Summary
Este protocolo presenta un método para evaluar la tasa de alimentación del crustáceo perforador de madera, Limnoria, mediante la medición de la producción de pellets fecales. Este método está diseñado para su uso en laboratorios no especializados y tiene potencial para su incorporación en protocolos de prueba estándar, para evaluar la durabilidad mejorada de la madera en condiciones marinas.
Abstract
Los invertebrados perforadores de madera destruyen rápidamente las maderas marinas y la infraestructura costera de madera, causando miles de millones de dólares en daños en todo el mundo cada año. Como los tratamientos de la madera con biocidas de amplio espectro, como la creosota y el arseniato de cobre cromado (CCA), ahora están restringidos en el uso marino por la legislación, se requieren especies de madera naturalmente duraderas y nuevos métodos de preservación de la madera. Estos métodos se someten a pruebas para cumplir con las normas reglamentarias, como la norma europea para probar conservantes de madera contra barrenadores marinos, EN 275. La investigación inicial de especies de maderas duraderas o tratamientos conservantes de madera se puede lograr de manera rápida y económica a través de pruebas de laboratorio, lo que ofrece muchas ventajas sobre los ensayos de campo marinos que suelen ser costosos y a largo plazo. Muchas especies de Limnoria (gribble) son crustáceos perforadores de madera marina. Limnoria son ideales para su uso en pruebas de laboratorio de biodegradación de madera por barrenadores de madera marinos, debido a la practicidad de criarlos en acuarios y la facilidad de medir sus tasas de alimentación en madera. A continuación, describimos una prueba de laboratorio estandarizable para evaluar la biodegradación de la madera utilizando gribble.
Introduction
Los barrenadores de la madera pueden causar daños extensos a las estructuras marinas de madera, como las defensas marinas, los muelles y las estructuras acuícolas; cuyo reemplazo o restauración cuesta miles de millones de dólares anuales en todo el mundo1,2,3. Con el fin de proteger estas estructuras, la madera a menudo se trata para reducir la biodegradación. Sin embargo, debido a la restricción del uso de biocidas de amplio espectro en Australia, la UE, el Reino Unido y los Estados Unidos, en el medio marino, se buscan nuevas técnicas de modificación y especies de madera que sean naturalmente duraderas para los barrenadores4,5,6,7. Las nuevas técnicas para la preservación de la madera en el medio marino requieren pruebas exhaustivas para cumplir con las normas reglamentarias y limitar los impactos ambientales de peligros como la lixiviación de cualquier conservante químico. Por ejemplo, la norma europea, EN 275, que es la norma europea actual de 1992, se utiliza para evaluar los tratamientos de conservación de la madera contra el daño del barrenador de la madera marina8,9. Esta norma, junto con otras legislaciones contra el uso de compuestos biocidas, como CCA4,5,6,7 y creosota10, requiere métodos sostenibles y no tóxicos de protección de la madera y el uso de especies de madera naturalmente duraderas para reemplazar los tratamientos biocidas11,12 . Los ensayos marinos, como los especificados en la norma EN 275, requieren largos períodos de exposición y, por lo tanto, son costosos y lentos para producir resultados significativos. Las pruebas de laboratorio, sin embargo, proporcionan una alternativa mucho más rápida a los métodos de prueba para preservar los productos de madera contra el ataque del barrenador de la madera marina, lo que permite una evaluación rápida de los ajustes a los programas de tratamiento13. Los resultados de este rápido experimento de laboratorio están diseñados para informar nuevos procesos de modificación de la madera e identificar especies de madera con durabilidad natural para el daño del barrenador. Una baja tasa de alimentación y vitalidad puede indicar una mayor resistencia en los productos potenciales y esta información se puede devolver a los socios de la industria para permitirles mejorar los diseños. Nuestro método permite una respuesta ágil y rápida, que es deseable en la industria, y una vez que se han identificado productos prometedores, los resultados se pueden complementar con los de los ensayos marinos.
