso de ligação de ligantes bem definido4,visando a região do terminal C de Hsp90 teve sucesso limitado4. Recentemente, a interrupção das interações de Hsp90-cochaperona por pequenas moléculas tem sido investigada como uma estratégia alternativa5. Direcionar as interações de cochaperona Hsp90 não provocaria resposta geral ao estresse celular e proporcionaria a possibilidade de regular especificamente vários processos intracelulares. O pentapeptida meevd conservado no C-terminus de Hsp90 é responsável pela interação com o motivo de repetição de tetratricopeptida (TPR) dos co-acompanhantes6. Das 736 proteínas contendo motivos TPR anotadas no banco de dados de proteínas humanas, ~20 proteínas diferentes interagem com o Hsp90 através deste peptídeo7. Moléculas competindo por ligação de peptídeos MEEVD interromperiam as interações entre Hsp90 e co-acompanhantes contendo um domínio TPR. O local de ligação de peptídeos tem estrutura terciária semelhante, mas a homologia geral entre diferentes domínios de motivos TPR é relativamente baixa7, proporcionando uma oportunidade de identificar moléculas especificamente capazes de bloquear interações entre Hsp90 e co-acompanhantes particulares do TPR-motivo. Entre esses co-acompanhantes de TPR-motivo, fk506-binding protein (FKBP) 51 e FKBP52 são reguladores de sinalização do receptor hormonal esteroide (SHR) e envolvidos em várias doenças dependentes de hormônios esteroides, incluindo câncer, doenças relacionadas ao estresse, doenças metabólicas e doença de Alzheimer8. Embora as ações FKBP51 e FKBP52 > similaridade de sequência de 80%, suas funções diferem: FKBP52 é um regulador positivo da atividade SHR, enquanto FKBP51 é um regulador negativo na maioria dos casos8. Portanto, identificar moléculas, bloqueando especificamente as interações entre Hsp90 e FKBP51 ou FKBP52, fornece um potencial terapêutico promissor para doenças relacionadas.
Ummplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) foi desenvolvido pela primeira vez em 1994 por Ullman EF et al.9. Agora é amplamente utilizado para detectar diferentes tipos de interações biológicas, como peptídeo10, proteína11,DNA12, RNA13e açúcar14. Nesta técnica, existem dois tipos de contas (diâmetro 200 nm), uma é a conta doadora e a outra é a conta aceitadora. As biomoléculas são imobilizadas sobre essas contas; suas interações biológicas trazem contas doadoras e aceitadoras para a proximidade. A 680 nm, um fotoensibilizador na conta doadora ilumina e converte oxigênio em oxigênio único. Como o oxigênio único tem uma vida curta, ele só pode difundir até 200 nm. Se o cordão aceitor estiver próximo, seu derivado de tiaxieno reage com o oxigênio único gerando quemiluminescência a 370 nm. Esta energia ativa ainda mais fluoroforos no mesmo projeto de conta aceitador para emitir luz em 520-620 nm15. Se as interações biológicas forem interrompidas, a conta aceitadora e o doador não podem chegar à proximidade, resultando na decadência de oxigênio única e no sinal de baixa produção.
Aqui descrevemos um protocolo usando esta técnica para triagem de pequenas moléculas inibindo interações entre co-acompanhantes de Hsp90 e TPR, especialmente FKBP51 e FKBP52. Os 10 peptídeos longos de aminoácidos correspondentes ao Hsp90 extremo C-terminus estão ligados a contas aceitadoras. Co-acompanhantes de TPR com marca GST purificados interagem com contas doadoras ligadas à glutona. Quando a interação entre peptídeos derivados de Hsp90 e co-acompanhantes de TPR-motivos reúne as contas, um sinal amplificado é produzido(Figura 1A). Se as pequenas moléculas rastreadas puderem inibir as interações entre os co-acompanhantes de Hsp90 e TPR-motivo, esse sinal amplificado será diminuído(Figura 1B). Seu IC50 pode ser calculado por medição quantitativa. Este protocolo pode ser estendido a qualquer acompanhante - TPR-motivo co-acompanhante interações de interesse e é de grande importância no desenvolvimento de novas moléculas, bloqueando especificamente a interação entre Hsp90 e FKBP51 ou FKBP52.
