Summary
Этот протокол представляет собой метод оценки скорости кормления древесно-бурового ракообразного , Limnoria, путем измерения производства фекальных гранул. Этот метод предназначен для использования в неспециализированных лабораториях и имеет потенциал для включения в стандартные протоколы испытаний для оценки повышенной долговечности древесины в морских условиях.
Abstract
Древовидные беспозвоночные быстро разрушают морскую древесину и деревянную прибрежную инфраструктуру, нанося ущерб на миллиарды долларов по всему миру каждый год. Поскольку обработка древесины биоцидами широкого спектра действия, такими как креозот и хромированный арсенат меди (ОАС), в настоящее время ограничена в морском использовании законодательством, требуются естественно прочные породы древесины и новые методы сохранения древесины. Эти методы проходят испытания на соответствие нормативным стандартам, таким как европейский стандарт для тестирования консервантов древесины против морских буров, EN 275. Первоначальное исследование долговечных пород древесины или обработки древесины консервантами может быть достигнуто быстро и недорого с помощью лабораторных испытаний, которые предлагают множество преимуществ по сравнению с морскими полевыми испытаниями, которые, как правило, являются дорогостоящими, долгосрочными усилиями. Многие виды Limnoria (gribble) являются морскими древовидными ракообразными. Лимнории идеально подходят для использования в лабораторных испытаниях биодеградации древесины морскими лесорубами, благодаря практичности выращивания их в аквариумах и простоте измерения скорости их питания на древесине. Здесь мы описываем стандартизируемый лабораторный тест для оценки биодеградации древесины с использованием грибка.
Introduction
Дровосеки могут нанести значительный ущерб морским деревянным конструкциям, таким как морские оборонительные сооружения, пирсы и сооружения аквакультуры; замена или восстановление которых обходится в миллиарды долларов в год во всем мире1,2,3. Чтобы защитить эти структуры, древесину часто обрабатывают, чтобы уменьшить биодеградацию. Однако из-за ограничения использования биоцидов широкого спектра действия в Австралии, ЕС, Великобритании и США в морской среде востребованы новые методы модификации и породы древесины, которые естественным образом долговечны для бурильщиков4,5,6,7. Новые методы сохранения древесины в морской среде требуют тщательного тестирования в целях соблюдения нормативных стандартов и ограничения воздействия на окружающую среду таких опасностей, как выщелачивание любого химического консерванта. Например, европейский стандарт EN 275, который является действующим европейским стандартом с 1992 года, используется для оценки обработки древесины на предмет повреждения морской древесиной8,9. Настоящий стандарт, наряду с другими законодательными актами, запрещающими использование биоцидных соединений, таких как CCA4,5,6,7 и creosote10, требует устойчивых, нетоксичных методов защиты древесины и использования естественно прочных древесных пород для замены биоцидных обработок11,12 . Морские испытания, такие как те, которые указаны в EN 275, требуют длительных периодов воздействия и, таким образом, являются дорогостоящими и медленными для получения значимых результатов. Лабораторные испытания, однако, обеспечивают гораздо более быструю альтернативу методам испытаний древесины против нападения морских дровосек, что позволяет быстро оценить корректировки графиков обработки13. Результаты этого быстрого лабораторного эксперимента предназначены для информирования о новых процессах модификации древесины и выявления пород древесины с естественной стойкостью к повреждению. Низкая скорость кормления и жизнеспособность могут указывать на повышенную устойчивость потенциальных продуктов, и эта информация затем может быть передана партнерам по отрасли, чтобы позволить им улучшить конструкции. Наш метод позволяет гибко и быстро реагировать, что желательно в промышленности, и как только перспективные продукты были идентифицированы, результаты могут быть дополнены результатами морских испытаний.
