Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

الاختبار السريع لمقاومة الأخشاب للتحلل البيولوجي من قبل القشريات البحرية المملة الخشب

Published: January 29, 2022 doi: 10.3791/62776
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1University of Portsmouth, 2Microbiology Department, University of Massachusetts

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتقييم معدل تغذية القشريات المملة بالخشب، ليموريا، من خلال قياس إنتاج الكريات البرازية. وقد صممت هذه الطريقة للاستخدام في مختبرات غير متخصصة، ولها إمكانية دمجها في بروتوكولات الاختبار القياسية، لتقييم متانة الخشب المعززة في ظل الظروف البحرية.

Abstract

اللافقاريات المملة بالخشب تدمر بسرعة الأخشاب البحرية والبنية التحتية الساحلية الخشبية، مما يسبب مليارات الدولارات من الأضرار في جميع أنحاء العالم كل عام. وبما أن علاجات الخشب ذات المبيدات الحيوية واسعة الطيف، مثل الكريوسوت ومؤخرات النحاس الكرومات، مقيدة الآن في الاستخدام البحري بموجب التشريع، فإن الأنواع الخشبية المعمرة بشكل طبيعي وطرق الحفظ الجديدة للخشب مطلوبة. وتخضع هذه الأساليب للاختبار من أجل الوفاء بالمعايير التنظيمية، مثل المعيار الأوروبي لاختبار المواد الحافظة للأخشاب ضد البور البحري، EN 275. ويمكن إجراء التحقيقات الأولية في أنواع الأخشاب المعمرة أو علاجات حافظة للأخشاب بسرعة وبتكلفة زهيدة من خلال الاختبارات المختبرية، التي توفر مزايا كثيرة على التجارب الميدانية البحرية التي عادة ما تكون مكلفة، والمساعي الطويلة الأجل. العديد من أنواع ليموريا (غريبل) هي القشريات البحرية الخشبية مملة. تعتبر ليموريا مثالية للاستخدام في الاختبارات المختبرية للتحلل البيولوجي للخشب بواسطة الأخشاب البحرية ، نظرا لعدم التطبيق العملي لمربيتها في الدلو وسهولة قياس معدلات تغذيتها على الخشب. وفي هذه الخانة، نحدد الخطوط العريضة لاختبار مختبري موحد لتقييم التحلل البيولوجي للأخشاب باستخدام الجرب.

Introduction

ويمكن أن تسبب الأخشاب أضرارا كبيرة للهياكل الخشبية البحرية، مثل الدفاعات البحرية والأرصفة وهياكل الاستزراع المائي؛ استبدال أو استعادة التي تكلف مليارات الدولارات سنويا في جميع أنحاء العالم1،2،3. ومن أجل حماية هذه الهياكل، غالبا ما تعالج الأخشاب للحد من التحلل البيولوجي. ومع ذلك، وبسبب تقييد استخدام المبيدات الحيوية واسعة الطيف في أستراليا والاتحاد الأوروبي والمملكة المتحدة والولايات المتحدة الأمريكية، في البيئة البحرية، يتم البحث عن تقنيات تعديل جديدة وأنواع من الخشب التي هي دائمة بشكل طبيعي للبورات بعد 4،5،6،7. وتتطلب التقنيات الجديدة لحفظ الخشب في البيئة البحرية إجراء اختبار شامل من أجل الوفاء بالمعايير التنظيمية والحد من الآثار البيئية الناجمة عن المخاطر مثل ترشيح أي مادة حافظة كيميائية. فعلى سبيل المثال، يستخدم المعيار الأوروبي EN 275، وهو المعيار الأوروبي الحالي منذ عام 1992، لتقييم علاجات الحفاظ على الخشب ضد أضرار الأخشاب البحرية 8،9. ويستلزم هذا المعيار، إلى جانب تشريعات أخرى ضد استخدام مركبات الإبادة البيولوجية، مثل CCA4,5,6,7 و creosote10، أساليب مستدامة وغير سامة لحماية الأخشاب واستخدام أنواع خشبية دائمة بشكل طبيعي لتحل محل علاجات الإبادة البيولوجية11,12 . وتتطلب التجارب البحرية، مثل تلك المحددة في EN 275، فترات تعرض طويلة، وبالتالي فهي مكلفة وبطيئة في تحقيق نتائج ذات مغزى. غير أن الاختبارات المختبرية توفر بديلا أسرع بكثير لاختبار أساليب الحفاظ على منتجات الأخشاب ضد هجوم الأخشاب البحرية، مما يسمح بإجراء تقييم سريع للتعديلات على جداول المعالجة(13). وقد صممت نتائج هذه التجربة المختبرية السريعة لإبلاغ عمليات تعديل جديدة للأخشاب وتحديد أنواع الأخشاب ذات المتانة الطبيعية لتلف البورر. يمكن أن يشير انخفاض معدل التغذية والحيوية إلى زيادة المقاومة في المنتجات المحتملة ويمكن بعد ذلك تغذية هذه المعلومات مرة أخرى إلى شركاء الصناعة للسماح لهم بتحسين التصاميم. تسمح طريقتنا باستجابة ذكية وسريعة ، وهذا أمر مرغوب فيه في الصناعة ، وبمجرد تحديد المنتجات الواعدة ، يمكن استكمال النتائج بالنتائج من التجارب البحرية.