Limnoria es un género de crustáceos isópodos de la familia Limnoriidae. Hay más de 60 especies de Limnoria en todo el mundo13,14,15, con tres especies comunes que se encuentran en el Reino Unido, Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata y Limnoria quadripunctata16. Perforaron túneles en la superficie de la madera que está sumergida en el agua de mar, a menudo causando daños económicamente significativos. Los gribbles son muy abundantes en las aguas costeras del Reino Unido y son fáciles de mantener en condiciones de laboratorio, lo que los convierte en organismos ideales para el estudio de la biodegradación de la madera por invertebrados perforadores de madera marina. La evaluación de las tasas de alimentación y la vitalidad de las planchas en diferentes especies de madera y los métodos de preservación de la madera pueden determinar la eficacia de su resistencia a la biodegradación. El siguiente protocolo establece un método estándar para medir las tasas de alimentación de gribble, desarrollado a partir del descrito por Borges y colegas12,17, además de agilizar la introducción del análisis de imágenes para que el proceso sea operable en laboratorios no especializados. El análisis de imágenes también se utiliza para reducir las limitaciones prácticas de contar manualmente un gran número de muestras. La durabilidad en las pruebas marinas a largo plazo, de acuerdo con la norma británica EN350-1:1994, se clasifica en referencia a la albura Pinus sylvestris18. En las pruebas de laboratorio a corto plazo presentadas aquí, utilizamos albura de pino silvestre (Pinus sylvestris L) como control para probar el duramen de las especies ekki (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), haya (Fagus sylvatica L), castaño dulce (Castanea sativa Mill) y trementina (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied). La producción promedio de pellets fecales y la vitalidad entre ocho réplicas por especie de madera se utilizó como indicador de durabilidad. Proporcionamos datos ilustrativos recopilados de una evaluación típica, utilizando la especie gribble Limnoria quadripunctata y una gama de especies de madera naturalmente duraderas. Limnoria quadripunctata, identificada por las claves proporcionadas por Menzies (1951), fue seleccionada como la especie óptima para los ensayos de biodegradación debido al hecho de que es el miembro más estudiado de la familia y está bien establecido como una especie modelo para su uso en ensayos de biodegradación. Este protocolo también es aplicable para ensayar maderas de diferentes tratamientos aunque el control utilizado debe ser replicaciones no tratadas de la misma especie.
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Protocol
1. Preparación de palos de prueba
- Una vez completados los procesos de tratamiento, corte la madera seca en varillas de prueba de 2 mm x 4 mm x 20 mm (Figura 1). El secado al aire se adhiere a un peso constante, en condiciones de laboratorio. Use al menos 5 réplicas de cada madera que se esté probando.
Figura 1: Varillas de prueba utilizadas en pruebas de laboratorio a corto plazo para evaluar las tasas de alimentación con gribble. Varillas de madera de prueba de tamaño 2 mm x 4 mm x 20 mm. De izquierda a derecha: ekki, trementina, castaña dulce y duramen de haya y albura de pino silvestre. Barra de escala de 4 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Impregnación al vacío
- Después de la preparación de la madera (es decir, corte y tratamiento, si corresponde), coloque los palitos debajo de una malla en un recipiente de plástico seguro para los alimentos, dentro del desecador al vacío y reemplace la tapa para garantizar que haya un sello hermético, facilitado por un recubrimiento de grasa al vacío (Figura 2).
- Conecte una válvula de tres vías entre el tubo que conecta el desecador y la bomba, con un tercer tubo que conduce al aire libre (Figura 2). Asegúrese de que la válvula de tres vías esté cerrada al aire y haga funcionar la bomba para lograr un vacío de entre -0.75 a -1.0 bar dentro del desecador de vacío y mantenga este vacío durante 45 minutos - 1 hora.
- Sumerja el extremo abierto del tercer tubo en un recipiente de agua de mar. Apague la bomba y cierre la válvula que conduce a la bomba, luego abra lentamente la válvula hasta que el vacío extraiga el agua de mar hacia el desecador. Deje que el agua fluya hasta que llene el recipiente de plástico, por encima del nivel de la malla.