Limnoria — род изоподовых ракообразных из семейства Limnoriidae. Существует более 60 видов Limnoria во всем мире13,14,15, с тремя распространенными видами, найденными в Великобритании: Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata и Limnoria quadripunctata16. Они прокладывали туннели на поверхности древесины, которая погружается в морскую воду, часто нанося экономически значительный ущерб. Грибы очень распространены в прибрежных водах Великобритании и их легко поддерживать в лабораторных условиях, что делает их идеальными организмами для изучения биодеградации древесины морскими древесными беспозвоночными. Оценка скорости кормления и жизнеспособности грибков на различных породах древесины и методов сохранения древесины может определить эффективность их устойчивости к биодеградации. Следующий протокол устанавливает стандартный метод измерения скорости подачи грибка, разработанный на основе того, что описан Борхесом и его коллегами12,17, в дополнение к упрощению внедрения анализа изображений, чтобы сделать процесс работоспособным в неспециализированных лабораториях. Анализ изображений также используется для уменьшения практических ограничений ручного подсчета большого количества образцов. Долговечность при длительных морских испытаниях, согласно британскому стандарту EN350-1:1994, оценивается по отношению к заболоне Pinus sylvestris18. В краткосрочном лабораторном тестировании, представленном здесь, мы используем заболонью сосну обыкновенную (Pinus sylvestris L) в качестве контроля для тестирования сердцевины пород экки (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), бука (Fagus sylvatica L), сладкого каштана (Castanea sativa Mill) и скипидара (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied). В качестве показателя долговечности использовалось среднее производство фекальных гранул и жизнеспособность среди восьми реплик на одну породу древесины. Мы предоставляем иллюстративные данные, собранные из типичной оценки, с использованием вида Limnoria quadripunctata и ряда естественно прочных пород древесины. Limnoria quadripunctata, идентифицированная ключами, предоставленными Menzies (1951), была выбрана в качестве оптимального вида для испытаний биодеградации из-за того, что она является наиболее хорошо изученным членом семейства и хорошо зарекомендовала себя в качестве модельного вида для использования в испытаниях биодеградации. Этот протокол также применим для тестирования древесины с различными обработками, хотя используемый контроль должен быть необработанными репликациями одного и того же вида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка тестовых палочек
- После завершения любых процессов обработки нарежьте сухую древесину на испытательные палочки размером 2 мм x 4 мм x 20 мм (рисунок 1). Воздух сухой прилипает к постоянному весу, в лабораторных условиях. Используйте не менее 5 реплик каждой тестируемой древесины.
Рисунок 1: Тестовые палочки, используемые в краткосрочных лабораторных испытаниях для оценки скорости кормления гриба. Тестовые деревянные палочки размером 2 мм x 4 мм x 20 мм. Слева направо: экки, скипидар, сладкий каштан и буковое сердцевина и заболонь сосны обыкновенной. Шкала 4 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Вакуумная пропитка
- После подготовки древесины (т.е. резки и обработки, если это применимо) поместите палочки под сетку в безопасный для пищевых продуктов пластиковый контейнер внутри вакуумного осушителя и замените крышку, обеспечив плотное уплотнение, чему способствует покрытие из вакуумной смазки (рисунок 2).
- Прикрепите трехходовой клапан между трубкой, соединяющей адсорбатор и насос, с третьей трубкой, ведущей на открытый воздух (рисунок 2). Убедитесь, что трехсторонний клапан закрыт для воздуха, и запустите насос для достижения вакуума от -0,75 до -1,0 бар в вакуумном осушителе и удерживайте этот вакуум в течение 45 минут - 1 часа.
- Погрузите открытый конец третьей трубы в емкость с морской водой. Выключите насос и закройте клапан, ведущий к насосу, затем медленно откройте клапан, пока морская вода не будет втянута вакуумом в осушитель. Дайте воде течь, пока она не наполнит пластиковый контейнер, выше уровня сетки.
- Затем извлеките трубку из морской воды в контейнер, позволив воздуху войти, пока осушитель не вернется к атмосферному давлению. Держите палочки погруженными под сетку, пока они не опустятся на дно пластикового контейнера.
Рисунок 2: Оборудование, используемое для вакуумной пропитки древесных палочек морской водой, при подготовке к кормлению грибов во время лабораторного анализа кормления. А) Вакуумный осушитель; Б) Насос; В) Манометр для вакуумного осушителя; D) Трехходовой клапан, ведущий к вакуумному осушителю, насосу и к открытому воздуху или морской воде (оранжевая трубка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Выщелачивание древесины
- Погружайте насыщенные морской водой тест-палочки в морскую воду, содержащуюся в пробирках объемом 50 мл (рисунок 3). Регулярно заменяйте воду в течение 20 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс выщелачивания применяется к любой экспериментальной древесине, проходящей испытания, включая обработанную или натуральную древесину.
- Погружайте насыщенные морской водой тест-палочки в морскую воду, содержащуюся в пробирках объемом 50 мл (рисунок 3). Регулярно заменяйте воду в течение 20 дней.
Рисунок 3: Выщелачивание из древесных палочек для подготовки к подкормке грибов во время лабораторного анализа кормления. Древесина, которая была полностью погружена в морскую воду, содержащуюся в 50 мл falcon tube, с регулярной сменой воды (1-3 дня), производила отчетливо окрашенный фильтрат. Слева направо выщелачивается из сердцевины; сладкий каштан, скипидар, экки, бук и сосновая заболонь обыкновенная. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Извлечение грибка
- Извлеките отдельные образцы грибка из зараженного деревянного блока. Используйте пару мелких щипцов и тонкую (размером 000/0,4 мм или меньше) кисть. Тщательно отклеивайте любую древесину, которая покрывает щипцами нору
ПРИМЕЧАНИЕ: Норы находятся на поверхности древесины и могут быть идентифицированы по небольшим отверстиям (рисунок 4). - После того, как грибок был обнажен, используйте кисть, чтобы осторожно поднять людей снизу и положить в чашку Петри, наполненную морской водой. Проверьте грибок под микроскопом, чтобы идентифицировать виды и убедиться, что во время извлечения не было нанесено никакого ущерба.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избиение плеоподов является признаком жизненной силы.- Отбросьте любые самки, выводящие яйца, так как гравидные самки имеют сниженную способность к питанию.