Gribbles (Limnoria) هي جنس من القشريات isopod في Limnoriidae الأسرة. هناك أكثر من 60 نوعا من ليموريا في جميع أنحاء العالم13,14,15، مع ثلاثة أنواع شائعة موجودة في المملكة المتحدة، ليمنيوريا ليغنروم، ليمنيوريا تريبونكتاتا وليمنيوريا quadripunctata16. وكانت تحمل أنفاقا على سطح الخشب غارقة في مياه البحر، مما يتسبب في كثير من الأحيان في أضرار كبيرة من الناحية الاقتصادية. الغريبل وفيرة للغاية في المياه الساحلية في المملكة المتحدة وسهلة الصيانة في ظل ظروف المختبر، مما يجعلها كائنات مثالية لدراسة التحلل البيولوجي الخشب عن طريق اللافقاريات البحرية مملة الخشب. ويمكن لتقييم معدلات التغذية وحيوية الشجيرات على مختلف أنواع الأخشاب وأساليب الحفاظ على الخشب أن يحدد فعالية مقاومتها للتحلل البيولوجي. يحدد البروتوكول التالي طريقة قياسية لقياس معدلات التغذية بالنسب، تم تطويرها من تلك التي وصفها بورخيس وزملاؤه12,17، بالإضافة إلى تبسيط إدخال تحليل الصور لجعل العملية قابلة للتشغيل في مختبرات غير متخصصة. كما يستخدم تحليل الصور للحد من القيود العملية للعد اليدوي لعدد كبير من العينات. المتانة في الاختبارات البحرية على المدى الطويل، وفقا لمعيار EN350-1:1994 البريطانية، يتم تصنيفها في إشارة إلى بينوس سيلفستريس sapwood18. في الاختبار المختبري على المدى القصير المعروضة هنا، ونحن نستخدم الصنوبر الاسكتلندي (بينوس سيلفستريس L) sapwood كتحكم لاختبار خشب القلب من الأنواع إيكي (لوفيرا ألاتا بانكس السابق C.F Gaertn)، الزان (فاغوس سيلفاتيكا L)، الكستناء الحلو (كاستانيا ساتيفا ميل) والتربنتين (Syncarpia glomulifera (Sm.) نيد). واستخدم متوسط إنتاج وحيوية الكريات البرازية بين ثماني نسخ متماثلة لكل نوع من أنواع الخشب كمؤشر على المتانة. نحن نقدم بيانات توضيحية تم جمعها من تقييم نموذجي ، وذلك باستخدام الأنواع limnoria quadripunctata ومجموعة من أنواع الأخشاب دائمة بشكل طبيعي. تم اختيار Limnoria quadripunctata ، التي حددتها المفاتيح التي قدمها Menzies (1951) ، كنوع مثالي لتجارب التحلل الحيوي نظرا لأنه أكثر أفراد الأسرة دراسة جيدا وهو راسخ كنوع نموذجي لاستخدامه في تجارب التحلل الحيوي. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على اختبار الغابة من العلاجات المختلفة على الرغم من أن التحكم المستخدم يجب أن يكون تكرارات غير معالجة لنفس النوع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد اختبار العصي

  1. بعد اكتمال أي عمليات علاج، قطع الخشب الجاف إلى اختبار العصي إلى حجم 2 مم × 4 ملم × 20 ملم (الشكل 1). الهواء الجاف العصي إلى وزن ثابت، في ظل ظروف المختبر. استخدام ما لا يقل عن 5 نسخ متماثلة من كل الخشب يجري اختبارها.

Figure 1
الشكل 1: اختبار العصي المستخدمة في الاختبارات المختبرية قصيرة الأجل لتقييم معدلات التغذية الجرب.  اختبار العصي الخشب الحجم 2 مم × 4 ملم × 20 ملم. من اليسار إلى اليمين: إيكي، التربنتين، الكستناء الحلو والزان خشب القلب والاسكتلنديين الصنوبر sapwood. شريط مقياس 4 ملم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تفريغ الفراغ
    1. إعداد الخشب آخر (أي، وقطع والعلاج، إذا كان ذلك ممكنا)، ووضع العصي تحت شبكة في وعاء من البلاستيك آمنة للأغذية، داخل مجفف فراغ واستبدال الغطاء ضمان وجود ختم ضيق، التي يسهلها طلاء الشحوم فراغ (الشكل 2).
    2. قم بإرفاق صمام ثلاثي بين الأنابيب التي تربط المجفف والمضخة، مع أنبوب ثالث يؤدي إلى الهواء الطلق (الشكل 2). تأكد من أن صمام ثلاثية مغلقة قبالة للهواء وتشغيل المضخة لتحقيق فراغ بين -0.75 إلى -1.0 شريط داخل فراغ المجفف وعقد هذا الفراغ لمدة 45 دقيقة - 1 ساعة.
    3. غمر الطرف المفتوح من الأنبوب الثالث في حاوية من مياه البحر. قم بإيقاف تشغيل المضخة وإغلاق الصمام المؤدي إلى المضخة، ثم افتح الصمام ببطء حتى يتم سحب مياه البحر بواسطة الفراغ إلى المجفف. السماح للماء بالتدفق حتى يملأ الحاوية البلاستيكية، فوق مستوى الشبكة.
    4. ثم سحب الأنبوب من مياه البحر في الحاوية، مما يسمح للهواء بالدخول، حتى يعود المجفف إلى الضغط الجوي. إبقاء العصي مغمورة تحت شبكة حتى تغرق إلى الجزء السفلي من الحاوية البلاستيكية.

Figure 2
الشكل 2: المعدات المستخدمة لتفريغ العصي الخشبية الملقحة بمياه البحر، استعدادا للتغذية إلى الفقاعات أثناء فحص التغذية المختبرية.  أ) فراغ المجفف؛ ب) مضخة؛ ج) مقياس الضغط لمجفف فراغ؛ د) صمام ثلاثية تؤدي إلى فراغ المجفف، مضخة والهواء الطلق أو مياه البحر (أنبوب برتقالي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. الرشح الخشب
    1. غمر العصي اختبار المشبعة بمياه البحر في مياه البحر الواردة في أنابيب 50 مل (الشكل 3). استبدال المياه بانتظام لمدة 20 يوما.
      ملاحظة: تنطبق عملية الرشح على أي خشب تجريبي قيد الاختبار، بما في ذلك الغابات المعالجة أو الطبيعية.