Figura 1: O princípio básico deste ensaio. (A) GST-FKBP51 purificado interage com contas doadoras ligadas à glutationa. Os 10 peptídeos longos de aminoácidos correspondentes ao extremo C-terminus de Hsp90 estão ligados a contas aceitadoras. A interação entre peptídeos derivados de Hsp90 e domínio TPR do FKBP51 aproxima o doador e o acceptor beads. A 680 nm, um fotoensibilizador na conta doadora ilumina e converte oxigênio em oxigênio único. A derivada de tiaxieno no projeto de garantia reage com o oxigênio singlet e gera chemiluminescence a 370 nm. Esta energia ativa ainda mais fluoroforos no mesmo projeto de conta aceitador para emitir luz a 520-620 nm. (B) Quando pequenas moléculas inibem as interações entre Hsp90 e FKBP51, o doador e as contas aceitadoras não podem alcançar a proximidade. Em seguida, o oxigênio singlet com decaimentos de curta duração, e nenhum sinal detectável é produzido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
NOTA: Uma visão geral deste protocolo é mostrada na Figura 2.
1. Expressão e purificação de GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 2A)
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Plasmídeo
NOTA: Obtenha clones cDNA para FKBP51 humano (clonagem: 5723416) e para FKBP52 humano (clonagem: 7474554) do consórcio IMAGE.- Amplie o DNA humano FKBP51 por PCR com primers (para a frente; 5'GGATCCATGACTGATGAAGG-3', reverso; 5'-CTCGAGCTATCTCTCTCTCCAC-3') contendo saliências bamhi e xhoi e clone em vetores pGEX6-1 nos locais de restrição BamHI / XhoI.
- Amplie o DNA FKBP52 humano por PCR com primers (para a frente; 5'-GAATTCATGACAGGAGGAGATG-3', reverso; 5'-CTCGAGCTATATTTCTCTCCAC-3') contendo saliências EcoRI e XhoI e clone em locais de restrição de locômica pGEX6-2 na EcoRI / XhoI.
NOTA: Configuração da reação do PCR e condições são mostradas na Tabela 1 e Tabela 2. - Verifique a sequência inserida e transforme os plasmídeos no E. coli quimicamente competente de acordo com o protocolo de fabricação.
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Expressão e purificação de proteínas
- Adicione 25 g de base de caldo de Luria (LB) em 1 L de água destilada para fazer a solução LB. Autoclave-o a 121 °C por 15 min. Após o resfriamento, adicione 50 μg/mL ampicillin.
- Pegue uma colônia de bactérias expressando GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e misture com 500 μL de solução LB em um tubo de 1,5 mL. Vórtice.
- Adicione a mistura de "1.2.2" em 1 L de solução LB no frasco erlenmeyer coberto com uma folha de alumínio. Incubar o frasco de Erlenmeyer no shaker durante a noite a 37 °C.
- Induzir a expressão proteica adicionando 1 mM isopropílico-β-D-thiogalactoside (IPTG) ao frasco de Erlenmeyer e continuar a incubação por mais 2 h.
- Para obter pelotas de célula, centrífuga a 5.000 x g por 15 min. Remova o supernatante.
NOTA: As pelotas celulares podem ser armazenadas a -20 °C. - Resuspend as pelotas de célula em 40 mL de PBS e sonicate 3 x 20 s no gelo. Adicione 1 mM PMSF, 1 mM EDTA e coquetel inibidor de protease (1 comprimido) para prevenir a proteólise.
- Centrifugar a suspensão por 30 min 50.000 x g para remover detritos celulares e aplicar o supernatante na coluna GST-trap de 5 mL.
- Depois de lavar a coluna com 30 mL PBS, elute GST-FKBP51 e GST-FKBP52 com 5 mL de glutathione de 10 mM em PBS.