Рисунок 4: Изображение норы с двумя типичными вентиляционными отверстиями. Л. квадрипунктата нора на палочке из сосны Радиата, размером 2 мм х 4 мм х 20 мм. Два меньших вентиляционных отверстия можно увидеть рядом с входом в нору. Шкала 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Идентификация Limnoria quadripunctata
- Идентифицируйте Limnoria quadripunctata под стереомикроскопом по четырем различным бугоркам, расположенным в квадратном рисунке, на плеотельсоне животного в дополнение к X-образной киле на пятом плеоните19 (рисунок 5).
Рисунок 5: Limnoria quadripunctata идентифицирующие признаки. Изображение дорсальной поверхности Limnoria quadripunctata, сделанное на стереомикроскопе при увеличении x20. Идентифицирующие признаки показаны красной стрелкой - указывает на X-образную килю, а синяя стрелка - указывает на четыре бугорка на плеотельсоне. Шкала 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Подготовка плит колодца
- В многоскважинных плитах с скважинами диаметром 20 мм поместите одну испытательную палочку и 5 мл нефильтрованной морской воды, между 32-35 ПГУ, на скважину (рисунок 6).
- Систематически размещайте обработки/породы древесины по всей плите колодца таким образом, чтобы каждый тип древесины был представлен по крайней мере один раз на плиту. Добавьте по одному крупицу на колодец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура должна поддерживаться стабильной в инкубаторе при 20 °C ± 2 °C для вида L. quadripunctata, другие виды Limnoria могут использоваться с поправками на температуру, сделанную в соответствии с конкретным видом. - Храните пластины в постоянных темных условиях, так как фотопериод не влияет на скорость подачи грибка15.
Рисунок 6: Экспериментальная установка для анализа кормления гриббла. Пример 12 многоскважинной пластины, используемой при лабораторных испытаниях скорости подачи грунта. Каждая скважина содержит 5 мл морской воды и одну пробную палочку (20 мм х 4 мм х 2 мм) различных пород древесины; Сосна обыкновенная, заболонь и экки, бук, сладкий каштан и сердцевина скипидара. Шкала 20 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Сбор и подсчет фекальных гранул и оценка жизнеспособности.
- Два раза в неделю извлекайте пробную палочку и каждую крупу (по одной на лунку) из плиты скважины и помещайте в свежеподготовленную плиту скважины (содержащую 5 мл морской воды на скважину [32-35 ПСС, 18-22 °C]).
- Используйте кисть, чтобы аккуратно смахнуть любые фекальные гранулы с палочки перед переноской и сохранить фекальные гранулы в оригинальной лунке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переносом грибка на свежую луночную тарелку жизнеспособность можно оценить по шкале 1-5; 1 = мертвые, 2 = пассивные, не на дереве, 3 = активно плавающие или бьющие плеоподы, не по дереву, 4 = ползающие по поверхности леса, 5 = зарытые в лес. - Обработка изображений
- Используйте тонкую кисть, чтобы отделить любые комки, чтобы были видны отдельные гранулы и отмахивались от самых краев колодца. Сделайте детальную фотографию под стереомикроскопом, с увеличением x4 и загрузите на компьютер (рисунок 7).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что гранулы находятся в фокусе, а фон равномерный, без теней или отражений света на поверхности воды.
- Используйте тонкую кисть, чтобы отделить любые комки, чтобы были видны отдельные гранулы и отмахивались от самых краев колодца. Сделайте детальную фотографию под стереомикроскопом, с увеличением x4 и загрузите на компьютер (рисунок 7).
Рисунок 7: Изображение фекальных гранул. Л. quadripunctata фекальные гранулы (мелкие, цилиндрические, коричневые гранулы) от кормления на древесине сосны Radiata в одном колодце многолуночной плиты. Взято при увеличении x4. Изображения до манипуляции для анализа изображений (см. рисунок 7). A) Пример подходящего изображения для использования для автоматического подсчета в ImageJ. Пеллеты достаточно растянуты и удалены от краев колодца. Колодец центрирован, и нет никаких препятствий или отражений. Б) Пример изображения, которое не подходит для анализа изображения. Скважина находится вне центра, отсекая нижнюю половину. Синий (пунктирный) круг показывает отражение света от поверхности воды. Оранжевый (твердый) круг показывает гранулы, которые сломлены слишком близко друг к другу и слишком близко к краю колодца. Красный (пунктирный) круг показывает щепу, которая не была удалена. Шкала 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Процесс для создания количества фекальных гранул с помощью ImageJ.