Figure 3
الشكل 3: الرشح من العصي الخشبية لإعداد التغذية إلى الشجيرات خلال فحص التغذية المختبرية.  الخشب الذي كان مغمورا بالكامل في مياه البحر الواردة في أنبوب فالكون 50 مل، مع تغيير المياه العادية (1-3 أيام)، أنتجت رشح الملونة بشكل واضح. من اليسار إلى اليمين رشح من خشب القلب من; الكستناء الحلو، التربنتين، إيكي، والزان والاسكتلنديين الصنوبر sapwood. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. استخراج غريبل

  1. استخراج عينات فردية من الجريبل من كتلة الخشب الموبوءة. استخدام زوج من ملقط غرامة ورقيقة (حجم 000/0.4 ملم أو أصغر) فرشاة الرسم. قشر بعناية مرة أخرى أي الخشب الذي يغطي جحر جريبل مع ملقط
    ملاحظة: توجد الجحور على سطح الخشب ويمكن التعرف عليها بواسطة ثقوب صغيرة (الشكل 4).
  2. مرة واحدة وقد تعرضت gribble، واستخدام فرشاة لالتقاط بلطف الأفراد من تحت وإيداع في طبق بتري مليئة بمياه البحر. تحقق من الجريبل تحت المجهر لتحديد الأنواع وضمان عدم حدوث أي ضرر أثناء الاستخراج.
    ملاحظة: الضرب pleopods هي علامة على الحيوية.
    1. تجاهل أي الإناث المكتئب البيض والإناث gravid لديها قدرة التغذية أقل.

Figure 4
الشكل 4: صورة جحر جريبل مع اثنين من فتحات التهوية النموذجية. ل. جحر رباعي الثقوب على عصا من خشب الصنوبر Radiata، بحجم 2 مم × 4 مم × 20 ملم. ويمكن رؤية اثنين من فتحات التهوية أصغر بجوار مدخل الجحر. شريط مقياس 2 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.  

  1. تحديد ليمنيوريا رباعية ال وربونكتاتا
    1. تحديد Limnoria quadripunctata تحت مجسمة من قبل الدرنات الأربعة متميزة، مرتبة في نمط مربع، على pleotelson الحيوان بالإضافة إلى كارينا على شكل X على pleonite19 الخامس (الشكل 5).

Figure 5
الشكل 5: Limnoria رباعية البونكتاتا تحديد السمات.  صورة للسطح الظهري Limnoria quadripunctata، التي اتخذت على منظار ستيريوميكروميسكوب في التكبير x20. تحديد الميزات التي تظهر بواسطة السهم الأحمر - يشير إلى كارينا على شكل حرف X والسهم الأزرق - يشير إلى أربعة درنات على pleotelson. شريط مقياس 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إعداد لوحات الآبار

  1. في لوحات متعددة الآبار مع آبار قطرها 20 ملم، ضع عصا اختبار واحدة و 5 مل من مياه البحر غير المصفاة، بين 32-35 وحدة دعم المشاريع، لكل بئر (الشكل 6).
  2. وضع العلاجات / أنواع الخشب بشكل منهجي في جميع أنحاء لوحة البئر بحيث يتم تمثيل كل نوع من الخشب مرة واحدة على الأقل لكل لوحة. إضافة جريبل واحد لكل بئر.
    ملاحظة: يجب أن تبقى درجة الحرارة مستقرة في حاضنة عند 20 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية للأنواع L. يمكن استخدام quadripunctata ، أنواع أخرى من ليمنيوريا مع تعديلات على درجة الحرارة التي تناسب الأنواع المحددة.
  3. احتفظ بالألواح في ظروف مظلمة ثابتة لأن الضوابير الضوئية ليس لها تأثير على معدل التغذية الجريبل15.

Figure 6
الشكل 6: إعداد تجريبي لإجراء فحص تغذية التجريب.  مثال على 12 لوحة متعددة الآبار المستخدمة في الاختبار المختبري لمعدل التغذية الجريبل. ويحتوي كل بئر على 5 مل من مياه البحر وعصا اختبار واحدة (20 مم × 4 مم × 2 مم) من أنواع خشبية مختلفة؛ الاسكتلنديون باين سابوود وإيكي، الزان، الكستناء الحلو، والربنتين خشب القلب. شريط مقياس 20 ملم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. جمع وعد الكريات البراز وتقييم الحيوية.

  1. مرتين في الأسبوع، وإزالة عصا الاختبار وكل جريبل (واحد لكل بئر) من لوحة البئر ووضعها في لوحة بئر أعدت مسبقا حديثا (تحتوي على 5 مل من مياه البحر لكل بئر [32-35 وحدة دعم النظام البيئي، 18-22 درجة مئوية]).
  2. استخدام فرشاة الطلاء لفرشاة بلطف قبالة أي الكريات البراز من العصا قبل نقل والاحتفاظ الكريات البراز داخل البئر الأصلي.
    ملاحظة: قبل نقل النبل إلى طبق بئر طازج، يمكن تقييم الحيوية على مقياس من 1-5. 1 = ميت، 2 = سلبي، وليس على الخشب، 3 = السباحة بنشاط أو الضرب pleopods، وليس على الخشب، 4 = الزحف على سطح الخشب، 5 = محفورة في الخشب.
  3. معالجة الصور
    1. استخدام فرشاة الطلاء غرامة لفصل أي كتل بحيث الكريات الفردية مرئية وفرشاة الكريات بعيدا عن حواف البئر. التقط صورة تفصيلية تحت مجهر ستيريو، عند تكبير x4 وتحميلها على جهاز كمبيوتر (الشكل 7).
      ملاحظة: تأكد من أن الكريات في بؤرة التركيز والخلفية موحدة، مع عدم وجود ظلال أو انعكاسات ضوئية على سطح الماء.