- Luego retire el tubo del agua de mar en el recipiente, permitiendo que entre aire, hasta que el desecador regrese a la presión atmosférica. Mantenga los palos sumergidos debajo de la malla hasta que se hundan en el fondo del recipiente de plástico.
Figura 2: Equipo utilizado para impregnar al vacío palos de madera con agua de mar, en preparación para la alimentación a gribbles durante un ensayo de alimentación de laboratorio. A) Desecador de vacío; B) Bomba; C) Manómetro para el desecador de vacío; D) La válvula de tres vías que conduce al desecador de vacío, a la bomba y al aire libre o al agua de mar (tubo naranja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Lixiviación de madera
- Sumergir las varillas de ensayo saturadas de agua de mar en agua de mar contenida en tubos de 50 ml (Figura 3). Reemplace el agua regularmente durante un período de 20 días.
NOTA: El proceso de lixiviación se aplica a cualquier madera experimental bajo prueba, incluidas las maderas tratadas o naturales.
- Sumergir las varillas de ensayo saturadas de agua de mar en agua de mar contenida en tubos de 50 ml (Figura 3). Reemplace el agua regularmente durante un período de 20 días.
Figura 3: Lixiviado de palos de madera para la preparación para la alimentación a gribbles durante un ensayo de alimentación de laboratorio. La madera que estaba completamente sumergida en agua de mar contenida en un tubo Falcon de 50 ml, con cambio regular de agua (1-3 días), producía lixiviados de colores distintos. De izquierda a derecha lixiviado de duramen de; castaña dulce, trementina, ekki, y albura de haya y pino silvestre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Extracción de Gribble
- Extraiga especímenes individuales de gribble de un bloque de madera infestado. Use un par de pinzas finas y un pincel delgado (tamaño 000/0.4 mm o menor). Pelar con cuidado cualquier madera que esté cubriendo la madriguera gribble con las pinzas
NOTA: Las madrigueras se encuentran en la superficie de la madera y se pueden identificar por pequeños agujeros (Figura 4). - Una vez que la plancha haya sido expuesta, use un pincel para recoger suavemente a las personas de debajo y depositarlas en una placa de Petri llena de agua de mar. Verifique el gribble bajo un microscopio para identificar especies y asegurarse de que no se causaron daños durante la extracción.
NOTA: Vencer a los pleópodos es un signo de vitalidad.- Descarte cualquier hembra que cría huevos ya que las hembras grávidas tienen una capacidad de alimentación reducida.
Figura 4: Imagen de una madriguera de gribble con dos orificios de ventilación típicos. L. madripunctata quadripunctata sobre un palo de madera de pino Radiata, de tamaño 2 mm x 4 mm x 20 mm. Dos agujeros de ventilación más pequeños se pueden ver junto a la entrada de la madriguera. Barra de escala de 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Identificación de Limnoria quadripunctata
- Identificar Limnoria quadripunctata bajo un estereomicroscopio por los cuatro tubérculos distintos, dispuestos en un patrón cuadrado, en el pleotelson del animal, además de una carina en forma de X en el quinto pleonito19 (Figura 5).
Figura 5: Características identificativas de Limnoria quadripunctata . Imagen de la superficie dorsal Limnoria quadripunctata, tomada en un estereomicroscopio a un aumento x20. Las características de identificación mostradas por la flecha roja - indica la carina en forma de X y la flecha azul - indica cuatro tubérculos en pleotelson. Barra de escala de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Preparación de placas de pozo
- En placas de pozos múltiples con pozos de diámetro 20 mm, coloque una varilla de prueba y 5 ml de agua de mar sin filtrar, entre 32-35 PSU, por pozo (Figura 6).
- Coloque tratamientos/especies de madera sistemáticamente en toda la placa del pozo para que cada tipo de madera esté representada al menos una vez por placa. Agregue un gribble por pozo.
NOTA: La temperatura debe mantenerse estable en una incubadora a 20 °C ± 2 °C para la especie L. quadripunctata, otras especies de Limnoria se pueden utilizar con ajustes a la temperatura realizados para adaptarse a la especie específica. - Mantenga las placas en condiciones de oscuridad constantes, ya que el fotoperíodo no tiene un efecto sobre la velocidad de alimentación del gribble15.