- Скачайте ImageJ (последняя версия от 08.03.21, 1.8.0_172) с https://imagej.nih.gov/ij/download.html или запустите из браузера компьютера.
- Загрузите стопку изображений, перетащив ее или выбрав Файл | Импорт | | последовательности изображений Обзор. Не изменяйте параметры, затем выберите ОК.
- Затем с помощью инструмента «Круг» выберите нижнюю часть скважины, содержащую фекальные гранулы. Удалите края колодца, выберите Изменить | Очистите снаружи. Сделайте изображение двоичным, выберите Обработать | Сделать двоичным.
- Выполните калибровку, выбрав анализ | Установите масштаб и выберите количество пикселей на миллиметр для изображения (например, 10 пикселей = 1 мм). Подсчитайте гранулы, выберите Анализ | Анализ частиц.
- В поле Рядом с полем Размер (блок2) выберите более низкий порог, который совпадает с наименьшим размером гранулы, используя шкалу единиц, установленную ранее (например, если 10 пикселей = 1 мм, а наименьшая гранула составляет 0,5 мм, выберите 5-бесконечность).
- В раскрывающемся списке Показать выберите Контуры , а затем установите флажок Сводка и нажмите Ok (рисунок 8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительную информацию можно найти по адресу https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html
Рисунок 8: Блок-схема процесса, используемого в ImageJ для подсчета фекальных гранул. A) Импорт последовательности изображений на вкладке Файл ImageJ. B) Кнопка обзора в диалоговом окне «Импорт последовательности изображений» для импорта последовательности изображений с локального устройства. C) Использование инструмента «Круг» для выбора области, содержащей фекальные гранулы D) Очистить снаружи кнопку в области вкладки редактирования, чтобы удалить за пределами выбранной области. Д) Сделайте двоичную кнопку на вкладке процесса. F) Установите кнопку масштабирования на вкладке Анализ. Расстояние в пикселях эквивалентно количеству пикселей до одной единицы измерения (мм). G) Кнопка "Анализировать частицы" на вкладке "Анализ". Размер (единица^2) установлен на нижний порог размера фекальной гранулы, в пикселях, до бесконечности. Показать «контуры» и «резюме» выбраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
-
Анализ данных
- Перевести количество гранул в гранулы в сутки, что дает и косвенный показатель скорости подачи. Отбросьте данные от любых линяющих особей в дни, когда произошла линька (рисунок 9).
ПРИМЕЧАНИЕ: Линька происходит в течение 1-3 дней и может быть идентифицирована, когда можно увидеть полную линьку экзоскелета.
- Перевести количество гранул в гранулы в сутки, что дает и косвенный показатель скорости подачи. Отбросьте данные от любых линяющих особей в дни, когда произошла линька (рисунок 9).
Рисунок 9: Пример линьки. Линька gribble (L. quadripunctata) на испытательной палочке из соснового дерева Radiata размером 20 мм x 4 мм x 2 мм. Линьки обозначены красными кружками. Шкала 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эксперимент по кормлению Л. квадрипунктата проводилась в течение 20 дней с использованием пяти различных типов древесины (сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L) заболони и сердцевина бука (Fagus sylvatica L), экки (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), сладкого каштана (Castanea sativa Mil) и скипидара (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (см. Таблицу материалов) в ноябре 2020 года. Восемь реплицированных палочек были использованы для каждой породы древесины, и один образец Limnoria quadripunctata был подан на палочку. Все глибблы были приобретены из запасов, которые содержатся в аквариумах института морских наук Университета Портсмута, Великобритания. Запасы регулярно пополняются дикими коллекциями с южного побережья Англии. Животные хорошо акклиматизируются к стабильным и последовательным условиям культивирования до начала эксперимента. Деревянные палочки (20 мм х 4 мм х 2 мм) выщелачивали в морской воде в течение двух недель до испытания кормления. Один гриб, одну испытательную палочку и 5 мл морской воды помещали на скважину в 12 многоскважинных пластин и хранили в инкубаторе при стабильных условиях 20 °C (± 0,2 °C) и в постоянных темных условиях. Фекальные гранулы подсчитывались и собирались каждые 2-5 дней, с полными изменениями воды при каждом сборе. Было использовано восемь реплик каждой породы древесины, дающие в общей сложности сорок палочек с одним отдельным грибком каждая. Морская вода, используемая для выщелачивания древесины и используемая на протяжении всего эксперимента, была получена непосредственно из аквариума, используемого для выращивания образцов. Состояние морской воды стабильно в аквариуме и стабильно в инкубаторе. Испарение от небольшого объема воды, используемой на скважину, сводится к минимуму за счет конструкции крышки плит скважины и полной подмены воды, происходящей каждые 2-5 дней.