Figure 7
الشكل 7: صورة الكريات البرازية. ل. الكريات البرازية رباعية الربوكتاتا (حبيبات صغيرة أسطوانية وبنية) من التغذية على خشب الصنوبر Radiata في بئر واحد من لوحة متعددة الآبار. اتخذت في التكبير x4. الصور قبل التلاعب لتحليل الصور (انظر الشكل 7). أ) مثال على صورة مناسبة لاستخدامها في العد الآلي في ImageJ. الكريات تنتشر بما فيه الكفاية وبعيدا عن حواف البئر. يتمركز البئر ولا توجد عوائق أو انعكاسات. ب) مثال على صورة غير مناسبة لتحليل الصور. البئر خارج المركز، يقطع النصف السفلي. تظهر الدائرة الزرقاء (المنقطة) انعكاس الضوء قبالة سطح الماء. البرتقالي (الصلبة) دائرة يظهر الكريات التي تتجمع بشكل وثيق جدا معا وقريبة جدا من حافة البئر. دائرة حمراء (متقطعة) يظهر رقاقة الخشب التي لم تتم إزالتها. شريط مقياس 10 ملم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.  

  1. عملية لتوليد عدد بيليه البراز باستخدام ImageJ.
    1. تحميل ImageJ (أحدث إصدار اعتبارا من 03/08/21، 1.8.0_172) من https://imagej.nih.gov/ij/download.html أو تشغيل من متصفح الكمبيوتر.
    2. تحميل مجموعة من الصور عن طريق سحب وإسقاط أو عن طريق تحديد ملف | استيراد | | تسلسل الصور تصفح. لا تقم بتغيير أية معلمات ثم حدد موافق.
    3. بعد ذلك ، استخدم أداة الدائرة لتحديد القسم السفلي من البئر الذي يحتوي على الكريات البرازية. إزالة حواف البئر، حدد تحرير | واضحة في الخارج. جعل الصورة ثنائية، حدد عملية | جعل ثنائي.
    4. معايرة عن طريق تحديد تحليل | تعيين مقياس واختيار عدد وحدات البكسل لكل ملليمتر للصورة (على سبيل المثال 10 بكسل = 1 مم). عد الكريات، حدد تحليل | تحليل الجسيمات.
    5. في المربع المجاور للحجم (unit2)، حدد عتبة أقل هي نفسها أصغر بيليه حجم، وذلك باستخدام مقياس الوحدة الذي تم تعيينه سابقا (على سبيل المثال، إذا كان 10 بكسل = 1 مم وأصغر بيليه هو 0.5 مم، اختر 5-infinity).
    6. في المربع إظهار المنسدلة، حدد المخططات التفصيلية ثم حدد ملخص واضغط على موافق (الشكل 8).
      ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من المعلومات في https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html

Figure 8

Figure 8.1
الشكل 8: رسم تخطيطي لتدفق العملية المستخدمة في ImageJ لحساب الكريات البرازية.  أ) استيراد تسلسل صورة في علامة التبويب ملف ImageJ. ب) زر الاستعراض في مربع الحوار "استيراد تسلسل الصور" لاستيراد سلسلة من الصور من جهاز محلي. ج) باستخدام أداة دائرة لتحديد المنطقة التي تحتوي على الكريات البراز D) مسح خارج زر في منطقة التبويب تحرير لإزالة خارج منطقة مختارة. E) جعل زر ثنائي في علامة التبويب عملية. F) تعيين زر مقياس في علامة التبويب تحليل. المسافة بالبكسل تعادل عدد وحدات البكسل لوحدة قياس واحدة (مم). G) زر تحليل الجسيمات في علامة التبويب تحليل. الحجم (الوحدة^2) المعين إلى العتبة السفلية لحجم الكريات البرازية، بالبكسل، إلى ما لا نهاية. يتم تحديد إظهار "المخططات التفصيلية" و"التلخيص". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تحليل البيانات
    1. تحويل عدد الكريات إلى الكريات يوميا، والذي يعطي وقياس غير مباشر لمعدل التغذية. تجاهل البيانات من أي أفراد moulting في الأيام التي وقعت moulting (الشكل 9).
      ملاحظة: يحدث Moulting على مدى 1-3 أيام ويمكن التعرف عليه عندما يمكن رؤية مولت كامل من الهيكل الخارجي.

Figure 9
الشكل 9: مثال على المولت الزجري.  Gribble (L. quadripunctata) moulting، على عصا اختبار خشب الصنوبر Radiata الحجم 20 ملم × 4 ملم × 2 ملم. ويشار إلى مولتس من قبل الدوائر الحمراء. شريط مقياس 2 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تجربة تغذية L. أجريت quadripunctata على مدى 20 يوما، وذلك باستخدام خمسة أنواع مختلفة من الخشب (الاسكتلنديين الصنوبر (بينوس سيلفستريس L) sapwood، وخشب القلب من الزان (فاغوس سيلفاتيكا L)، إيكي (لوفيرا ألاتا بانكس السابق C. F Gaertn)، الكستناء الحلو (كاستانيا ساتيفا ميل)، والتربنتين (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (انظر جدول المواد)، في نوفمبر 2020. واستخدمت ثمانية العصي تكرار لكل أنواع الخشب وعينة واحدة من Limnoria quadripunctata تم تغذية كل عصا. تم الحصول على جميع الجريبل من المخزونات التي يتم الاحتفاظ بها في الدلو في معهد علوم البحار، جامعة بورتسموث، المملكة المتحدة. وتستكمل المخزونات بانتظام مع مجموعات البرية من الساحل الجنوبي لانكلترا. الحيوانات متأقلمة بشكل جيد مع ظروف الثقافة المستقرة والمتسقة قبل التجربة. تم ترشيح العصي الخشبية (20 مم × 4 مم × 2 مم) في مياه البحر لمدة أسبوعين قبل تجربة التغذية. ووضعت جريبلة واحدة وعصا اختبار واحدة و5 مل من مياه البحر لكل بئر في صفيحة متعددة الآبار 12 وأبقى في حاضنة في ظروف مستقرة تبلغ 20 درجة مئوية (± 0.2 درجة مئوية) وفي ظروف مظلمة مستمرة. تم عد الكريات البرازية وجمعها كل يومين إلى 5 أيام ، مع تغييرات المياه الكاملة في كل مجموعة. واستخدمت ثماني نسخ متماثلة من كل نوع من أنواع الخشب، مما أعطى ما مجموعه أربعين عصيا مع جريبل فردي واحد لكل منها. تم الحصول على مياه البحر المستخدمة في رشح الخشب واستخدامها طوال التجربة مباشرة من الحوض المستخدم في إعادة العينات. ظروف مياه البحر مستقرة في الحوض ومستقرة في الحاضنة. يتم تقليل التبخر من الحجم الصغير للمياه المستخدمة في البئر الواحد من خلال تصميم غطاء لوحات الآبار وتغيرات المياه الكاملة التي تحدث كل يومين إلى 5 أيام.