- Concentre as proteínas na unidade de centrifugação de 15 mL 10.000 MWCO. Para remover glutationa livre, passe concentrados através da coluna PD-10 equilibrada com PBS de 0,5x e concentre-se novamente no dispositivo de centrífuga do filtro.
- Coletar frações que contenham proteínas. Verifique as proteínas em SDS-PAGE e ajuste as concentrações proteicas para 1 mg/mL.
NOTA: O rendimento típico da proteína é de 2-5 mg/L cultura. A proteína pode ser armazenada a -20 °C.
2. Acoplamento do peptídeo terminal Hsp90 C às contas aceitadoras(Figura 2B)
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Preparação de peptídeos Hsp90
- Sintetizar dez peptídeos de aminoácido NH2-EDASRMEEVD-COOH correspondentes aos aminoácidos 714-724 de isoforma beta Hsp90 humano (UniProt ID: P08238) por um serviço de síntese de peptídeos.
- Diluir o peptídeo Hsp90 na concentração de PBS para 1 mg/mL.
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Preparação de contas aceitadoras
- Diluir as contas aceitadoras não conjugadas na concentração pbs para 1 mg/mL e transferir para um tubo de 1,5 mL.
- Realize a lavagem por centrifugação a 16.000 x g por 15 min. Remova cuidadosamente o supernatante.
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Conjugação
- Defina a razão entre contas e peptídeos como 10:1. No tubo de 1,5 mL contendo 1 mg de pelota de contas aceitadora (preparada como descrito acima), adicione 1 mL de PBS (pH 7.4), 0,1 mg de peptídeo diluído, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL de uma solução de 400 mM de cianoboroidride de sódio (NaBH3CN) na água.
ATENÇÃO: NaBH3CN é tóxico; use um capuz de fumaça e luvas. A solução NaBH3CN deve ser preparada recentemente. - Incubar por 24 h a 37 °C com agitação final (10-20 rpm) em um agitador rotativo.
- Defina a razão entre contas e peptídeos como 10:1. No tubo de 1,5 mL contendo 1 mg de pelota de contas aceitadora (preparada como descrito acima), adicione 1 mL de PBS (pH 7.4), 0,1 mg de peptídeo diluído, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL de uma solução de 400 mM de cianoboroidride de sódio (NaBH3CN) na água.
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Saciamento de reação e lavagem de contas
- Adicione 20 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8.0) à reação para bloquear sites não redigidos. Incubar por 1h a 37 °C.
- Centrifugar a 16.000 x g (ou velocidade máxima) por 15 min a 4 °C. Remova o supernatante e resuspenda a pelota de contas em 1 mL de solução Tris-HCl (100 mM, pH 8.0).
- Repita o passo de lavagem três vezes.
- Após a última centrifugação, resuspense as contas a 1 mg/mL em tampão de armazenamento (1 mL de 0,5 × PBS com azida de sódio de 0,01% como conservante). Armazene a solução de contas de aceitação conjugada à luz de 4 °C protegida.
ATENÇÃO: O azida de sódio é tóxico; use um capuz de fumaça e luvas.
3. O ensaio que sonda a interação entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e Hsp90 C-terminal peptídeo, e inibição com pequenos compostos de massa molecular(Figura 2C)
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Proteínas com marca GST interagindo com contas doadoras de glutationa
- Configure as reações em placas de 384 poços.
- Prepare a solução contendo 10 μg/mL das contas doadoras de glutationa em 0,5x PBS, pH 7.4.
NOTA: Após o armazenamento prolongado, as contas se acalmam e precisam ser vórtices. - Adicione GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 a uma concentração final de 10 μg/mL.
- Incubar no escuro a 25 °C por 10 min.
NOTA: Nesta etapa, as proteínas marcadas pelo GST interagirão com glutationa anexada às contas. Para cada poço, serão utilizados 22,5 μL desta mistura. A concentração dos parceiros vinculantes deve ser determinada empiricamente. Titule GST-FKBP51 e GST-FKBP52 e escolha a concentração que dá o melhor sinal.
-
Adição composta
- Faça diluições seriais de compostos de teste no DMSO.