Гранулы подсчитывались автоматически с помощью Image J (версия 1.8.0_112).
Gribble, питающийся заболонью сосны обыкновенной в качестве контроля, производил наибольшее количество фекальных гранул в день последовательно, за исключением 20-го дня, когда производство пеллет было превзойдено буком. Ekki производила самые низкие фекальные гранулы в день из всех протестированных пород древесины. Второе по величине производство фекальных гранул было замечено на буке, за которым следовали сладкий каштан и скипидар. С 5-го по 7-й день наблюдалось увеличение производства фекальных гранул у всех видов. Производство пеллет сократилось у всех видов, кроме экки, между 7-м и 12-м днями, возможно, из-за увеличения времени между изменениями воды. После этого производство фекальных пеллет оставалось довольно стабильным среди каждой из древесных пород. С 14-го дня сосна обыкновенная снизилась в ежедневном производстве фекальных гранул, в то время как бук увеличился (рисунок 10).
Рисунок 10: Количество фекальных гранул в сутки (n=40) (среднее ± SE), производимых L. quadripunctata с использованием различных пород древесины, в течение 20 дней. Тестировался скипидар, сладкий каштан, бук и сердцевина экки, а в качестве контроля использовались заболонь сосны обыкновенной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Самая высокая жизнеспособность балла (5) наблюдалась у большинства людей, питающихся сосновой древесиной обыкновенной, за исключением одного мертвого человека. 5 указывает на животных, которые зарылись в лес, и это было замечено только на сосновой заболони обыкновенной и буковой сердцевине. К 12-му дню для сосны обыкновенной и 20-му дню для бука все живые особи зарылись в лес. Сладкий каштан имел самый высокий процент смертности, но не увеличивался с течением времени. Остальные живые особи оставались на жизненной силе 4 (ползая по поверхности дерева), за исключением 14-го дня, когда две особи были вне древесины (жизнеспособность 3). Экки и скипидар также имели у большинства людей жизнеспособность 4 в течение всего эксперимента, за исключением 14-го и 5-го дня для скипидара. Смертность не показала увеличения с течением времени ни по одной из древесных пород. Было замечено, что только роение увеличилось на сосне и буке обыкновенной, в то время как другие три породы древесины в основном оставались на жизнеспособности 4 (рисунок 11).
Рисунок 11: Жизнеспособность особей с течением времени, в процентах от реплик, питающихся различными породами древесины. Тестировался скипидар, сладкий каштан, бук и сердцевина экки, а в качестве контроля использовались заболонь сосны обыкновенной. Из восьми реплик на породу древесины процент при различных жизнеспособностях был построен в течение 20-дневного экспериментального периода. Темно-синий представляет жизненную силу 5 (роение), светло-синий - жизнеспособность 4 (на дереве), серый - жизнеспособность 3 (вне древесины, но активный), фиолетовый - жизнеспособность 2 (из дерева и пассивный), а черный показывает жизнеспособность 1 или мертвых особей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Результаты этого метода испытаний могут быть использованы для идентификации типов древесины или обработки, которые имеют повышенную устойчивость к повреждениям морской древесины. Затем могут быть проведены морские полевые испытания, как описано в европейском стандарте EN 275, и можно оценить долговечность (0 = «отсутствие атаки», 1 = «легкая атака», 2 = «умеренная атака», 3 = «тяжелая атака», 4 = «отказ»20) в дополнение к сравнению с непрочной контрольной древесиной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прежде чем выбрать образцы грибка для использования в эксперименте по кормлению, особи должны быть проверены, чтобы оценить их пригодность. Могут быть некоторые различия в скорости кормления между особями из-за различий в размерах, поэтому следует отбирать только полностью взрослые экземпляры. Никакой существенной разницы между скоростью кормления особей длиной от 1,5 мм до 3 мм обнаружено не было обнаружено Borges et al., 200917. Самки лимнорий выводят свои яйца, за это время имеют сниженную норму кормления. Поэтому любые выводковые самки должны быть проверены и выброшены при отборе экземпляров. Аналогичным образом, линяющие особи также будут иметь сниженную норму кормления21. Поэтому количество фекальных гранул в дни, когда особи линяют, должно быть выброшено17. Поскольку линька происходит более суток, линьки подсчитываются, когда полная экзоскелетная линька может быть замечена в дни сбора гранул. Лимнории при создании своих нор имеют увеличенное производство фекальных гранул, а также будут производить больше frass (мелких древесных отходов, которые не включены в фекальные гранулы). Высокие уровни фрасса могут мешать идентификации фекальных гранул, но могут быть аккуратно удалены под наблюдением стереомикроскопа, с использованием пипетки или тонкой кисти, перед захватом изображения для автоматического подсчета. В качестве альтернативы, гранулы могут быть подсчитаны вручную.