Figura 6: Configuración experimental para el ensayo de alimentación de gribble. Un ejemplo de una placa de 12 pocillos múltiples utilizada en las pruebas de laboratorio de la tasa de alimentación de gribble. Cada pozo contiene 5 ml de agua de mar y una varilla de ensayo (20 mm x 4 mm x 2 mm) de diferentes especies de madera; Albura de pino silvestre y ekki, haya, castaña dulce y duramen de trementina. Barra de escala de 20 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Recolección y conteo de pellets fecales y evaluación de la vitalidad.
- Dos veces por semana, retire la varilla de prueba y cada plancha (una por pozo) de la placa del pozo y colóquela en una placa de pozo recién preparada (que contenga 5 ml de agua de mar por pozo [32-35 PSU, 18-22 ° C]).
- Use un pincel para cepillar suavemente cualquier gránulo fecal del palo antes de transferir y retener los gránulos fecales dentro del pozo original.
NOTA: Antes de transferir el gribble a un plato de pozo fresco, la vitalidad se puede evaluar en una escala de 1 a 5; 1= muerto, 2 = pasivo, no en la madera, 3 = nadar o golpear activamente pleópodos, no en la madera, 4 = gatear en la superficie de la madera, 5 = excavado en la madera. - Tratamiento de imágenes
- Use un pincel fino para separar cualquier grupo para que los gránulos individuales sean visibles y cepille los gránulos lejos de los bordes del pozo. Tome una fotografía detallada bajo un microscopio estereoscópico, con aumento x4 y cárguela en una computadora (Figura 7).
NOTA: Asegúrese de que los gránulos estén enfocados y que el fondo sea uniforme, sin sombras ni reflejos de luz en la superficie del agua.
- Use un pincel fino para separar cualquier grupo para que los gránulos individuales sean visibles y cepille los gránulos lejos de los bordes del pozo. Tome una fotografía detallada bajo un microscopio estereoscópico, con aumento x4 y cárguela en una computadora (Figura 7).
Figura 7: Imagen de pellets fecales gribulables. L. gránulos fecales quadripunctata (gránulos pequeños, cilíndricos y marrones) que se alimentan de madera de pino Radiata en un pozo de una placa de varios pozos. Tomado a aumento x4. Imágenes previas a la manipulación para el análisis de imágenes (ver Figura 7). A) Ejemplo de una imagen adecuada para ser utilizada para el conteo automatizado en ImageJ. Los gránulos están suficientemente extendidos y lejos de los bordes del pozo. El pozo está centrado y no hay obstrucciones ni reflejos. B) Un ejemplo de una imagen que no es adecuada para el análisis de imágenes. El pozo está descentrado, cortando la mitad inferior. El círculo azul (punteado) muestra la reflexión de la luz de la superficie del agua. El círculo naranja (sólido) muestra gránulos que se agrupan demasiado juntos y demasiado cerca del borde del pozo. El círculo rojo (discontinuo) muestra una astilla de madera que no se quitó. Barra de escala de 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Proceso para generar el recuento de pellets fecales utilizando ImageJ.
- Descargue ImageJ (última versión a partir del 03/08/21, 1.8.0_172) desde https://imagej.nih.gov/ij/download.html o ejecute desde el navegador de la computadora.
- Cargue una pila de imágenes arrastrando y soltando o seleccionando Archivo | Importar | Secuencia de | de imágenes Navegar. No cambie ningún parámetro y, a continuación, seleccione Aceptar.
- A continuación, use la herramienta de círculo para seleccionar la sección inferior del pozo que contiene los gránulos fecales. Elimine los bordes del pozo, seleccione Editar | Despejar por fuera. Haga que la imagen sea binaria, seleccione Procesar | Hacer binario.
- Calibrar seleccionando Analizar | Establezca la escala y elija el número de píxeles por milímetro para la imagen (por ejemplo, 10 píxeles = 1 mm). Cuente los pellets, seleccione Analizar | Analizar partículas.