تم عد الكريات تلقائيا باستخدام الصورة J (الإصدار 1.8.0_112).

Gribble تغذية على خشب الصنوبر الاسكتلندي sapwood كعنصر تحكم، أنتجت الكريات معظم البراز يوميا باستمرار، وبصرف النظر عن في اليوم 20 حيث تم تجاوز إنتاج بيليه من قبل الزان. أنتجت إيكي أقل الكريات البرازية في اليوم من جميع أنواع الخشب التي تم اختبارها. وشوهد ثاني أعلى إنتاج بيليه البراز على الزان، تليها الكستناء الحلو والتربنتين. وكانت هناك زيادة في إنتاج الكريات البرازية في جميع الأنواع من اليوم الخامس إلى اليوم السابع. انخفض إنتاج بيليه في جميع الأنواع، بخلاف إيكي، بين اليوم 7 واليوم 12، ربما بسبب زيادة الوقت بين تغيرات المياه. بعد ذلك، بقي إنتاج الكريات البراز متسقة إلى حد ما بين كل من أنواع الخشب. ومنذ اليوم الرابع عشر، انخفض إنتاج الصنوبر الاسكتلندي يوميا من البراز، في حين زاد الزان (الشكل 10).

Figure 10
الشكل 10: عدد الكريات البرازية يوميا (n=40) (متوسط ± SE) التي تنتجها L. quadripunctata باستخدام أنواع خشبية مختلفة، على مدى 20 يوما. تم اختبار التربنتين والكستناء الحلو والزان وأكي خشب القلب، مع استخدام خشب الصنوبر الاسكتلندي كعنصر تحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وشوهدت أعلى حيوية من درجة (5) في معظم الأفراد الذين يتغذون على خشب الصنوبر الاسكتلندي، بخلاف الفرد الميت واحد. 5 يشير إلى الحيوانات التي حفرت في الخشب وهذا شوهد فقط على خشب الصنوبر الاسكتلندي وخشب القلب الزان. بحلول اليوم 12 لالاسكتلنديين الصنوبر واليوم 20 لالزان، وكان جميع الأفراد الأحياء قد حفرت في الخشب. وكان الكستناء الحلو أعلى معدل وفيات في المئة ولكن لم زيادة مع مرور الوقت. بقي بقية الأفراد الأحياء في حيوية من 4 (الزحف على سطح الخشب)، وبصرف النظر عن في اليوم 14 حيث كان شخصان قبالة الخشب (حيوية 3). وكان إيكي والتربنتين أيضا غالبية الأفراد في حيوية من 4 على مدى مدة التجربة، وبصرف النظر عن في اليوم 14 واليوم 5 لتوربنتين. ولم تظهر الوفيات زيادة بمرور الوقت في أي من أنواع الخشب. ولم ينظر إلا إلى التجشؤ على زيادة الصنوبر والزان الاسكتلنديين في حين ظلت الأنواع الخشبية الثلاثة الأخرى في الغالب في حيوية 4 (الشكل 11).

Figure 11
الشكل 11: حيوية الأفراد مع مرور الوقت، كنسبة مئوية من التكرارات، تتغذى على أنواع مختلفة من الخشب.  تم اختبار التربنتين والكستناء الحلو والزان وأكي خشب القلب، مع استخدام خشب الصنوبر الاسكتلندي كعنصر تحكم. ومن بين ثماني نسخ متماثلة لكل نوع من أنواع الخشب، تم رسم النسبة المئوية في مختلف التخصصات الحيوية على مدى الفترة التجريبية التي استغرقت 20 يوما. الأزرق الداكن يمثل حيوية 5 (التجشؤ)، والأزرق الفاتح حيوية 4 (على الخشب)، رمادي حيوية 3 (قبالة الخشب ولكن نشطة)، الأرجواني حيوية 2 (قبالة الخشب والسلبي) والأسود يظهر حيوية من 1 أو الأفراد القتلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويمكن استخدام نتائج طريقة الاختبار هذه لتحديد أنواع الخشب أو العلاجات التي لها مقاومة متزايدة للتلف البحري بالخشب البور. ثم، يمكن إجراء التجارب الميدانية البحرية، كما هو موضح في المعيار الأوروبي EN 275، ويمكن تصنيف المتانة (0 = "لا هجوم"، 1 = "هجوم طفيف"، 2= "هجوم معتدل"، 3= "هجوم شديد"، 4='failure'20) بالإضافة إلى مقارنة مع خشب التحكم غير الدائم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

قبل اختيار عينات الجربعة لاستخدامها في تجربة التغذية ، يجب فحص الأفراد لتقييم مدى ملاءمتها. يمكن أن يكون هناك بعض الاختلاف في معدل التغذية بين الأفراد بسبب الاختلافات في الحجم ، لذلك يجب اختيار عينات البالغين الكاملة النمو فقط. لم يتم الكشف عن أي فرق كبير بين معدل تغذية الأفراد بين 1.5 مم و 3 مم من قبل بورخيس وآخرون، 200917. الإناث Limnoria حضن بيضها، وخلال هذه الفترة لديها انخفاض معدل التغذية. لذلك ، يجب فحص أي أنثى مكتئبة والتخلص منها أثناء اختيار العينات. وبالمثل، فإن الأفراد المغسولين سيحصلون أيضا على معدل تغذية مخفض21. لذلك ، يجب التخلص من بيليه البراز في الأيام التي يكون فيها الأفراد مضرطين17. كما يحدث moulting لأكثر من يوم واحد، يتم احتساب moults عندما يمكن رؤية moult هيكل خارجي كامل في أيام جمع بيليه. Limnoria، عند إنشاء جحورهم، لديها زيادة إنتاج بيليه البراز، وسوف تنتج أيضا المزيد من frass (النفايات الخشبية الجميلة التي لم يتم دمجها في الكريات البراز). يمكن أن تتداخل المستويات العالية من الفريسة مع تحديد الكريات البرازية ولكن يمكن إزالتها بعناية تحت مراقبة المنظار المجسم ، باستخدام ماصة أو فرشاة طلاء دقيقة ، قبل التقاط الصورة للعد التلقائي. بدلا من ذلك، يمكن عد الكريات يدويا.