Программное обеспечение ImageJ требует качественных, в фокусе изображений для обработки изображений. С этой целью должны быть получены изображения, на которых фекальные гранулы не закупориваются стенками колодца, и следует использовать кисть для разделения отдельных фекальных гранул. Фон изображения должен быть однородным без областей света или тени, которые будут мешать при преобразовании изображения в двоичный для обработки в ImageJ. Нет необходимости регулировать контраст или свет перед обработкой изображения. При импорте стопки изображений все фотографии должны быть сделаны в одной плоскости, чтобы при обработке не возникало ошибок.
Вакуумная пропитка древесины морской водой приводит к тому, что древесина тонет и становится легко доступной для грязи. Выщелачивание древесины перед воздействием грязи приведет к удалению любых водорастворимых экстрактов, которые могут повлиять на их скорость кормления или вызвать смертность12. Смертность из-за добывающих веществ в воде не является репрезентативной для смертности, ожидаемой в море, где добывающие вещества будут быстро разбавляться. Плиты колодцев должны храниться при постоянной температуре, которая является оптимальной для тестируемых видов. Распространенный южный британский вид, L. quadripunctata, хорошо питается между 15 и 25 ° C и имеет оптимальную скорость подачи при 20 ° C17 , поэтому хорошо пластины можно удобно хранить в инкубаторе при постоянных 20 ° C ± 0,5 ° C.
При оценке жизнеспособности кормового грунтозаготовки выявляются сублетальные или предлетальные эффекты обработки древесины или естественно прочных пиломатериалов. Высокая жизнеспособность 5 указывает на то, что гриб демонстрирует естественное поведение, зарываясь в древесину и не испытывает неблагоприятного воздействия от контакта с ней. Жизненная сила 4 показывает, что, не зарывшись в древесину, грибок по-прежнему удобен для ползания по своей поверхности. Оценка 3 присваивается грибкам, которые не находятся на дереве, а вместо этого активно плавают в воде или неподвижны, но с быстро бьющимися ногами и плеоподами. Низкая жизнеспособность 2 означает, что грибок обнажен и / или имеет мало энергии. Это может произойти из-за длительного периода низкой скорости кормления или из-за того, что экстрактивные вещества либо выщелачиваются в воду, либо становятся доступными во время кормления. Если высокая смертность наблюдается через 7-8 недель, это может быть связано с голоданием, так как голодные грибы (содержащиеся в колодцах всего с 5 мл морской воды и без древесины) могут выжить так долго (личное наблюдение).
Преимущества использования краткосрочного лабораторного анализа в отличие от долгосрочных морских полевых испытаний заключаются в том, что новые методы обработки и древесные продукты могут быть быстро протестированы для выявления их потенциала для коммерческого использования. Кроме того, такие анализы могут способствовать быстрой оптимизации процессов обработки. Если наблюдается значительно более низкое производство фекальных гранул по сравнению с контрольной древесиной, то тестирование может быть дополнено морскими испытаниями. Slevin et al., 201523 и Westin et al., 201624 демонстрируют хорошую корреляцию между лабораторными и полевыми оценками путем тестирования одной и той же древесины в двух разных условиях, что указывает на способность к прогнозированию первой. Кратковременный анализ можно проводить в течение нескольких недель. Голодные грибы могут выживать в течение 7-8 недель при содержании в хорошо аэрированной воде без древесины (личное наблюдение), что может обеспечить дополнительное сравнение при исследовании реакции смертности на различные виды древесины. Однако, согласно недавним, неопубликованным наблюдениям, нет никаких значительных колебаний в производстве фекальных гранул в течение периода времени, превышающего 20 дней, кроме того, когда начинает происходить смертность. Кроме того, предыдущие методы, такие как методы, используемые Borges et al., 2008 и 2009, работают в течение 15 дней. Таким образом, 20 дней является достаточным временем для быстрого лабораторного испытания, чтобы обеспечить индикацию долговечности древесины.
Хотя этот метод подходит для краткосрочных испытаний, результаты должны дополняться долгосрочными морскими полевыми экспериментами. Лабораторные условия не могут воспроизвести разнообразие биотических и абиотических факторов, которые могут влиять на древесину в морской среде. Биообрастающие организмы, наряду с другими видами морских дровосек (таких как судовые черви), все еще могут присутствовать и наносить ущерб древесине25,26. Кроме того, истирание от брошенной волной черепицы или песка может изнашивать древесину, которая затем может стать доступной для gribbles27. Тем не менее, стандартный лабораторный метод может обеспечить первоначальный скрининг новых продуктов, которые показывают перспективы для морских применений. Оценивая производство фекальных гранул и жизнеспособность, можно определить древесину, которая лучше снижает скорость подачи грибка.