- En el cuadro situado junto a Tamaño (unidad2), seleccione un umbral inferior que sea el mismo que el pellet de tamaño más pequeño, utilizando la escala unitaria establecida anteriormente (por ejemplo, si 10 píxeles = 1 mm y el gránulo más pequeño es 0,5 mm, elija 5-infinito).
- En el cuadro desplegable Mostrar , seleccione Contornos y, a continuación, marque Resumir y presione Aceptar (Figura 8).
NOTA: Puede encontrar más información en https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html
Figura 8: Un diagrama de flujo del proceso utilizado en ImageJ para contar los gránulos fecales. A) Importar una secuencia de imágenes en la pestaña Archivo de ImageJ. B) El botón examinar en el cuadro de diálogo 'Importar secuencia de imágenes' para importar una secuencia de imágenes desde un dispositivo local. C) Uso de la herramienta de círculo para seleccionar el área que contiene gránulos fecales D) Botón Borrar exterior en el área de la pestaña de edición para eliminar fuera del área seleccionada. E) Hacer botón binario en la pestaña proceso. F) Establecer botón de escala en la pestaña Analizar. La distancia en píxeles es equivalente al número de píxeles a una unidad de medida (mm). G) Botón Analizar partículas en la pestaña Analizar. Tamaño (unidad^2) establecido en el umbral inferior del tamaño de la bolita fecal, en píxeles, hasta el infinito. Se seleccionan mostrar 'esquemas' y 'resumen'. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
-
Análisis de datos
- Convierta los recuentos de pellets en pellets por día, lo que da una medida indirecta de la tasa de alimentación. Descarte los datos de cualquier individuo que muda en los días en que ocurrió la muda (Figura 9).
NOTA: La muda ocurre durante 1-3 días y se puede identificar cuando se puede ver una muda completa del exoesqueleto.
- Convierta los recuentos de pellets en pellets por día, lo que da una medida indirecta de la tasa de alimentación. Descarte los datos de cualquier individuo que muda en los días en que ocurrió la muda (Figura 9).
Figura 9: Ejemplo de muda de gribble. Muda de gribble (L. quadripunctata), sobre una varilla de prueba de madera de pino Radiata de 20 mm x 4 mm x 2 mm. Las mudas están indicadas por círculos rojos. Barra de escala de 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Un experimento de alimentación de L. quadripunctata se realizó durante 20 días, utilizando cinco tipos diferentes de madera (albura de pino silvestre (Pinus sylvestris L) y duramen de haya (Fagus sylvatica L), ekki (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), castaño dulce (Castanea sativa Mil) y trementina (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (Ver Tabla de materiales), en noviembre de 2020. Se utilizaron ocho palos replicados por especie de madera y un espécimen de Limnoria quadripunctata fue alimentado por palo. Todos los gribble fueron adquiridos de acciones que se mantienen en acuarios en el Instituto de Ciencias Marinas de la Universidad de Portsmouth, Reino Unido. Las poblaciones se complementan regularmente con colecciones silvestres de la costa sur de Inglaterra. Los animales están bien aclimatados a las condiciones de cultivo estables y consistentes antes del experimento. Los palos de madera (20 mm x 4 mm x 2 mm) se lixiviaron en agua de mar durante dos semanas antes de la prueba de alimentación. Se colocaron una plancha, una varilla de prueba y 5 ml de agua de mar por pozo en una placa de 12 pozos múltiples y se mantuvieron en una incubadora en condiciones estables de 20 ° C (± 0,2 ° C) y en condiciones de oscuridad constante. Los pellets fecales se contaron y recolectaron cada 2 a 5 días, con cambios de agua completos en cada recolección. Se utilizaron ocho réplicas de cada especie de madera, dando un total de cuarenta palos con un gribble individual cada uno. El agua de mar utilizada para lixiviar la madera y utilizada durante todo el experimento se obtuvo directamente del acuario utilizado para criar especímenes. Las condiciones del agua de mar son estables en el acuario y estables en la incubadora. La evaporación del pequeño volumen de agua utilizado por pozo se minimiza mediante el diseño de la tapa de las placas del pozo y los cambios de agua completos que ocurren cada 2-5 días.