NOTA: As concentrações utilizadas são tipicamente de 10, 30, 100, 300, 1.000 e 3.000 μM. - Adicione 0,25 μL de DMSO (controle negativo) ou peptídeo de terminal C Hsp90 (controle positivo, 30 μM) ou compostos em DMSO até o canto de cada poço da placa. Use triplicados para cada concentração composta.
- Adicione 22,5 μL da solução contendo contas doadoras de glutationa com proteínas marcadas pelo GST em cada poço.
- Agite a placa suavemente com a mão, mas completamente. Incubar no escuro a 25 °C por 15 min.
NOTA: Durante este tempo, os compostos interagirão com o domínio TPR no local de ligação de peptídeos do terminal Hsp90.
- Faça diluições seriais de compostos de teste no DMSO.
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Adição de contas aceitadoras
- Diluir as contas aceitadoras com peptídeo de terminal Hsp90 C anexado a 100 μg/mL em PBS de 0,5x.
- Adicione 2,25 μL de contas aceitadoras diluídas a cada poço.
- Misture suavemente, mas bem. Incubar no escuro a 25 °C por 15 min.
NOTA: Nesta etapa, as contas doador e aceitadora são trazidas para a proximidade pelas interações proteína-peptídeo. O volume final da mistura de reação é de 25 μL. Portanto, as concentrações finais dos compostos variam de 0,1 a 30 μM.
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Leitura de placas
NOTA: Leia a placa usando um conjunto de leitor de placas no modo relevante.- Ligue o instrumento e abra o software
- Escolha o protocolo relevante.
- Clique em Editar mapa da placa e selecione o bem que está sendo usado na placa para medição.
- Clique em Seguir para continuar e Execute o protocolo selecionado.
- Após a medição, clique em Mostrar resultados para ver os resultados.
- Exportar os dados.
4. Análise de dados
-
Fator Z e relação sinal-fundo (S/B)
- Calcule o fator Z e a razão S/B para o ensaio usando a seguinte equação:
Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
S/B=μneg/μpos
onde, σ e μ representam os desvios padrão e meios dos controles positivo (peptídeo terminal Hsp90 C, 30 μM) e negativo (DMSO), respectivamente. Um fator Z > 0,5 garantirá que o ensaio seja robusto o suficiente para a triagem. Para monitorar a sensibilidade do ensaio, a razão S/B também foi calculada.
- Calcule o fator Z e a razão S/B para o ensaio usando a seguinte equação:
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Curva dose-resposta e IC 50
NOTA: Use a análise de regressão não linear para se adequar aos dados dos inibidores do PPI Hsp90-cochaperonas por software.- Crie uma tabela de dados XY na caixa de diálogo Bem-vindo e selecione X Numberse Y Enter 3 (se triplicados) replica valores em colunas lado a lado.
- Normalize os dados de sinal das amostras para o grupo de controle negativo. Valores de concentração de importação para a coluna X e os valores do sinal para a coluna Y.
- Clique em Analisar e escolha Transformar concentração (X) em Transformar | Normalize. Escolha transformar em logaritmos.
NOTA: Isso transformará a concentração em uma escala de registro. Se a sua concentração inicial for zero, defina-a para um número muito pequeno que é efetivamente zero (por exemplo, 0,1 nM) para não perder esses valores, uma vez que o logaritmo de zero não está definido. - Clique em Analisar e escolha regressão não linear (ajuste de curva) em análises XY,abra a Inibição dose-resposta e escolha Log(inibidor) vs. resposta -- Inclinação variável.
- Clique em OK para ver os Resultados (contendo valor ic50) e gráficos.