Из-за правил и ограничений консервантов древесины, таких как CCA и креозот, важно найти новые продукты для замены этих обработок. Древесина подвержена высоким уровням биодеградации в морской среде, но по-прежнему является одним из наиболее возобновляемых доступных строительных материалов и хорошо сохраняет свою прочность и структуру в морской воде27,28. Древесина, устойчивая к биодеградации, не только снизит затраты, но и будет более экологически чистой, чем использование альтернативных материалов, таких как бетон или сталь, которые требуют высоких затрат энергии во время производства29,30, или биоцидных консервантов широкого спектра действия, которые могут выщелачиваться и влиять на окружающую экосистему31,32,33,34,35,36, 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, связанного с данным исследованием.
Acknowledgments
Спасибо Исследовательскому совету Норвегии (Региональный фонд Осло, Alcofur rffofjor 269707) и Университету Портсмута (исследовательская стипендия факультета естественных наук) за предоставление финансирования исследований Люси Мартин. Кроме того, Жерве С. Сойеру, который предоставил древесину, используемую для получения репрезентативных результатов. Скипидар был предоставлен профессором Филиппом Эвансом из Университета Британской Колумбии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 150200 | |
| 50ml Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Adjustable volume pipette | Fisher Scientific | FBE10000 | 1-10 ml |
| Beech | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Fagus sylvatica | Taxonomic authority: L |
| Ekki | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Lophira alata | Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn. |
| Forceps | Fisher Scientific | 10098140 | |
| Incubator | LMS LTD | INC5009 | |
| Microporous specimen capsules | Electron Microscopy Sciences | 70187-20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Scots Pine | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Pinus sylvestris | Taxonomic authority: L. |
| Size 00000 paintbrush | Hobby Craft | 5674331001 | Size 000 or 0000 also acceptable |
| Sweet Chestnut | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Castanea sativa | Taxonomic authority: Mill |
| Turpentine | P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) | Syncarpia glomulifera | Taxonomic authority: (Sm.) Nied. |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific | 15544635 |
References
- Morrell, J. J. Protection of wood-based materials. Handbook of environmental degradation of materials, 3rd ed. Kutz, M. , Elsevier Science and Technology Books. Oxford. 343-368 (2018).
- Distel, D. L. The biology of marine wood boring bivalves and their bacterial endosymbionts. Wood deterioration and preservation. Goodell, B., Nicholas, D., Schultz, T. , American Chemical Society. Washington, D.C. 253-271 (2003).
- Buslov, V., Scola, P. Inspection and structural evaluation of timber pier: case study. Journal of Structural Engineering. 117 (9), 2725-2741 (1991).
- US EPA. Registration Eligibility Decision for Chromated Arsenicals. List A, Case No. 0132. US EPA - Office of prevention, pesticides and toxic substances. , Available from: https://swap.stanford.edu/20110202084/http://www.epa.gov/oppsrrd1/reregistration/REDs/cca_red.pdf 800-807 (2008).
- Arsenic timber treatments (CCA and arsenic trioxide) review scope document, Review series 03.1. ISSN number 1443. Australian pesticides and veterinary medicines authority. , Available from: https://apvma.gov.au/sites/default/files/publication/14296-arsenic-timber-review-scope.pdf (2003).
- Commission directive 2003/2/EC of 6 January 2003 relating to restrictions on the marketing and use of arsenic (tenth adaptation to technical progress to Council Deretive 76/769/EEC). Official Journal of the European Communities. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2003/2/adopted (2003).
- The Hazardous Waste (England and Wales) Regulations 2005 No.894. Environmental Protection England and Wales. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/uksi/2005/894/contents/made (2005).
- Palanti, S., Cragg, S. M., Plarre, R. Resistance against marine borers: About the revision of EN 275 and the attempt for a new laboratory standard for Limnoria. International Research Group on Wood Preservation, Document No. IRG/WP 20-20669. , (2020).
- The European Commission for Standardization. EN 275:1992. Wood preservatives- Determination of the protective effectiveness against marine wood borers. The European Commission for Standardization (CEN). , (1992).
- European Commission. Directive 98/8/EC concerning the placing of biocidal products on the market. Communication and Information Resource Centre for Administrations, Businesses and Citizens. , (2010).
- Mantanis, G. I. Chemical modification of wood by acetylation or furfurylation: A review of the present scaled-up technologies. BioResources. 12 (2), 4478-4489 (2017).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Bergot, J., Williams, J. R., Shayler, B., Sawyer, G. S. Laboratory screening of tropical hardwoods for natural resistance to the marine borer Limnoria quadripunctata: The role of leachable and non-leachable factors. Holzforschung. 62 (1), 99-111 (2008).
- Cragg, S. M., Pitman, A., Henderson, S. Developments in the understanding of the biology of marine wood boring crustaceans and in methods of controlling them. International Biodeterioration & Biodegradation. 43 (4), 197-205 (1999).
- Cookson, L. J., Vic, M. D. C.
- Cookson, L. Australasian species of Limnoriidae (Crustacea: Isopoda). Memoirs of the Museum of Victoria. 52 (2), 137 (1991).
- Jones, L. T. The geographical and vertical distribution of British Limnoria [Crustacea: Isopoda]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 43 (3), 589-603 (1963).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Busch, S. A laboratory assay for measuring feeding and mortality of the marine wood borer Limnoria under forced feeding conditions: A basis for a standard test method. International Biodeterioration & Biodegradation. 63 (3), 289-296 (2009).
- BSI Standards Publication. BS EN 350:2016. Durability of wood and wood-based products - Testing and classification of the durability to biological agents of wood and wood-based materials. BSI Standards Publication. , (2016).
- Menzies, R. The phylogeny, systematics, distribution, and natural history of limnoria. , University of Southern California. Dosctoal dissertation 196-208 (1951).
- Palanti, S., Feci, E., Anichini, M. Comparison between four tropical wood species for their resistance to marine borers (Teredo spp and Limnoria spp) in the Strait of Messina. International Biodeterioration & Biodegradation. 104, 472-476 (2015).
- Delgery, C. C., Cragg, S. M., Busch, S., Morgan, E. Effects of the epibiotic heterotrich ciliate Mirofolliculina limnoriae and moulting on the faecal pellet production by the wood-boring isopods Limnoria tripunctata and Limnoria quadripunctata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 334 (2), 165-173 (2006).
- Morrell, J. J., Helsing, G. G., Graham, R. D. Marine wood maintenance manual: a guide for proper use of Douglas-fir in marine exposures. Forest Research Laboratory. , Oregon State University. Corvallis. Research Bulletin 48 (1984).
- Slevin, C. R., Westin, M., Lande, S., Cragg, S. Laboratory and marine trials of resistance of furfurylated wood to marine borers. Eighth European Conference on Wood Modification. , Aalto University. 464-471 (2015).
- Westin, M., et al. Marine borer resistance of acetylated and furfurylated wood - results from up to 16 years of field exposure. International Research Group on Wood Preservation. , Document No. IRG/WP 16-40756 (2016).
- Westin, M., Rapp, A., Field Nilsson, T. Field test of resistance of modified wood to marine borers. Wood Material Science and Engineering. 1 (1), 34-38 (2006).
- Borges, L. M. S. Biodegradation of wood exposed in the marine environment: Evaluation of the hazard posed by marine wood-borers in fifteen European sites. International Biodeterioration & Biodegradation. 96 (1), 97-104 (2014).
- Treu, A., et al. Durability and protection of timber structures in marine environments in Europe: An overview. BioResources. 14 (4), 10161-10184 (2019).
- Williams, J. R., Sawyer, G. S., Cragg, S. M., Simm, J. A questionnaire survey to establish the perceptions of UK specifiers concerning the key material attributes of timber for use in marine and freshwater engineering. Journal of the Institute of Wood Science. 17 (1), 41-50 (2005).
- Purnell, P. The carbon footprint of reinforced concrete. Advances in Cement Research. 25 (6), 362-368 (2013).
- Hill, C. A. S. The environmental consequences concerning the use of timber in the built environment. Frontiers in Built Environment. 5, 129 (2019).
- Mercer, T. G., Frostick, L. E. Leaching characteristics of CCA-treated wood waste: a UK study. Science of the Total Environment. 427, 165-174 (2012).
- Brown, C. J., Eaton, R. A., Thorp, C. H. Effects of chromated copper arsenate (CCA) wood preservative on early fouling community formation. Marine Pollution Bulletin. 42 (11), 1103-1113 (2001).
- Brown, C. J., Eaton, R. A. Toxicity of chromated copper arsenate (CCA)-treated wood to non-target marine fouling communities in Langstone Harbour, Portsmouth, UK. Marine Pollution Bulletin. 42 (4), 310-318 (2001).
- Brown, C. J., Albuquerque, R. M., Cragg, S. M., Eaton, R. A. Effects of CCA (copper-chrome-arsenic) preservative treatment of wood on the settlement and recruitment of wood of barnacles and tube building polychaete worms. Biofouling. 15 (1-3), 151-164 (2000).
- Lebow, S. T., Foster, D. O., Lebow, P. K. Release of copper, chromium and arsenic from treated southern pine exposed in seawater and freshwater. Forest Products Journal. 49 (7), 80-89 (1999).
- Smith, P. T. Risk to human health and estuarine posed by pulling out creosote-treated timber on oyster farms. Aquatic Toxicology. 86 (2), 287-298 (2008).
- Brown, C. J., et al. Assessment of Effects of Chromated Copper Arsenate (CCA)-Treated Timber on Nontarget Epibiota by Investigation of Fouling Community Development at Seven European Sites. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45 (1), 0037-0047 (2003).