Los pellets se contaron automáticamente utilizando la Imagen J (versión 1.8.0_112).
Gribble alimentándose de madera de albura de pino silvestre como control, produjo la mayor cantidad de pellets fecales por día de manera consistente, excepto en el Día 20 donde la producción de pellets fue superada por la haya. Ekki produjo los gránulos fecales más bajos por día de todas las especies de madera probadas. La segunda mayor producción de pellets fecales se observó en la haya, seguida de la castaña dulce y la trementina. Hubo un aumento en la producción de pellets fecales en todas las especies desde el día 5 hasta el día 7. La producción de pellets disminuyó en todas las especies, excepto en ekki, entre el día 7 y el día 12, posiblemente debido al aumento del tiempo entre los cambios de agua. Después de esto, la producción de pellets fecales se mantuvo bastante consistente entre cada una de las especies de madera. A partir del día 14, el pino silvestre disminuyó en la producción diaria de pellets fecales, mientras que la haya aumentó (Figura 10).
Figura 10: Número de pellets fecales por día (n=40) (media ± SE) producidos por L. quadripunctata utilizando diferentes especies de madera, durante 20 días. Se ha probado trementina, castaña dulce, haya y duramen ekki, con albura de pino silvestre utilizada como control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La mayor vitalidad de la puntuación (5) se observó en la mayoría de los individuos que se alimentan de madera de pino silvestre, excepto en el único individuo muerto. 5 indica animales que han excavado en la madera y esto se vio solo en la albura de pino silvestre y el duramen de haya. Para el día 12 para el pino silvestre y el día 20 para la haya, todos los individuos vivos habían excavado en el bosque. La castaña dulce tuvo el mayor porcentaje de mortalidad, pero no aumentó con el tiempo. El resto de los individuos vivos se mantuvieron en una vitalidad de 4 (arrastrándose sobre la superficie de la madera), excepto en el Día 14 donde dos individuos estaban fuera de la madera (vitalidad de 3). Ekki y trementina también tuvieron la mayoría de los individuos en una vitalidad de 4 durante la duración del experimento, aparte de en el día 14 y el día 5 para la trementina. La mortalidad no mostró un aumento con el tiempo en ninguna de las especies de madera. Solo se observó que la madriguera aumentaba en el pino silvestre y la haya, mientras que las otras tres especies de madera se mantuvieron en su mayoría en una vitalidad de 4 (Figura 11).
Figura 11: Vitalidad de los individuos a lo largo del tiempo, como porcentaje de réplicas, alimentándose de diferentes especies de madera. Se ha probado trementina, castaña dulce, haya y duramen ekki, con albura de pino silvestre utilizada como control. De ocho réplicas por especie de madera, el porcentaje en diferentes vitalidades se trazó durante el período experimental de 20 días. El azul oscuro representa una vitalidad de 5 (madriguera), el azul claro una vitalidad de 4 (sobre madera), el gris una vitalidad de 3 (fuera de madera pero activo), el púrpura una vitalidad de 2 (fuera de madera y pasivo) y el negro muestra una vitalidad de 1 o individuos muertos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los resultados de este método de prueba se pueden utilizar para identificar tipos de madera o tratamientos que tienen una mayor resistencia al daño del barrenador de la madera marina. Luego, se pueden realizar ensayos de campo marinos, como se describe en la norma europea EN 275, y se puede calificar la durabilidad (0 = 'sin ataque', 1 = 'ataque leve', 2 = 'ataque moderado', 3 = 'ataque severo', 4 = 'falla'20) además de la comparación con la madera de control no duradera.