يتطلب برنامج ImageJ صورا عالية الجودة في التركيز لمعالجة الصور. وتحقيقا لهذه الغاية، ينبغي التقاط صور لا تعوق فيها جدران البئر الكريات البرازية، وينبغي استخدام فرشاة طلاء لفصل الكريات البرازية الفردية. يجب أن تكون خلفية الصورة موحدة بدون مناطق الضوء أو الظل ، والتي تتداخل عندما يتم تحويل الصورة إلى ثنائي للمعالجة في ImageJ. ليست هناك حاجة لضبط التباين أو الضوء قبل معالجة الصور. عند استيراد كومة من الصور، يجب التقاط جميع الصور الفوتوغرافية في نفس المستوى حتى لا تحدث أي أخطاء أثناء المعالجة.

فراغ تلقيح الخشب بمياه البحر يسبب الخشب تغرق وتصبح متاحة بسهولة إلى الجريبل. إن الرشح الخشبي قبل تعريضه للغريبلات يزيل أي مستخلصات قابلة للذوبان في الماء قد تؤثر على معدل تغذيتها أو تسبب الوفيات12. ولا تمثل الوفيات الناجمة عن الاستخراج في المياه معدل الوفيات المتوقع في البحر، حيث ستصبح الاستخراجات مخففة بسرعة. وينبغي الاحتفاظ لوحات الآبار في درجة حرارة ثابتة وهذا هو الأمثل لأنواع الجربل التي يجري اختبارها. الأنواع البريطانية الجنوبية المشتركة، L. رباعية الابتكار، يغذي جيدا بين 15 و 25 درجة مئوية، ولها معدل التغذية المثلى في 20 °C17 حتى لوحات جيدا يمكن أن تبقى مريح في حاضنة في ثابت 20 °C ± 0.5 درجة مئوية.

تقييم حيوية جريبل التغذية يكشف الآثار شبه المميتة أو قبل المميتة من العلاجات الخشبية أو الأخشاب دائم بشكل طبيعي. حيوية عالية من 5 يشير إلى أن الجريبل يدل على السلوك الطبيعي عن طريق التجشؤ في الخشب ويعاني من أي تأثير سلبي من الاتصال معها. تظهر حيوية 4 أنه في حين لا يكون قد حفر في الخشب ، فإن الجريبل لا يزال مريحا للزحف على طول سطحه. درجة 3 تعطى لجريبل التي ليست على الخشب، ولكن بدلا من ذلك السباحة بنشاط في الماء أو ثابتة ولكن مع ضرب الساقين بسرعة وpleopods. انخفاض حيوية 2 يعني أن يتعرض الجريبل و / أو لديه القليل من الطاقة. وقد يحدث ذلك من فترة طويلة من انخفاض معدل التغذية أو من المواد الاستخراجية إما الرشح في الماء أو تصبح متاحة أثناء التغذية. إذا كان ينظر إلى ارتفاع معدل الوفيات بعد 7-8 أسابيع، وهذا قد يكون بسبب المجاعة، كما gribbles يتضورون جوعا (أبقى في الآبار مع 5 مل فقط من مياه البحر وعدم وجود الخشب) يمكن البقاء على قيد الحياة لهذه المدة الطويلة (المراقبة الشخصية).

وفوائد استخدام المقايسة المختبرية القصيرة الأجل بدلا من التجارب الميدانية البحرية الطويلة الأجل هي أنه يمكن اختبار العلاجات الجديدة والمنتجات الخشبية بسرعة لتحديد إمكاناتها لاستخدامها تجاريا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسهل مثل هذه الكواسير التحسين السريع لعمليات العلاج. إذا كان ينظر إلى انخفاض كبير في إنتاج الكريات البراز بالمقارنة مع الخشب التحكم، ثم يمكن استكمال الاختبار من خلال التجارب البحرية. Slevin et al., 201523 وWestin et al., 201624 تظهر وجود علاقة جيدة بين التقييمات المختبرية والميدانية من خلال اختبار نفس الخشب في سياقين مختلفين, مما يدل على قدرة التنبؤ قادرة من الأول. يمكن إجراء فحص قصير الأجل لعدة أسابيع. يمكن أن تعيش الشجيرات الجائعة لمدة 7-8 أسابيع عندما تبقى في مياه مهضة بشكل جيد دون خشب (ملاحظة شخصية) والتي قد توفر مقارنة إضافية إذا تم التحقيق في استجابة الوفيات لأنواع مختلفة من الغابات. ومع ذلك، من خلال الملاحظات الأخيرة غير المنشورة، لا يوجد أي تقلب كبير في إنتاج الكريات البرازية على مدى فترة زمنية أطول من 20 يوما، بخلاف الوقت الذي يبدأ فيه حدوث الوفيات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الأساليب السابقة، مثل تلك التي استخدمها بورخيس وآخرون، 2008 و 2009، تستمر لمدة 15 يوما. لذلك، 20 يوما هو الوقت الكافي لاختبار سريع على أساس المختبر لتوفير مؤشر على متانة الخشب.