Figura 2: Esquema deste protocolo. (A) Expressão e purificação de GST-FKBP51 e GST-FKBP52. (B) Acoplamento do peptídeo terminal Hsp90 C para as contas aceitadoras. (C) O ensaio que sonda a interação entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 e Hsp90 C-terminal peptídeo. Inibição com pequenos compostos de massa molecular. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Em nosso ensaio, o fator Z e a razão S/B são 0,82 e 13,35, respectivamente(Figura 3A),demonstrando que nosso ensaio é robusto e confiável para triagem de alto rendimento. Então usamos para rastrear pequenos compostos moleculares de massa. A Figura 3B apresenta inibição dependente de dose de interações acompanhante-cochaperona com uma pequena molécula selecionada (D10). As curvas de dose-resposta para D10 são geradas pela análise de regressão não linear, com base na qual os valores de IC50 são calculados. D10 mostra inibição dependente de dose tanto em Hsp90 - GST-FKBP51 e Hsp90 - GST-FKBP52 PPIs. Mas os valores do IC50 são diferentes: suas interações IC50 para Hsp90 - GST-FKBP51 é de 65 nM, enquanto, para as interações Hsp90 - GST-FKBP52, a inibição completa não foi alcançada com a maior concentração composta (100 μM), sua IC50 é estimada em > 30 μM. Esses resultados fornecem evidências de que a inibição seletiva de PPIs Hsp90-HKBP51 ou Hsp90-FKBP52 com pequenas moléculas pode ser alcançada (domínios TPR de FKBP51 e FKBP52 têm 60% de sequência de identidade e > 80% de similaridade de sequência), e este ensaio pode ser aplicado para esta triagem.
Figura 3: Análise e resultados de ensaio. (A) Z' fator e razão sinal-para-fundo (S/B) deste ensaio. Os dados representam sinais de controle positivo (○) peptídeo terminal C (Hsp90 C-terminal peptídeo, 30 μM) e (●) controle negativo (DMSO) de 48 poços. Foram calculados um valor Z de 0,82 e uma razão S/B de 13,35 dessas duas populações de dados. (B) A inibição do composto selecionado (D10) nas interações de Hsp90 com FKBP51 (●) ou FKBP52 (○) neste ensaio. D10 inibe a dose de Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 com dependência. Seu IC50 é de 65 nM para interação Hsp90-FKBP51, mas acima de 30 μM para interação Hsp90-FKBP52. Os dados são normalizados para o grupo controle e expressos como meios ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente de reação | Volume (μL) |
| Tampão PCR (5 x concentrado) | 4 |
| Primer para a frente | 1 |
| Primer reverso | 1 |
| Plasmídeo | 0.5 |
| mistura dNTP (10 mM cada) | 0.5 |
| Polimerase de DNA de phusion | 0.5 |
| Água (grau de DNA) | 12.5 |
| Total | 20 |
Tabela 1: Reação do PCR configurada para amplificação humana de DNA FKBP51 e FKBP52.
| Palco | Temperatura (°C) | Hora | Ciclos |
| Desnaturação inicial | 94 | 3 min. | 1 |
| Desnaturação | 94 | 30 segundos | 35 |
| Recozimento | 56 | 30 segundos | |
| Extensão | 72 | 1 min. | |
| Extensão final | 72 | 5 min. | 1 |
| Nota: A temperatura da tampa é de 105 °C. |
Tabela 2: Condições do termocidor para amplificação humana do DNA FKBP51 e FKBP52.
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Discussion
Aqui descrevemos um protocolo usando o ensaio para triagem de pequenas moléculas inibindo interações entre co-acompanhantes de Hsp90 e TPR-motivo, especialmente FKBP51 e FKBP52. Sua pontuação Z alta (>0,8) demonstra a robustez e confiabilidade para um formato de alto rendimento. Os resultados podem ser obtidos dentro de uma hora, e pequenas quantidades de contas, proteínas e compostos são necessárias. Além disso, este protocolo poderia facilmente ser estendido a qualquer interação de interesse de Hsp90/Hsp70 - TPR-motivos. Vários co-acompanhantes do TPR-motivo do Hsp90 foram implicados em várias doenças humanas que vão desde a doença de Alzheimer até doenças autoimunes, câncer, etc. O protocolo descrito aqui fornece um ensaio in vitro robusto e barato para a triagem de alto rendimento de pequenas moléculas inibindo interações acompanhante-cochaperone de alta importância médica.