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Discussion
Antes de seleccionar los especímenes de gribble para ser utilizados en el experimento de alimentación, los individuos deben ser examinados para evaluar su idoneidad. Puede haber alguna variación en la tasa de alimentación entre los individuos debido a las diferencias de tamaño, por lo que solo se deben seleccionar especímenes adultos completamente desarrollados. Borges et al., 200917 no detectaron diferencias significativas entre la velocidad de alimentación de los individuos entre 1,5 mm y 3 mm de longitud. Las hembras de Limnoria crían sus huevos, durante el cual tienen una tasa de alimentación reducida. Por lo tanto, cualquier hembra de cría debe ser revisada y descartada al seleccionar especímenes. Del mismo modo, los individuos que mudan también tendrán una tasa de alimentación reducida21. Por lo tanto, los recuentos de pellets fecales en los días en que los individuos están mudando deben descartarse17. Como la muda ocurre durante más de un día, las mudas se cuentan cuando se puede ver una muda completa del exoesqueleto en los días de recolección de pellets. Limnoria, al crear sus madrigueras, tienen una mayor producción de pellets fecales y también producirán más frass (residuos de madera fina que no se incorporan a los pellets fecales). Los altos niveles de frass pueden interferir con la identificación de gránulos fecales, pero se pueden eliminar cuidadosamente bajo la observación estereomicroscopio, utilizando una pipeta o un pincel fino, antes de la captura de imágenes para el conteo automático. Alternativamente, los pellets se pueden contar manualmente.
El software ImageJ requiere imágenes de calidad y enfocadas para el procesamiento de imágenes. Con este fin, se deben capturar imágenes en las que los gránulos fecales no estén obstruidos por las paredes del pozo y se debe usar un pincel para separar los gránulos fecales individuales. El fondo de la imagen debe ser uniforme sin áreas de luz o sombra, lo que interferiría cuando la imagen se transforma en binaria para su procesamiento en ImageJ. No es necesario ajustar el contraste o la luz antes del procesamiento de la imagen. Al importar una pila de imágenes, todas las fotografías deben tomarse en el mismo plano para que no se produzcan errores durante el procesamiento.
La impregnación al vacío de la madera con agua de mar hace que la madera se hunda y sea fácilmente accesible para la plancha. La lixiviación de la madera antes de exponerla a planchas eliminará cualquier extractivo soluble en agua que pueda afectar su tasa de alimentación o causar mortalidad12. La mortalidad debida a las extracciones en el agua no es representativa de la mortalidad que se espera en el mar, donde las extracciones se diluirán rápidamente. Las placas de pozo deben mantenerse a una temperatura constante que sea la óptima para las especies de gribble que se están probando. La especie común del sur de Gran Bretaña, L. quadripunctata, se alimenta bien entre 15 y 25 ° C y tiene una tasa de alimentación óptima a 20 ° C17 , por lo que las placas de pozo se pueden mantener convenientemente en una incubadora a una temperatura constante de 20 ° C ± 0.5 ° C.
La evaluación de la vitalidad de la gribble de alimentación detecta efectos subletales o preletales de los tratamientos de madera o maderas naturalmente duraderas. Una alta vitalidad de 5 indica que el gribble está demostrando un comportamiento natural al excavar en la madera y no sufre ningún efecto adverso por el contacto con ella. Una vitalidad de 4 muestra que, si bien no se ha excavado en la madera, la plancha sigue siendo cómoda para arrastrarse a lo largo de su superficie. Se da una puntuación de 3 a los gribble que no están en la madera, sino que nadan activamente en el agua o son estacionarios pero con patas y pleópodos que golpean rápidamente. Una vitalidad baja de 2 significa que el gribble está expuesto y / o tiene poca energía. Esto puede deberse a un período prolongado de baja tasa de alimentación o a que las extracciones se filtren en el agua o se vuelvan accesibles durante la alimentación. Si se observa una alta mortalidad después de 7-8 semanas, esto puede deberse a la inanición, ya que las planchas hambrientas (mantenidas en pozos con solo 5 ml de agua de mar y sin madera) pueden sobrevivir durante tanto tiempo (observación personal).
Los beneficios de utilizar un ensayo de laboratorio a corto plazo en lugar de ensayos de campo marinos a largo plazo, es que los nuevos tratamientos y productos de madera se pueden probar rápidamente para identificar su potencial para ser utilizados comercialmente. Además, tales ensayos pueden facilitar la optimización rápida de los procesos de tratamiento. Si se observa una producción de pellets fecales significativamente menor en comparación con una madera de control, entonces las pruebas pueden complementarse con ensayos marinos. Slevin et al., 201523 y Westin et al., 201624 demuestran una buena correlación entre las evaluaciones de laboratorio y de campo a través de la prueba de la misma madera en dos entornos diferentes, lo que indica una capacidad predictiva capaz de la primera. Un ensayo a corto plazo se puede ejecutar durante varias semanas. Las planchas hambrientas pueden sobrevivir durante 7-8 semanas cuando se mantienen en agua bien aireada sin madera (observación personal), lo que puede proporcionar una comparación adicional si se investiga la respuesta de mortalidad a diferentes tipos de maderas. Sin embargo, a través de observaciones recientes no publicadas, no hay una fluctuación significativa en la producción de pellets fecales durante un período de tiempo superior a 20 días, aparte de cuando comienza a ocurrir la mortalidad. Además, los métodos anteriores, como el utilizado por Borges et al., 2008 y 2009, duran 15 días. Por lo tanto, 20 días es un tiempo suficiente para que una prueba rápida basada en el laboratorio proporcione una indicación de la durabilidad de la madera.
Si bien este método es adecuado para ensayos a corto plazo, los hallazgos deben complementarse con experimentos de campo marino a largo plazo. Las condiciones de laboratorio no pueden replicar la variedad de factores bióticos y abióticos que pueden afectar a la madera en el medio marino. Los organismos bioincrustantes, junto con otras especies de barrenadores de la madera marinos (como los gusanos de barco) aún pueden estar presentes y causar daños a la madera25,26. Además, la abrasión de las tejas o la arena arrojadas por las olas puede desgastar la madera, que luego puede ser accesible para gribbles27. Sin embargo, un método de laboratorio estándar puede proporcionar una selección inicial de nuevos productos que son prometedores para aplicaciones marinas. Al evaluar la producción y vitalidad de pellets fecales, se pueden identificar las maderas que son mejores para reducir la tasa de alimentación de gribble.
Debido a las regulaciones y restricciones de los conservantes de madera, como el CCA y la creosota, es importante encontrar productos novedosos para reemplazar estos tratamientos. La madera está sujeta a altos niveles de biodegradación en el medio marino, pero sigue siendo uno de los materiales de construcción más renovables disponibles y conserva bien su resistencia y estructura en el agua de mar27,28. La madera resistente a la biodegradación no solo reducirá los costos, sino que también será más respetuosa con el medio ambiente que el uso de materiales alternativos como el hormigón o el acero, que requieren un alto aporte de energía durante la fabricación29,30, o conservantes biocidas de amplio espectro que pueden filtrarse y afectar al ecosistema circundante31,32,33,34,35,36, 37.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este estudio.
Acknowledgments
Gracias al Consejo de Investigación de Noruega (Fondo Regional de Oslo, Alcofur rffofjor 269707) y a la Universidad de Portsmouth (beca de investigación de doctorado de la Facultad de Ciencias) por proporcionar fondos para los estudios de Lucy Martin. También, a Gervais S. Sawyer quien proporcionó la madera utilizada para generar los resultados representativos. La trementina fue proporcionada por el Prof. Philip Evans de la Universidad de Columbia Británica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 150200 | |
| 50ml Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Adjustable volume pipette | Fisher Scientific | FBE10000 | 1-10 ml |
| Beech | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Fagus sylvatica | Taxonomic authority: L |
| Ekki | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Lophira alata | Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn. |
| Forceps | Fisher Scientific | 10098140 | |
| Incubator | LMS LTD | INC5009 | |
| Microporous specimen capsules | Electron Microscopy Sciences | 70187-20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Scots Pine | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Pinus sylvestris | Taxonomic authority: L. |
| Size 00000 paintbrush | Hobby Craft | 5674331001 | Size 000 or 0000 also acceptable |
| Sweet Chestnut | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Castanea sativa | Taxonomic authority: Mill |
| Turpentine | P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) | Syncarpia glomulifera | Taxonomic authority: (Sm.) Nied. |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific | 15544635 |
References
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