وفي حين أن هذه الطريقة مناسبة للتجارب القصيرة الأجل، ينبغي استكمال النتائج بتجارب ميدانية بحرية طويلة الأجل. ولا يمكن للظروف المختبرية أن تكرر تنوع العوامل الأحيائية والأحيائية التي قد تؤثر على الخشب في البيئة البحرية. وقد تظل الكائنات الحية التي تتحلل بيولوجيا، إلى جانب أنواع أخرى من الأخشاب البحرية (مثل ديدان السفن) موجودة وتسبب أضرارا للأخشاب 25,26. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يرتدي التآكل من القوباء المنطقية أو الرمل الذي يتم قذفه بالموجة الخشب لأسفل ، والذي قد يصبح متاحا بعد ذلك ل gribbles27. ومع ذلك، يمكن لطريقة مختبرية قياسية أن توفر فحصا أوليا للمنتجات الجديدة التي تبشر بالتطبيقات البحرية. من خلال تقييم إنتاج بيليه البراز والحيوية، يمكن تحديد الغابات التي هي أفضل في الحد من معدل التغذية النهم.

بسبب اللوائح والقيود المفروضة على المواد الحافظة للخشب ، مثل CCA والكريوسوت ، من المهم العثور على منتجات جديدة لتحل محل هذه العلاجات. ويخضع الأخشاب لمستويات عالية من التحلل البيولوجي في البيئة البحرية، ولكنها لا تزال واحدة من أكثر مواد البناء المتاحة قدرة على التجدد وتحتفظ بقوتها وهيكلها بشكل جيد في مياه البحر27,28. ولن تؤدي الأخشاب المقاومة للتحلل البيولوجي إلى خفض التكاليف فحسب، بل ستكون أيضا أكثر ملاءمة للبيئة من استخدام مواد بديلة مثل الخرسانة أو الصلب، التي تتطلب مدخلات عالية من الطاقة أثناء التصنيع 30 29، أو مواد حافظة واسعة الطيف للسيدات الحيوية التي قد تتسرب وتؤثر على النظام الإيكولوجي المحيط بها 31,32,33,34,35,36، 37- ال 37- الانتعاش في التسعينات

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه الدراسة.

Acknowledgments

شكرا لمجلس البحوث النرويجي (صندوق أوسلو الإقليمي، 269707 الكوفوفجور) وجامعة بورتسموث (منحة أبحاث دكتوراه كلية العلوم) لتوفير التمويل لدراسات لوسي مارتن. أيضا، لجيرفيه س. سوير الذي قدم الخشب المستخدمة لتوليد النتائج التمثيلية. تم توفير توربنتين من قبل البروفيسور فيليب إيفانز من جامعة كولومبيا البريطانية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well cell culture plates ThermoFisher Scientific 150200
50ml Falcon tubes Fisher Scientific 14-432-22
Adjustable volume pipette Fisher Scientific FBE10000 1-10 ml
Beech G. Sawyer (consultant in timber technology) Fagus sylvatica Taxonomic authority: L
Ekki G. Sawyer (consultant in timber technology) Lophira alata Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn.
Forceps Fisher Scientific 10098140
Incubator LMS LTD INC5009
Microporous specimen capsules Electron Microscopy Sciences 70187-20
Petri dish Fisher Scientific FB0875713
Scots Pine G. Sawyer (consultant in timber technology) Pinus sylvestris Taxonomic authority: L.
Size 00000 paintbrush Hobby Craft 5674331001 Size 000 or 0000 also acceptable
Sweet Chestnut G. Sawyer (consultant in timber technology) Castanea sativa Taxonomic authority: Mill
Turpentine P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) Syncarpia glomulifera Taxonomic authority: (Sm.) Nied.
Vacuum desiccator Fisher Scientific 15544635