Além disso, os medicamentos direcionados aos domínios de TPR e inibidores da interação com o Hsp90 devem ser avaliados não apenas por sua afinidade com o alvo, mas também por sua seletividade em relação a outras proteínas tpr-motivo. O genoma humano codifica > 20 proteínas de motivo TPR capazes de interagir com o peptídeo terminal Hsp90 C. Este ensaio usando contas de glutationa e proteínas marcadas pelo GST permite a avaliação do efeito da droga em múltiplos parceiros TPR de ligação. Nosso laboratório possui uma biblioteca de 20 proteínas TPR humanas em sua forma marcada pelo GST e pode obter perfis de afinidade e seletividade para cada pequena molécula testada.
Foi demonstrado anteriormente que o PPI entre os co-acompanhantes do Hsp90 e do TPR é mediado pelo peptídeo terminal C de Hsp90; a exclusão do Hsp90 C-terminus aboli completamente a vinculação dos co-acompanhantes tpr-motivo6. Descobrimos que compostos eficientes em nosso ensaio onde o peptídeo do terminal Hsp90 C foi usado também foram capazes de inibir a interação de Hsp90 de comprimento completo com GST-FKBP51/52 em um ensaio puxado para baixo usando contas de sepharose glutathione (dados não mostrados). Alguns dos compostos selecionados também mostram a afinidade vinculante com o FKBP51 pela tecnologia de ressonância de plasmon de superfície, e seus locais específicos de ligação determinados pela co-cristalização estão atualmente sob investigação.
Um passo crítico em nosso protocolo é a ordem de adição; primeiro formamos um complexo entre uma pequena molécula e seu alvo TPR. Se já foram formados complexos entre o peptídeo terminal FKBP51 e Hsp90 C, são necessários tempos de incubação mais longos e maiores concentrações de compostos medicamentosos para quebrar os PPIs. Isso se deve principalmente ao obstáculo estérico de contas que limitam o acesso de moléculas ao local de interação.
É possível acoplar covalentemente proteínas TPR e peptídeos terminais Hsp90 para doadores e contas aceitadoras, respectivamente, e sondar diretamente PPIs. No entanto, não é recomendável anexar covalentemente ambos os parceiros de ligação às contas devido ao movimento reduzido de moléculas na solução que afeta a cinética das interações. Isso também aumenta o risco de obstáculos estéricos devido ao tamanho das contas. Portanto, escolhemos contas aceitadoras aliadas a peptídeos e contas doadoras de glúteo Hsp90 C que estão interagindo com proteínas marcadas pelo GST em nosso ensaio, onde vários parceiros de TPR podem ser avaliados.
Neste ensaio, é provável que alguns compostos identificados possam ser falso-positivos devido à sua interferência com a tecnologia de ensaio, como saciar oxigênio singlet, saciar a luz e espalhar luz. Resultados falso-positivos também podem ser induzidos interrompendo a ligação da tag GST com contas doadoras de glutationa. Esses resultados falso-positivos podem ser evitados ao triagem de moléculas tanto em PPIs Hsp90-FKBP51 quanto Hsp90-FKBP52 para identificar inibidores seletivos. Outros métodos que detectam PPIs também devem ser aplicados para verificar os inibidores selecionados.
A limitação do nosso ensaio é que ele não pode ser usado para detectar a interação entre co-acompanhantes de Hsp90 e TPR-motivo em amostras biológicas brutas, como lises celulares. Após a triagem de alto rendimento, as inibições de compostos selecionados em Hsp90 - TPR-motivo co-acompanhantes PPI em amostras biológicas precisam ser verificadas por outros métodos, como co-imunoprecipitação e ensaio de ligadura de proximidade.
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Disclosures
Os autores não relatam conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subsídios do Conselho Sueco de Pesquisa (2018-02843), Fundação Brain (Fo 2019-0140), Fundação para Doenças Geriátricas do Instituto Karolinska, Fundação Gunvor e Josef Anérs, Fundação Magnus Bergvalls, Fundação Gun e Bertil Stohnes, Fundação Tore Nilssons para pesquisa médica, Fundação Margaret Afha Ugglas e Fundação
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
References
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