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morrell, J. J. Protection of wood-based materials. Handbook of environmental degradation of materials, 3rd ed. Kutz, M. , Elsevier Science and Technology Books. Oxford. 343-368 (2018).
  2. Distel, D. L. The biology of marine wood boring bivalves and their bacterial endosymbionts. Wood deterioration and preservation. Goodell, B., Nicholas, D., Schultz, T. , American Chemical Society. Washington, D.C. 253-271 (2003).
  3. Buslov, V., Scola, P. Inspection and structural evaluation of timber pier: case study. Journal of Structural Engineering. 117 (9), 2725-2741 (1991).
  4. US EPA. Registration Eligibility Decision for Chromated Arsenicals. List A, Case No. 0132. US EPA - Office of prevention, pesticides and toxic substances. , Available from: https://swap.stanford.edu/20110202084/http://www.epa.gov/oppsrrd1/reregistration/REDs/cca_red.pdf 800-807 (2008).
  5. Arsenic timber treatments (CCA and arsenic trioxide) review scope document, Review series 03.1. ISSN number 1443. Australian pesticides and veterinary medicines authority. , Available from: https://apvma.gov.au/sites/default/files/publication/14296-arsenic-timber-review-scope.pdf (2003).
  6. Commission directive 2003/2/EC of 6 January 2003 relating to restrictions on the marketing and use of arsenic (tenth adaptation to technical progress to Council Deretive 76/769/EEC). Official Journal of the European Communities. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2003/2/adopted (2003).
  7. The Hazardous Waste (England and Wales) Regulations 2005 No.894. Environmental Protection England and Wales. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/uksi/2005/894/contents/made (2005).
  8. Palanti, S., Cragg, S. M., Plarre, R. Resistance against marine borers: About the revision of EN 275 and the attempt for a new laboratory standard for Limnoria. International Research Group on Wood Preservation, Document No. IRG/WP 20-20669. , (2020).
  9. The European Commission for Standardization. EN 275:1992. Wood preservatives- Determination of the protective effectiveness against marine wood borers. The European Commission for Standardization (CEN). , (1992).
  10. European Commission. Directive 98/8/EC concerning the placing of biocidal products on the market. Communication and Information Resource Centre for Administrations, Businesses and Citizens. , (2010).
  11. Mantanis, G. I. Chemical modification of wood by acetylation or furfurylation: A review of the present scaled-up technologies. BioResources. 12 (2), 4478-4489 (2017).
  12. Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Bergot, J., Williams, J. R., Shayler, B., Sawyer, G. S. Laboratory screening of tropical hardwoods for natural resistance to the marine borer Limnoria quadripunctata: The role of leachable and non-leachable factors. Holzforschung. 62 (1), 99-111 (2008).
  13. Cragg, S. M., Pitman, A., Henderson, S. Developments in the understanding of the biology of marine wood boring crustaceans and in methods of controlling them. International Biodeterioration & Biodegradation. 43 (4), 197-205 (1999).
  14. Cookson, L. J., Vic, M. D. C. Additions to the taxonomy of the Limnoriidae. Memoirs of the Museum of Victoria. 56 (1), 129-143 (1997).
  15. Cookson, L. Australasian species of Limnoriidae (Crustacea: Isopoda). Memoirs of the Museum of Victoria. 52 (2), 137 (1991).
  16. Jones, L. T. The geographical and vertical distribution of British Limnoria [Crustacea: Isopoda]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 43 (3), 589-603 (1963).
  17. Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Busch, S. A laboratory assay for measuring feeding and mortality of the marine wood borer Limnoria under forced feeding conditions: A basis for a standard test method. International Biodeterioration & Biodegradation. 63 (3), 289-296 (2009).
  18. BSI Standards Publication. BS EN 350:2016. Durability of wood and wood-based products - Testing and classification of the durability to biological agents of wood and wood-based materials. BSI Standards Publication. , (2016).
  19. Menzies, R. The phylogeny, systematics, distribution, and natural history of limnoria. , University of Southern California. Dosctoal dissertation 196-208 (1951).
  20. Palanti, S., Feci, E., Anichini, M. Comparison between four tropical wood species for their resistance to marine borers (Teredo spp and Limnoria spp) in the Strait of Messina. International Biodeterioration & Biodegradation. 104, 472-476 (2015).
  21. Delgery, C. C., Cragg, S. M., Busch, S., Morgan, E. Effects of the epibiotic heterotrich ciliate Mirofolliculina limnoriae and moulting on the faecal pellet production by the wood-boring isopods Limnoria tripunctata and Limnoria quadripunctata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 334 (2), 165-173 (2006).
  22. Morrell, J. J., Helsing, G. G., Graham, R. D. Marine wood maintenance manual: a guide for proper use of Douglas-fir in marine exposures. Forest Research Laboratory. , Oregon State University. Corvallis. Research Bulletin 48 (1984).
  23. Slevin, C. R., Westin, M., Lande, S., Cragg, S. Laboratory and marine trials of resistance of furfurylated wood to marine borers. Eighth European Conference on Wood Modification. , Aalto University. 464-471 (2015).
  24. Westin, M., et al. Marine borer resistance of acetylated and furfurylated wood - results from up to 16 years of field exposure. International Research Group on Wood Preservation. , Document No. IRG/WP 16-40756 (2016).
  25. Westin, M., Rapp, A., Field Nilsson, T. Field test of resistance of modified wood to marine borers. Wood Material Science and Engineering. 1 (1), 34-38 (2006).
  26. Borges, L. M. S. Biodegradation of wood exposed in the marine environment: Evaluation of the hazard posed by marine wood-borers in fifteen European sites. International Biodeterioration & Biodegradation. 96 (1), 97-104 (2014).
  27. Treu, A., et al. Durability and protection of timber structures in marine environments in Europe: An overview. BioResources. 14 (4), 10161-10184 (2019).
  28. Williams, J. R., Sawyer, G. S., Cragg, S. M., Simm, J. A questionnaire survey to establish the perceptions of UK specifiers concerning the key material attributes of timber for use in marine and freshwater engineering. Journal of the Institute of Wood Science. 17 (1), 41-50 (2005).
  29. Purnell, P. The carbon footprint of reinforced concrete. Advances in Cement Research. 25 (6), 362-368 (2013).
  30. Hill, C. A. S. The environmental consequences concerning the use of timber in the built environment. Frontiers in Built Environment. 5, 129 (2019).
  31. Mercer, T. G., Frostick, L. E. Leaching characteristics of CCA-treated wood waste: a UK study. Science of the Total Environment. 427, 165-174 (2012).
  32. Brown, C. J., Eaton, R. A., Thorp, C. H. Effects of chromated copper arsenate (CCA) wood preservative on early fouling community formation. Marine Pollution Bulletin. 42 (11), 1103-1113 (2001).
  33. Brown, C. J., Eaton, R. A. Toxicity of chromated copper arsenate (CCA)-treated wood to non-target marine fouling communities in Langstone Harbour, Portsmouth, UK. Marine Pollution Bulletin. 42 (4), 310-318 (2001).
  34. Brown, C. J., Albuquerque, R. M., Cragg, S. M., Eaton, R. A. Effects of CCA (copper-chrome-arsenic) preservative treatment of wood on the settlement and recruitment of wood of barnacles and tube building polychaete worms. Biofouling. 15 (1-3), 151-164 (2000).
  35. Lebow, S. T., Foster, D. O., Lebow, P. K. Release of copper, chromium and arsenic from treated southern pine exposed in seawater and freshwater. Forest Products Journal. 49 (7), 80-89 (1999).
  36. Smith, P. T. Risk to human health and estuarine posed by pulling out creosote-treated timber on oyster farms. Aquatic Toxicology. 86 (2), 287-298 (2008).
  37. Brown, C. J., et al. Assessment of Effects of Chromated Copper Arsenate (CCA)-Treated Timber on Nontarget Epibiota by Investigation of Fouling Community Development at Seven European Sites. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45 (1), 0037-0047 (2003).

Tags

العلوم البيئية، العدد 179، ليموريا، الجريبل، الكريات البرازية، معدل التغذية، الحفاظ على الخشب، EN275، التحلل البيولوجي البحري
الاختبار السريع لمقاومة الأخشاب للتحلل البيولوجي من قبل القشريات البحرية المملة الخشب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, L. S., Shipway, J. R.,… More

Martin, L. S., Shipway, J. R., Martin, M. A., Malyon, G. P., Akter, M., Cragg, S. M. Rapid Testing of Resistance of Timber to Biodegradation by Marine Wood-Boring Crustaceans. J. Vis. Exp. (179), e62776, doi:10.3791/62776 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter